Aplicación de Métodos Quimiométricos 
para la Caracterización y Control de Calidad 
de Plantas Medicinales. 
 

Juan Ricardo Lucio Gutiérrez 

TESIS DOCTORAL 

Programa de Doctorado de Química 

Director: Dr. Jordi Coello Bonilla 

Departamento de Química 
Facultad de Ciencias 
 
2012

 
  

Memòria presentada per aspirar al Grau de Doctor per Juan Ricardo Lucio Gutiérrez 

Juan Ricardo Lucio Gutiérrez 

Vist i plau 

Dr. Jordi Coello Bonilla 
Catedràtic Química Analítica  
 

Bellaterra, 11 de Juliol de 2012. 

 
 Agradecimientos 
 

  A Dios quién me da fuerza para enfrentar los retos que surgen en el cumplimiento de 
mi Leyenda Personal y para seguir por el sendero de la vida cada día. 
 
A mi familia por su apoyo y comprensión, en esta estancia tan lejana. 
 
Quiero empezar por mi asesor, el Dr. Jordi Coello, por toda la ayuda que me ha brindado a lo 
largo de este proyecto; por su asistencia a través de los (tediosos) trámites administrativos y 
por  su  tiempo,  esfuerzo  y  paciencia.  Así  mismo,  por  las  positivas  contribuciones  que  ha 
realizado a mi formación profesional y como persona. También por haberme ayudado tanto, a 
través de sus explicaciones y consejos, con el proceso de adaptación al nuevo entorno cultural; 
una situación siempre complicada para un extranjero cuando se encuentra recién llegado a un 
País.  También  quiero  hacer  mención  del  Dr.  Santiago  Maspoch  por  las,  siempre  certeras, 
observaciones  y  contribuciones  hechas  durante  este  proyecto.  Así  mismo,  agradezco  a  los 
catedráticos  que  integran  el  Grupo  de  Quimiometría  Aplicada,  en  especial  al  Dr.  Marcelo 
Blanco, por las facilidades prestadas para que fuesen posibles los trabajos realizados. 
 
A  mis  compañeros  del  Grupo  de  Quimiometría  Aplicada,  a  los  más  antiguos  y  a  los  que  han 
llegado  en  fechas  más  recientes  y  también  a  las  personas  con  las  que  he  convivido  durante 
estos  años  en  Barcelona;  todos  me  han  dejado  alguna  experiencia  de  vida  y  por  lo  tanto  he 
aprendido algo nuevo de todos y cada uno, que de un modo u otro me ha enriquecido como 
persona. Espero tener la sabiduría para aplicar lo aprendido. No me es posible listar a todas las 
personas  en  este  apartado,  no  quiero  que  nadie  se  sienta  menospreciado;  no  obstante,  me 
gustaría  hacer  mención  de  David  Zamora  por  su  amistad  (siempre  dispuesto  a  ofrecer 
asistencia,  consejo  y  consuelo  ante  las  adversidades  personales  que  me  aquejaban);  al  Sr. 
“Don”  Ing.  M.  Sc.  Francesc  Vila  García  (Rancez),  por  su  valiosa  asistencia  en  el  campo  de  la 
informática  (me  ahorro  algunos  euros  en  paracetamol);  al  Dr.  José  Amigo  por  su  buena 
disposición  para  explicar  aspectos  técnicos  de  Matlab  y  de  la  quimiometría  y  a  Isabel  Osorio 
por su apoyo moral. 
 
A mis profesores y amigos de la Facultad de Medicina de la U.A.N.L., en especial a la Dra. Ma. 
de la Luz Salazar Cavazos y a la Dra. Noemí Waksman, pues gracias a su apoyo fueron posibles 
la gestiones necesarias para realizar la Tesis Doctoral en España. Así mismo, agradezco a la Dra. 
Aurora  Garza  por  su  colaboración  en  el  trabajo  sobre  Turnera  diffusa.  A  mi  estimada  amiga 
Anabel Torres Cirio que siempre tiene palabras para motivarme. 

 
 Agradecimientos 
 
Agradezco a la Licenciada en Farmacia María José Alonso Osorio, vocal de plantas medicinales 
y  homeopatía  del  Colegio  Oficial  de  Farmacéuticos  de  Barcelona,  por  la  orientación  recibida 
sobre el uso y consumo de plantas medicinales en España y a la Empresa Amorós Nature por la 
donación realizada de diversas muestras autenticadas de plantas medicinales. 
 
A las instituciones que posibilitaron el desarrollo de este proyecto de formación en Barcelona 
(España) por medio de una beca: La fundación Alan ‐ Universidad Autónoma de Nuevo León; 
“Con el apoyo del Programa Alan, Programa de Becas de Alto Nivel de la Unión Europea para 
América  Latina,  beca  nº  E07D401919MX”  (octubre  de  2007  ‐  julio  de  2010)  y  el  Consejo 
Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt), beca nº 308657 (octubre de 2010 ‐ abril de 2012). 
Al Ministerio de Ciencia y Tecnología de España por la financiación de los materiales necesarios 
para el desarrollo de esta Tesis en el marco del proyecto CTQ2007‐26528. 
 
 

 
  
 
 

La felicidad es un viaje, no un destino. 

Robin S. Sharma 

(El monje que vendió su Ferrari) 

 
 Índice 
 
Resumen.....................................................................................................................  xv 
Abstract...................................................................................................................... xvii 
1. Introducción............................................................................................................  1 

  1.1. Medicina tradicional..............................................................................................  3 
  1.2. Plantas Medicinales...............................................................................................  4 
  1.3. Situación actual y tendencias del control de calidad de las plantas medicinales...  5 
  1.4. Desafíos en el control de calidad de las plantas medicinales.................................  7 
  1.5. Procedimientos analíticos empleados en el control de calidad de las plantas 
medicinales............................................................................................................  9 

  1.5.1. Procedimientos de extracción........................................................................  9 
  1.5.2. Técnicas instrumentales empleadas con los productos fitoterapéuticos......  10 
  1.5.3. Espectroscopia en el infrarrojo cercano........................................................  12 
  1.5.4. Cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR)....................................  14 

  1.5.4.1. Factores que afectan el establecimiento del perfil cromatográfico.. 14 

  1.6. Quimiometría.........................................................................................................  16 

  1.6.1. Pretratamientos de los datos obtenidos con los métodos instrumentales...  17 

  1.6.1.1. Variable aleatoria normal tipificada (SNV, Standard  

Normal Variate)...............................................................................  17 
  1.6.1.2. Derivadas.........................................................................................  17 
  1.6.1.3. Normalización..................................................................................  18 
  1.6.1.4. Escalado (Scaling)............................................................................  18 
  1.6.1.5. Corrección de la línea base (Baseline correction)...........................  18 
  1.6.1.6. Alineación optimizada mediante correlación (COW,  
Correlation Optimized Warping)....................................................  19 
  1.61.7. Centrado (Mean centering).............................................................  20 

  1.6.2. Métodos de reconocimiento de pautas.......................................................  20 

  1.6.2.1. Análisis en componentes principales (PCA,  

Principal Component Analysis)........................................................  20 
  1.6.2.2. Modelado blando independiente de analogías de clases (SIMCA, 
Soft Independent Modeling of Class Analogy)................................  21 
  1.6.2.3. Análisis discriminante (DA, Discriminat Analysis)...........................  23 

 
 Índice 
 
  1.6.3. Métodos de regresión..................................................................................  23 

  1.6.3.1. Regresión por mínimos cuadrados parciales (PLSR,  

Partial Least Squares Regression).................................................  23 
  1.6.3.2. Análisis discriminante con mínimos cuadrados parciales (PLS‐DA, 
Partial Least Squares ‐ Discriminat Analysis)..................................  24 
  1.6.4. Resolución multivariable de curvas ‐ mínimos cuadrados alternados  
(MCR‐ALS, Multivariate Curve Resolution ‐ Alternating Least Squares)...  25 

  1.6.5. Verificación de los modelos y selección del número de factores.................  26 

Referencias del capítulo...................................................................................................  29 

2. Objetivos...............................................................................................................  35 
  2.1. Objetivo General………………………………………………………………………………………………  37 
  2.2. Objetivos Específicos………………………………………………………………………………………..  38 

3. Eleutherococcus senticosus…………………………………………………………………………………..  39 

  3.1. Introducción……………………………………………………………………………………………………..  41 
  3.1.1. Descripción de la planta medicinal……………………………………………………………  41 
  3.1.2. Problemática con el control de calidad del Eleutherococcus senticosus……  41 
  3.1.3. Descripción del estudio…………………………………………………………………………….  42 
  3.2. Metodología específica…………………………………………………………………………………….  42 
  3.2.1. Descripción de las muestras……………………………………………………………………..  42 
  3.2.2. Análisis espectroscópico en el infrarrojo cercano.…………………………………...  44 
  3.2.3. Análisis multivariante……………………………………………………………………………….  45 
  3.3. Resultados y discusión……………………………………………………………………………………..  47 
  3.3.1. Características de los espectros de infrarrojo cercano……………………………..  47 
  3.3.2. Estudio del agrupamiento natural de las muestras………………………………….  49 
  3.3.3. Modelado blando independiente de analogías de clases (SIMCA)………......  50 
  3.3.4. Análisis discriminante con mínimos cuadrados parciales (PLS‐DA)..........  54 
  3.3.5. Análisis discriminante (DA)……………………………………………………………………...  57 
  3.4. Conclusiones del capítulo …………………………………………………………………………….....  59 

Referencias del capítulo……………………………………………………………………………………………..  61 

 
 Índice 
 
4. Panax ginseng........................................................................................................  63 

  4.1. Introducción.........................................................................................................  65 
  4.1.1. Descripción de la planta medicinal..............................................................  65 
  4.1.2. Problemática con el control de calidad del Panax ginseng..........................  65 
  4.1.3. Descripción del estudio................................................................................  66 
  4.2. Metodología específica........................................................................................  67 
  4.2.1. Descripción de las muestras........................................................................  67 
  4.2.2. Análisis espectroscópico en el infrarrojo cercano........................................  69 
  4.2.3. Análisis multivariante..................................................................................  70 
  4.3. Resultados y discusión.........................................................................................  72 
  4.3.1. Características de los espectros de infrarrojo cercano................................  72 
  4.3.2. Estudio de la similitud de las muestras........................................................  73 
  4.3.3. SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy)................................  75 
  4.3.4. PLS‐DA (partial least squares ‐ discriminant analysis)..................................  76 
  4.3.5. DA (discriminant analysis)...........................................................................  77 
  4.3.6. Análisis semicuantitativo de mezclas...........................................................  78 
  4.4. Conclusiones del capítulo.....................................................................................  80 

Referencias del capítulo....................................................................................................  83 

5. Valeriana officinalis………………………………………………………………………………………………  85 

  5.1. Introducción……………………………………………………………………………………………………..  87 
  5.1.1. Descripción de la planta medicinal……………………………………………………………  87 
  5.1.2. Problemática con el control de calidad de Valeriana officinalis………………..  87 
  5.1.3. Antecedentes……………………………………………………………………………………………  88 
  5.1.4. Descripción del estudio…………………………………………………………………………….  89 
  5.2. Metodología específica…………………………………………………………………………………….  90 
  5.2.1. Descripción de las muestras……………………………………………………………………..  90 
  5.2.2. Reactivos………………………………………………………………………………………………….  91 
  5.2.3. Preparación de las muestras y de las mezclas de laboratorio…………………..  92 
  5.2.4. Instrumentación y procedimiento cromatográfico…………………………………..  92 
  5.2.5. Análisis multivariante……………………………………………………………………………….  93 
  5.2.6. Construcción de las huellas dactilares con múltiples longitudes de onda…  95 
  5.2.6.1. Reducción de variables…………………………………………………………………….  95 
  5.2.6.2. Ajuste de la línea de base y normalización de los datos……………………  96 

 
 Índice 
 
  5.2.6.3. Desdoblamiento de la matriz (unfolding)…………………………………………..  96 
  5.2.7. Optimización de los parámetros para COW 
(correlation optimized warping)………………………………………………………………..  97 
  5.3. Resultados y discusión………………………………………………………………………………………  97 
  5.3.1. Optimización y validación de la metodología…………………………………………….  97 
  5.3.2. Características de los cromatogramas y de las  
huellas dactilares aumentadas………………………………………………………………….  99 
  5.3.3. COW (correlation optimized warping) dirigida mediante 
PCA (principal component analysis)…………………………………………………………. 104 
  5.3.4. Comparación de los resultados de los modelos de clasificación……………….  107 
  5.4. Conclusiones del capítulo………………………………………………………………………...........  109 

Referencias del capítulo……………………………………………………………………………………………….  111 

6. Turnera diffusa.......................................................................................................  113 

  6.1. Introducción.........................................................................................................  115 
  6.1.1. Descripción de la planta medicinal..............................................................  115 
  6.1.2. Problemática con el control de calidad de Turnera diffusa.........................  115 
  6.1.3. Antecedentes...............................................................................................  116 
  6.1.4. Descripción del estudio................................................................................. 117 
  6.2. Metodología específica......................................................................................... 117 
  6.2.1. Descripción de las muestras.........................................................................  117 
  6.2.2. Reactivos....................................................................................................... 117 
  6.2.3. Preparación de los extractos......................................................................... 118 
  6.2.4. Instrumentación y procedimientos analíticos.............................................  118 
  6.2.4.1. Procedimiento por CLAR‐DAD............................................................... 118 
  6.2.4.2. Determinación de la actividad captadora del 
radical libre DPPH mediante espectrofotometría................................  119 
  6.2.5. Análisis multivariante...................................................................................  120 
  6.2.6. Construcción de las huellas dactilares con múltiples longitudes de onda...  121 
  6.2.7. Alineación de las huellas dactilares aumentadas mediante COW.............  121 
  6.3. Resultados y discusión..........................................................................................  122 
  6.3.1. Resultados del ensayo con DPPH y del método CLAR.................................  122 
  6.3.2. Construcción de las huellas dactilares aumentadas....................................  122 
  6.3.2.1. Selección de las longitudes de onda de trabajo..................................  123 

 
 Índice 
 
  6.3.2.2. Efecto de los pretratamientos..............................................................  125 
  6.3.2.3. Alineación............................................................................................  126 
  6.3.3. Predicción de la actividad antioxidante (EC50) por PLSR..............................  128 
  6.4. Conclusiones del capítulo.....................................................................................  131 

Referencias del capítulo...................................................................................................  133 

7. Conclusiones generales........................................................................................... 135 

8. Perspectivas...........................................................................................................  139 

Anexo........................................................................................................................  143 
 

 
 Resumen 
 
  La  medicina  tradicional  herbolaria  y  sus  preparaciones  han  sido  ampliamente 
empleadas por miles de años; sin embargo en muchos de los países occidentales aún 
no  ha  sido  oficialmente  aceptada.  Esto  es  debido  a  que  no  hay  datos  suficientes  de 
eficacia  y  seguridad  que  cumplan  con  los  criterios  requeridos  para  que  su  uso  sea 
universal. No obstante, la Organización Mundial de la Salud ha confirmado que el 80 % 
de la población mundial, especialmente millones de personas de las áreas rurales de 
los países en desarrollo, hacen uso de las medicinas herbales para sus necesidades de 
salud.  La  seguridad  en  el  consumo  de  un  producto  herbal  debe  ser  otorgada  por  un 
proceso  completo  de  control  de  calidad;  este  debe  ser  un  proceso  estandarizado, 
detallado,  claro,  conciso  y  reproducible.  De  no  existir  este  proceso  pueden  surgir 
confusiones  entre  los  productos  que  pueden  resultar  peligrosas  para  la  salud  del 
usuario. La falta de datos de investigación se debe, no sólo a políticas de salud pública, 
sino también a la falta de control de calidad de estos productos; debido principalmente 
a que no se dispone de metodologías adecuadas y aceptadas para la evaluación de los 
mismos.  Uno  de  los  motivos  para  la  falta  de  métodos  aceptables  podría  ser  que,  a 
diferencia  de  los  compuestos  de  síntesis  de  alta  pureza,  una  fórmula  herbal  puede 
consistir  en  cientos  de  compuestos.  Con  ayuda  de  la  quimiometría  se  puede 
definitivamente tener una mayor oportunidad de afrontar las dificultades que surgen 
al emplear técnicas cromatográficas o espectroscópicas para el análisis de calidad de 
las  plantas  medicinales,  como  son  las  señales  no  resueltas  y  la  gran  cantidad  de 
componentes en las plantas. 
 
  En  esta  memoria,  se  presenta  la  aplicación  de  diversos  métodos 
quimiométricos  para  realizar  el  control  de  calidad  de  cuatro  plantas  medicinales  de 
amplio uso comercial, para las cuales existen informes de confusiones, adulteraciones 
o  presentación  de  reacciones  adversas  en  los  consumidores:  Panax  ginseng, 
Eleutherococcus  senticosus,  Valeriana  officinalis  y  Turnera  diffusa.  Los  capítulos 
guardan  relación  entre  sí,  pero  han  sido  estructurados  para  ser  autónomos, 
presentando la descripción y problemática de cada planta, metodología, resultados y 
bibliografía particulares. 
 

xv 
 Resumen 
 
  El primer capítulo de la tesis consiste en una introducción general sobre el uso 
de  la  medicina  tradicional,  específicamente  de  las  plantas  medicinales,  y  sobre  las 
diferentes  estrategias  que  han  sido  utilizadas  para  su  control  de  calidad,  incluyendo 
una revisión de los aspectos analíticos y finalizando con la descripción de los métodos 
quimiométricos  usados  en  los  trabajos  presentados  en  los  capítulos.  El  capitulo  dos 
consiste en los objetivos que persigue esta Tesis Doctoral. 
 
  Los capítulos tres y cuatro describen el uso  de la espectroscopia de infrarrojo 
cercano como técnica analítica en el control de calidad del Eleutherococcus senticosus 
y el Panax ginseng, respectivamente, junto con varios métodos de reconocimiento de 
pautas  (análisis  en  componentes  principles,  modelado  blando  independiente  de 
analogías  de  clases  y  análisis  discriminante)  y  el  método  de  regresión  de  análisis 
discriminante con mínimos cuadrados parciales. Para el Panax ginseng (capítulo 4) se 
describe también el uso de la resolución multivariable de curvas ‐ mínimos cuadrados 
alternados con el fin de realizar la cuantificación de mezclas. 
 
  En el capítulo cinco se describe un tratamiento de la información que implica el 
uso  de  cromatogramas  a  varias  longitudes  de  onda  para  la  construcción  de  huellas 
dactilares  aumentadas  de  Valeriana  officinalis,  con  la  correspondiente  evaluación  de 
los  resultados  obtenidos  de  la  clasificación  efectuada  con  los  métodos  de 
reconocimiento de pautas. 
 
  El  capítulo  seis  trata  sobre  la  aplicación  de  la  estrategia  de  huellas  dactilares 
aumentadas, junto con la regresión por mínimos cuadrados parciales, para mejorar la 
predicción de la actividad antioxidante de Turnera diffusa. 
 
  El  capítulo  siete  presenta  las  conclusiones  globales  obtenidas  de  los  métodos 
de  control  de  calidad  propuestos  para  las  cuatro  plantas  medicinales  en  estudio  y  el 
capítulo  ocho  describe  las  perspectivas  que  abre  esta  Tesis  Doctoral,  proponiendo 
diversas líneas de trabajo. Finalmente, en el anexo se lista las publicaciones resultantes 
de los trabajos realizados. 
 

 
xvi
 Abstract 
 
  Traditional  herbal  medicine  and  its  preparations  have  been  widely  used  for 
thousands  of  years,  but  in  many  Western  countries  it  has  not  yet  been  officially 
accepted.  The  reason  is  a  lack  of  data  about  their  efficacy  and  security  that  are 
required  for  a  universal  use.  However,  the  World  Health  Organization  has  confirmed 
that 80% of the people in the world, especially millions who live in the rural areas in 
developing countries, make use of herbal medicines for their needs of health. Safety in 
the  use  of  an  herbal  product  should  be  granted  for  a  complete  process  of  quality 
control  that  should  be  a  standardized,  detailed,  clear,  concise  and  reproducible 
process. Its absence may arise confusion between products that may be hazardous to 
the health of the user. The lack of research data is due not only to public health policy 
but  also  to  the  deficient  quality  control  of  these  products,  mainly  due  to  the 
unavailability of suitable methodologies for the evaluation thereof. One reason for so 
little  acceptable  methods  may  be  that,  unlike  the  synthesis  of  compounds  of  high 
purity, an herbal formulation may consist of hundreds of compounds. With the aid of 
chemometrics  there  is  a  greater  opportunity  to  face  the  difficulties  that  arise  when 
using  chromatographic  or  spectroscopic  techniques  for  the  analysis  of  quality  of  the 
medicinal  plants,  such  as  unresolved  signals  and  the  large  number  of  components  in 
plants. 
 
  In this thesis, it is presented the application of different chemometric methods 
for  quality  control  of  four  medicinal  plants  in  widespread  commercial  use  for  which 
there  are  reports  of  confusion,  adulteration  or  presentation  of  adverse  reactions  in 
consumers:  Panax  ginseng,  Eleutherococcus  senticosus,  Valeriana  officinalis  and 
Turnera  diffusa.  The  chapters  are  interrelated,  but  have  been  structured  to  be  self‐
describing;  presenting  description,  problems,  methodology,  results  and  literature  for 
each plant. 
 
  The first chapter of the thesis is a general introduction to the use of traditional 
medicine,  particularly  medicinal  herbs,  and  about  the  different  strategies  that  have 
been used for its quality control, including a review of analytical issues and finally, the 
description  of  the  chemometric  methods  used  in  the  studies  presented  in  each 
chapter. Chapter two presents the objectives of this thesis. 

 
xvii
 Abstract 
 
  Chapters  three  and  four  describe  the  use  of  near  infrared  spectroscopy  as  an 
analytical  technique  in  the  quality  control  of  Eleutherococcus  senticosus  and  Panax 
ginseng,  respectively,  along  with  various  methods  of  pattern  recognition  (Principal 
Component  Analysis,  Soft  Independent  Modeling  of  Class  Analogy  and  Discriminant 
Analysis) and the regression method of Partial Least Squares ‐ Discriminat Analysis. For 
Panax  ginseng  (Chapter  4)  is  also  described  the  quantification  of  mixtures  using 
Multivariate Curve Resolution ‐ Alternating Least Squares.  
 
  Chapter  five  describes  an  information  processing  that  involves  the  use  of 
chromatograms at various wavelengths for the construction of enhanced fingerprints 
of  Valeriana  officinalis,  with  the  corresponding  evaluation  of  the  results  from  the 
classification conducted by pattern recognition methods. 
 
  Chapter six deals with the implementation of the enhanced fingerprint strategy 
together with Partial Least Squares Regression, in order to improve the prediction of 
the antioxidant activity of Turnera diffusa. 
 
  Chapter seven presents the overall conclusions drawn from the quality control 
methods  proposed  for  the  four  medicinal  plants  studied  and  Chapter eight  describes 
the prospects offered by this thesis, proposing several possibilities for further research. 
Finally, the appendix lists the publications resulting from the work carried out. 
 

 
xviii
  
 
 
1 
 
Introducción. 
 
 
 
 Introducción 

1.1. Medicina tradicional. 
 
  Se  puede  definir  la  medicina  tradicional  como  la  suma  total  de  los 
conocimientos, habilidades y prácticas basadas en las teorías, creencias y experiencias 
indígenas  de  distintas  culturas  (sean  o  no  explicables),  que  se  utilizan  en  la 
preservación  de  la  salud;  así  como  en  la  prevención,  el  diagnóstico,  la  mejora  o  el 
tratamiento de enfermedades físicas y mentales. En algunos países, donde la medicina 
tradicional no está incorporada al sistema predominante para el cuidado de la salud, 
los  términos  “medicina  complementaria”,  “alternativa”  o  “no  convencional”  son 
usados  de  manera  indistinta  [1].  En  las  últimas  décadas,  el  uso  de  la  medicina 
tradicional se ha expandido a nivel mundial debido a que ha ganado popularidad y, en 
consecuencia, no solamente está siendo utilizada para la atención primaria de la salud 
de  los  pobres  en  los  países  en  desarrollo,  sino  que  también  se  está  utilizando  en  los 
países desarrollados donde la medicina convencional es predominante. Considerando 
la importante expansión mundial en el uso de la medicina tradicional, la seguridad, la 
eficacia  así  como  el  control  de  calidad  de  las  medicinas  tradicionales  y  los 
procedimientos  basados  en  terapias  tradicionales,  se  han  convertido  en  tópicos 
relevantes  tanto  para  las  autoridades  sanitarias  como  para  los  usuarios  de  estos 
remedios [2]. 
 
