Lipasa Termotolerante de Penicillium SP
Lipasa Termotolerante de Penicillium SP
Lipasa Termotolerante de Penicillium SP
1. Introducción
Las lipasas (triacilglicerol acil hidrolasas, E.C. 3.1.1.3) constituyen una
cerveza; Además, también se pueden utilizar para reducir las calorías de los lípidos mediante
transesterificación de ácidos grasos (Houde et al., 2004; Aravindan et al.,
2007). En las industrias farmacéutica y cosmética, las lipasas se utilizan para
2. Materiales y métodos
2.1. Microorganismo
La cepa Penicillium se aisló del suelo de Atlantic Rainforest, en Estación Ecológica
Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil (Ruegger y Tauk- Tornisielo, 2004), y identificado
preliminarmente como productor de lipasa. (Almeida 2013). La taxonomía morfológica y
molecular reveló que La cepa Penicillium pertenece a la sección Gracilenta; sin embargo,
fue No es posible clasificar a nivel de especie. La cepa está disponible en la Colección
Brasileña de Microorganismos Ambientales e Industriales - CBMAI / CPQBA - UNICAMP,
Paulínia, São Paulo, Brasil, bajo registro número de registro CBMAI 1583.
2.2. Mantenimiento de la cepa y preparación del inóculo.
La cepa de Penicillium se cultivó periódicamente en un 3% (w v − 1 ) agar de avena
Inclinados durante cinco días a 28 ° C y almacenados a 4 ° C. Se preparó el inóculo
suspendiendo los conidios de cultivos de cinco días de vida en destilados estériles
agua. Un mililitro de suspensión de conidios ajustado a 107.
Conidia mL-1 se utilizó para inocular los medios de cultivo.
2.3. Produccion de enzimas
Los cultivos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer (125 ml) que contenían
25 ml de medio de cultivo (g L − 1
). El cultivo se realizo
(v v − 1
) diluidos en los sistemas de tampón mencionados anteriormente, durante 24 horas a 4 ° C.
(2)
Relación con el control (sin ninguna sustancia). Todos los ensayos fueron realizados
Formado en duplicado.
) Triton X-100
), seguido por
ácidos palmítico, oleico y mirístico (0.294, 0.133 y 0.115 U mL − 1
respectivamente). En particular, la producción de lipasa con ácido esteárico fue de 32,5 veces.
–0.056 U mL − 1
Gama más amplia de sustratos que las esterasas. El estado físico de los sub-
El estrato es un factor probable que contribuye a la especificidad del sustrato.
Los ácidos grasos de cadena larga son típicamente insolubles o al menos poco solubles.
Así, la lipasa debe poder identificar insolubles o fuertemente agregadas.
sustratos Dado que la lipasa es activa hacia sustratos agregados, la lipasa
la actividad está directamente relacionada con el área total del sustrato y no con la
Concentración de sustrato (Verger, 1997).
, seguido de palmítico
h−1
). Actividades específicas, medidas para purificación adicional de enzimas.
procedimientos, fue mayor en el cultivo con ácido esteárico (0.265 U.μg de
proteína − 1
), seguido de ácido palmítico (0,150 U μg de proteína − 1
).
). Bajo estas
En estas condiciones, los valores más altos usando aceite de oliva también se observaron
Actividad específica (1.62 U μg de proteína − 1
(115.96 U g de biomasa − 1
h−1
) (Tabla 2). El aceite de linaza presentó valores de actividad específica (1.03
U.μg de proteína − 1
), rendimiento de lipasa en biomasa (86.859 U g de biomasa − 1
)
(2012) también verificaron una disminución en la producción de lipasa por Candida viswa-
nathii usando aceite de linaza bajo condiciones sumergidas. En esa obra, la C.
fuente de carbono por el hongo; Por otro lado, alta concentración lipídica.
puede causar la represión de la producción de lipasa debido al exceso de
La concentración de lípidos mostró que los valores más altos se encontraron con
0.5% de aceite de oliva (1.62 U mL − 1
). Este resultado muestra un aumento de 1,82 veces en
Producción de lipasa. En estas condiciones, los parámetros de fermentación.
también fueron más altos en comparación con las otras concentraciones de lípidos (YP / X =
354.65 U g − 1
; PL = 4.92 U g de biomasa − 1 h − 1 y actividad específica de
1.83 U μg de proteína − 1
paso de purificación similar para aislar una lipasa producida por Candida vis-
Wanathii. Después de seleccionar la resina octil sefarosa y amonio 0,02 M
Bancerz et al., 2005; Gutarra et al., 2009). Sin embargo, las especies de Penicillium
Con frecuencia produce lipasas alcalinas con actividad óptima en el pH.
van de 7.0 a 9.0 (Druet et al., 1992; Pimentel et al., 1994; Lima
et al., 2003; Tan et al., 2004; Menoncin et al., 2010).