  Se  considera  que  la  seguridad  y  la  eficacia  de  la  medicina  tradicional  ha  sido 
demostrada a través del uso histórico; es decir, a través de la experiencia transmitida 
de  generación  en  generación.  No  obstante,  se  reconoce  que  es  necesaria  la 
investigación científica para proporcionar evidencia adicional de su seguridad y eficacia 
[3]. Sin embargo, diversas prácticas de la medicina tradicional no han sido oficialmente 
reconocidas  en  la  mayoría  de  los  países  occidentales;  debido  a  esto,  no  existe  un 
desarrollo  paralelo  de  normas  internacionales  y  métodos  apropiados  para  su 
evaluación en diferentes culturas y regiones. Consecuentemente, la cantidad y calidad 
de  los  datos  de  seguridad  y  eficacia  de  la  medicina  tradicional  están  lejos  de  ser 
suficientes  para  cumplir  con  los  criterios  necesarios  para  apoyar  su  uso  en  todo  el 
mundo.  De  esta  manera,  el  reto  actual  es  asegurar  que  la  medicina  tradicional  es 

3
 
 Introducción 

empleada correctamente y determinar cómo debe de llevarse a cabo la investigación y 
evaluación en este campo [4]. 
 
1.2. Plantas Medicinales. 
 
  La medicación tradicional normalmente implica el uso de plantas medicinales, 
partes de animales y minerales; siendo las plantas medicinales el recurso terapéutico 
más ampliamente utilizado [5]. Así, de las diversas prácticas de la medicina tradicional, 
el presente trabajo se focaliza en el control de calidad de las plantas medicinales. 
 
  Históricamente  las  plantas  han  sido  utilizadas  como  medicamentos.  Durante 
mucho tiempo los remedios naturales y sobre todo las plantas medicinales, fueron el 
principal e incluso el único recurso del que disponían los médicos para el tratamiento 
de  enfermedades,  por  lo  que  las  plantas  medicinales  forman  parte  esencial  de  las 
estrategias  utilizadas  por  la  población  de  países  en  desarrollo  para  enfrentar  sus 
enfermedades cotidianas. Se estima que han sido identificadas de 250.000 a 350.000 
especies de plantas en el mundo y que cerca de 35.000 son ampliamente usadas con 
propósitos medicinales. El uso de plantas medicinales se da no solamente en el medio 
indígena  y  rural,  sino  en  las  zonas  urbanas  y  suburbanas,  como  resultado  de  la 
necesidad  de  recursos  accesibles  para  enfrentar  muy  diversos  padecimientos  [6].  La 
Organización  Mundial  de  la  Salud  (OMS)  ha  confirmado  que  el  80  %  de  la  población 
mundial hace uso de la fitoterapia para atender sus necesidades de salud [3].  
 
  Por  otro  lado,  las  plantas  medicinales  y  sus  preparaciones  han  sido 
ampliamente usadas en muchos países orientales y su popularidad se ha extendido en 
las últimas décadas a países occidentales, aunque sin ser aún aceptadas oficialmente 
en muchos de ellos; esto es debido principalmente a que no hay datos suficientes de 
eficacia  y  seguridad.  Las  razones  para  la  falta  de  estos  datos  incluye  la  carencia  de 
políticas de salud pública y de metodologías adecuadas y aceptadas para la evaluación 
de  las  plantas  medicinales.  La  escasez  de  metodologías  puede  ser  debida  a  que,  a 
diferencia de los compuestos de síntesis de alta pureza, un medicamento tradicional a 
base de plantas puede consistir en cientos de compuestos [7]. 

4
 
 Introducción 

1.3. Situación actual y tendencias del control de calidad de las plantas medicinales. 
 
  El  creciente  interés  en  el  uso  de  plantas  medicinales  está  dando  lugar  a  un 
mercado  de  rápido  crecimiento  para  los  productos  fitoterapéuticos,  suplementos 
dietéticos, nutracéuticos y alimentos funcionales [8]. Esta importante expansión en el 
uso  de  plantas  medicinales  plantea  muchas  inquietudes  acerca  de  su  control  de 
calidad, ya que podría dar lugar a la recolección masiva y sin supervisión, sin ninguna 
consideración  de  la  calidad  de  las  plantas  usadas  como  materias  primas  [9].  La 
seguridad en el consumo de un producto fitoterapéutico debe ser garantizada por un 
proceso  completo  de  control  de  calidad.  Este  debe  ser  un  proceso  estandarizado, 
detallado,  conciso  y  reproducible  que  pueda  ser  utilizado  para  evaluar  a  otros 
productos  de  la  misma  naturaleza.  El  aseguramiento  de  calidad  de  productos 
fitoterapéuticos,  es  un  prerrequisito  para  realizar  ensayos  clínicos  con  resultados 
reproducibles  y  es  necesario  con  el  fin  de  identificar  adulteraciones,  falsificaciones  o 
confusiones entre plantas [3,6,10].  
 
  Una  gran  parte  de  los  productos  fitoterapéuticos  son  clasificados  como 
suplementos  dietéticos,  por  lo  que  no  están  sujetos  a  los  mismos  procesos  de 
monitorización de los medicamentos; es por ello que en Estados Unidos, la FDA (Food 
and  Drug  Administration)  emitió  la  guía  DSHEA  (Dietary  Supplement  Health  and 
Education Act of 1994) para la regulación de este tipo de productos. La guía permite a 
las  compañías  hacer  afirmaciones  sobre  los  beneficios  de  sus  productos  en  la 
conservación  de  la  salud.  Sin  embargo,  no  revisa  que  se  cumplan  los  estándares  de 
control de calidad en cuanto a seguridad, eficacia y pureza [11].  
 
  La  OMS,  en  su  manual  de  métodos  de  control  de  calidad  para  plantas 
medicinales, la FDA y las Farmacopeas de diversos países presentan una colección de 
procedimientos  recomendados  para  evaluar  la  identidad,  pureza  y  contenido  de  los 
materiales de plantas medicinales; con estos procedimientos intentan proporcionar a 
los  laboratorios  una  herramienta  para  llevar  a  cabo  el  control  de  calidad  de  los 
productos  fitoterapéuticos.  Los  parámetros  que  incluyen  estas  referencias  para 
describir  la  calidad  de  los  productos  a  base  de  plantas  usados  como  medicamentos 

5
 
 Introducción 

son:  a)  pruebas  de  identidad,  donde  consideran  las  características  macroscópicas, 
microscópicas y organolépticas, así como el perfil obtenido por cromatografía en capa 
fina;  b)  pruebas  de  pureza  para  determinar  humedad,  cenizas,  materia  extraña, 
disolventes, la presencia de contaminantes microbianos, aflatoxinas, metales pesados 
y  residuos  de  plaguicidas;  y  c)  la  valoración  de  principios  activos  y/o  marcadores 
[1,6,10,12]. 
 
  La mayoría de las plantas medicinales han sido autenticadas tradicionalmente 
por medios morfológicos e histológicos. Sin embargo, este enfoque puede no ser fiable 
porque las plantas de la misma familia son morfológicamente similares y los productos 
comerciales elaborados con plantas se preparan de diversas maneras que hacen más 
difícil su identificación a través de una inspección sensorial [13]. Actualmente, es una 
práctica  común  entre  los  analistas  de  productos  naturales  la  selección de  uno  o  más 
compuestos como marcadores para la identificación y evaluación de la calidad [14]. Sin 
embargo, es reconocido que este tipo de determinaciones no proporciona por sí una 
idea completa de un producto farmacéutico a base de plantas, ya que son múltiples los 
constituyentes  responsables  de  sus  efectos  terapéuticos  y  a  veces  la  selección  de 
marcadores  adecuados  es  difícil  y  subjetiva  [15,16].  Estos  constituyentes  pueden 
trabajar  sinérgicamente  y  pueden  variar  dependiendo  no  únicamente  de  la  especie, 
sino también de las condiciones de crecimiento, de la época de cosecha, del origen, de 
los  métodos  de  proceso  y  secado  y  del  tiempo  de  almacenaje,  entre  otros  factores 
[17,18].  Por  otra  parte,  algunos  productores  sin  escrúpulos  continuamente  están 
tratando de desarrollar maneras de hacer el perfil químico de sus productos similar al 
perfil auténtico presentado por la planta medicinal en cuestión. En estas circunstancias 
específicas, el uso de compuestos marcadores es incapaz de confirmar la identidad de 
una planta. Es por estas razones que se hace necesario determinar la mayoría de los 
constituyentes de las plantas medicinales con el propósito de asegurar la confiabilidad 
y  precisión  de  las  investigaciones  farmacológicas  y  clínicas,  para  conocer  su 
bioactividad  y  los  posibles  efectos  colaterales  de  los  compuestos  activos,  así  como 
mejorar el control de calidad de sus productos [5]. 
 

6
 
 Introducción 

  El  establecimiento  de  huellas  dactilares  para  las  plantas  medicinales  es  un 
enfoque relativamente reciente adoptado por los investigadores para hacer frente a la 
complejidad  química  de  los  productos  fitoterapéuticos  y  los  problemas  relacionados 
con  el  uso  de  pocos  compuestos  marcadores.  La  huella  dactilar  de  una  planta 
medicinal podría ser un espectro o un cromatograma obtenido por un procedimiento 
definido para caracterizar la composición química de una muestra; se supone que es 
una  característica  única  para  la  identificación  de  las  plantas,  extractos  de  plantas  o 
preparados  en  cuestión  [16,19].  Así  pues,  el  perfil  cromatográfico  o  el  perfil 
espectroscópico  de  la  planta  medicinal,  parece  ser  la  herramienta  más  conveniente 
para llevar a cabo el control de calidad de los productos de uso farmacéutico a base de 
plantas  [20‐24].  Normativas  actualizadas  sobre  plantas  medicinales  publicadas  por  la 
Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia de Medicinas y Alimentos de los 
Estados  Unidos  (Food  and  Drug  Administration,  FDA)  y  la  Agencia  Europea  del 
Medicamento (EMA) se pronuncian por el uso de las huellas dactilares; indican que la 
identificación  de  la  planta  medicinal  debe  ser  una  de  las  primeras  pruebas  aplicadas 
para  garantizar  la  calidad  y  para  discriminar  entre  especies  relacionadas  o  muestras 
adulteradas [3,12,25,26]. 
 
1.4. Desafíos en el control de calidad de las plantas medicinales. 
 
  La  metabolómica  de  las  plantas  puede  ser  empleada  para  obtener  huellas 
dactilares  de  las  especies  con  propósitos  bioquímicos  o  taxonómicos,  ya  que  el 
metaboloma es la expresión final de los genes y define el fenotipo bioquímico de una 
célula  o  tejido;  así,  la  determinación  cualitativa  y  cuantitativa  de  los  metabolitos 
celulares  proveen  una  visión  del  estatus  bioquímico  de  un  organismo  dado  [27].  El 
concepto de fitoequivalencia hace uso del fenotipo bioquímico y fue desarrollado en 
Alemania  para  asegurar  la  congruencia  entre  la  composición  de  distintos  lotes  de 
medicamentos  tradicionales  basados  en  plantas.  Según  este  concepto,  para  ser 
considerada fitoequivalente, una planta medicinal requiere presentar un perfil químico 
que  debe  ser  comparable  con  el  perfil  de  un  producto  ya  conocido;  con  este  fin  se 
pueden  aplicar  diversas  técnicas  cromatográficas  y  espectroscópicas,  considerando 
como componente activo la planta medicinal en su totalidad [28‐32]. 

7
 
 Introducción 

  La  huella  dactilar  debe  proporcionar  las  atribuciones  fundamentales  de 

integridad  y  semejanzas  o  diferencias  para  representar  químicamente  el  producto 
fitoterapéutico  investigado,  permitiendo  autenticar  el  material  vegetal.  Las  huellas 
dactilares han de ser capaces de demostrar las semejanzas y diferencias entre varias 
muestras  de  una  planta  medicinal  en  particular,  incluso  si  el  número  y/o  la 
concentración de los componentes químicamente característicos no son exactamente 
iguales  entre  ellas,  de  tal  manera  que,  al  analizar  la  huella  dactilar  de  una  planta 
medicinal,  se  consideran  los  múltiples  constituyentes  y  no  solamente  uno  o  dos 
marcadores durante el proceso de evaluación de la calidad de estos productos [33‐36]. 
Sin  embargo,  en  cualquier  producto  herbal  existen  cientos  de  componentes 
desconocidos  y  muchos  de  ellos  se  encuentran  en  baja  concentración.  Además, 
normalmente existen variabilidades entre muestras de la misma planta medicinal; en 
consecuencia,  obtener  huellas  dactilares  confiables  que  representen  componentes 
químicamente característicos de un producto fitoterapéutico no es tarea fácil. Por ello, 
en el desarrollo de métodos para el análisis de plantas medicinales aparecen una serie 
de desafíos: 
 
 El  análisis  de  marcadores  o  componentes  activos  en  una  matriz  compleja  y 
algunas veces desconocida. 
 Los  analitos  buscados  pueden  tener  problemas  en  su  extracción  con 
disolventes o ser térmicamente lábiles. 
 La  falta  de  sustancias  químicas  de  referencia  y/o  materiales  de  referencia 
certificados. 
 La selección adecuada del método de extracción. 
 La variación en la composición de la planta obtenida entre lote y lote [37,38]. 
 
  Además, la seguridad, eficacia y calidad de productos finales a base de plantas 
medicinales  dependen  de  la  calidad  de  las  materias  primas  y  de  cómo  se  manejan  a 
través de procesos de producción.  Considerando lo anterior, la presente memoria se 
centra en el control de calidad de las plantas medicinales en forma de materias primas. 
 

8
 
 Introducción 

1.5.  Procedimientos  analíticos  empleados  en  el  control  de  calidad  de  las  plantas 
medicinales. 
 
  En  general,  los  métodos  de  control  de  calidad  de  las  plantas  medicinales 
deberían  incluir,  además  de  la  inspección  sensorial,  ensayos  analíticos  tales  como  la 
cromatografía en capa fina, la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de 
alta  resolución,  espectros  de  infrarrojo  medio  y  análisis  mediante  otras 
espectrometrías diversas, como el infrarrojo cercano o resonancia magnética nuclear. 
En la presente memoria se han utilizado las técnicas de la espectroscopia de infrarrojo 
cercano y de la cromatografía de líquidos de alta resolución y se hace énfasis en sus 
aplicaciones para el control de calidad de las plantas medicinales. 
 
1.5.1. Procedimientos de extracción. 
 
  El  método  de  extracción  y  preparación  de  muestra  es  muy  importante  para 
obtener buenos resultados, ya que si se quiere tener una buena información del perfil 
de una planta medicinal es necesario contar con un método que extraiga la mayoría de 
los  componentes  activos  de  las  plantas,  que  garantice  la  integridad  de  la  actividad 
farmacológica y, a la vez, que sea un método preciso y ofrezca buenas recuperaciones 
[39].  En  los  productos  fitoterapéuticos,  los  compuestos  de  interés  suelen  presentar 
grandes  diferencias  en  cuanto  a  polaridad  y  termoestabilidad.  Por  ello,  aún  con  una 
misma  técnica  de  extracción  las  condiciones  de  trabajo  (solvente,  temperatura,  etc.) 
pueden  variar  de  un  material  vegetal  a  otro,  lo  que  hace  indispensable  evaluar 
cuidadosamente la eficiencia del método empleado. El calentamiento con reflujo y la 
extracción  soxhlet  se  encuentran  entre  los  métodos  más  empleados  para  productos 
naturales.  Sin  embargo,  este  tipo  de  métodos  son  lentos,  requieren  grandes 
cantidades de solventes y pueden tener eficiencias de extracción bajas [40]. 
 
  En la última década, se han desarrollado técnicas como la  microextracción en 
fase  sólida  (SPME)  o  la  microextracción  en  fase  líquida  (LPME)  cuyas  principales 
ventajas son la disminución en el consumo de disolventes y en los tiempos de análisis, 
su  relativo  bajo  costo,  su  simplicidad  y  en  muchos  casos  la  posibilidad  de  obtener 

9
 
 Introducción 

factores de enriquecimiento mayores [41]. La SPME fue introducida en los años 90 y se 
ha  convertido  en  una  técnica  muy  utilizada  para  la  preparación  de  muestras  para 
cromatografía de gases y en menor medida para cromatografía líquida. En el análisis 
de  productos  fitoterapéuticos  esta  técnica  ha  sido  empleada  principalmente  para 
caracterizar compuestos volátiles [41‐46]. Se han publicado algunas aplicaciones de la 
SPME  en  modo  headspace  para  la  obtención  de  la  huella  dactilar  de  compuestos 
volátiles en plantas medicinales chinas y en otros en vegetales [47,48]. 
 
1.5.2. Técnicas instrumentales empleadas con los productos fitoterapéuticos. 
 
  Con  respecto  a  las  técnicas  de  análisis  de  las  plantas  medicinales,  las 
cromatográficas tienen una muy poderosa capacidad de separación para los complejos 
componentes  químicos  de  los  extractos,  siendo  posible  separarlos  en  muchas  sub‐
fracciones relativamente simples. La cromatografía de capa fina (CCF) ha sido la técnica 
de  elección  para  el  análisis  de  plantas  medicinales  y  es  aún  usada  con  mucha 
frecuencia [6,10]. Con las limitaciones habituales de la técnica, la CCF es usada como 
un  método  de  rastreo  y  semicuantitativo  que  provee  perfiles  cromatográficos 
característicos  y  permite  identificar  adulteraciones  en  los  productos.  Las  principales 
ventajas de esta técnica es que es sencilla, rápida, versátil y permite analizar muchas 
muestras  a  la  vez  [16,49].  No  obstante,  su  aplicación  regularmente  se  limita  a  la 
identificación de compuestos marcadores, con las desventajas que ello conlleva. 
 
  Es bien conocido que muchos de los principios farmacológicamente activos en 
las  plantas  medicinales  son  compuestos  volátiles,  por  lo  que  su  estudio  es  de  gran 
importancia  en  el  análisis  de  medicinas  tradicionales  a  base  de  plantas.  La 
cromatografía de gases (CG) ha sido empleada en el análisis de compuestos volátiles 
de las plantas medicinales con propósitos de establecer perfiles de identificación de las 
mismas, ya que la composición y concentración relativa de los compuestos orgánicos 
volátiles (aceites) son característicos de algunas plantas. Cambios en la composición de 
los  aceites  volátiles,  pueden  indicar  adulteraciones  o  indicar  cambios  enzimáticos  de 
oxidación  o  fermentación  [5,50,51].  El  empleo  del  acoplamiento  con  espectrometría 
de  masas  (CG‐EM)  para  establecer  perfiles  cromatográficos  de  plantas  ha  sido 

10
 
 Introducción 

empleado  por  varios  autores  [7,43,45,47,52].  El  establecimiento  de  estos  perfiles  se 
realiza mediante comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas de 
los  componentes  comunes  en  los  especímenes.  La  CG‐EM  tiene  la  ventaja  de  que 
proporciona,  además,  información  de  identidad  de  los  compuestos.  La  principal 
desventaja  de  la  CG  es  que  no  puede  ser  empleada  para  análisis  de  compuestos 
polares y no volátiles, a menos que se realice una derivatización previa de la muestra 
[5]. 
 
  La  electroforesis  capilar  (EC)  fue  introducida  a  principios  de  los  80  como  una 
poderosa  técnica  analítica  de  separación  que  ha  sido  desarrollada  rápidamente.  Los 
métodos  electroforéticos,  especialmente  la  EC,  han  sido  empleados  en  el  análisis  de 
plantas medicinales en la última década [53]. La EC permite la separación y análisis de 
los  ingredientes  activos  en  las  plantas  medicinales;  tiene  la  ventaja  de  que  requiere 
poca  cantidad  de  muestra  y  permite  realizar  análisis  rápidamente  con  muy  buena 
capacidad de separación [54]. También es una buena herramienta para la generación 
de  huellas  dactilares  de  las  plantas  medicinales.  Estudios  recientes  de  alcaloides  y 
flavonoides en plantas medicinales han empleando la EC [55]. 
 
  Si  bien  los  métodos  cromatográficos  han  sido  ampliamente  utilizados  para 
establecer la huella dactilar en productos fitoterapéuticos, ha habido avances en el uso 
de  la  resonancia  magnética  nuclear  (RMN)  de  alta  resolución  y  la  espectroscopia  de 
infrarrojo. Las huellas dactilares obtenidas por  1HRMN han sido utilizadas, sobre todo, 
en el análisis de alimentos naturales como vino, aceites de oliva, cervezas, entre otros. 
El método es versátil, no depende de la naturaleza de la muestra y se pueden obtener 
huellas  dactilares  cuantitativas  [56].  Permite  detectar  simultáneamente  todos  los 
componentes  en  la  muestra  que  tengan  núcleos  de  hidrogeno,  lo  cual  cubre 
prácticamente  todos  los  compuestos  orgánicos  como  carbohidratos,  aminoácidos, 
ácidos grasos, aminas, ésteres, éteres, fenoles y lípidos [57]. Gingko biloba es una de 
las plantas sobre la cual se han publicado mayor número de trabajos con esta técnica, 
hasta el momento, con sensibilidades semejantes a las obtenidas por CLAR, pero con 
menor  tiempo  de  análisis  y  evitando  el  consumo  de  insumos  caros  (solventes  y 
columnas) [58]. Además, actualmente se dispone de programas para el procesamiento 

11
 
 Introducción 

de los datos post‐adquisición en forma off‐line, lo cual permite mejorar la resolución, 
obtener una óptima relación señal/ruido y aumentar la sensibilidad [59‐61]. 
 
1.5.3. Espectroscopia en el infrarrojo cercano. 
 
  La  región  del  infrarrojo  cercano  (NIR),  se  extiende  entre  800  y  2500  nm  o, 
expresado en número de onda, de 12 500 a 4000 cm‐1. Es la primera región espectral 
que  muestra  bandas  de  absorción  relacionadas  con  las  vibraciones  moleculares  y  se 
caracteriza  por  las  bandas  armónicas  y  las  bandas  de  combinación.  Esta  región  se 
utiliza  ampliamente  para  el  análisis  de  la  composición  de  diversos  productos, 
incluyendo  los  alimenticios  [62].  La  espectroscopia  NIR  recoge  la  información  de  las 
estructuras químicas, a través de la valoración de los enlaces moleculares reflejados en 
el  espectro  obtenido  (p.  ej.  C‐H,  N‐H  and  O‐H,  que  son  los  principales  componentes 
estructurales  de  las  moléculas  orgánicas).  La  composición  química  de  la  muestra 
origina  diferencias  que  quedan  reflejadas  en  las  vibraciones  armónicas  y  de 
combinación, construyendo de esta manera un espectro característico que sirve como 
huella dactilar [63‐66]. La relación entre la huella dactilar y la composición química de 
la  muestra  puede  parecer  poco  evidente  pero  el  hecho  es  que,  aplicando  el  mismo 
procedimiento  experimental,  el  espectro  obtenido  puede  considerarse  como  una 
característica determinada únicamente por los componentes químicos presentes en la 
planta medicinal y en estas circunstancias es aplicable el concepto de fitoequivalencia, 
ya que este no exige el aislamiento e identificación de los componentes de la muestra 
[16,28]. 
 
  Existen  tres  tipos  de  configuración  instrumental  para  el  registro  de  espectros 
NIR:  transmitancia,  reflectancia  y  transflectancia;  en  la  Figura  1.1  se  muestra  una 
representación  esquemática.  Considérese  que  el  haz  de  luz  que  emite  la  fuente  de 
radiación ya ha atravesado el correspondiente sistema de selección de longitudes de 
onda. En las medidas por reflectancia (sólidos y semisólidos), el haz de luz es reflejado 
por  la  propia  muestra  y  llega  al  detector.  En  modo  transmitancia  (gases,  líquidos, 
semilíquidos y sólidos), el haz de luz atraviesa la muestra desde la fuente de radiación 
hasta  el  detector.  Finalmente,  un  caso  intermedio  lo  ocupa  las  medidas  por 

12
 
 Introducción 

transflectancia  (líquidos  turbios  y  semilíquidos),  donde  el  haz  de  luz  atraviesa  la 
muestra y se refleja en un reflector que está en contacto con la misma, hasta llegar de 
nuevo  al  detector.  Para  los  trabajos  descritos  en  la  presente  memoria  se  empleó  el 
modo de reflectancia. 
 
 

 
Figura 1.1. Esquema de las configuraciones para el registro de espectros NIR. 
 
 
  La  espectroscopia  NIR  presenta  las  ventajas  de  ser  un  método  rápido  y  no 
destructivo, que requiere una mínima (o ninguna) preparación de muestra; así mismo, 
hace  posible  la  determinación  simultánea  del  contenido  químico  y  de  algunas 
propiedades físicas de la muestra [67]. Como resultado, en los últimos años, ha habido 
una tendencia creciente en el uso de la espectroscopia NIR para el análisis cualitativo y 
cuantitativo de las plantas medicinales. Por mencionar algunos ejemplos, empleando 
el método NIR se ha determinado la autenticidad de S. miltiorrhiza, se han identificado 
las diferentes variedades geográficas de Paeonia lactiflora, Phellodendri chinensis y P. 
amurensis; así mismo, los algunos compuestos representativos de estas plantas se han 
cuantificado con PLS (partial least squares) [49]. A pesar de las ventajas en el empleo 
de los perfiles espectroscópicos, los cromatográficos siguen siendo los más utilizados 
para evaluar la calidad de las plantas medicinales [5]; probablemente debido a que la 
técnica  no  es  muy  sensible,  así  que  por  lo  general  sólo  puede  aplicarse  a  los 
componentes mayoritarios [68]. 
 
 

13
 
 Introducción 

1.5.4. Cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR). 
 
  La CLAR es un método popular empleado en el análisis de plantas medicinales 
debido  a  que  es  una  técnica  relativamente  sencilla  y  muy  versátil,  ya  que  permite 
analizar  compuestos  tanto  volátiles  como  no  volátiles,  polares,  no  polares  y  hasta 
iónicos [14,69]. En general, la CLAR puede ser empleada para analizar la mayoría de los 
compuestos en las plantas medicinales, tal y como lo revelan las publicaciones a este 
respecto. Entre los métodos cromatográficos para la toma de huellas dactilares de las 
plantas  medicinales,  el  más  popular  sigue  siendo  la  cromatografía  líquida  de  alta 
resolución  acoplada  a  un  detector  de  diodos  (CLAR‐DAD)  [5,34,49].  El  uso  de 
detectores  de  diodos  en  línea  proporciona  información  adicional  a  los  perfiles 
cromatográficos  obtenidos  a  longitudes  de  onda  simples,  ya  que  se  pueden  obtener 
además  los  espectros  relacionados  con  cada  uno  de  los  picos,  lo  cual  puede  ser 
empleado como criterio de identificación y análisis de pureza de cada uno de los picos 
[15,20,70]. 
 
  Otros  acoplamientos,  tales  como:  CLAR–EM,  CLAR‐RMN,  también  han  sido 
utilizados  con  estos  mismos  propósitos;  en  particular,  los  acoplamientos  CLAR‐EM  se 
han convertido en una herramienta ampliamente utilizada en el análisis de productos 
fitoterapéuticos ya que proporcionan también información espectral adicional, que es 
muy  útil  para  el  análisis  cualitativo  y  para  la  elucidación  estructural.  Aunque 
tradicionalmente este tipo de acoplamientos han sido utilizados para la identificación 
de compuestos específicos, en la actualidad existe un interés creciente en su aplicación 
a la obtención de la huella dactilar del producto completo [20,21,71‐73]. 
 
1.5.4.1. Factores que afectan el establecimiento del perfil cromatográfico. 
 
  La huella dactilar cromatográfica de una planta es una característica obtenida 
por un procedimiento definido, separando tantos compuestos como sea posible para 
construir un patrón de reconocimiento específico. La identidad de estos componentes 
químicos puede ser conocida o desconocida [14,34].  Puesto que todo  el conjunto  de 
compuestos caracteriza la composición química de la planta medicinal, la huella digital 

14
 
 Introducción 

cromatográfica  representa  una  metodología  cualitativa  razonable,  en  la  cual  todo  el 
cromatograma  es  evaluado  durante  el  análisis  de  datos  para  discriminar  entre 
diferentes  especies  de  la  misma  familia  de  plantas  [5,34,49].  Obtener  un  buen  perfil 
cromatográfico que represente la fitoequivalencia de una planta medicinal depende de 
varios  factores,  tales  como  el  procedimiento  de  extracción,  el  instrumento  de 
medición  y  las  condiciones  de  separación,  entre  otros  [14,74‐77].  La  mayoría  de  los 
procesos  de  extracción  para  plantas  medicinales,  emplean  mezclas  hidroalcohólicas 
como  solvente  de  extracción  y  los  solventes  más  comúnmente  utilizados  son  agua, 
metanol y etanol [2,5,16,49,78]. 
 
  En  cuanto  a  los  aspectos  instrumentales,  se  debe  considerar  que  la  huella 
dactilar puede ser afectada por factores como la degradación de la fase estacionaria; 
por ejemplo, debido a la baja estabilidad del sílice y de los soportes a base de sílice a 
valores altos de pH y también se debe contemplar la posibilidad del colapso de la fase 
unida  C18  a  causa  de  una  fase  móvil  altamente  polar  (dewetting).  Los  pequeños 
cambios en la composición de la fase móvil también afectan a los perfiles obtenidos; 
causados  por  fluctuaciones  de  temperatura  y  presión,  variaciones  en  la  velocidad  de 
flujo  y  en  la  dispersión  del  gradiente.  Algunas  variaciones  pueden  tener  origen  en  el 
detector, por ejemplo, un desplazamiento de la longitud de onda en un espectrómetro 
UV‐Visible  o  un  mal  alineamiento  del  monocromador.  Hay  que  tener  cuidado  de  no 
sobrecargar  la  columna,  ya  que  algunos  componentes  pueden  presentar  una  alta 
concentración. Finalmente, los perfiles cromatográficos se pueden ver afectados por la 
interacción  entre  analitos;  este  último  factor,  junto  con  los  cambios  instrumentales 
desconocidos,  produce  una  gran  incertidumbre  en  el  establecimiento  de  los  perfiles 
[5,38,79]. 
 
  Una vez optimizadas las condiciones de tratamiento de muestra y separación, 
el siguiente reto es el análisis de los datos obtenidos. Como ya se ha mencionado es 
posible  emplear  las  técnicas  cromatográficas  para  obtener  perfiles  relativamente 
completos de las plantas medicinales que permitan establecer la fitoequivalencia. Sin 
embargo,  la  interpretación  de  estos  perfiles  se  complica  cuando  el  número  de 
componentes  es  grande  y  más  aún  cuando  se  presentan  señales  no  resueltas.  La 

15
 
 Introducción 

quimiometría permite afrontar las dificultades en el análisis de calidad de las plantas 
medicinales.  El  empleo  de  técnicas  quimiométricas  facilita  el  análisis  de  datos,  tanto 
cromatográficos como espectrales. 
 
1.6. Quimiometría. 
 
  Como  se  ha  estado  mencionando  anteriormente,  se  pueden  emplear  muchas 
técnicas  cromatográficas  y  espectroscópicas,  incluyendo  técnicas  con  acoplamientos, 
para el análisis de los productos fitoterapéuticos y para construir los perfiles típicos de 
éstos. El problema aquí es cómo se evalúa la información obtenida con estas técnicas.  
 
  La  quimiometría  es  un  campo  interdisciplinario  que  involucra  el  análisis 
multivariable, los modelos matemáticos, la informática y la química analítica. Algunas 
de  las  áreas  de  aplicación  más  importantes  de  la  quimiometría  incluyen  (1)  la 
calibración, validación y pruebas de significación, (2) la optimización de las mediciones 
químicas  y  procedimientos  experimentales  y  (3)  la  extracción  del  máximo  de 
información  química  a  partir  de  datos  analíticos  [80].  El  perfil  cromatográfico  o 
espectroscópico  de  una  planta  medicinal  es  un  sistema  multivariable,  tanto  por  la 
manera en que los instrumentos actuales realizan el registro de las señales analíticas, 
como porque se involucra en el perfil a la mayoría de los componentes fitoquímicos de 
la  planta  medicinal.  Con  ayuda  de  la  quimiometría  se  puede  afrontar,  con  mayores 
posibilidades de éxito, las dificultades que surgen al emplear técnicas cromatográficas 
o espectroscópicas para el control de calidad de las plantas medicinales, como son las 
señales no resueltas, la gran cantidad de componentes en las plantas y la complejidad 
de los espectros del infrarrojo cercano.  
 
  La  quimiometría  abarca  diversos  objetivos  como  la  aplicación  de 
pretratamientos  a  los  datos  experimentales  para  mejorar  la  calidad  de  la  señal,  la 
construcción  de  modelos  para  el  reconocimiento  de  pautas  y  la  determinación 
cuantitativa [81]. Son muchas las técnicas quimiométricas que se pueden utilizar para 
llevar  a  cabo  estos  objetivos;  en  esta  sección  se  describen  aquéllas  que  han  sido 
utilizadas en esta memoria. 

16
 
 Introducción 

1.6.1. Pretratamientos de los datos obtenidos con los métodos instrumentales. 
 
  De  manera  general,  el  pretratamiento  es  la  modificación  de  datos  realizada 
antes  de  construir  un  modelo  matemático  o  antes  de  aplicar  otra  forma  de  analizar 
los datos. El propósito del pretratamiento es hacer lineal la respuesta de las variables 
y eliminar las fuentes extrañas de variación que no son de interés en el análisis. De no 
ser  eliminada  la  varianza  debida  a  los  errores  sistemáticos  presentes  en  los 
experimentos,  el  modelo  requerirá  un  trabajo  más  complejo  para  obtener  la 
información de interés [78,82]. 
 
1.6.1.1. Variable aleatoria normal tipificada (SNV, Standard Normal Variate). 
 
  SNV  es  una  transformación  que  se  aplica  habitualmente  a  los  datos 
espectroscópicos  para  minimizar  los  efectos  de  la  dispersión  de  la  luz.  Utiliza  el 
centrado y escalado de cada espectro individual (es decir, estandariza cada espectro 
manipulando únicamente los datos del mismo). El resultado práctico del SNV es que 
minimiza  las  interferencias  multiplicativas  de  la  dispersión  en  los  datos  espectrales 
producidas por los distintos tamaños de partícula en la muestra; un efecto del SNV es 
que, en la escala vertical, cada espectro está centrado en cero [83]. 
 
1.6.1.2. Derivadas. 
 
  Las  derivadas  permiten  aumentar  las  diferencias  entre  las  bandas  anchas  y 
solapadas de los espectros; también se utilizan para corregir los efectos de línea base. 
La primera derivada elimina los desplazamientos de línea base paralelos al eje de las 
abscisas,  mientras  que  la  segunda  derivada  elimina  los  términos  que  varían 
linealmente con la longitud de onda. Los métodos de derivación más utilizados son el 
de Norris [84] y el de Savitzky‐ Golay [85], el cual incluye un suavizado simultáneo con 
la derivación. 
 
 
 

17
 
 Introducción 

1.6.1.3. Normalización. 
 
  En  muchos  métodos  analíticos,  las  variables  medidas  para  una  muestra  dada 
son  incrementadas  o  disminuidas  de  su  valor  auténtico  por  un  factor  multiplicativo. 
Los  métodos  de  normalización  intentan  corregir  este  tipo  de  efectos  mediante  la 
identificación  de  algún  aspecto  de  cada  muestra  que  debería  ser  esencialmente 
constante  de  una  muestra  a  otra,  y  realizar  la  corrección  de  la  escala  de  todas  las 
variables  utilizando  dicha  característica.  Cuando  se  construyen  modelos  de  análisis 
discriminante tales como PLS‐DA (partial least squares ‐ discriminat analysis) o SIMCA 
(soft independent modeling of class analogy), la normalización se efectúa si la relación 
entre  las  variables  y  no  la  magnitud  absoluta  de  la  respuesta  es  el  aspecto  más 
importante  de  los  datos  para  la  identificación  de  una  especie;  por  ejemplo,  la 
concentración  de  un  compuesto  no  es  tan  relevante,  sólo  el  hecho  de  que  se 
encuentre en una cantidad detectable. El uso de la normalización en estas condiciones 
debería ser considerado después de evaluar cómo son los cambios en la respuesta de 
las variables para las diferentes clases de interés [82,86]. 
 
1.6.1.4. Escalado (Scaling). 
 
  El escalado de los datos de una matriz entre un valor mínimo y uno máximo, es 
un  caso  particular  de  normalización  que  puede  ser  aplicado  antes  de  la  construcción 
de  los  modelos  matemáticos.  Este  pretratamiento  puede  ser  útil  para  evitar  la 
presencia de valores extremos en la escala de los datos en algunas muestras de origen 
natural y se prefiere su uso cuando se trata de aplicaciones cuantitativas [69]. 
 
1.6.1.5. Corrección de la línea base (Baseline correction). 
 
  Existen  diferentes  maneras  de  hacer  la  corrección  de  la  línea  base;  en  la 
presente memoria se ha utilizado el método de mínimos cuadrados ponderados (WLS, 
Weighted  Least  Squares).  Este  método  es  comúnmente  empleado  en  aplicaciones 
espectroscópicas  (o  cromatográficas)  donde  la  señal  de  algunas  variables  es  debida 
solamente a la señal de fondo. Estas variables sirven como referencia para determinar 

18
 
 Introducción 

cuanta señal de fondo debe ser eliminada de las variables cercanas. El algoritmo WLS 
emplea  un  enfoque  automático  para  determinar  qué  puntos  son  los  más  probables 
para  ser  sólo  línea  base;  esto  lo  hace  ajustando  de  manera  iterativa  un  línea  base  a 
cada espectro (o cromatograma) y determinando qué variables están claramente por 
arriba de la línea base (es decir, la señal) y cuáles están debajo de ésta. Se asume que 
los  puntos  debajo  de  la  línea  base  son  más  significativos  en  el  ajuste  de  la  señal  de 
fondo del espectro.  
 
  Este  método  también  es  llamado  "asymmetric  weighted  least  squares".  El 
efecto práctico de su uso es una eliminación automática de la señal de fondo, evitando 
la creación de picos intensamente negativos [79,82]. 
 
1.6.1.6.  Alineación  optimizada  mediante  correlación  (COW,  Correlation  Optimized 
Warping). 
 
  COW es un método para alinear las señales de datos de muestras que exhiben 
cambios  en  su  posición  a  lo  largo  del  eje  x,  empleando  un  vector  de  referencia  para 
alinear  el  vector  de  la  muestra.  El  vector  usado  como  referencia  debe  ser 
representativo de las muestras que se quieren alinear. El método funciona mediante la 
división  del  vector  de  la  muestra  a  ser  alineada  en  segmentos  de  tamaño  definido  y 
permitiendo  el  aumento  o  la  disminución  de  la  longitud  de  estos  segmentos  para 
buscar la correlación óptima con los segmentos del vector de referencia [87].  
 
  Así,  los  parámetros  que  hay  que  definir  para  la  aplicación  de  este  método  de 
alineación  son:  el  vector  a  ser  usado  como  referencia,  la  longitud  del  segmento  y  el 
grado  de  flexibilidad  (slack);  la  selección  adecuada  de  estos  parámetros  puede  ser 
realizada aplicando algoritmos como los descritos por Skov [88] y Tomasi [89]. COW se 
aplica  típicamente  en  datos  cromatográficos  donde  la  posición  de  los  picos  puede 
cambiar  entre  análisis,  debido  a  pequeños  cambios  en  las  muestras  o  en  las 
condiciones del cromatógrafo. 
 
 

19
 
 Introducción 

1.6.1.7. Centrado (Mean centering). 
 
  Éste  pretratamiento  calcula  el  valor  medio  de  cada  columna  de  la  matriz  de 
datos  y  resta  este  valor  de  la  columna,  trasladando  los  ejes  del  sistema  de 
coordenadas hacia el centroide de los datos y hace que cada muestra exhiba solo las 
diferencias que tiene con respecto a la muestra promedio de los datos originales [81]. 
 
1.6.2. Métodos de reconocimiento de pautas. 
 
  Aquí  se  mencionan  las  técnicas  multivariables  utilizadas  en  esta  memoria 
mediante  las  que  se  puede  establecer  agrupaciones  de  muestras  en  función  de  su 
similitud y métodos de clasificación de nuevas muestras. 
 
1.6.2.1. Análisis en componentes principales (PCA, Principal Component Analysis). 
 
  El  PCA  es  un  método  matemático  bilineal  que  provee  una  interpretación 
general de la principal información contenida en una tabla multivariable, mediante la 
extracción y visualización de la variación sistemática de los datos en dicha tabla [35]. 
Los  datos  originales  se  transforman  en  una  combinación  lineal  de  variables  no 
correlacionadas  entre  sí,  llamadas  componentes  principales  (PCs).  No  todos  los 
componentes  principales  contienen  la  misma  información;  los  primeros  son  los  que 
describen  la  mayor  variación  en  los  datos,  que  se  asocia  a  la  información  más 
relevante, mientras que los últimos describen variaciones en los datos que pueden ser 
debidas  a  ruido  o  error  experimental,  o  a  un  sobreajuste  del  modelo  y  pueden  ser 
descartados,  con  lo  que  se  consigue  una  importante  reducción  del  número  de 
variables. Se aplica la siguiente ecuación: 
 
X   ti piT  E    (1.1) 
i a

 
donde  X  es  la  matriz  de  datos  a  tratar  (en  esta  tesis  serán  huellas  dactilares,  datos 
espectrales  o  cromatográficos  después  de  su  pretratamiento),  a  es  el  número  de 

20
 
 Introducción 

componentes principales que contienen la información deseada, ti son los scores para 
cada  componente  principal  y  pi  los  loadings  y  E  es  una  matriz  de  error,  es  decir  la 
variación  residual  de  X  que  no  es  explicada  por  el  modelo  con  a  componentes 
principales.  El  superíndice  T  indica  la  matriz  traspuesta.  La  ecuación  1.1  se  puede 
expresar de la siguiente manera: 
 

X  TPT  E   (1.2) 
 
donde  T  es  la  matriz  de  scores,  con  tantas  filas  como  la  matriz  original  X,  y  que 
contiene  la  información  sobre  las  filas  (los  objetos)  de  la  matriz  original;  PT 
corresponde a la transpuesta de la matriz de loadings, con tantas columnas como los 
datos originales, y que contiene información sobre las columnas (las variables) de la 
matriz original. El número de columnas de la matriz de scores corresponde al número 
calculado  de  componentes  principales,  a;  PC1  explica  la  máxima  variabilidad  de  la 
matriz X, PC2 es ortogonal a la primera componente y abarca la mayor cantidad de la 
variación  restante,  y  así  sucesivamente,  hasta  que  se  explica  el  total  de  la  variación 
útil  de  la  matriz  original  X.  Al  representar  gráficamente  los  valores  de  los  scores,  es 
posible detectar e interpretar las pautas presentadas por las muestras, agrupaciones, 
similitudes, diferencias y muestras anómalas. 
 
1.6.2.2.  Modelado  blando  independiente  de  analogías  de  clases  (SIMCA,  Soft 
Independent Modeling of Class Analogy). 
 
  SIMCA es un método de clasificación supervisado donde cada clase se modela 
usando  un  PCA  de  forma  independiente,  de  forma  que  cada  clase  tiene  un  modelo 
específico  que  la  describe  con  el  número  óptimo  de  PCs  [80].  De  esta  manera,  se 
puede  construir  un  “espacio  de  la  clase”,  cuya  volumen  marca  el  límite  entre  las 
muestras que son descritas por el modelo como pertenecientes a la clase estudiada y 
las  muestras  que  no  pueden  ser  consideradas  como  pertenecientes  a  ella,  para  un 
nivel de confianza seleccionado [17]. Para saber si una nueva muestra se ajusta a la 
clase,  la  información  que  se  calcula  es  dividida  en  dos,  una  parte  explicada  por  el 
modelo  de  la  clase  y  otra  que  permanece  en  los  residuales.  Si  los  residuales  de  la 

21
 
 Introducción 

muestra son significativamente mayores que los de la clase, la muestra es rechazada 
[74].  
 
  Dependiendo del programa utilizado en la construcción del modelo SIMCA, se 
pueden tener diferentes maneras de representar los resultados en la clasificación de 
las  muestras  desconocidas;  por  ejemplo,  pueden  ser  visualizados  empleando  un 
gráfico  de  Cooman,  que  muestra  la  discriminación  de  dos  clases  a  la  vez  (véase  la 
Figura  1.2).  La  distancia  desde  el  modelo  para  la  clase  1  es  representada  frente  la 
distancia  del  modelo  2,  las  distancias  críticas  son  indicadas  en  ambos  ejes.  Por  lo 
tanto,  se  definen  cuatro  zonas  en  el  gráfico:  clase  1  (I),  clase  2  (II),  una  zona  de 
confusión en la cual se superponen las clases 1 y 2 (III), y la zona de valores atípicos 
(IV).  Al  representar  las  muestras  del  conjunto  de  validación  en  este  gráfico,  es  más 
fácil evaluar qué tan certera es la clasificación. 
 

II IV

III I

 
Figura 1.2. Ejemplo de un grafico de Cooman; las líneas rojas indican las  
distancias críticas. (Imagen extraída del software The Unscrambler X). 
 
  Otra  forma  de  interpretar  los  resultados  obtenidos,  es  determinar  el  espacio 
definido por una clase dada (T2) y su espacio residual (Q), con la finalidad de evaluar si 
los valores de cada muestra predicha están mejor descritos por el espacio T2; de ser 
así, las muestras son clasificadas como miembros de la clase. 

22
 
 Introducción 

1.6.2.3. Análisis discriminante (DA, Discriminat Analysis). 
 
  El  análisis  discriminante  es  una  técnica  supervisada  de  clasificación,  es  decir, 
donde se han definido previamente el número de clases y de muestras que pertenecen 
a  cada  una  de  ellas  [63].  Cuanto  mayores  son  las  diferencias  entre  dos  clases  dadas, 
mayor es la distancia de Mahalanobis entre ellas. La discriminación de las muestras se 
consigue mediante el cálculo de la distancia de Mahalanobis de cada una de ellas a los 
centros  de  los  grupos  considerados  [95].  Una  muestra  desconocida  se  clasifica  como 
perteneciente al grupo con el cual tenga una distancia más cercana al centro [80]. El 
DA puede considerarse similar al PCA sólo en el sentido de que ambos determinan un 
hiperplano con un menor número de variables en el cual se proyectan los datos de las 
muestras  desde  un  plano  con  más  variables.  Sin  embargo,  el  PCA  selecciona  la 
dirección  que  retiene  la  máxima  estructura  entre  los  datos,  mientras  que  el  DA 
selecciona la dirección en la que se consigue una separación máxima entre los grupos 
definidos [96]. En la construcción de este modelo se debe tener en consideración que 
se requiere un mayor número de muestras que de variables. 
 
1.6.3. Métodos de regresión.  
 
  A  continuación  se  mencionan  las  técnicas  multivariables  empleadas  en  esta 
memoria  para  buscar  una  relación  entre  la  señal  analítica  y  alguna  propiedad  de  la 
muestra. 
 
1.6.3.1  Regresión  por  mínimos  cuadrados  parciales  (PLSR,  Partial  Least  Squares 
Regression). 
 
  La regresión parcial por mínimos cuadrados (PLSR) se utiliza para encontrar las 
relaciones  fundamentales  entre  las  variables  independientes  (X)  y  las  variables 
dependientes (Y), las cuales son modeladas simultáneamente teniendo en cuenta no 
sólo  la  varianza  de  X,  sino  la  covarianza  entre  X  e  Y  [90].  Entonces,  X  e  Y  se 
descomponen  simultáneamente  en  un  producto  de  otras  dos  matrices  de  scores  y 
loadings; como es descrito por las siguientes ecuaciones: 

23
 
 Introducción 

 
X = TPT + E  (1.3) 
Y = UQT+ F  (1.4) 
 
donde TPT se aproxima a los datos de la matriz X y UQT a los verdaderos valores de Y. 
La descomposición no es independiente y existe una relación lineal entre los scores T 
y  U.  Los  términos  E  y  F  de  las  ecuaciones  1.3  y  1.4  son  matrices  de  error  y  el 
superíndice T significa la transpuesta de la matriz. El algoritmo PLS trata de encontrar 
factores  (llamados  variables  latentes)  que  maximizan  la  cantidad  de  variación 
explicada en X que es relevante para la predicción de Y, es decir, capturar varianza y 
conseguir correlación [91]. 
 
1.6.3.2.  Análisis  discriminante  con  mínimos  cuadrados  parciales  (PLS‐DA,  Partial 
Least Squares ‐ Discriminat Analysis). 
 
  Es un método supervisado de análisis que se basa en la regresión en mínimos 
cuadrados parciales [96]. Las variables independientes (X) pueden ser el espectro o el 
cromatograma  de  cada  muestra,  mientras  que  la  variable  dependiente  Y  es  una 
variable  categórica,  definida  por  el  analista,  que  codifica  cada  clase  de  manera 
numérica [81]. Habitualmente, la matriz Y consta de números enteros [97].  
 
  El resultado de la regresión son valores de Y cercanos a los que indican cada 
categoría.  Una  muestra  del  conjunto  de  predicción  se  considera  que  está 
correctamente  categorizada  si  cumple  dos  criterios:  debe  tener  un  perfil 
cromatográfico o espectral que no sea significativamente diferente de los perfiles de 
las muestras que forman el conjunto de calibración y el valor calculado de la variable 
categórica debe estar dentro de un intervalo de valores alrededor del número con el 
que se codifica la categoría (cut ‐ off value). 
 
 
 

24
 
 Introducción 

1.6.4.  Resolución  multivariable  de  curvas  ‐  mínimos  cuadrados  alternados  (MCR‐

ALS, Multivariate Curve Resolution ‐ Alternating Least Squares). 
 