Las condiciones pueden ser consideradas como una ruta alternativa sin la
Clasificación del jabón formado para obtener ácidos grasos.
4.6. Actividad de temperatura y estabilidad.
La actividad de la lipasa se evaluó de 40 a 80 ° C (Fig. 8). Lipasa bruta
actividad máxima presentada a 70 ° C; mientras que la lipasa purificada presentada
su actividad, mientras que por encima de 70 ° C la actividad disminuyó bruscamente. Esta operación
la temperatura del tiempo es más alta que la de otras lipasas de Penicillia tales
La enzima que se pretende aplicar debe exhibir una actividad óptima alrededor de
50 ° C.
Se realizó inactivación térmica de la lipasa cruda y purificada.
incubando muestras de enzimas sin sustrato a 40, 50, 60 y
70 ° C. Ambas formas de enzimas eran completamente estables hasta 40 ° C. Encima de esto
temperatura, se observó un patrón de inactivación bifásica, como se describe
por un modelo cinético de primer orden para la inactivación de enzimas, indicando el
Presencia de regiones termolábiles y termoestables en la enzima.
estructura (no se muestra). Los parámetros Kd y T1 / 2 de la enzima.
mostró que la enzima cruda era 22, 11 y 12 veces más estable
que la enzima purificada a 50, 60 y 70 ° C, respectivamente (Tabla 5).
4.7. Efecto de los compuestos químicos e iones metálicos sobre la actividad enzimática.
El efecto de los iones y otros compuestos químicos sobre la actividad de
la lipasa purificada se muestra en la Tabla 6. En general, la mayoría de las sustancias químicas
los compuestos a 2 mM no mostraron ninguna influencia sobre la actividad enzimática.
Excepcionalmente, los detergentes no iónicos como Tween 20 y Tween 80
activó la enzima en un 15%, mientras que PMSF inhibió la actividad enzimática por
57%. A 10 mM, EDTA DTT también mostró un ligero efecto negativo en
Actividad enzimática. PMSF fue un inhibidor fuerte y SDS completamente desnaturalizado
la enzima
A 2 mM, Ba2 + era un activador fuerte, mientras que Ca2 + era un inter-
Inhibidor mediato. Mn2 +, Mg2 +, NH4 +, Na + y Co2 + activados por 10
Chrysogenum (Li y Zong, 2010). Sin embargo, al igual que nuestro trabajo, el P. aur-
La lipasa antiogriseum fue inhibida por este ion, así como por otros divalentes.
Cationes como Cu2 + y Ba2 + (Lima et al., 2003). Hg2 + inhibe nu-
Enzimas numerosas, incluyendo muchas lipasas. Este efecto está asociado a su
interacción con grupos tiol de cisteína, que puede ser importante para
Catálisis (Sugihara et al., 1996).
4.8. Efecto de los disolventes orgánicos sobre la actividad enzimática.
Los disolventes orgánicos son ampliamente utilizados en reacciones con lipasas porque
Facilitan la manipulación de sustratos hidrófobos, y pueden
También modular y / o mejorar la actividad y selectividad de las lipasas.
El efecto de los disolventes orgánicos sobre la estabilidad de la lipasa purificada es
mostrados en la Tabla 7. Los solventes se clasificaron de acuerdo con el aumento de
log P, que es el coeficiente de partición del disolvente entre n-octanol
) fueron calculados
.mg de proteína − 1
4.7 × 107 M − 1 s
−1
, mientras que en presencia de Triton X-100 se observó
.mg de proteína − 1
, kcat 886.3 s − 1
actuar como un inhibidor competitivo por dos razones: (1) una cantidad dada de
5. Conclusiones
En este trabajo, la producción de lipasa por Penicillium sp. sección
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a São Paulo Research
Fundación - FAPESP, Brasil, por la beca otorgada a la primera.
autor y Ministerio de Ciencia e Innovación de España - MICINN, España
(Proyecto BIO-2012–36861).
Conflictos de interés
Los autores confirman que no existen conflictos de interés conocidos.