  El  objetivo  del  MCR  es  la  descomposición  bilineal  de  una  respuesta 
instrumental  compleja  en  las  contribuciones  vinculadas  a  cada  uno  de  los  n 
componentes  puros  en  el  sistema  bajo  estudio  [80,92],  como  se  describe  con  la 
siguiente ecuación: 
 
D = CST + E  (1.5) 
 
  En el caso de la espectroscopia NIR, por ejemplo, las filas de la matriz D son los 
espectros de las mezclas que se midieron durante el experimento, los perfiles de las 
columnas de la matriz C y los perfiles de las filas de la matriz ST están asociados con 
las  contribuciones  y  los  espectros  puros  de  los  componentes  resueltos, 
respectivamente.  El  superíndice  T  significa  la  transpuesta  de  la  matriz  S,  donde  los 
espectros puros son los perfiles contenidos en las columnas. E es una matriz de error, 
es decir, la variación residual del conjunto de datos que no se explica por el producto 
CST y por lo tanto no debería estar relacionada con ninguna contribución química. 
 
  La ecuación 1.5 puede resolverse de forma iterativa utilizando ALS, donde las 
matrices  C  y  ST son  refinadas,  tanto  como  sea  posible,  para  producir  perfiles  que  se 
ajusten a los datos experimentales de la matriz D. El proceso de optimización se inicia 
empleando un número propuesto de factores y con las estimaciones iniciales de C o 
ST; estos parámetros de entrada pueden ser obtenidos con el conocimiento previo de 
los componentes implicados o mediante el uso de otros métodos matemáticos tales 
como PCA (Principal Component Analysis) o EFA (Evolving Factor Analysis) [93,94].  
 
  Durante  la  optimización  con  ALS,  se  puede  reducir  el  número  de  posibles 
soluciones  de  la  ecuación  1.5  aplicando  una  serie  de  limitaciones  (constraints)  tales 
como  la  no  negatividad  (todos  las  contribuciones  o  espectros  tienen  valores 
positivos), unimodalidad (permite la presencia de sólo un máximo por perfil) y closure 
(con  esta  limitación,  la  suma  de  las  concentraciones  de  todas  las  especies 

25
 
 Introducción 

consideradas  se  ve  obligada  a  ser  igual  a  un  valor  constante,  es  decir,  a  la 
concentración  total).  La  convergencia  se  logra  cuando  en  dos  ciclos  de  iteraciones 
consecutivas, la diferencia relativa en la desviación estándar de los residuales que hay 
entre  los  datos  experimentales  y  los  obtenidos  con  ALS  son  menores  a  un  valor 
previamente seleccionado. 
 
1.6.5. Verificación de los modelos y selección del número de factores. 
 
  La  verificación  (también  llamada  validación)  de  un  modelo  basado  en  datos 
empíricos  significa  revisar  qué  tan  bien  se  desempeñará  cuando  sea  utilizado  en  la 
predicción de nuevas muestras, del mismo tipo que las utilizadas en su construcción; 
es  decir,  estima  la  incertidumbre  de  las  futuras  predicciones.  Si  la  incertidumbre  es 
razonablemente baja, el modelo puede ser considerado válido [80,81]. 
 
  La  verificación  de  la  bondad  del  modelo  se  puede  ensayar  sobre  un  nuevo 
conjunto de muestras, distintas de las utilizadas en la construcción del mismo (llamado 
conjunto  de  prueba,  test  set)  o  mediante  un  sistema  de  validación  cruzada  (cross‐
validation).  Con  el  método  de  la  validación  cruzada,  las  mismas  muestras  se  utilizan 
tanto para la estimación del modelo, como para su evaluación. Unas cuantas muestras 
quedan fuera del conjunto de calibración y se construye un modelo con las muestras 
restantes.  Entonces,  son  predichas  las  muestras  que  han  quedado  fuera  de  la 
calibración  y  se  calculan  los  residuales  de  predicción.  El  proceso  se  repite  con  otro 
subconjunto  de  muestras  del  conjunto  de  calibración,  y  así  sucesivamente  hasta  que 
todos los objetos se ha dejado fuera una vez [80]. A partir de la validación cruzada se 
pueden calcular figuras de mérito para evaluar cómo se comporta el modelo cuando se 
aplica a nuevos datos y también se puede determinar el número óptimo de factores a 
incluir (componentes principales para un PCA o variables latentes en un PLS) [82]. Los 
nombres de las figuras de mérito obtenidas, en la validación cruzada y en la predicción 
de un conjunto de muestras independiente, varían entre los diferentes programas de 
quimiometría; en este trabajo, se han utilizado los siguientes: 
 

26
 
 Introducción 

 Raíz del error cuadrático medio de calibración (RMSEC, root mean square error 
of  calibration),  nos  proporciona  información  sobre  el  ajuste  del  modelo  a  los 
datos  de  calibración;  es  una  medida  de  lo  bien  que  se  ajusta  el  modelo  a  los 
datos. 
 Raíz del error cuadrático medio de la validación cruzada (RMSECV, root mean 
square  error  of  cross‐validation),  que  es  una  medida  de  la  capacidad  de  un 
modelo  para  predecir  las  muestras  que  no  fueron  utilizadas  para  construirlo 
durante el procedimiento de validación cruzada.  
 Raíz del error cuadrático medio de predicción (RMSEP, root mean square error 
of  prediction),  nos  da  información  sobre  el  ajuste  del  modelo  a  los  datos  de 
predicción.  Son  utilizadas  las  muestras  de  validación  preparadas  y  medidas 
independientemente  de  las  muestras  de  calibración;  es  decir,  que  no  fueron 
empleadas en la construcción del modelo o en la validación cruzada. 
 
  El parámetro PRESS (Prediction Sum of Squares) es la suma del cuadrado de los 
residuales  utilizando  un  modelo  construido  con  un  determinado  número  de 
componentes principales o variables latentes. El PRESS se representa gráficamente en 
función  del  número  de  factores  y  sirve  como  ayuda  para  la  selección  del  número 
óptimo  de  componentes  en  el  modelo.  El  error  del  modelo  debería  decrecer  en  la 
medida  en  que  se  incluyen  factores  que  describen  grandes  cantidades  de  varianza 
sistemática, y debería aumentar al incluir factores que describen ruido; es decir, que 
sólo  describen  una  pequeña  cantidad  de  varianza.  Se  debe  seleccionar  el  número  de 
factores donde el error del modelo sea mínimo [81,82]. 
 
  Hay  otras  maneras  de  seleccionar  el  número  adecuado  de  factores  para  un 
modelo.  Algunos  programas  proporcionan  las  curvas  de  varianza  explicada  (o  las 
curvas de varianza residual), tanto para la calibración como para la predicción obtenida 
por  la  validación  cruzada;  el  usuario  debe  comparar  dichas  curvas  para  elegir  el 
número de factores. 

27
 
 Introducción 

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31
 
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32
 
 Introducción 

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Sons, Ltd: 2007; pp 145‐191.  
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33
 
 Introducción 

(97)  Liu,  F.;  He,  Y.  Classification  of  brands  of  instant  noodles  using  Vis/NIR  spectroscopy  and 
chemometrics. Food Res. Int. 2008, 41, 562‐567.  
 

34
 
  
 
 
2 
 
Objetivos. 
 
 
 Objetivos 

 
  La eficacia de gran cantidad de productos fitoterapéuticos ha sido demostrada 
desde  el  punto  de  vista  científico;  sin  embargo,  para  asegurar  la  efectividad  es 
necesario  que  cada  medicamento  de  plantas  medicinales  cumpla  con  una  serie  de 
requisitos que garanticen su calidad y seguridad. Mientras que en países de la Unión 
Europea, el simple procedimiento de registro de productos fitoterapéuticos implica un 
estricto  control  de  calidad,  en  países  en  desarrollo  la  situación  es  completamente 
contraria.  No  obstante,  tanto  en  países  desarrollados  como  en  desarrollo,  siguen 
apareciendo  reacciones  adversas  por  el  consumo  de  suplementos  dietéticos 
elaborados  a  base  de  plantas  medicinales  y  los  informes  en  la  literatura  señalan  la 
mala  calidad  de  una  gran  parte  de  los  productos  de  origen  herbolario  que  están 
disponibles  en  el  mercado.  Realizar  el  control  de  calidad  en  productos  de  origen 
herbolario  no  es  tarea  fácil,  por  lo  complejo  de  la  matriz  y  por  la  gran  cantidad  de 
componentes  que  presentan  este  tipo  de  muestras.  Por  ello  la  OMS  recomienda 
utilizar los perfiles cromatográficos y espectroscópicos y hoy en día la construcción de 
huellas  dactilares  es  una  de  las  aproximaciones  más  poderosas  para  el  control  de 
calidad  de  plantas  medicinales,  aunque  para  poder  manejar  los  resultados  obtenidos 
es  imprescindible  aplicar  herramientas  quimiométricas.  Además,  el  correlacionar  la 
información obtenida de las huellas dactilares de las plantas y la actividad biológica, lo 
que  se  puede  traducir  en  eficacia  de  las  mismas,  es  uno  de  los  requerimientos  de 
investigación urgentes para el control de calidad de productos fitoterapéuticos. 
 
  Todo ello conlleva a que se haya realizado esta Tesis Doctoral con los siguientes 
objetivos: 
 
2.1. Objetivo General. 
 
  Establecer  métodos  de  control  de  calidad  para  plantas  con  uso  medicinal  a 
partir  del  tratamiento  de  sus  perfiles  cromatográficos  o  espectroscópicos  (huellas 
dactilares) con técnicas quimiométricas. 
 
 

37
 
 Objetivos 

2.2. Objetivos Específicos. 
 
1) Obtener el perfil cromatográfico o  espectroscópico de las plantas medicinales 
seleccionadas: Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Valeriana officinalis 
y Turnera diffusa. 
 
2) Pre‐tratamiento  de  los datos  obtenidos  en  el  objetivo  1  y construcción  de  los 
modelos quimiométricos cualitativos, semi‐cuantitativos o cuantitativos. 
 
3) Comparar  los  métodos  quimiométricos  desarrollados  y  seleccionar  el  más 
adecuado  para  el  control  de  calidad  de  cada  una  de  las  plantas  medicinales 
elegidas. 
 
4) Correlacionar,  en  su  caso,  la  información  obtenida  de  la  huella  dactilar  de  la 
planta con la actividad biológica. 
 

38
 
  
 
 
3 
 
Eleutherococcus senticosus. 
 
 
 Eleutherococcus senticosus 

3.1. Introducción. 
 
3.1.1. Descripción de la planta medicinal. 
 
  Eleutherococcus  senticosus  (Rupr.  y  Maxim.)  Maxim.  también  conocido  como 
Acanthopanax  senticosus,  ciwujia  o  ginseng  siberiano,  es  un  arbusto  espinoso  que 
pertenece a la familia Araliaceae, que crece en Siberia y partes del noreste de China y 
Corea [1‐3]. En las últimas tres décadas ha habido un creciente interés en esta planta 
debido  al  amplio  espectro  de  propiedades  terapéuticas  de  sus  raíces  y  rizomas;  que 
incluyen  efectos  anticancerígeno,  antioxidante,  antibacterial,  antiviral, 
hipocolesterolémico,  actividades  antiinflamatoria  e  inmunoestimulante, 
hipoglucemiante  y  propiedades  adaptogénicas  [1,2,4].  A  pesar  de  que  la  acción 
farmacológica de E. senticosus podría parecerse a la de Panax ginseng y de que ambos 
son de la familia Araliaceae, su composición química es muy diferente y por lo tanto no 
pueden  ser  utilizados  de  manera  intercambiable.  Los  compuestos  aislados  en 
Eleutherococcus  son  de  grupos  químicos  muy  variados  e  incluyen  fenilpropanoides, 
lignanos, saponinas, cumarinas, el ácido betulínico triterpeno, provitaminas, vitaminas 
y otros compuestos que, aún hoy, están sin identificar o sin nombre [1]. Componentes 
característicos de esta planta son los eleuterósidos, compuestos heterogéneos que son 
responsables,  en  cierta  medida,  de  sus  actividades  biológicas.  El  eleuterósido  E 
(siringinoresinol  diD‐glucósido,  un  lignano)  y  eleuterósido  B  (siringina,  un 
derivado  de  fenilpropano)  se  han  propuesto  como  los  compuestos  marcadores  en  la 
identificación y el análisis de E. senticosus [5]. 
 
3.1.2. Problemática con el control de calidad del Eleutherococcus senticosus. 
 
  Davydov  et  al.  han  descrito  problemas  de  nomenclatura  e  identidad  de  E. 
senticosus  debido  a  la  ubiquidad  de  los  compuestos  marcadores  seleccionados  en  su 
control  de  calidad  [1].  Por  otra  parte,  algunos  productores  sin  escrúpulos 
continuamente están tratando de desarrollar maneras para obtener un perfil químico 
de  sus  productos  similar  al  perfil  auténtico  presentado  por  la  planta  medicinal  en 
cuestión. En estas circunstancias específicas, el uso de compuestos marcadores no sólo 

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 Eleutherococcus senticosus 

es incapaz de confirmar la identidad de una planta concreta, sino que también podría 
ignorar  la  influencia  de  otros  componentes  químicos  de  origen  intrínseco  y,  por  lo 
tanto, en algunos casos, su uso puede ser inadecuado para los propósitos de control de 
calidad  [6,7].  Además,  sería  deseable  que  el  tiempo  del  análisis  fuera  lo  más  corto 
posible,  aunque  como  la  mayoría  de  estos  procedimientos  se  basan  en  aplicaciones 
cromatográficas son bastante lentos, por ejemplo, la determinación de eleuterósidos 
puede  tardar  de  35  ‐  40  min  por  análisis  sin  incluir  la  preparación  de  las  muestras 
[2,5,8]. 
 
3.1.3. Descripción del estudio.  
 
  En  este  estudio  se  ha  propuesto  un  procedimiento  para  una  rápida 
identificación  de  las  raíces  de  E.  senticosus  empleando  huellas  dactilares  obtenidas 
mediante  la  espectroscopia  de  infrarrojo  cercano  (NIR).  El  procedimiento  de 
preparación de la muestra es simple; sólo es necesario moler y tamizar la muestra para 
registrar los espectros. De esta manera, en lugar de un análisis cromatográfico largo, 
puede  lograrse  en  unos  pocos  minutos  un  examen  rápido  por  espectroscopia  NIR, 
incluyendo la preparación de la muestra sin el uso de disolventes [9]. La complejidad 
de  los  espectros  NIR  requiere  el  uso  de  quimiometría  para  extraer  y  visualizar  la 
información  analítica  útil;  así,  se  han  utilizado  y  comparado  el  PCA  (principal 
component analysis), el método SIMCA (soft independent modeling of class analogy), 
el DA (discriminant analysis) y el PLS‐DA (partial least squares ‐ discriminant analysis). 
Por lo que sabemos, sólo hay un informe de uso de la espectroscopia molecular (FT‐IR) 
para el establecimiento de huellas dactilares de E. senticosus [10], por lo que decidió 
investigar este tema. 
 
3.2. Metodología específica. 
 
3.2.1. Descripción de las muestras. 
 
  Con  el  fin  de  incluir  la  mayor  variabilidad  posible  en  las  muestras, 
independientemente  de  su  origen  geográfico,  las  muestras  fueron  recolectadas  de 

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varios proveedores durante los años 2007‐2009. Las raíces de E. senticosus (ES), Panax 
ginseng  (PG),  Panax  quinquefolium  (PQ),  Panax  notoginseng  (PN),  Lepidium  meyenii 
(LM),  Withania  somnifera  (WS),  Angelica  sinensis  (AS),  Pfaffia  paniculata  (PP)  y 
jengibre  (una  especia  de  cocina  con  propiedades  estimulantes  [G])  fueron  obtenidas 
de  Amorós  Nature  (Girona,  Catalunya,  España),  Galke  (Gittelde,  Alemania),  Richters 
(Ontario,  Canada),  Desert  Botanicals  (Gilbert,  AZ,  EE.UU.),  Frontier  Natural  Products 
Co‐op  (Norway,  IA,  EE.UU.),  MaxNature  (Los  Angeles,  CA,  EE.UU.),  Modern  Jungle 
(EE.UU.) y herboristerías de la zona metropolitana de Barcelona (España) y la ciudad de 
Monterrey (México). Varios proveedores autenticaron sus productos y proporcionaron 
un  certificado  de  identidad.  Por  lo  tanto,  el  conjunto  de  muestras  consistió  en 
miembros de la familia Araliaceae (ES, PG y PQ), y otros tipos de plantas que no están 
relacionados  con  Araliaceae,  que  son  llamados  "ginseng"  de  forma  genérica.  En  la 
Tabla 3.1 se presenta un resumen de las muestras en estudio.  
 
Tabla 3.1. Resumen de las muestras y conjuntos de espectros. 
Muestras    Lotes    Número de espectros en 
    SIMCA, 
Número  PLS‐DA, DA 
ID a  Origen b  QS c  NSSQC d  PCA f   
Total e 
CS g  PS g 
                     
ES  CA,  DE,  ES,   
5  15  20  45  42  18 
MX, US 
PG  DE, ES, US    3  5  10  21  21  9 
LM  DE, ES, US    3  3  5  12  0  15 
PQ  CA, US    3  3  4  9  12  0 
AS  ES, US    2  2  4  9  0  12 
WS  DE, US    3  3  4  9  0  12 
PP  DE, US    3  3  3  6  0  9 
PN  US    1  1  1  3  0  3 
Jengibre  US    0  0  1  3  0  3 
                     
a
  Identidad:  ES,  Eleutherococcus  senticosus;  PG,  Panax  ginseng;  PQ,  Panax  quinquefolium;  PN,  Panax 
notoginseng;  AS,  Angelica  sinensis;  LM,  Lepidium  meyenii;  PP,  Pfaffia  paniculata  and  WS,  Withania 
somnifera. 
b
 CA, Canadá; DE, Alemania; ES, España; MX, México and US, Estados Unidos.  
c
 Proveedores de calidad; número de proveedores con una certificación de calidad. 
d
 Número de muestras procedentes de proveedores con alguna certificación de calidad. 
e
  Diferentes  lotes  de  plantas  adquiridos  de  varios  proveedores  y  herboristerías  en  tres  años  (es  decir, 
todas las muestras proceden de diferentes lotes, proveedores o años). 
f
 Número de espectros empleados para construir un modelo de PCA global (N.B. éste no es el modelo 
empleado para la reducción de variables en el análisis discriminante). 
g
 Número de espectros empleados en el conjunto de calibración (CS) o en el conjunto de predicción (PS) 
para la construcción y evaluación de los modelos de clasificación. 

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 Eleutherococcus senticosus 

  Las  raíces  se  utilizaron  tal  como  fueron  adquiridas;  es  decir,  no  fue  aplicado 
ningún  secado  adicional  en  el  laboratorio  para  evitar  la  modificación  de  sus 
características originales y posibles cambios en la composición química. Las muestras 
recibidas  como  raíces  enteras  o  troceadas  se  molieron  en  un  molinillo  Turmix  Mill 
(Barcelona, España) y luego fueron sometidas a un tamizado por vibración empleando 
una tamizadora RP‐15 (CISA, Barcelona, España). Las muestras recibidas en forma  de 
polvo  se  tamizaron  directamente.  En  todos  los  casos,  fue  obtenido  un  polvo  con  un 
tamaño  de  partícula  igual  o  inferior  a  100  m.  Además,  como  parte  del  conjunto  de 
predicción,  se  prepararon  en  el  laboratorio  diez  mezclas  sintéticas,  mezclando 
diferentes  cantidades  de  las  plantas  en  estudio  con  muestras  de  E.  senticosus;  estas 
mezclas contenían finalmente 5%, 10% o 20% del adulterante seleccionado. En la Tabla 
3.2 se presenta la composición de cada muestra adulterada. 
 
Tabla 3.2. Composición de las mezclas sintéticas. 
Adulterante   ES  
Mezcla no. a  Identidad del adulterante 
(%) b  (%) b 
       
1  P. ginseng  5  95 
2  P. quinquefolium  5  95 
3  P. notoginseng  5  95 
4  Jengibre  5  95 
5  P. ginseng  10  90 
6  L. meyenii  10  90 
7  A. sinensis  10  90 
8  P. ginseng  20  80 
9  W. somnifera  20  80 
10  P. paniculata  20  80 
       
  a
 Cada mezcla fue preparada por triplicado y se registró el espectro de cada replicado. 
b
   Porcentajes por pesada. Peso total de 3 g. 
 
3.2.2. Análisis espectroscópico en el infrarrojo cercano. 
 
  Se  registraron  los  espectros  NIR  utilizando  un  espectrómetro  con 
monocromador  de  barrido  NIRSystems  modelo  5000  (Foss  NIRSystems,  Silver  Spring, 
MD),  equipado  con  un  módulo  RCA  (Rapid  Content  Analyzer),  una  lámpara  halógena 
de cuarzo y un detector de sulfuro de plomo. Los espectros fueron obtenidos en modo 
de reflectancia sobre la región espectral de 1100 ‐ 2498 nm con una resolución de 2 

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 Eleutherococcus senticosus 

nm,  empleando  como  referencia  un  patrón  interno  de  cerámica,  que  viene  provisto 
con  el  instrumento.  La  lectura  de  las  muestras  se  realizó  en  una  cubeta  de  muestra 
circular  de  vidrio  (40  mm  de  diámetro  y  10  mm  de  espesor)  llena  hasta  el  borde.  Se 
aplicó  un  peso  constante  de  100  g  durante  aproximadamente  30  segundos  en  la 
muestra  con  el  fin  de  obtener  una  compactación  del  polvo  relativamente  constante. 
Cada  muestra  se  midió  por  triplicado,  empleando  tres  porciones  de  muestra 
procesadas  de  forma  independiente,  donde  cada  espectro  fue  el  promedio  de  64 
barridos sucesivos (obteniendo 700 datos por barrido). El control del espectrómetro y 
la manipulación de los archivos espectrales se realizaron utilizando el software Vision, 
versión 2.51, de NIRSystems Foss. Los datos de reflectancia fueron almacenados como 
el  recíproco  del  logaritmo  de  la  reflectancia,  log  (1  /  R).  Se  revisó  todos  los  días  de 
trabajo el buen funcionamiento del instrumento utilizando las opciones de diagnóstico 
proporcionados por el fabricante del mismo.  
 
3.2.3. Análisis multivariante. 
 
  Los  espectros  sin  tratar  fueron  exportados  desde  el  programa  Vision  como 
archivos NSAS para el análisis de datos. La construcción de los modelos de PCA, SIMCA 
y  PLS‐DA  fue  realizada  utilizando  el  programa  Unscrambler  (v  9.8;  CAMO,  Oslo, 
Noruega),  mientras  que  el  DA  se  llevó  a  cabo  con  el  programa  SPSS  (v  18.0,  IBM,  IL, 
EE.UU.). Con el fin de minimizar el efecto de dispersión de la radiación, los espectros 
necesitan  ser  pre‐tratados;  con  este  fin  se  ensayaron  los  pre‐tratamientos  de  SNV 
(standard normal variate), primera y segunda derivada [11]. Las principales bandas de 
absorción debidas al agua fueron eliminadas para reducir la influencia de la humedad 
en los espectros NIR [12]. 
 
  El PCA es a menudo el primer paso para el análisis de los espectros obtenidos 
con  el  fin  de  detectar  patrones  en  las  muestras  registradas  empleando  NIR.  En  este 
caso  se  utilizó  con  el  fin  de  examinar  los  agrupamientos  naturales  de  las  plantas  en 
estudio,  la  detección  de  muestras  anómalas,  así  como  para  desarrollar  el  método 
SIMCA y realizar el DA en las componentes principales (PCs) que explican más varianza 
del sistema. 

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 Eleutherococcus senticosus 

  Los  resultados  del  método  SIMCA  fueron  visualizados  utilizando  el  gráfico  de 
Cooman, que muestra la discriminación entre dos clases; al representar las muestras 
del  conjunto  de  validación  en  este  gráfico,  es  más  fácil  evaluar  qué  tan  certera  es  la 
clasificación. 
 
  En este estudio se utilizó el DA para discriminar E. senticosus (grupo 1), de los 
otros  miembros  de  la  familia  Araliaceae,  Panax  ginseng  (grupo  2)  y  Panax 
quinquefolium (grupo 3) y de otras plantas que pudieran ser confundidas con ginseng. 
El  DA  requiere  un  mayor  número  de  muestras  que  de  variables;  por  esta  razón,  se 
realizó previamente un PCA y el DA fue realizado utilizando los scores de las primeras 
componentes principales, las que contienen la mayor parte de la información útil del 
sistema estudiado. Las reglas de clasificación se elaboraron utilizando únicamente las 
plantas de los grupos 1 – 3. 
 
  Para  la  construcción  del  modelo  de  PLS‐DA,  se  asignaron  a  las  muestras  del 
conjunto de calibración dos variables indicando  la categoría de las mismas: 1 para E. 
senticosus  y  0  para  otras  plantas.  Se  considera  que  una  muestra  del  conjunto  de 
predicción  está  correctamente  clasificada  si  su  valor  calculado  está  dentro  de  un 
intervalo de valores calculado a partir de los valores experimentales. El número óptimo 
de factores se determinó con el criterio del valor mínimo de PRESS (prediction sum of 
squares) [13]. Como figuras de mérito de los modelos construidos, fueron evaluados el 
RMSEC,  el  RMSEP  y  el  coeficiente  de  determinación  r2.  En  la  construcción  de  los 
modelos  de  calibración  de  PCA  y  PLS‐DA,  fue  utilizada  la  validación  cruzada  (CV), 
empleando tres muestras por segmento y estableciendo la selección de muestra como 
aleatoria. La comparación de los resultados obtenidos con SIMCA, PLS‐DA y DA se hizo 
en  términos  de  sensibilidad,  especificidad,  la  tasa  general  de  éxito  en  la  clasificación 
(GSR) y el porcentaje de mezclas clasificadas correctamente (MCC). 
 
 
 
 
 

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 Eleutherococcus senticosus 

3.3. Resultados y discusión. 
 
3.3.1. Características de los espectros de infrarrojo cercano. 
 
  Las  moléculas  poliatómicas  presentes  en  la  matriz  de  las  plantas  medicinales 
exhiben múltiples vibraciones armónicas y de combinación, haciendo que sus bandas 
espectrales se superpongan. Como resultado, se pueden observar bandas espectrales 
muy  amplias  y  sin  rasgos  distintivos;  las  Figuras  3.1a  y  3.1b  presentan  espectros 
registrados.  
 
  No  obstante,  los  espectros  NIR  contienen  información  molecular  de  las 
muestras,  y  esta  información  puede  ser  extraída  por  medio  de  métodos 
quimiométricos. Las bandas de humedad originadas por el enlace O‐H, se encuentran 
alrededor de 1350 nm y 1950 nm, que son respectivamente bandas de armónicos y de 
combinación. Con el fin de excluir a estas bandas del análisis, las longitudes de onda 
comprendidas  de  1306  a  1396  nm  y  de  1846  a  2016  nm,  fueron  excluidas  en  el  pre‐
tratamiento  y  la  construcción  del  modelo  matemático.  Es  evidente  que  no  se  puede 
realizar la identificación de la especie de la planta a través de la inspección visual los 
espectros.  Aparecen  algunas  diferencias  en  los  espectros  a  longitudes  de  onda  por 
encima de 2050 nm; sin embargo, también sufren un efecto relativamente importante 
de dispersión. Aunque no son visualmente perceptibles, existen diferencias en todo el 
espectro, por lo que se pueden construir los modelos de clasificación utilizando todas 
las longitudes de onda que quedan.  
 
  De todos los pre‐tratamientos ensayados, el SNV efectuó la mejor corrección de 
los  artefactos  espectrales  y  produjo  los  modelos  más  sencillos,  por  lo  que  este  pre‐
tratamiento fue seleccionado para ser aplicado en el resto del estudio. 
 
 
 
 
 

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 Eleutherococcus senticosus 

 
Figura 3.1. (a) Espectros de infrarrojo cercano de los miembros de la familia Araliaceae y (b) 
plantas no relacionadas. (c) Representación de los scores de la PC1 vs. PC2 de un PCA global, 
presentando  la  elipse  de  confianza  al  95%.  (d)  Gráfico  de  influencia;  las  muestras  anómalas 
presentan valores altos de leverage y de varianza residual. En (c) y (d), se señalan las muestras 
sospechosas de ser anómalas. 
 

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 Eleutherococcus senticosus 

3.3.2. Estudio del agrupamiento natural de las muestras. 
 
Se  realizó  un  PCA  global  empleando  algunas  muestras  de  cada  tipo  de  planta 
(véase la Tabla 3.1). El conjunto de calibración incluyó 117 espectros, tomados al azar 
de  los  156  espectros  disponibles  para  ser  evaluados;  excluyendo  las  mezclas 
preparadas en el laboratorio. Este conjunto de calibración, que incluyó todos los tipos 
de  plantas,  nos  permitió  examinar  la  presencia  de  pautas.  Las  otras  muestras  se 
utilizaron para construir el conjunto de predicción y, posteriormente, fueron utilizadas 
como muestras externas (es decir, objetos completamente nuevos no utilizados en el 
desarrollo  del  modelo).  El  modelo  de  PCA  fue  construido  empleando  4  PCs, 
presentando  una  varianza  explicada  del  97.90%.  La  capacidad  del  modelo  en  la 
predicción de nuevos objetos se evaluó por medio de la varianza explicada obtenida de 
la  validación  cruzada,  la  cual  presentó  un  valor  de  97.76%,  lo  que  indica  una  buena 
capacidad  predictiva.  Los  elevados  valores  de  varianza  explicada  alcanzados  en  la 
calibración y la validación del modelo, así como la pequeña diferencia que presentan 
entre  ellos,  sugiere  que  el  sistema  no  se  ve  afectado  de  forma  importante  por 
muestras  anómalas.  En  el  gráfico  de  scores  se  pueden  observar  las  pautas  de 
agrupación de acuerdo con la especie de planta (Figura 3.1c). La primera componente 
principal separó el E. senticosus de otras especies, al posicionar este grupo en valores 
positivos de scores mientras que la mayoría de las otras muestras se ubican en valores 
negativos.  Las  muestras  de  P.  paniculata  fueron  las  más  cercanas  al  grupo  del  E. 
senticosus. Las fronteras del grupo E. senticosus parecen estar bien definidas, sólo una 
muestra apareció a una distancia moderada del grupo.  
 
  Así, parece posible la identificación de E. senticosus frente a otras especies de 
plantas,  independientemente  si  están  o  no  relacionadas  con  la  familia  Araliaceae.  La 
muestra sospechosa ubicada entre los valores de score 4 y 5 de PC1, la muestra ES23, y 
aquéllas  fuera  de  la  elipse  de  confianza  del  95%  (AS18,  AS41)  fueron  examinadas 
usando  el  gráfico  de  influencia,  con  el  fin  de  decidir  si eran  o  no  muestras  anómalas 
(Figura 3.1d). A partir de la figura se determinó que la muestra ES23 era una muestra 
anómala evidente. Tomar una decisión para las otras muestras sospechosas (G, AS18 y 
AS41)  fue  más  complicado.  Aunque  se  sospechaba  que  estas  muestras  podrían  ser 

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 Eleutherococcus senticosus 

anómalas, fueron conservadas ya que son descritas correctamente por el modelo, tal 
como  se  puede  observar  del  análisis  de  los  residuales  y  de  las  distancias  que 
presentaron al modelo construido. El comportamiento presentado por la muestra ES23 
se debió a longitudes de onda que estaban por encima de 2200 nm. 
 
  Al  igual  que  con  todos  los  métodos  no  supervisados  de  clasificación,  el  PCA 
proporciona un panorama general para explicar las pautas de las muestras estudiadas, 
pero la asignación de nuevas muestras a una clase puede ser una tarea difícil con este 
método, ya que no calcula una regla que defina fronteras o regiones que diferencien 
entre  los  grupos  de  muestras  en  estudio.  Por  lo  tanto,  fueron  empleados  métodos 
supervisados con el fin de lograr una clasificación más objetiva. 
 
3.3.3. Modelado blando independiente de analogías de clases (SIMCA). 
 
  Como  las  muestras  de  la  familia  Araliaceae  tienen  espectros  similares, 
consideramos  apropiado  estudiar  la  posibilidad  de  que  las  muestras  de  E.  senticosus 
(ES)  fueran  mal  clasificadas  en  las  clases  P.  ginseng  (PG)  y  P.  quinquefolium  (PQ).  En 
consecuencia, para la construcción del modelo SIMCA se consideraron tres clases: ES, 
PG y PQ. El número de espectros empleados en cada clase, se indica en la Tabla 3.1. El 
número  de  componentes  principales  necesarias  para  definir  adecuadamente  cada 
clase fueron de 6, 4 y 3, respectivamente, presentando en todos los casos una varianza 
explicada > 97%, obtenida mediante la validación cruzada. Todas las variables incluidas 
en la construcción del modelo SIMCA exhibieron una buena capacidad de modelado y 
de  discriminación.  Adicionalmente,  las  distancias  presentadas  entre  los  modelos  de 
PCA  de  cada  clase  fueron  grandes,  indicando  que  hubo  una  buena  resolución  entre 
ellas. En la Figura 3.2a se presenta un gráfico de Cooman, que muestra la distancia de 
las  muestras  de  validación  con  respecto  a  las  clases  del  E.  senticosus  y  P.  ginseng.  A 
partir de esta gráfica llegamos a la conclusión de que las muestras de validación de E. 
senticosus tienen una buena probabilidad de ser asignadas a la clase correcta, dentro 
de un nivel de significación del 5%. 

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 Eleutherococcus senticosus 

 
Figura 3.2. (a) Gráfico de Cooman que presenta la distancias ortogonales de las muestras de 
validación  a  las  clases  (modelos)  del  E.  senticosus  y  el  P.  ginseng.  (b)  Leverage  (distancia  al 
centro del modelo de E. senticosus) vs. distancia de la muestra a la clase del E. senticosus. En 
(a) y (b) fue marcada con un circulo la muestra anómala ES23. (c) Ampliación del recuadro. 

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 Eleutherococcus senticosus 

  Como  era  de  esperar,  la  muestra  ES23  estaba  más  lejos  de  la  clase 
correspondiente que otras muestras de E. senticosus, lo cual es un resultado coherente 
con  las  observaciones  realizadas  en  los  scores  y  loadings  obtenidos  del  PCA  global 
realizado previamente. En ningún caso las muestras de E. senticosus estuvieron cerca 
de la clase PG o de la clase PQ; además, ninguna muestra de P. ginseng empleada en la 
validación  presentó  proximidad  a  la  clase  del  E.  senticosus.  Esta  comprobación 
cruzada, permitió confirmar la correcta asignación de clase entre los miembros de la 
familia Araliaceae. 
 
  La  clasificación  final  de  las  muestras  del  conjunto  de  predicción  fue  realizada 
con  el  gráfico  de  la  distancia  de  la  muestra  a  la  clase  del  E.  senticosus  y  el  leverage 
(Figura  3.2b).  Como  era  de  esperar,  todas  las  muestras  de  E.  senticosus  estuvieron 
dentro de los límites de clasificación, y la muestra ES23 fue excluida correctamente de 
la  clase.  El  resto  de  las  otras  especies  de  plantas  en  estudio  excedieron  los  valores 
límite  de  clasificación,  claramente  indicando  que  no  pertenecen  a  la  clase  del  E. 
senticosus. 
 
  La  semejanza  a  E.  senticosus  presentada  por  las  plantas  estudiadas,  expuesta 
en  orden  decreciente,  es  como  sigue:  PP,  PN,  WS,  PG,  LM  and  AS.  Esta  información 
también está de acuerdo con los resultados obtenidos en el PCA. Los resultados para 
las  mezclas  preparadas  en  el  laboratorio  se  muestran  en  la  Figura  3.2c,  las  muestras 
clasificadas como E. senticosus están dentro del cuadrado formado por los límites y los 
ejes. Las últimas cuatro mezclas de la Tabla 3.2 fueron excluidos por el modelo de la 
clase ES, por lo que es posible detectar muestras adulteradas, con certeza, desde un 
20%  de  adulterante.  A  pesar  de  que  la  mezcla  siete  se  preparo  con  un  10%  de  otra 
especie de planta y se identificó como adulterada, SIMCA no pudo detectar las mezclas 
cinco y seis, que presentan la misma proporción de adulterante. Los resultados de la 
mezcla siete podría atribuirse a la especie de planta utilizada, ya que AS es el producto 
más diferente a E. senticosus y es fácilmente discriminado por el modelo. En resumen, 
sólo es posible detectar mezclas que tengan alrededor de un 20% de contaminante. 
 
 

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 Eleutherococcus senticosus 

Tabla 3.3. Resultados obtenidos en la clasificación con los modelos construidos. 
Clasificado en b
Tipo de  a  Sensibilidad  Especificidad  MCC  GSR 
Modelo   n  Clase  Clase 
Muestra  (%)  (%)  (%)   (%)  
ES  NOES 
                 
SIMCA                84 
  ES   15  15  0  100       
  OHPs   66  0  66    100     
  Mezclas  30  18  12      40   
                 
                 
PLS‐DA                92 
  ES   15  11  4  73       
  OHPs   66  0  66    100     
  Mezclas  30  5  25      83   
                 
                 
DA                70 
  ES  15  15  0  100       
  OHPs   66  3  63    96     
  Mezclas  30  30  0      0   
                 
a
 Número de espectros en el conjunto de prueba (PS).  
b
 Clase ES, muestras que pertenecen a la clase E. senticosus; 
Clase NOES, muestras que no pertenecen a la clase E. senticosus. 

 
  La  Tabla  3.3  recoge  los  resultados  generales  obtenidos  con  SIMCA.  La  tasa 
general de éxito en la clasificación (GSR) representa el porcentaje total de las muestras 
correctamente  clasificadas.  Utilizando  SIMCA  se  obtuvo  un  valor  de  GSR  bastante 
bueno,  sólo  disminuido  a  causa  de  mezclas  con  cantidades  de  adulterante  que  eran 
inferiores  al  20%.  El  porcentaje  de  mezclas  correctamente  clasificadas  (MCC)  es  el 
porcentaje  de  mezclas  clasificadas  como  ajenos  a  la  clase  E.  senticosus.  Dos 
parámetros  relacionados  afectan  a  este  valor,  el  producto  herbal  utilizado  para 
preparar las mezclas y la cantidad mínima de adulterante discriminada por el modelo. 
La  sensibilidad  es  la  proporción  de  muestras  que  pertenecen  a  la  clase  E.  senticosus 
que fueron correctamente identificadas por el modelo matemático. La especificidad es 
la  proporción  de  muestras  que  no  pertenecen  a  la  clase  E.  senticosus  que  fueron 
identificadas como extrañas por el modelo (aquí denotadas de manera general como 
OHPs, otros productos herbales). Estos dos criterios son similares a los propuestos por 
Lau, et al. [14]. El valor de sensibilidad obtenido indica que hay una probabilidad muy 
pequeña  de  obtener  un  falso  negativo  al  realizar  la  prueba  de  identidad  usando  el 

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 Eleutherococcus senticosus 

modelo  construido.  Además,  de  acuerdo  con  la  especificidad,  los  OHPs  en  todos  los 
casos serian excluidos de la clase del E. senticosus. 
 
3.3.4. Análisis discriminante con mínimos cuadrados parciales (PLS‐DA). 
 
  Las  variaciones  en  las  variables  espectrales  (X)  y  las  variables  categóricas  (Y) 
fueron descritas por tres variables latentes (LVs), presentando una varianza explicada 
de  94.75%  y  96.59%,  respectivamente,  obtenida  por  la  validación  cruzada.  Este 
número relativamente pequeño de LVs sugiere una baja correlación en los espectros 
de diferentes clases, pero similitudes en los espectros dentro de las clases. Además, el 
bajo  número  de  LVs  proporciona  una  indicación  de  la  buena  diferenciación  entre  las 
clases construidas. Estas suposiciones fueron confirmadas mediante la inspección del 
gráfico  de  scores,  donde  sólo  fue  necesaria  la  LV1  para  lograr  una  separación  de  la 
clase ES de las otras dos. No hubo presencia de muestras anómalas en el conjunto de 
calibración,  de  acuerdo  a  lo  observado  en  un  grafico  de  leverage  vs.  la  varianza 
residual de las variables X. En la Figura 3.3a, se presenta un gráfico de los valores Y de 
referencia  vs.  los  valores  Y  calculados  por  el  modelo  (predicción  de  la  validación 
cruzada), para todas las muestras de la clase ES. La línea de regresión obtenida en la 
predicción de las muestras utilizadas en la calibración, mostró una pendiente de 0.982, 
una ordenada de 0.011 y r2 = 0.983. Así mismo, el RMSECV no superó el valor de 0.07 
(unidades arbitrarias, au). Considerando estos  resultados, se concluyó que el modelo 
PLS‐DA desarrollado es útil para clasificar las nuevas muestras del conjunto externo de 
predicción. 
 
Para  ser  clasificada  correctamente,  una  muestra  debe  cumplir  dos  criterios: 
debe tener un espectro que no sea significativamente diferente de los espectros de las 
muestras que forman el conjunto de calibración y el valor de la variable categórica Y 
calculada, ha de caer dentro de un cierto intervalo de aceptación, calculado a partir de 
los resultados experimentales. 
 

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 Eleutherococcus senticosus 

 
Figura 3.3. (a) Gráfico de los valores Y de referencia vs. los valores Y calculados; se presentan 
las líneas de regresión para la calibración y la validación. Las líneas discontinuas muestran el 
intervalo de aceptación y la línea continua el valor categórico asignado. (b) Representación de 
los  valores  de  Hotelling  T2  vs.  los  valores  del  estadístico  “inlier”;  se  consideró  que  todas  las 
muestras  con  valores  fuera  de  los  límites  no  pertenecen  a  la  clase  E.  senticosus.  El  círculo 
señala la muestra ES23. (c) Ampliación del recuadro. 

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 Eleutherococcus senticosus 

  Si  una  nueva  muestra  desconocida  tiene  un  espectro  significativamente 

diferente de los espectros de las muestras utilizadas en el conjunto de calibración, al 
realizar su predicción se observará en el gráfico de scores que se posiciona lejos de la 
muestra  de  calibración  más  próxima,  en  tal  caso  se  marcará  como  un  "inlier".  La 
detección de inliers es la primera etapa para asignar las nuevas muestras a alguna de 
las clases. Con este fin, se utilizaron de manera conjunta la distancia de Mahalanobis 
entre  cada  nueva  muestra  calculada  y  su  vecino  de  calibración  más  cercano,  y  el 
estadístico  de  Hotelling.  Las  muestras  auténticas  de  E.  senticosus  del  conjunto  de 
predicción deberían estar bien descritas por el modelo construido y no ser marcadas 
como  inliers.  Sin  embargo,  cabe  esperar  la  presencia  de  inliers,  ya  que  en  la 
construcción del modelo PLS‐DA se han dejado fuera algunas especies de plantas (por 
ejemplo, P. notoginseng, A. sinensis y W. somnifera), las cuales serán posteriormente 
clasificadas.  Esta  es  una  situación  común  en  los  análisis  de  rutina.  Los  resultados 
obtenidos con el conjunto de predicción fueron representados como se muestra en la 
Figura  3.3b.  El  límite  establecido  por  la  distancia  inlier  fue  de  0.57,  mientras  que  el 
límite de Hotelling fue de 8.54. Ninguno de los inliers estaba relacionado con la clase 
del E. senticosus, excepto la muestra atípica ES23. No fue inesperado que algunos de 
los otros productos herbales (OHPs) y algunas mezclas se ajustaran al modelo debido a 
que sus espectros son semejantes a los del E. senticosus (véase la Figura 3.3c). 
 
  Cuando  un  método  de  regresión  se  utiliza  para  construir  un  modelo  de 
clasificación,  uno  de  los  parámetros  más  importantes  a  definir  es  el  intervalo  de 
aceptación  en  el  cual  un  nuevo  objeto  se  considera  clasificado  correctamente  en  la 
clase,  lo  que  se  denomina  “cut‐off  value”.  Se  han  utilizado  varias  alternativas  para 
elegir un intervalo apropiado; por ejemplo véanse los trabajos desarrollados por Lau, 
et al. [14], Chen, et al. [15] y Woodcock, et al. [16]. En este estudio, se determinó el 
intervalo aceptable para una clasificación correcta considerando la línea de validación 
de la clase del E. senticosus y los errores en las predicciones de la validación cruzada. 
Para cada muestra de calibración, se halló la diferencia entre los valores Y calculados 
por el modelo y los de referencia, encontrando un valor mínimo (m) y máximo (M); se 
añadió el error asociado a la predicción, el RMSECV, y el promedio de los tres valores 

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 Eleutherococcus senticosus 

absolutos  fue  el  valor  del  intervalo  aceptado  para  clasificar  nuevas  muestras  en  una 
clase u otra: 
 
Cutoff value = ± (│m│ + │M│+│RMSECV│)/ 3  (3.1) 
 
  El siguiente paso para clasificar las muestras restantes, las que están dentro de 
los  límites  de  los  estadísticos  de  Hotelling  y  de  la  distancia  inlier,  fue  comprobar  el 
ajuste  de  sus  valores  calculados  de  Y  en  el  intervalo  de  aceptación  definido 
previamente.  El intervalo hallado fue de ± 0.10. Esto significa que todas las muestras 
con un valor calculado de Y de 0.90 a 1.10, y que no se han considerado inliers, serán 
clasificadas como pertenecientes a la clase del E. senticosus. 
 
  Los resultados generales después de los dos pasos se presentan en la Tabla 3.3. 
El  valor  de  la  sensibilidad  disminuyó  debido  a  las  muestras  con  falso  negativo,  las 
cuales  eran  todas  réplicas  de  la  muestra  ES33  y  una  réplica  de  la  muestra  ES35.  Por 
otro  lado,  el  método  construido  presentó  una  buena  especificidad;  ninguna  de  las 
muestras  de  otras  plantas  medicinales  fue  clasificada  erróneamente.  Además,  la 
mayoría  de  las  mezclas  probadas  fueron  clasificadas  correctamente  fuera  de  la  clase 
del E. senticosus; sólo la mezcla 3 y un replicado de las mezclas 4 y 5 fueron asignados 
erróneamente. Por lo tanto, mediante el uso de PLS‐DA, es posible detectar muestras 
adulteradas a partir de 5% de adulterante, pero teniendo en cuenta que la especie de 
la  planta  empleada  como  adulterante  no  debe  de  ser  de  los  miembros  de  la  familia 
Araliaceae, especialmente el P. notoginseng. El PLS‐DA presentó un mejor valor de GSR 
que SIMCA, principalmente debido a una mayor capacidad para detectar mezclas y una 
buena  especificidad,  aunque  es  posible  rechazar  algunas  muestras  auténticas  de  E. 
senticosus. 
 
3.3.5. Análisis discriminante (DA). 
 
  El método DA presenta la importante limitación de requerir más muestras que 
variables para que la matriz de covarianza pueda ser invertible. Se llevó a cabo un PCA 
con  el  fin  de  reducir  el  número  de  variables  espectrales  a  unas  pocas  componentes 

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 Eleutherococcus senticosus 

principales  y  se  utilizaron  como  variables  de  entrada  las  primeras  10  PCs,  que 
explicaban una varianza > 98%. Las muestras de las clases de Araliaceae previamente 
definidas (Tabla 3.1) fueron utilizadas para la construcción del modelo. El método de 
inclusión de variables por etapas (stepwise) fue aplicado a fin de incluir en el modelo 
discriminante  las  PCs  estadísticamente  significativas.  Para  tal  fin,  fue  utilizado  el 
criterio  de  maximización  de  la  distancia  de  Mahalanobis,  ya  que  éste  considera  la 
dirección y dispersión de los datos multivariantes [13]. Al final fue utilizado un modelo 
con las primeras 8 PCs como variables independientes.  
 
  La  prueba  de  Box  rechazó  la  igualdad  de  la  covarianza  para  las  clases 
establecidas,  de  modo  que,  en  la  clasificación  fueron  utilizadas  las  matrices  de 
covarianza  por  separado.  Al  haber  sido  empleadas  tres  clases  fueron  obtenidas  dos 
funciones  discriminantes,  aquí  nombradas  como  CF1  y  CF2.  La  matriz  de  estructura 
sugirió  la  mayor  correlación  absoluta  entre  la  variable  PC1  y  CF1,  mientras  que  la 
variable PC4 hizo lo mismo con CF2. Como era de esperar, CF1 fue la principal función 
para la clasificación, su correlación canónica fue de 0.997 con una varianza explicada 
del 94.10%. Para el conjunto de calibración, el porcentaje de muestras correctamente 
clasificadas fue del 100%. 
 
  Las  muestras  del  conjunto  de  predicción  fueron  proyectadas  sobre  el  modelo 
de PCA construido previamente y, a continuación, se utilizaron los scores obtenidos en 
el  análisis  discriminante.  Los  resultados  alcanzados  se  pueden  ver  en  la  Tabla  3.3. 
Todas  las  muestras  auténticas  de  E.  senticosus  fueron  asignadas  correctamente  a  su 
clase;  sin  embargo,  la  especificidad  se  vio  afectada  por  la  clasificación  errónea  de  la 
muestra ES23. Los OHPs fueron excluidos de la clase ES; desgraciadamente, todas las 
mezclas fueron clasificadas en la clase ES, independientemente de la cantidad o el tipo 
de adulterante presente en la mezcla. Por lo tanto, el método DA no es adecuado para 
la detección de muestras adulteradas, tal como ha indicado el valor de MCC, pero aun 
así  es  útil  para  discriminar  E.  senticosus  no  procesado  de  otros  productos 
fitoterapéuticos procedentes de diferentes orígenes. De todos los modelos ensayados, 
el método DA obtuvo el valor más bajo de GSR como resultado de la limitación en la 
detección de mezclas y la posibilidad de falsos positivos. 

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 Eleutherococcus senticosus 

3.4. Conclusiones del capítulo. 
 
  Mediante  el  uso  de  la  espectroscopia  NIR  y  la  quimiometría  se  consiguió  la 
diferenciación  rápida  de  materiales  sin  procesar  de  E.  senticosus  de  otras  ocho 
especies de plantas, relacionadas y no relacionadas con la familia Araliaceae. 
 
  Los tres métodos de clasificación evaluados, SIMCA, DA, y PLS‐DA, permitieron 
hacer  una  buena  discriminación  entre  E.  senticosus  y  otras  plantas;  sin  embargo,  las 
pruebas con mezclas preparadas en laboratorio indicaron que sólo el PLS‐DA y SIMCA 
eran realmente útiles para la detección de falsificaciones y adulteraciones. El método 
SIMCA  y  el  PLS‐DA  obtuvieron  una  tasa  general  de  éxito  en  la  clasificación  de  84%  y 
92%,  respectivamente.  La  sensibilidad  y  la  especificidad  de  todos  los  modelos 
(supervisados) de clasificación construidos fueron superiores al 73%. 
 
  El DA requiere la compresión previa de las variables originales por medio de un 
PCA y, en consecuencia, la reducción de la especificidad fue evidente, por lo que se vio 
afectada la capacidad para detectar muestras adulteradas.  
 
  El  método  SIMCA,  intuitivo  y  sencillo,  sería  útil  si  el  objetivo  principal  del 
estudio fuese detectar confusiones de especie, ya que tiene una excelente sensibilidad 
y especificidad. 
 
  El PLS‐DA proporcionó los mejores resultados y es capaz de descubrir mezclas 
de plantas con una cantidad de adulterante menor a las que puede detectar SIMCA; la 
clasificación  de  las  mezclas  de  laboratorio  mostró  que  es  posible  detectar 
adulteraciones con una cantidad de material herbal cercana al 5%, dependiendo de la 
proximidad  que  tenga  esta  planta  con  la  familia  Araliaceae.  Los  resultados  sugieren 
que la espectroscopia NIR puede ser utilizada para autenticar E. senticosus. 
 

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 Eleutherococcus senticosus 

Referencias. 

(1)  Davydov,  M.;  Krikorian,  A.  D.  Eleutherococcus  senticosus  (Rupr.  &  Maxim.)  Maxim. 
(Araliaceae) as an adaptogen: a closer look. J. Ethnopharmacol. 2000, 72, 345‐393.  
(2)  Zgórka,  G.;  Kawka,  S.  Application  of  conventional  UV,  photodiode  array  (PDA)  and 
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61
 
 

 
  
 
 
4 
 
Panax ginseng. 
 
 
 Panax ginseng 

4.1. Introducción. 
 
4.1.1. Descripción de la planta medicinal. 
 
  Panax  ginseng  es  una  famosa  planta  medicinal que  se  usa  ampliamente  en  la 
medicina tradicional oriental, pertenece a la familia Araliaceae y crece principalmente 
en Corea y China [1‐3]. Los componentes activos principales de P. ginseng, y también 
de  otras  especies  pertenecientes  al  género  Panax,  son  saponósidos  del  dammarano 
comúnmente  referidos  como  ginsenósidos  [1,4].  Ha  habido  un  creciente  interés  en 
esta  planta  debido  al  amplio  espectro  de  propiedades  terapéuticas  de  sus  raíces  y 
rizomas,  que  incluyen  efectos  anticancerígeno,  antioxidante,  antibacterial,  antiviral, 
hipocolesterolémico,  actividades  antiinflamatoria  e  inmunoestimulante, 
hipoglucemiante  y  propiedades  adaptogénicas  [5‐7].  A  pesar  de  que  la  acción 
farmacológica de otros miembros de la familia Araliaceae (p. ej. E. senticosus) podría 
parecerse  a  la  de  Panax  ginseng,  ya  se  ha  mencionado  en  el  capítulo  3  que  la 
composición  química  de  Araliaceae  es  muy  diferente  y  por  lo  tanto  no  pueden  ser 
utilizados de manera intercambiable [8]. 
 
4.1.2. Problemática con el control de calidad del Panax ginseng. 
 
  El  P.  ginseng  tiene  que  ser  diferenciado  de  otras  especies  de  Panax,  de  otros 
integrantes  de  la  familia  Araliaceae  y  de  otros  tipos  de  plantas  que  no  están 
relacionados  con  Araliaceae,  que  se  consideran  como  ginseng.  Dado  que  ha  habido 
informes de reacciones adversas, es obvio que es necesaria una mejora en el control 
de calidad para evitar indeseables efectos secundarios [5,9].  
 
  En la actualidad, el método más común de análisis es CLAR de los extractos de 
ginseng  con  detección  ya  sea  por  espectrometría  UV  o  de  masas;  sin  embargo,  los 
métodos  cromatográficos  destruyen  las  muestras  de  ginseng,  consumen  tiempo  y 
disolventes y se centran principalmente en los ginsenósidos [4,6]. Se han desarrollado 
métodos que utilizan la espectroscopia de infrarrojo medio o cercano para el control 
de calidad de las especies de Panax; sin embargo, éstos se centran en la determinación 

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 Panax ginseng 

de la humedad y de ginsenósidos específicos [7,10], en la distinción de áreas de cultivo 
y  calidades  (grados)  del  ginseng  [6,11]  o  en  discriminar  el  ginseng  de  un  pequeño 
número de plantas de aspecto similar [3‐5,12]. A partir de aquí, es evidente que sigue 
siendo necesaria una estrategia complementaria para el establecimiento de la huellas 
dactilar del P. ginseng; sobre todo para discriminarlo de un número mayor de posibles 
falsificaciones, incluyendo las mezclas de plantas. 
 
4.1.3. Descripción del estudio. 
 
  En  este  estudio  se  ha  desarrollado  un  procedimiento  para  una  identificación 
rápida de las raíces de P. ginseng empleando huellas dactilares obtenidas mediante la 
espectroscopia  de  infrarrojo  cercano  (NIR).  El  procedimiento  de  preparación  de  la 
muestra es simple, sólo es necesario moler y tamizar para registrar los espectros. De 
esta  manera,  en  lugar  de  un  largo  análisis  cromatográfico,  en  unos  pocos  minutos 
puede  lograrse  un  examen  rápido  por  espectroscopia  NIR,  incluyendo  la  preparación 
de la muestra sin el uso de disolventes.  
 
  La  complejidad  de  los  espectros  NIR  requiere  el  uso  de  quimiometría  para 
extraer  y  visualizar  la  información  analítica  útil;  en  este  trabajo,  se  han  utilizado  y 
comparado el PCA (principal component analysis), el método SIMCA (soft independent 
modeling  of  class  analogy),  el  DA  (discriminant  analysis)  y  el  PLS‐DA  (partial  least 
squares ‐ discriminant analysis).  
 
  Además, se han utilizado mezclas preparadas en el laboratorio en la evaluación 
de la capacidad de los modelos para detectar muestras adulteradas. Si la intención del 
análisis de las mezclas de plantas es la exploración de su composición, una opción útil 
podría  ser  el  uso  de  los  espectros  NIR  y  el  MCR‐ALS  (multivariate  curve  resolution  ‐ 
alternating least squares), ya que el análisis habitual por CLAR de mezclas de plantas 
podría llevar mucho tiempo y consume cantidades considerables de disolventes. Así, se 
ha llevado a cabo el análisis semicuantitativo de mezclas binarias de P. gingseng y un 
adulterante utilizando MCR‐ALS. 
 

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 Panax ginseng 

4.2. Metodología específica. 
 
4.2.1. Descripción de las muestras. 
 
  Las raíces de Panax ginseng (PG), E. senticosus (ES), Panax quinquefolium (PQ), 
Panax  notoginseng  (PN),  Lepidium  meyenii  (LM),  Withania  somnifera  (WS),  Angelica 
sinensis  (AS),  Pfaffia  paniculata  (PP)  y  jengibre  (ginger,  una  especia  de  cocina  con 
propiedades estimulantes [G]) fueron obtenidas de Amorós Nature (Girona, Catalunya, 
España),  Galke  (Gittelde,  Alemania),  Richters  (Ontario,  Canada),  Desert  Botanicals 
(Gilbert, AZ, EE.UU.), Frontier Natural Products Co‐op (Norway, IA, EE.UU.), MaxNature 
(Los  Angeles,  CA,  EE.UU.),  Modern  Jungle  (EE.UU.)  y  herboristerías  de  la  zona 
metropolitana de Barcelona (España) y la ciudad de Monterrey (México).  
 
  Así,  el  conjunto  de  muestras  consistió  en  miembros  de  la  familia  Araliaceae 
(PG, ES, PQ y PN), y otros tipos de plantas que no están relacionados con Araliaceae, y 
que son considerados como ginseng. Varios proveedores poseen una certificación de 
calidad  (p.  ej.  ISO,  GMP  o  de  otro  tipo);  otros  son  capaces  de  de  autenticar  sus 
productos  a  través  de  botánicos  expertos  que  identifican  las  plantas  de  sus  propios 
cultivos; de este modo, pueden proporcionar un comprobante de identidad. 
 
  Al  igual  que  en  el  estudio  de  E.  senticosus,  las  muestras  fueron  recolectadas 
durante los años 2007 a 2009 con el fin de incluir la mayor variabilidad posible. En la 
Tabla 4.1 se presenta un resumen de las muestras en estudio. El tratamiento también 
fue similar; las raíces se utilizaron tal como fueron adquiridas, es decir no fue aplicado 
ningún  secado  adicional  en  el  laboratorio  para  evitar  la  modificación  de  sus 
características originales y posibles cambios en la composición química. Las muestras 
recibidas  como  raíces  enteras  o  troceadas  se  molieron  en  un  molinillo  Turmix  Mill 
(Barcelona,  España)  y  fueron  posteriormente  tamizadas  por  vibración  con  una  criba 
vibratoria RP‐15 (CISA, Barcelona, España). Las muestras recibidas en forma de polvo 
se tamizaron directamente. En todos los casos, fue obtenido un polvo con un tamaño 
de partícula igual o inferior a 100 m. 
 

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 Panax ginseng 

Tabla 4.1. Características de las muestras y conjuntos de espectros. 

Muestras    Lotes    Número de espectros en 

    SIMCA, 
Número  PLS‐DA, DA 
ID a  Origen b  QS c  NSSQC d  PCA f   
Total e 
CS g  PS g 
                     
PG  DE, ES, US    3  12  18  54  36  18 
ES  CA, DE, ES,   
5  7  14  42  27  15 
MX, US 
LM  DE, ES, US    3  3  5  15  0  15 
PQ  CA, US    3  3  4  12  12  0 
AS  ES, US    2  2  4  12  0  12 
WS  DE, US    3  3  4  12  0  12 
PP  DE, US    3  3  3  9  0  9 
PN  US    1  1  1  3  0  3 
Jengibre  US    0  0  1  3  0  3 
Mezclas h  ‐‐‐    ‐‐‐  ‐‐‐  ‐‐‐  30    0  30 
                     
a
  Identidad:  PG,  Panax  ginseng;  ES,  Eleutherococcus  senticosus;  PQ,  Panax  quinquefolium;  PN,  Panax 
notoginseng;  AS,  Angelica  sinensis;  LM,  Lepidium  meyenii;  PP,  Pfaffia  paniculata  and  WS,  Withania 
somnifera. 
b
 CA, Canadá; DE, Alemania; ES, España; MX, México and US, Estados Unidos.  
c
 Proveedores de calidad; número de proveedores con una certificación de calidad. 
d
 Número de muestras procedentes de proveedores con alguna certificación de calidad. 
e
  Diferentes  lotes  de  plantas  adquiridos  de  varios  proveedores  y  herboristerías  en  tres  años  (es  decir, 
todas las muestras proceden de diferentes lotes, proveedores o años). 
f
 Número de espectros empleados para construir un modelo de PCA global (N.B. éste no es el modelo 
empleado para la reducción de variables en el análisis discriminante). 
g
 Número de espectros empleados en el conjunto de calibración (CS) o en el conjunto de predicción (PS) 
para la construcción y evaluación de los modelos de clasificación. 
h
 ‐‐‐, No aplica. 
 
 
  Además,  como  parte  del  conjunto  de  predicción,  fueron  preparadas  en  el 
laboratorio diez mezclas sintéticas mediante el mezclado de diferentes cantidades de 
las  plantas  en  estudio  con  muestras  de  P.  ginseng.  En  la  Tabla  4.2  se  presenta  la 
composición de cada muestra adulterada, incluyendo aquéllas utilizadas en el análisis 
semicuantitativo por MCR. Todas las muestras fueron almacenadas a temperatura de 
laboratorio (25 ºC aprox.), protegidas de la luz y la humedad, y analizadas dentro de la 
fecha de caducidad dada por el fabricante. 
 
 
 

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 Panax ginseng 

Tabla 4.2.Composición de las mezclas. 
Modo   Número/Tipo de  Identidad del  PG  Adulterante 
mezcla a  Adulterante     (%) b  (%) b 
         
Clasificación  1  P. quinquefolium   95  5 
  2  E. senticosus  95  5 
(SIMCA,  3  P. notoginseng  95  5 
PLS‐DA,  4  Ginger  95  5 
DA)  5  P. quinquefolium  90  10 
6  L. meyenii  90  10 
7  A. sinensis  90  10 
8  P. quinquefolium  80  20 
9  W. somnifera  80  20 
10  P. paniculata  80  20 
       
Semi‐ Simulación  E. senticosus  90  10 
cuantificación  numérica    85  15 
    80  20 
(MCR)    75  25 
  70  30 
  60  40 
       
Experimental  E. senticosus  90  10 
  80  20 
  70  30 
  60  40 
         
a
 Cada mezcla se preparó por triplicado y se registró el espectro de cada réplica (exceptuando las 
mezclas simuladas). 
b
 Porcentajes por pesada. Peso total de 3 g. 
 
4.2.2. Análisis espectroscópico en el infrarrojo cercano. 
 
  Los  espectros  NIR  fueron  obtenidos  usando  un  espectrómetro  con 
monocromador  de  barrido  NIRSystems  modelo  5000  (Foss  NIRSystems,  Silver  Spring, 
MD),  equipado  con  un  módulo  RCA  (Rapid  Content  Analyzer),  una  lámpara  halógena 
de cuarzo y un detector de sulfuro de plomo. Los espectros fueron obtenidos en modo 
de reflectancia, empleando como referencia un patrón de cerámica, provista de fabrica 
con el instrumento, sobre la región espectral de 1100 ‐ 2498 nm con una resolución de 
2 nm. Las muestras fueron analizadas en una cubeta de muestra circular de vidrio (40 
mm  de  diámetro  y  10  mm  de  espesor)  llena  hasta  el  borde.  Se  aplicó  un  peso 
constante de 100 g, durante aproximadamente 30 segundos, en la muestra con el fin 
de obtener en la cubeta una compactación del polvo relativamente constante.  

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 Panax ginseng 

  Cada muestra se registró por triplicado, empleando tres porciones de muestra 
procesadas  de  forma  independiente,  donde  cada  espectro  fue  el  promedio  de  64 
barridos sucesivos (obteniendo 700 datos por barrido). El control del espectrómetro y 
la manipulación de los archivos espectrales se realizaron utilizando el programa Vision, 
versión 2.51, de NIRSystems Foss. Los datos de reflectancia fueron almacenados como 
el  recíproco  del  logaritmo  de  la  reflectancia,  log  (1  /  R).  Se  reviso  el  buen 
funcionamiento  del  instrumento  todos  los  días  de  trabajo,  utilizando  las  opciones  de 
diagnóstico proporcionados por el fabricante. 
 
4.2.3. Análisis multivariante. 
 
  Los  espectros  sin  tratar  fueron  exportados  desde  el  programa  Vision  como 
archivos  NSAS  para  el  análisis  de  datos.  El  PCA,  SIMCA  y  PLS‐DA  fueron  realizados 
utilizando el programa PLS‐Toolbox (v. 6.5.1; Eigenvector Research, Inc.) para uso en el 
entorno computacional MATLAB (v 7.9, The MathWorks, Inc.), mientras que el DA fue 
llevado  a  cabo  con  el  programa  SPSS  (v  19.0;  IBM).  En  la  Tabla  4.1  se  presentan  los 
espectros  utilizados  para  construir  y  probar  los  modelos  matemáticos.  Con  el  fin  de 
minimizar  el  efecto  de  dispersión  de  la  radiación,  los  espectros  necesitan  ser 
pretratados;  con  este  fin  se  utilizaron  los  pretratamientos  de  SNV  (standard  normal 
variate),  primera  y  segunda  derivada  [13].  Se  eliminaron  las  principales  bandas  de 
absorción del agua para reducir la influencia de la humedad en los espectros NIR [10]. 
El cálculo de MCR‐ALS fue realizado utilizando el software MATLAB y la interfaz gráfica 
de  usuario  desarrollada  por  Jaumot  et  al.  [14],  que  está  disponible  libremente  en 
http://www.ub.edu/mcr/web_mcr/welcome.htm. 
 
  Como es habitual, el estudio previo de las muestras se realizó mediante un PCA. 
También  se  empleó  esta  técnica  para  el  modelado  de  cada  una  de  las  tres  clases 
consideradas,  P.  ginseng,  P.  quinquefolium  y  E.  senticosus,  y  que  se  utilizaron  en  el 
método de clasificación SIMCA. El resto de las muestras y las mezclas de laboratorio se 
utilizaron  en  el  conjunto  de  prueba.  Al  aplicar  el  método  SIMCA,  los  limites  para  el 
espacio  (T2)  definido  por  el  modelo  de  P.  ginseng  y  su  espacio  residual  (Q)  fueron 

70
 
 Panax ginseng 

establecidos a un nivel de confianza del 95% y las muestras con distancias dentro de 
los limites fueron clasificadas como miembros de la clase.  
 
  Se empleó el DA para discriminar P. ginseng (grupo 1) de los otros miembros de 
la  familia  Araliaceae,  de  E.  senticosus  (grupo  2),  de  P.  quinquefolium  (grupo  3)  y  de 
plantas  consideradas  como  ginseng;  los  grupos  1  a  3  se  utilizaron  para  elaborar  las 
reglas de clasificación. Puesto que el DA requiere un mayor número de muestras que 
de  variables,  se  realizó  previamente  una  reducción  de  variables  con  un  PCA, 
seleccionando las componentes que explican la mayor variabilidad de los datos. 
 
  En el caso del PLS‐DA, las variables categóricas fueron asignadas a las muestras 
del  conjunto  calibración  de  la  siguiente  manera:  1  a  P.  ginseng  y  0  para  las  otras 
plantas  (ES  y  PQ).  Los  criterios  para  considerar  que  una  muestra  está  correctamente 
clasificada se han mencionado en la sección 1.6.3.2. y su aplicación ha sido descrita en 
las secciones 3.2.3 y 3.3.4. 
 
  Los  modelos  de  calibración  de  PCA  y  PLS  fueron  validados  empleando  la 
validación cruzada con el método de bloques contiguos y tres muestras por segmento, 
los  replicados  de  muestra  son  eliminados  o  introducidos  juntos  en  el  conjunto  de 
calibración. El número óptimo de factores para construir el modelo se determinó con 
el criterio del valor mínimo de PRESS (Prediction Sum of Squares) [15]. Los estadísticos 
evaluados  en  la  construcción  de  los  modelos  de  calibración  incluyeron  RMSEC  (root 
mean square error of calibration), RMSECV (root mean square error of cross validation) 
y el coeficiente de determinación r2. 
 
  La comparación de los resultados obtenidos con SIMCA, PLS‐DA y DA se hizo en 
términos de sensibilidad, especificidad, la tasa general de éxito en la clasificación (GSR) 
y  el  porcentaje  de  mezclas  clasificadas  correctamente  (MCC).  Podemos  definir  estos 
términos  de  manera  análoga  a  la  descrita  en  la  sección  3.3.3.  La  sensibilidad  es  la 
proporción de muestras que pertenecen a la clase P. ginseng que son correctamente 
identificadas por el modelo matemático. La especificidad es la proporción de muestras 
que no pertenecen a la clase P. ginseng (es decir, ES, PQ, PN, LM, WS, AS y PP) que son 

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 Panax ginseng 

correctamente identificados por el modelo como extrañas. El valor de GSR se obtiene 
calculando  el  porcentaje  global  de  muestras  predichas  que  fueron  correctamente 
clasificadas  con  respecto  a  la  clase  P.  ginseng.  El  porcentaje  de  mezclas  clasificadas 
correctamente  es  útil  para  comparar  la  capacidad  de  los  modelos  para  discriminar 
muestras adulteradas. 
 
  Para  evaluar  la  viabilidad  de  aplicar  el  algoritmo  MCR‐ALS  se  utilizaron  dos 
conjuntos  de  datos,  una  primera  matriz  D  se  construyó  con  espectros  de  mezclas 
simuladas  matemáticamente,  las  cuales  fueron  formadas  a  partir  de  los  espectros 
puros  de  P.  ginseng  y  un  adulterante  seleccionado.  La  otra  matriz  D  se  construyó 
registrando  espectros  de  mezclas  de  plantas  preparadas  en  el  laboratorio  y  cuya 
composición  se  muestra  en  la  Tabla  4.2.  A  fin  de  facilitar  el  proceso  de  resolución, 
ambas  matrices  se  aumentaron  con  varios  espectros  de  P.  ginseng  puro.  El  número 
propuesto de factores se estableció en 2 y como estimaciones iniciales se utilizaron los 
espectros “puros” de las plantas. Asimismo, fue evaluada la utilidad de las limitaciones 
de  no  negatividad,  closure  y  las  restricciones  de  igualdad.  El  valor  de  convergencia 
seleccionado fue del 0.1%. 
 
4.3. Resultados y discusión. 
 
4.3.1. Características de los espectros de infrarrojo cercano. 
 
  Las moléculas complejas, presentes en la matriz de las raíces de ginseng y las 
plantas  analizadas,  exhiben  múltiples  vibraciones  armónicas  y  de  combinación, 
haciendo  que  sus  bandas  se  superpongan;  las  Figuras  4.1a  y  4.1b  presentan  los 
espectros registrados. Como resultado, se obtienen espectros con bandas muy amplias 
y  sin  rasgos  distintivos,  características  comunes  en  el  análisis  por  NIR  de  las  plantas 
medicinales  [16].  Al  igual  que  para  E.  senticosus,  las  bandas  de  humedad  fueron 
excluidas  en  el  pre‐tratamiento  y  la  construcción  de  los  modelos  matemáticos.  De 
todos  los  pre‐tratamientos  ensayados,  el  SNV  efectuó  la  mejor  corrección  de  la 
dispersión de la radiación y permitió obtener los modelos más sencillos, por lo que se 
aplicó en el resto del estudio. 

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 Panax ginseng 

4.3.2. Estudio de la similitud de las muestras. 
 
  Se realizó un PCA global empleando las muestras indicadas en la Tabla 4.1 que 
con  5  componentes  principales  (PCs)  explicaba  una  varianza  de  98.86%  con  un 
RMSECV  de  0.302.  Este  valor  de  RMSECV  y  el  alto  porcentaje  de  varianza  explicada 
empleando pocos PCs sugiere que el modelo no es afectado de forma importante por 
ninguna  muestra  anómala.  En  los  gráficos  de  scores  se  observó  un  agrupamiento 
complejo de las muestras según la especie de la planta; el gráfico de PC1 vs. PC4 fue el 
mejor  para  examinar  la  forma  de  agrupamiento  del  P.  ginseng  y  para  representar  la 
distribución natural y el agrupamiento de las otras especies de plantas alrededor del 
grupo del P. ginseng, véanse las Figuras 4.1c y 4.1d. La proximidad de las otras especies 
de plantas al grupo del P. ginseng, con la excepción de las muestras de E. senticosus y 
P.  paniculata,  indica  que  puede  ser  difícil  conseguir  una  buena  clasificación;  nótese 
que  algunas  de  las  mezclas  están  situadas  junto  a  muestras  P.  ginseng  y  también  la 
proximidad  de  P.  quinquefolium.  Afortunadamente,  las  fronteras  del  grupo  del  P. 
ginseng parecen ser claras y el grupo es compacto, sólo unas pocas muestras aparecen 
a  una  cierta  distancia  del  grupo;  estas  características  harán  posible  discriminar  las 
otras especies de plantas cuando se construya el correspondiente modelo de la clase. 
Así,  es  posible  la  identificación  del  P.  ginseng  frente  a  otras  especies  de  plantas, 
independientemente si están o no relacionadas con la familia Araliaceae. 
 
  Las  muestras  sospechosas  fuera  de  la  elipse  de  confianza  del  95%  fueron 
examinadas  mediante  la  revisión  de  sus  valores  de  residual  (Q)  y  de  leverage  (T2)  y, 
finalmente, se decidió conservarlas ya que se llegó a la conclusión de que obedecían el 
modelo  de  PCA  construido.  La  inspección  de  los  residuales  de  los  loadings  mostró  la 
posibilidad  de  que  el  SNV  no  haya  corregido  completamente  los  efectos  de  la 
dispersión de la radiación en longitudes de onda por encima de 2270 nm. 
 
  Al  igual  que  todos  los  métodos  no  supervisados  de  clasificación,  el  PCA 
proporciona un panorama general para explicar las pautas de las muestras estudiadas, 
pero la asignación de nuevas muestras a una clase puede ser una tarea difícil con este 
método, ya que no calcula una regla que defina fronteras o regiones para diferenciar 

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 Panax ginseng 

entre  los  grupos  obtenidos  a  partir  de  las  muestras  en  estudio.  Por  lo  tanto,  fueron 
empleados métodos supervisados con el fin de lograr una clasificación más objetiva. 

 
Figura  4.1. (a) Espectros de infrarrojo cercano de los miembros de la familia Araliaceae y (b) 
plantas  no  relacionadas  utilizadas  como  sustitutos  del  ginseng.  (c)  Gráfico  de  scores  PC1  vs. 
PC4 de un PCA global presentando la elipse de confianza al 95%. (d) Ampliación del recuadro. 
 
4.3.3. SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy). 
 
  Se consideraron tres clases para construir el modelo SIMCA, como se describe 
en la Tabla 4.1. El principal interés es estudiar los posibles errores de clasificación de 
las  muestras  de  P.  ginseng  en  las  clases  PQ  y  ES,  puesto  que  las  muestras 
pertenecientes a la familia Araliaceae tienen características similares. Además, la clase 
PG debe ser capaz de discriminar las muestras adulteradas y otras especies de plantas 
diferentes a las que constituyen la clase. Al construir el modelo SIMCA se necesitaron 5 
PCs  para  definir  correctamente  la  clase  PG,  5  para  la  clase  ES  y  3  para  la  clase  PQ, 

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 Panax ginseng 

obteniendo  una  varianza  explicada  >  98%  y  un  valor  de  RMSECV  <  0.08.  Todas  las 
variables  incluidas  en  la  construcción  del  modelo  SIMCA  exhibieron  una  buena 
capacidad  de  modelado.  Ninguna  muestra  de  P.  ginseng  del  conjunto  de  predicción 
mostró  cercanía  suficiente  a  la  clase  PQ  o  la  clase  ES  para  ser  clasificados 
erróneamente;  esto  permite  confirmar  la  asignación  correcta  de  clase  entre  los 
miembros de la familia Araliaceae. 
 
Tabla 4.3. Comparación de los resultados de la calcificación. 
Clasificado b Sensibilidad Especificidad MCC  GSR 
Modelo  ID  n a 
PG  AHG  (%)  (%)  (%) c  (%) d 
             
SIMCA            95
  PG  18  18 0 100     
  OHs e 69  0 69   100   
  Mezclas  30  6 24     80 
             
           
PLS‐DA            85
  PG  18  18 0 100       
  OHs e 69  6 63   91     
  Mezclas  30  12 18     60   
             
             
DA            80
  PG  18  18 0 100       
  OHs e 69  9 60   87     
  Mezclas  30  14 16     53   
             
a
 Número de espectros en el conjunto de prueba (PS). 
b
 PG, P. ginseng; AHG, otro grupo de plantas. 
c
 Porcentaje de mezclas correctamente clasificadas como ajenas a la clase PG. 
d
 Tasa general de éxito en la clasificación. 
e
 Otras plantas, aquí se encuentran E. senticosus, P. notoginseng, L. meyenii, W. somnifera, A. sinensis, 
P. paniculata y el jengibre (ginger). 
 
  La  Tabla  4.3  resume  el  resultado  al  utilizar  SIMCA.  El  valor  de  sensibilidad 
obtenido indica que hay una probabilidad muy pequeña de obtener un falso negativo 
al realizar la prueba de identidad usando el modelo construido. Además, de acuerdo 
con  la  especificidad,  las  otras  especies  de  plantas  serían  excluidas  de  la  clase  PG  en 
todos  los  casos.  Utilizando  SIMCA  se  obtuvo  un  valor  de  GSR  bastante  bueno,  sólo 
disminuido a causa de los espectros de las mezclas uno y cinco, ambas preparadas con 
ginseng Americano (PQ), que fueron clasificadas erróneamente como P. ginseng. Este 

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 Panax ginseng 

error de clasificación no es inesperado debido a que estas mezclas fueron las situadas 
junto  al  grupo  del  P.  ginseng  en  la  Figura  4.1d.  Aunque  algunas  de  las  especies  de 
plantas  utilizadas  en  la  preparación  de  mezclas  eran  lo  suficientemente  diferentes 
como  para  ser  discriminadas  por  el  modelo  SIMCA,  incluso  en  una  cantidad  del  5%, 
otras  especies  con  espectros  similares  al  del  P.  ginseng,  por  ejemplo  el  P. 
quinquefolium,  podrían  ser  erróneamente  identificadas  en  mezclas  a  un  10%;  por  lo 
tanto, sólo es posible detectar con fiabilidad las muestras que contengan alrededor de 
un 20% de adulterante. 
 
4.3.4. PLS‐DA (partial least squares ‐ discriminant analysis). 
 
  Utilizando la matriz X de espectros, las clases codificadas en el vector Y fueron 
descritas con tres variables latentes (LVs), presentando una varianza explicada de 94% 
y 98%, respectivamente. El utilizar un número de LVs igual al número de clases sugiere 
una baja correlación química en los espectros de diferentes clases, pero similitudes de 
los  espectros  dentro  de  las  clases;  es  decir,  el  número  bajo  de  LVs  proporciona  una 
idea  de  la  buena  capacidad  del  modelo  para  describir  las  clases  propuestas.  Los 
estadísticos de la regresión mostraron un RMSEC de 0.128, un RMSECV de 0.182 y r2 
obtenida  de  la  validación  cruzada  de  0.869.  Este  valor  de  r2  puede  parecer  bajo;  sin 
embargo, durante la construcción del modelo no se detectaron muestras anómalas. Un 
valor  de  corte  de  ±  0.20  se  determinó  empleando  la  ecuación  3.1  (sección  3.3.4), 
considerando la línea de validación de la clase PG y el error en las predicciones. Esto 
significa que todas las muestras calculadas que se han estimado dentro de los límites 
establecidos  por  el  valor  de  Hotelling  T2  y  el  valor  de  residuales  Q  a  un  nivel  de 
confianza  del  95%  y  con  un  valor  Y  de  0.80  a  1.20  serían  clasificadas  como 
pertenecientes a la clase del PG. 
 
  Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.3. El valor de especificidad 
fue de un 91% debido a muestras que dieron falso positivo, todas ellas replicados de 
muestras  de  L.  meyenii.  Por  otro  lado,  el  modelo  construido  presenta  una  buena 
sensibilidad  ya  que  ninguna  de  las  muestras  de  P.  ginseng  fue  clasificada 
erróneamente. Desafortunadamente, más de un tercio de los espectros de las mezclas 

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 Panax ginseng 

analizadas  (1,  3,  5  y  6)  fueron  clasificadas  erróneamente  ya  que  las  especies 
adulterantes  de  esas  muestras  no  fueron  discriminadas  por  el  modelo  PLS‐DA;  ver  la 
Tabla  4.2.  De  acuerdo  con  estos  resultados,  sólo  es  posible  detectar  las  mezclas  con 
una  cantidad  de  adulterante  que  esté  necesariamente  en  torno  a  un  20%,  ya  que 
fueron confundidas varias especies de plantas aparte de P. quinquefolium. 
 
  Aunque el PLS‐DA presentó un valor menor de GSR que SIMCA, principalmente 
debido  a  una  inferior  capacidad  para  detectar  mezclas  y  su  menor  especificidad,  es 
posible rechazar la mayoría de las muestras de otras especies y hay una probabilidad 
muy  pequeña  de  clasificar  una  muestra  auténtica  de  P.  ginseng  como  un  falso 
negativo. 
 
4.3.5. DA (discriminant analysis). 
 
  Debido a las características del DA, no es posible establecer que una muestra 
dada no pertenezca a una de las clases definidas previamente en el modelo; es decir, 
todas  las  muestras  a  clasificar  deben  ser  asignadas  a  una  clase  y  las  especies  no 
incluidas  en  el  modelo  serán  clasificadas  en  alguna  de  ellas  aunque  no  sea  la  que  le 
corresponde.  En  consecuencia,  se  debe  determinar  qué  muestras  podrían  ser 
confundidas  con  respecto  a  la  clase  del  PG.  Como  ya  se  ha  comentado  en  la  sección 
1.6.2.3,  el  método  DA  presenta  la  limitación  de  requerir  más  muestras  que  variables 
para  que  la  matriz  de  covarianza  pueda  ser  invertible;  consecuentemente,  se  llevó  a 
cabo un PCA con las muestras de las clases de Araliaceae previamente definidas (Tabla 
4.1), con el fin de reducir el número de variables espectrales a unas pocas PCs. De esta 
manera,  se  utilizaron  como  variables  de  entrada  las  primeras  10  PCs  del  modelo  de 
PCA  que  explican  el  99.96%  de  la  varianza.  Se  aplicó  el  método  de  inclusión  de 
variables  por  etapas  (stepwise)  a  fin  de  incluir  en  el  modelo  discriminante  las 
componentes  estadísticamente  significativas;  para  tal  fin,  se  utilizó  el  criterio  de 
maximización de la distancia de Mahalanobis, ya que con él se considera la dirección y 
dispersión de los datos multivariantes [15]. Al final, fue obtenido un modelo con 9 PCs 
como  variables  independientes;  la  PC3  no  fue  significativo  y  no  fue  incluido  en  el 
modelo  definitivo.  La  prueba  de  Box  rechazó  la  igualdad  de  la  covarianza  para  las 

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 Panax ginseng 

clases establecidas, de modo que, en la clasificación fueron utilizadas las matrices de 
covarianza por separado; es decir, las fronteras no fueron líneas rectas. 
 
  Se  obtuvieron  dos  funciones  discriminantes  canonícas  (CF)  y  la  matriz  de 
estructura sugirió la mayor correlación absoluta entre la variable PC1 y CF1; mientras 
que el resto de las variables hicieron lo mismo con CF2, siendo la variable PC4 la más 
importante. Como era de esperar, CF1 fue la principal función para la clasificación, su 
correlación canónica fue de 0.998 con una varianza explicada del 93.7%. El porcentaje 
de muestras correctamente clasificadas en el conjunto de calibración fue del 100%. Las 
muestras  del  conjunto  de  predicción  fueron  proyectadas  sobre  el  modelo  de  PCA  y 
posteriormente  el  modelo  DA  fue  aplicado  en  los  valores  de  score  obtenidos.  Los 
resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.3. Todas las muestras auténticas de P. 
ginseng fueron correctamente asignadas a su clase y la mayoría de las otras especies 
fueron  debidamente  excluidas  de  la  clase  PG;  sin  embargo,  varias  muestras  de  L. 
meyenii fueron asignadas erróneamente, lo que disminuyó el valor de la especificidad. 
Las mezclas con 5% y 10% de adulterante fueron mal clasificadas, excluyendo la mezcla 
2, la cual probablemente pudo ser fácilmente discriminada por el modelo debido a que 
los  espectros  de  E.  senticosus  son  los  más  distintos  a  los  de  P.  ginseng,  como  se 
observa en los scores del PCA global. El método DA obtuvo el valor más bajo de GSR de 
todos  los  modelos  matemáticos  ensayados,  como  resultado  de  la  limitación  en  la 
detección  de  las  mezclas,  fueron  confundidos  casi  la  mitad  de  los  espectros  de  las 
mezclas, y también por el porcentaje de especificidad obtenido. 
 
4.3.6. Análisis semicuantitativo de mezclas. 
 
  El  éxito  en  la  aplicación  del  MCR‐ALS  requiere  que  los  espectros  de  los 
componentes  puros  tengan  baja  correlación.  Se  seleccionó  el  E.  senticosus  para 
preparar  las  mezclas  ya  que  fue  la  especie  que  presentó  una  mayor  diferencia  en  su 
espectro  con  el  P.  ginseng,  tal  como  fue  mencionado  en  las  secciones  4.3.2  y  4.3.5, 
para poner a prueba el procedimiento de semicuantificación propuesto. 
 

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 Panax ginseng 

  Como únicamente hay dos componentes en las mezclas, se utilizó un espectro 
promedio  de  P.  ginseng  puro  y  otro  espectro  promedio  de  E.  senticosus  puro  como 
estimaciones  iniciales  para  la  resolución.  En  la  primera  etapa,  se  trabajó  con  un 
conjunto de espectros de mezclas simuladas, obtenidos por ordenador a partir de los 
espectros  de  los  componentes,  variando  la  composición  de  5  a  5%,  y  se  llegó  a  la 
conclusión de que las limitaciones (constraints) útiles y con sentido químico fueron "no 
negatividad",  aplicada  a  los  perfiles  de  las  contribuciones  (concentraciones),  lo  que 
implica que los componentes fueron siempre positivos, y "closure", se supone que el 
perfil  de  contribución  de  cada  mezcla  puede  cumplir  con  un  balance  de  masa 
constante igual a la unidad, representando el 100% de los componentes de la misma. 
 
  Utilizando estas restricciones, se obtuvo la contribución de P. ginseng en cada 
mezcla simulada y la diferencia entre los valores reales y los calculados por el modelo. 
El promedio de los valores absolutos de estas diferencias fue de 3.64%, sugiriendo que 
al  añadir  E.  senticosus  a  una  muestra  de  P.  ginseng,  el  algoritmo  no  es  capaz  de 
distinguir cambios en la concentración nominal de P. ginseng en la muestra de ± ese 
valor.  Por  consiguiente,  las  mezclas  preparadas  en  el  laboratorio  fueron  elaboradas 
presentando variaciones en la composición de P. ginseng de 10 en 10%.  
 
  Posteriormente, se concatenaron la matriz de las mezclas simuladas y la de las 
mezclas preparadas en el laboratorio, junto con varios espectros de P. ginseng puro, y 
se  aplicó  el  algoritmo  MCR‐ALS  con  las  restricciones  enunciadas  anteriormente.  La 
convergencia  fue  alcanzada  con  5  iteraciones  y  el  modelo  explicó  el  99.9%  de  la 
varianza,  presentando  una  diferencia  entre  los  datos  iniciales  y  los  reproducidos  por 
MCR‐ALS (fitting error) de 0.932.  
 
  Las  Figuras  4.2a  y  4.2b  muestran  los  espectros  originales  y  los  obtenidos 
después  de  la  resolución  de  la  mezcla,  respectivamente.  Se  puede  observar  que  los 
perfiles  espectrales  resultantes  del  MCR‐ALS  son  buenas  aproximaciones  de  los 
espectros originales; sin embargo, está presente una ambigüedad en la intensidad. La 
ambigüedad  probablemente  se  debe  a  que  los  espectros  originales  no  pudieron 
someterse a restricciones. 

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 Panax ginseng 

(a) (b)

 
Figura 4.2. (a) Estimaciones iniciales empleadas para iniciar el algoritmo MCR‐ALS y (b) perfiles 
obtenidos  después  de  la  resolución  de  las  mezclas.  Las  líneas  continuas  representan  al  P. 
ginseng y las líneas discontinuas al E. senticosus. 
 
  Se  calculó  el  porcentaje  de  error  únicamente  a  partir  de  los  perfiles  de 
contribución (concentración) obtenidos de los replicados de las mezclas preparadas en 
el laboratorio. Los valores obtenidos se encontraban en un intervalo de 0.36 a 8.60% y 
el  valor  medio  fue  de  5.53%;  lo  que  indica  que  los  resultados  de  la  contribución 
deberían ser expresados utilizando un intervalo de 10% (por ejemplo, si 84.92% es la 
contribución  de  P.  ginseng  obtenida  en  una  mezcla  por  el  algoritmo,  sólo  se  puede 
decir que el resultado se encuentra entre 80 y 90%). 
 
  De  acuerdo  con  los  resultados  observados  para  el  P.  ginseng  puro,  se  puede 
considerar  que  una  muestra  no  está  mezclada  con  otra  especie  de  planta  si  la 
resolución proporciona un valor de contribución igual o superior al 95%. Así, todos los 
resultados  sugieren  que  el  MCR‐ALS  es  capaz  de  proporcionar  una  estimación  rápida 
de los componentes en las mezclas de P. ginseng y E. senticous. 
 
4.4. Conclusiones del capítulo. 
 
  La construcción de huellas dactilares NIR desarrollado en esta Tesis, representa 
una  buena  y  rápida  alternativa  a  los  análisis  tradicionales  por  CLAR  para  la 
diferenciación de P. ginseng de las otras ocho especies de plantas estudiadas. 
 

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 Panax ginseng 

  Los  tres  métodos  de  clasificación  aplicados,  SIMCA,  DA  y  PLS‐DA,  permitieron 
obtener  una  buena  discriminación  de  P.  ginseng,  al  conseguir  igual  valor  de 
sensibilidad (100%). Sin embargo, las pruebas en mezclas preparadas en el laboratorio 
mostraron  que  SIMCA  tiene  una  mejor  capacidad  para  detectar  las  muestras 
adulteradas  (MCC  =  80%).  Además,  su  especificidad  (100%)  fue  mejor  que  la  de  los 
otros  métodos  de  clasificación;  todas  estas  características  hicieron  que  SIMCA 
consiguiera el mejor rendimiento, como indicó el valor de GSR (95%). 
 
  La  espectroscopia  NIR  con  MCR‐ALS  podría  ser  utilizada  para  realizar  una 
determinación  rápida  y  semicuantitativa  de  la  composición  de  una  mezcla,  pero 
teniendo en cuenta que se han de aplicar las restricciones apropiadas y que las plantas 
“puras” deberán presentar espectros suficientemente diferentes para que puedan ser 
resueltos por el algoritmo. El porcentaje de error promedio fue de 5.53% y mostró que 
la  composición  de  mezcla  debe  cambiar  en  cantidades  de  aproximadamente  un  10% 
con el fin de obtener buenos resultados. Las ventajas de este método incluyen el no 
requerimiento  de  un  conjunto  de  calibración  o  un  método  de  referencia  para 
determinar los componentes de la mezcla. Una estrategia de trabajo podría ser utilizar 
SIMCA  para  clasificar  una  muestra  y,  si  es  etiquetada  como  una  mezcla,  estimar  su 
composición utilizando MCR‐ALS. En el presente estudio, esta estrategia funcionó para 
mezclas de P. ginseng and E. senticosus. 
 

81
 
 Panax ginseng 

Referencias. 

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83
 
  

 
 5

Valeriana officinalis.
 Valeriana officinalis

5.1. Introducción.

5.1.1. Descripción de la planta medicinal.

Valeriana officinalis pertenece al género Valeriana (familia Valerianaceae),

compuesto por cerca de 250 especies con muchas más subespecies, varias de ellas
referidas genéricamente como valeriana. Las raíces y los rizomas de las especies
pertenecientes a este género se utilizan en la medicina tradicional de muchas culturas
como un sedante suave [1]. Aunque han sido identificados más de 150 compuestos en
los extractos de valeriana, no está del todo claro qué constituyentes son los
responsables de sus efectos biológicos, lo que apunta a la posibilidad de una
interacción sinérgica. A este respecto, substancias como los esteres de terpenos
(denominados valepotriatos), los baldrinales y el ácido valerénico, así como los
derivados de éste, son considerados como los más importantes. Sin embargo, estudios
recientes plantean que los lignanos, flavonoides y el ácido clorogénico también
desempeñan un papel relevante [2]. Además de V. officinalis, otras importantes
especies comerciales son Valeriana wallichii (India) y Valeriana edulis (México), las
cuales también se utilizan en este trabajo; su composición química difiere
considerablemente provocando que las fitomedicinas preparadas a partir de ellas
tengan una composición muy diversa [3,4].

5.1.2. Problemática con el control de calidad de Valeriana officinalis.

Considerando la disponibilidad comercial y el uso vago del nombre "valeriana",

no es de extrañar que algunos estudios sugieran que sea común la adulteración de V.
officinalis con otras especies de Valeriana [2,4]. Este tema adquiere relevancia porque
sólo ha sido confirmada por la Agencia Europea del Medicamento (EMA) [5] la eficacia
terapéutica de V. officinalis y también, porque algunos hechos experimentales
plantean dudas respecto a la participación real de los componentes químicos de las
diferentes valerianas con actividades similares [2]. Los métodos actuales para el
control de calidad de V. officinalis se centran principalmente en la detección de la
presencia sólo de valepotriatos y del ácido valerénico [2,3]; en tales condiciones,

87
 Valeriana officinalis

podrían pasar inadvertidas las adulteraciones con varias especies de valeriana de

importancia comercial que contienen otros componentes químicos además del ácido
valerénico. Así, la práctica de identificar V. officinalis midiendo algunos pocos
marcadores o componentes activos está lejos de ser satisfactoria. Además,
generalmente no se considera el uso de la quimiometría para mejorar los resultados
del control de calidad de la planta. Por lo tanto, todavía es un reto para los analistas de
productos naturales la obtención de información útil para distinguir entre las especies
de Valeriana.

5.1.3. Antecedentes.

Tal como se ha mencionado en la sección 1.5.4, el método analítico más

popular para la obtención de huellas dactilares de las plantas medicinales sigue siendo
la cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a un detector de diodos en línea
(CLAR-DAD) [6-8]. Sin embargo, la forma habitual de trabajar es utilizar un solo
cromatograma a una longitud de onda fija (unidimensional); de este modo, no se
consideran picos cromatográficos que pueden aparecer a otras longitudes de onda y
que pueden ser útiles para la identificación de la especie estudiada. Han sido
propuestas diferentes estrategias para utilizar más información del cromatograma; por
ejemplo, las huellas dactilares bidimensionales desarrolladas por Yan, S., et al. [9] y el
método de fusión utilizado por Fan, X., et al. [10] y por Ni, Y., et al [11]. No obstante,
deben tenerse en cuenta algunas consideraciones cuando se utilizan estos métodos,
debido a que pueden existir cambios de un cromatograma a otro [8,12]. El método
bidimensional de obtención de huellas dactilares, presentado por Yan, S., et al., sólo
considera el uso de la primera componente principal (PC1), posiblemente excluyendo
datos relevantes, ya que la información útil puede ser dividida en varios componentes
principales. El método de fusión pondera los vectores considerados, es decir, las
respuestas en las longitudes de onda a lo largo del tiempo de análisis, mediante un
coeficiente de combinación; los detalles del método pueden consultarse en [11]. Su
aplicación a más de dos vectores puede ser compleja, ya que es necesario calcular
varios coeficientes de combinación.

88
 Valeriana officinalis

En la obtención de la huella dactilar de una planta por cromatografía, la forma y

posición de los picos desempeñan un papel fundamental; por lo tanto, la estabilidad
del sistema cromatográfico es importante para su correcto uso, ya que cualquier
perturbación debido a cambios inesperados en las muestras analizadas o en el
dispositivo de medida, podrían inducir a huellas dactilares alteradas. Así mismo, los
datos deben ser corregidos de variaciones no deseadas, tales como cambios de la línea
base o desplazamientos del tiempo de retención, ya que éstos influyen en gran medida
en el resultado del análisis [13]. Sin embargo, ninguno de los enfoques descritos para
aumentar la información tiene en cuenta la influencia de esas variaciones en la
construcción de la huella dactilar o en la interpretación de los resultados. A partir de
aquí, es evidente que aún son necesarias estrategias complementarias para la
obtención de huellas dactilares de las plantas medicinales; especialmente para las
muestras con perfiles cromatográficos complejos y para las mezclas de plantas.

5.1.4. Descripción del estudio.

En este trabajo se describe un tratamiento de la información que implica el uso

de cromatogramas a varias longitudes de onda para la construcción de huellas
dactilares aumentadas de plantas medicinales. Tomando los cromatogramas en un
intervalo de longitudes de onda, se obtiene la matriz de datos de una muestra dada,
con dimensiones (tiempo de retención x longitudes de onda); posteriormente, se
calcula la transpuesta de la matriz y se seleccionan, tanto las longitudes de onda de
trabajo como el intervalo o intervalos de tiempo de retención de interés para
conseguir el mejor control de calidad posible. Entonces, los perfiles cromatográficos
recuperados son sometidos a pretratamientos con el fin de eliminar las variaciones
cromatográficas no deseadas y reordenados en un único vector de datos, que es la
huella dactilar final (o ampliada) de la muestra. El conjunto de todas las huellas
dactilares ampliadas es el que se utiliza para construir los modelos de exploración y de
clasificación por medio de PCA (principal component analysis), SIMCA (soft
independent modeling of class analogy) y PLS-DA (partial least squares discriminant
analysis).

89
 Valeriana officinalis

Dado que esta estrategia permite la inclusión de tantas longitudes de onda

como seleccione el investigador, la mayoría de la información cromatográfica
relevante puede ser considerada en la clasificación, lo que permite obtener mejores
resultados que en el caso de utilizar una sola longitud de onda.

A fin de mostrar la utilidad del uso de cromatogramas con múltiples longitudes

de onda, se ha aplicado este procedimiento mejorado de obtención de huellas
dactilares a cromatogramas de Valeriana officinalis. Esta planta fue seleccionada
debido a que hay todavía muchas dudas respecto a la identidad de las especies de
Valeriana, que aumentan cuando se analizan mezclas de especies.

5.2. Metodología específica.

5.2.1. Descripción de las muestras.

Las raíces secas de Valeriana officinalis (VOF), Valeriana wallichii (VIN) y

Valeriana edulis (VMX), y las hojas de Passiflora incarnata (PI), fueron obtenidas de
Amóros Nature (Girona, Cataluña, España), Galke (Gittelde, Alemania), Richter
(Ontario, Canadá), Desert Botanicals (Gilbert, AZ, EE.UU.), Frontier Natural Products
Co-op (Noruega, IA, EE.UU.), MaxNature (Los Angeles, CA, EE.UU.), Modern Jungle
(EE.UU.) y herboristerías de las áreas metropolitanas de Barcelona (España), Oporto
(Portugal) y Monterrey (México). Varios proveedores poseen una certificación de
calidad (p. ej. ISO, GMP o de otro tipo) e identifican las plantas de sus propios cultivos
mediante estudios botánicos; de este modo, son capaces de autenticar sus productos y
proporcionar un comprobante de identidad. En la Tabla 5.1 se presenta un resumen de
las muestras en estudio. Con el fin de incluir la mayor variabilidad posible en las
muestras, aparte de su origen geográfico, todas ellas fueron recolectadas durante los
años 2007 a 2009; por consiguiente, el número de lotes corresponde al número de
muestras de cada especie de valeriana, porque todas las muestras provienen de
diferentes partidas, proveedores o años. Las muestras de valeriana fueron
almacenadas protegidas de la luz y la humedad a temperatura de laboratorio (25 º C
aprox.) y fueron analizadas dentro de la fecha de caducidad, dada por el fabricante.

90
 Valeriana officinalis

Tabla 5.1. Características de las muestras y conjuntos de objetos.

Muestras Lotes Número of objetos en

Número SIMCA, PLS-DA

IDa Origenb PTc QS d NCf NPf PCAg
total e CSh PSh

BG, CA,
DE, ES,
VOF RHR 5 29 15 5 87 45 42
HR, MX,
PT, US

VIN DE, IN RHR 2 2 0 2 6 0 6

VMX DE, MX RHR 1 13 7 3 39 21 18

PI ES RHL 0 1 0 0 1 0 1

Mezclasi --- --- --- --- --- --- 9 0 9

a
Identidad: VOF, V. officinalis; VIN, V. wallichii; VMX, V. edulis y PI, P. incarnata.
b
BG, Bulgaria; CA, Canadá; HR, Croacia; DE, Alemania; IN, India; MX, México; PT, Portugal; ES, España y
US, Estados Unidos.
c
Tipo de producto, RHR, raíces sin procesar; RHL, hojas sin procesar.
d
Proveedores de calidad; número de proveedores con una certificación de calidad.
e
Diferentes lotes de plantas adquiridos de varios proveedores y herboristerías en tres años .
f
Número de muestras en el conjunto de calibración (NC) o en el conjunto de prueba (NP)procedentes de
proveedores con una certificación de calidad.
g
Número de huellas dactilares aumentadas.
h
Número de huellas dactilares (a una única longitud de onda o con múltiples longitudes de onda)
empleadas en el conjunto de calibración (CS) o en el conjunto de predicción (PS)para la construcción y
evaluación de los modelos matemáticos.
i
---, No aplica.

5.2.2. Reactivos.

Acetonitrilo y metanol grado HPLC (ambos Chromasolv) fueron adquiridos a

Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). El ácido fosfórico (85%, Biochemika) y bifenilo
calidad GC, utilizado como marcador externo para la corrección de los
desplazamientos del tiempo de retención, se obtuvieron de Fluka (Buchs, Suiza). El
agua para la fase móvil cromatográfica y para la preparación de los extractos de
valeriana se purificó en un sistema Milli-Q (Millipore, Madrid, España). Etanol grado
HPLC (96% v/v) fue adquirido a Scharlau (Sentmenat, España).

91
 Valeriana officinalis

5.2.3. Preparación de las muestras y de las mezclas de laboratorio.

Las muestras de valeriana analizadas recibidas como raíces enteras o en forma

de raíces troceadas, así como las hojas de P. incarnata, fueron molidas con un molinillo
Turmix Mill (Barcelona, España) durante 1.5 minutos aproximadamente; las muestras
recibidas en forma de polvo se utilizaron directamente. De catorce lotes de V.
officinalis disponibles en el conjunto de predicción, nueve fueron seleccionados al azar
para preparar nueve mezclas en el laboratorio. Con este propósito, varias cantidades
de V. wallichii, V. edulis y P. incarnata, procedentes de plantas distintas, fueron
mezcladas con V. officinalis, originando mezclas conteniendo 5%, 10% o 20% del
adulterante seleccionado.

Para cada muestra se pesó con precisión 1.00 g del polvo y se añadieron 100 µL
de bifenilo disuelto en metanol (2 mg ml-1). Después de un mezclado manual y un
período de reposo de 10 minutos, se adicionaron 3 mL de una solución de metanol -
agua (9:1) a cada muestra. Se colocaron en un baño de ultrasonidos 15 minutos para
posteriormente centrifugarlas durante 10 min a 3500 rpm. El sobrenadante fue
transferido a un matraz aforado de 10 mL. El procedimiento se repitió dos veces más, y
los respectivos sobrenadantes fueron combinados. El volumen final se enrasó a 10 mL
con la solución de metanol – agua (9:1). Antes de ser inyectadas en el cromatógrafo,
todas las soluciones obtenidas fueron filtradas utilizando un filtro de membrana de
nylon con tamaño de poro de 0.45 µm. Los extractos fueron sometidos a análisis por
CLAR en las 12 horas siguientes de su preparación para mantener la estabilidad y la
integridad de su contenido. Se preparó un replicado de cada muestra durante tres días
no consecutivos (aunque las mezclas preparadas en el laboratorio fueron únicas),
utilizando cada día una porción de muestra procesada de forma independiente.

5.2.4. Instrumentación y procedimiento cromatográfico.

Los análisis por CLAR se realizaron con un sistema HPLC-DAD de Agilent serie
1100, equipado con un desgasificador de vacío G1379A, una bomba binaria G1312A,
un muestreador automático con un inyector ajustable de 100 µL de loop G1313A, un

92
 Valeriana officinalis

compartimiento de columna con temperatura controlada G1316A, un detector de

diodos en línea (diode array) G1315B y un ordenador equipado con el programa de
control ChemStation para LC 3D (Rev. B.01.03). La separación fue realizada utilizando
una columna Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18; 4.6 mm x 250 mm, 5 µm de tamaño de
partícula operada a 35 ºC.

La fase móvil consistió en (A) agua y (B) acetonitrilo-metanol (1 + 1), ambas

fases con 0.05% de H3PO4. La secuencia del gradiente de elución fue establecida como
sigue: inicial a 5% de B; entonces, el porcentaje de B se incrementó de 5 hasta 17% de
0 a los 10 min, de 17 a 50% de los 10 a 25 min y, finalmente, de 50 hasta 100% de los
25 a 45 min. Cada análisis fue seguido por un lavado de 5 minutos con 100% de B y a
continuación el sistema fue restablecido a las condiciones iniciales (95% A, 5% B)
durante 10 min. El flujo de la fase móvil se mantuvo a 1.2 mL min-1 y el volumen de
inyección fue de 20 µL. Los espectros UV-Vis fueron registrados en el intervalo de 200
a 500 nm cada 2 nm, estableciendo el tiempo de respuesta en 2 s (tiempo de muestreo
del detector de 0.0067 min).

5.2.5. Análisis multivariante.

Los datos CLAR-DAD obtenidos de los triplicados de 44 muestras de valeriana,

las 9 mezclas preparadas y un replicado de una muestra de PI, un total de 142
cromatogramas, se exportaron desde el programa de control del cromatógrafo en
formato CVS y fueron importados a MATLAB 7.9 (The MathWorks, Inc); que fue
utilizado para el manejo de las matrices de datos cromatográficos. Utilizando el
programa PLS-Toolbox 5.5 (Eigenvector Research), se realizó la co-adición
(combinación de datos adyacentes), la corrección de la línea base, la normalización, el
desdoblamiento de la matriz de datos y la construcción de los modelos matemáticos.
Los códigos para Matlab desarrollados por Skov [14] y por Tomasi [15], que están
disponibles libremente en www.models.kvl.dk, fueron empleados para la alineación de
los cromatogramas mediante COW (correlation optimized warping).

93
 Valeriana officinalis

Se llevó a cabo un PCA para decidir cuál era el método de alineación que
proporcionaba mejores resultados (muestras más agrupadas). Se utilizó el gráfico de
scores para observar las pautas de las muestras, las agrupaciones, las similitudes,
diferencias y muestras anómalas.

El método SIMCA se utilizó para clasificar las muestras en dos clases, V.

officinalis y V. edulis. El resto de las especies utilizadas y las mezclas de laboratorio
fueron incluidas siempre en el conjunto de predicción. Los límites para el espacio
definido por el modelo de V. officinalis (T2) y su espacio residual (Q) fueron
establecidos a un nivel de confianza del 95%; las muestras calculadas dentro de los
límites fueron clasificadas como miembros de la clase.

En la construcción del modelo PLS-DA, la matriz X se compone de las huellas

dactilares aumentadas y el vector Y es un conjunto de variables categóricas que indica
a qué clase pertenecen los objetos. Las variables categóricas se asignaron como 1 a V.
officinalis y 0 a V. edulis.

Para construir los modelos de calibración de PCA y PLS-DA se utilizó la

validación cruzada (CV), empleando el método de bloques contiguos con 22 divisiones
(los replicados de muestra son eliminados o introducidos juntos en el proceso de
construcción del modelo). El número óptimo de factores se determinó con el criterio
del valor mínimo de PRESS (prediction sum of squares) en la validación cruzada [16].
Los estadísticos evaluados en la construcción de los modelos de calibración incluyeron
RMSEC (root mean square error of calibration), RMSECV (root mean square error of
cross validation) y el coeficiente de determinación r2. Se compararon los resultados
obtenidos con SIMCA y PLS-DA en términos de sensibilidad, especificidad, de tasa
general de éxito en la clasificación (GSR) y de porcentaje de mezclas clasificadas
correctamente (MCC). La sensibilidad es la proporción de muestras que pertenecen a
la clase V. officinalis que son correctamente identificadas por el modelo matemático,
mientras que la especificidad es la proporción de muestras que no pertenecen a la
clase V. officinalis (es decir, VIN, VMX, PI y mezclas), que son correctamente
identificados por el modelo como extrañas. Estos dos criterios son similares a los

94
 Valeriana officinalis

propuestos por C. Lau, et al [17]. El valor de GSR se obtiene calculando el porcentaje

global de muestras predichas que fueron correctamente clasificadas con respecto a la
clase V. officinalis. El valor de MCC es útil para comparar la capacidad de los modelos
para discriminar muestras adulteradas; se ve afectado por la planta utilizada para
preparar las mezclas y la cantidad mínima de adulterante discriminado por el modelo.

De forma paralela, se construyeron modelos matemáticos con los datos

pretratados de huellas dactilares a una sola longitud de onda (226 nm) y se
compararon los resultados obtenidos.

5.2.6. Construcción de las huellas dactilares con múltiples longitudes de onda.

En la Figura 5.1 se representa el procedimiento general para la construcción de

las huellas dactilares aumentadas para los cromatogramas de plantas.

Para cada muestra se obtuvo una matriz de datos cromatográficos (Sn) de

dimensiones 7643 x 151 (tiempo de retención x longitudes de onda); a continuación,
se calculó la transpuesta de la matriz (SnT) y la dimensión del tiempo de retención fue
co-adicionada, es decir, las variables adyacentes se combinaron, utilizando el valor
promedio de grupos de 5 variables, obteniendo una matriz de (151 x 1529).

5.2.6.1. Reducción de variables.

Fueron seleccionadas las longitudes de onda y el intervalo de tiempo de

retención que mostraron la mayoría de los picos. Durante la optimización del método
cromatográfico, se observó que las respuestas más intensas estuvieron en cuatro
longitudes de onda: 226, 254, 280 y 326 nm; por lo que los cromatogramas de estas
longitudes de onda se utilizaron para construir la huella dactilar aumentada de cada
muestra. El intervalo de tiempo de retención seleccionado fue de los 10 a los 44
minutos, ya que todos los picos más intensos se encontraban en este rango y se evitó
la inclusión en los modelos matemáticos de ruido o señales no informativas. De aquí
que las dimensiones de la matriz se redujeran a 4 x 1020.

95
 Valeriana officinalis

S1
λ1 .. . λm
TR1 TR1* .. . . TRn*
λ1 TR Interval TR Interval
(S1)T Corrección X
Extracto 1
.. . . . . λa λa Unfolding
(λa, λb, λc) de Datos

.. .
λb λb
λa λb λc
Binning* (TRi* : TRj*) λc λc S1
λm S2
Sn
TRn
N
S2 Unfolding
COW Simplex
λ1 .. . λm
TR1 TR1* .. . . TRn* t
λ1 TR Interval TR Interval
(S2)T Corrección X alineada
Extracto 2

λa λa
.. . . . .

.. . (λa, λb, λc) de Datos

λb λb
λa λb λc
Binning* (TRi* : TRj*) λc λc S1
λm S2
Sn
TRn

Sn Unfolding
λ1 .. . λm Construcción de Modelos
TR1 TR1* .. . . TRn*
λ1 TR Interval TR Interval
(Sn)T Corrección
Extracto n

λa λa
.. . . . .

(λa, λb, λc) de Datos

.. .

λb λb Exploración Clasif icación Cuantitativo

Binning* (TRi* : TRj*) λc λc
λm PCA PLS-DA PLSR

TRn
SIMCA

Figura 5.1. Esquema de la construcción de las huellas dactilares aumentadas. S1, S2, ..., Sn;
representan los datos cromatográficos originales en dos dimensiones (tiempo de retención
[TR] x longitudes de onda) de los diferentes extractos de plantas. X es la nueva matriz de datos
construida con huellas dactilares aumentadas. COW, N y t son el acrónimo y los símbolos para
correlation optimized warping, longitud de segmento y el parámetro slack, respectivamente. X
alineada, es la matriz de datos final que se utiliza en la construcción de los modelos matemáticos.

5.2.6.2. Ajuste de la línea de base y normalización de los datos.

Las variaciones en la línea base fueron minimizadas por medio del método de
mínimos cuadrados asimétricos ponderados (WLS) utilizando un polinomio de tercer
grado; se pueden encontrar más detalles sobre el método en la sección 1.6.1.5 y en
[18]. La variabilidad en la escala entre las muestras fue minimizada normalizando cada
vector de datos; es decir, en la matriz con la línea base corregida fue normalizado cada
cromatograma, empleando la suma del cuadrado de los valores de todas las variables
para un dado vector de datos, obteniendo una matriz con vectores de longitud unidad.

5.2.6.3. Desdoblamiento de la matriz (unfolding).

La matriz corregida fue desdoblada de tal manera que los vectores de datos
para cada longitud de onda fueron colocados uno tras otro para construir un único
vector de datos con dimensiones de 1 x 4080; que es la huella dactilar aumentada.
Finalmente, las huellas dactilares aumentadas de todas las muestras se ordenaron en

96
 Valeriana officinalis

una matriz (X) para la subsiguiente construcción de los modelos de exploración o

clasificación.

5.2.7. Optimización de los parámetros para COW (correlation optimized warping).

Antes de la construcción de la matriz final de huellas dactilares aumentadas (X),

los desplazamientos del tiempo de retención deben de ser corregidos. El algoritmo
COW fue utilizado para este propósito, mediante la ejecución de los códigos de Matlab
mencionados en la sección 5.2.5. Se seleccionó, a partir de las huellas dactilares
aumentadas de muestras autenticadas de V. officinalis, un vector de datos que fue
usado como referencia, y los otros cromatogramas se alinearon con respecto es éste.
Se utilizó como criterio el máximo acumulado del producto de los coeficientes de
correlación. La teoría de los algoritmos que se han utilizado en la selección del
cromatograma de referencia y la optimización del COW puede ser consultada en [14].

Los valores de la longitud del segmento (N) y el grado de flexibilidad (t) fueron
determinados por medio de un diseño simplex, realizado dentro de un espacio de
optimización definido: longitud del segmento de 25 a 250; flexibilidad de 2 a 20. Estos
valores fueron elegidos de acuerdo con las anchuras de los picos y los desplazamientos
observados en los cromatogramas. El número de puntos de inicio en la red de
búsqueda se ajustó a 3, el número máximo de pasos de optimización a 25 y la fracción
de la máxima desviación del centro en la alineación COW al 15%.

5.3. Resultados y discusión.

5.3.1. Optimización y validación de la metodología.

Los parámetros de CLAR-DAD han sido optimizados en función de las

condiciones descritas en la literatura [2,3,19,20]. Fueron evaluadas varias
composiciones de fase móvil constituidas por agua - metanol o agua y metanol -
acetonitrilo, separando una primera serie de extractos de una muestra autenticada de
V. officinalis. Se utilizaron caudales de 0.8, 1.2 y 1.5 mL min-1 y temperaturas de

97
 Valeriana officinalis

columna de 25, 30 y 35 ºC. Se ensayaron dos volúmenes de inyección de 10 y 20 µL;

fue seleccionado el segundo ya que se mejoró la respuesta sin aumentar
excesivamente la anchura de pico. Una buena separación y adecuadas condiciones de
trabajo fueron logradas empleando las condiciones presentadas en la sección 5.2.4.

Las respuestas de los componentes químicos detectables de las valerianas en

estudio aparecen, principalmente, en la región espectral de 200 a 400 nm. La mayoría
de los eluatos presentaron una absorbancia máxima en alguna de las siguientes
longitudes de onda: 226, 254, 280 y 326 nm. Esta observación se corresponde con el
conocido hecho de que las principales familias de compuestos presentes en
Valerianaceae (por ejemplo, valepotriatos, lignanos, flavonoides y el ácido clorogénico)
tienen la mayor respuesta en estas longitudes de onda. Debido a ello, fueron las
longitudes de onda seleccionadas para realizar el estudio. El resto de la optimización se
realizó a 226 nm, ya que todos los grupos de picos cromatográficos exhibieron
respuesta en esta longitud de onda.

En la extracción se seleccionó metanol (MeOH) frente a (EtOH) al conseguir

picos cromatográficos con una mejor simetría. El rendimiento de la extracción mejoró
mediante la adición de agua, ensayando soluciones de MeOH-H2O (9:1) y MeOH-H2O
(8:2). La primera composición proporcionó picos con una forma más simétrica, por lo
que fue el medio elegido.

Con el fin de evaluar la estabilidad de la metodología utilizada, se determinaron

la repetibilidad y la precisión intermedia. Se obtuvo la repetibilidad del método
mediante el análisis, en un mismo día, de cuatro porciones independientes de una
muestra de V. officinalis. Para cada cromatograma se registraron las áreas de 14 picos,
que abarcaban toda la región cromatográfica de interés, y fue calculada la desviación
estándar relativa (RSD) para cada conjunto de picos. Los valores de RSD para las áreas
fueron menores del 4.61%. Para los tiempos de retención, el valor mayor de RSD
obtenido fue de 0.12%, sugiriendo que no se tendrían cambios de importancia en el
tiempo de retención. Desafortunadamente, en las etapas posteriores del trabajo

98
 Valeriana officinalis

aparecieron ligeros cambios en el tiempo de retención, probablemente debido a

cambios menores en la composición de la fase móvil.

Puesto que la composición química de las plantas en estudio puede variar

considerablemente, no es posible determinar la precisión intermedia del método a
partir de los compuestos endógenos que se producen de forma natural en las
muestras, de modo que para determinar este parámetro sólo se utilizó el marcador
externo. A partir de los replicados de 8 muestras, procesadas y analizadas en tres días
diferentes se obtuvieron las áreas de los picos del bifenilo, presentando un RSD de
7.37%. Así, todos los resultados indican una buena estabilidad del procedimiento
cromatográfico utilizado.

5.3.2. Características de los cromatogramas y de las huellas dactilares aumentadas.

Los cromatogramas obtenidos fueron complejos, mostrando más de 40 picos y

es evidente que algunos de ellos no están completamente resueltos, Figura 5.2. A
pesar del control riguroso de las condiciones de separación, aparecieron variaciones
cromatográficas habituales en el análisis por CLAR de extractos de plantas: cambios en
la línea base, cambios en el tiempo de retención y diferente número de picos entre los
replicados de las mismas muestras. Estas variaciones están relacionadas con la
incertidumbre en la composición del extracto, los cambios inesperados en las muestras
analizadas o las perturbaciones introducidas por el mismo dispositivo de medición
[8,12]. Esta complejidad representa un reto para la correcta identificación de las
especies de plantas y en la construcción de los modelos de clasificación.

Los conjuntos de picos se distribuyen en dos regiones del cromatograma; la

primera se encuentra entre los tiempos de retención de 10 a 27 min y la otra de 33 a
44 min. De acuerdo con la literatura [2,3,19,20], se conoce que los principales
constituyentes presentes en el primer conjunto cromatográfico son el ácido
clorogénico, lignanos y flavonoides; mientras que el segundo grupo de picos consiste
principalmente en ácido valerénico y sus derivados (sesquiterpenos) y valepotriatos
(por ejemplo, valtrato, didrovaltrato, acevaltrato).

99
 Valeriana officinalis

(a) (d)

*
*

Minutos Minutos

(b) (e)

*
*

Minutos Minutos

(c) (f)

* *

Minutos Minutos

(g)

Minutos

Figura 5.2. Comparación de los cromatogramas a 226 nm de las diferentes muestras

estudiadas. (a) V. officinalis, VOF; (b) V. edulis, VMX; (c) V. wallichii, VIN; (d) mixture VOF - VIN;
(e) mezcla VOF - VMX; (f) mezcla VOF - P. incarnata, (todas las mezclas antes mencionadas
están preparadas en una proporción de 9:1) y (g) sección de los cromatogramas de tres
muestras diferentes de VOF. El asterisco indica la posición del pico del bifenilo; la flecha de
línea continua indica la presencia de un pico inesperado en una de las muestras y las flechas de
líneas discontinuas muestran algunos ejemplos del desplazamiento en el tiempo de retención.

Además, se puede notar que el contenido de sesquiterpenos y valepotriatos en

V. edulis (Fig. 5.2b) y V. wallichii (Fig. 5.2c) difieren en gran medida de V. officinalis (Fig.
5.2a). Sin embargo, la utilidad de esta diferencia para la identificación de las especies
de valeriana es limitado, ya que el contenido químico en muestras de plantas puede

100
 Valeriana officinalis

variar considerablemente y porque no es de ninguna manera fácil asignar la identidad

de la valeriana por inspección visual de los cromatogramas, sobre todo empleando una
única longitud de onda y tratándose de mezclas; tal como se puede observar en las
Figuras 5.2d-f. Esta tarea es aún más complicada debido a la presencia de picos
inesperados, lo cual ocurrió espontáneamente en algunos extractos, y también debido
a los cambios del tiempo de retención, como se muestra en la Fig. 5.2g. Bajo estas
circunstancias, pueden ocurrir identificaciones erróneas de las muestras adulteradas
no sólo al utilizar otras especies de valeriana en cantidades del 20%, sino también
cuando se utiliza una hierba completamente ajena (género y especie diferentes) como
P. incarnata.

La Figura 5.3a muestra las variaciones presentadas por los cromatogramas de

una muestra V. officinalis en las longitudes de onda seleccionadas que fueron
utilizadas para construir las huellas dactilares aumentadas. La más evidente de estas
variaciones fue el cambio en la pendiente de la línea base, presente en unos pocos
cromatogramas, pero que se produjo en todas las especies de valeriana en estudio.
Hubo una ligera tendencia hacia valores positivos a 226 nm y una tendencia
importante a los valores negativos a 254 y 280 nm. En tales condiciones, no era viable
desdoblar la matriz de datos cromatográficos para construir el vector de la huella
dactilar aumentada; de modo que, los datos tuvieron que ser corregidos.

La Fig. 5.3b muestra el resultado de la aplicación de los pretratamientos a los

vectores de la matriz de datos cromatográficos. El orden en que se utilizaron fue el
siguiente: combinación de datos adyacentes, corrección de la línea base y posterior
normalización. La combinación de datos adyacentes mantuvo la información
cromatográfica, es decir, no afectó las características del cromatograma, y redujo el
número de datos en la dimensión del tiempo de retención de la matriz. La corrección
de la línea base eliminó, con éxito, las tendencias exhibidas por la señal de fondo de
los cromatogramas. Finalmente, la normalización de los vectores cromatográficos hizo
posible reducir la influencia ejercida por la absortividad de los constituyentes químicos
de las muestras; también evita obtener resultados de clasificación sesgados hacia la
variabilidad generada por la concentración total de la muestra.

101
 Valeriana officinalis

(A) (B)

226 nm 226 nm

Minutos Minutos

254 nm 254 nm

Minutos Minutos

280 nm 280 nm

Minutos Minutos

326 nm 326 nm

Minutos Minutos

Figura 5.3. Cromatogramas de una muestra de V. officinalis a las longitudes de onda utilizadas
en la construcción de las huellas dactilares aumentadas. (A) Antes de los pretratamientos y (B)
después de la combinación de datos, corrección de línea base y normalización; N.I. se refiere a
valores normalizados de intensidad.

Las matrices de datos corregidas fueron desdobladas a lo largo de la dimensión

del tiempo de retención para generar las huellas dactilares con múltiples longitudes de
onda; Figura 5.4. Como resultado del desdoblamiento de la matriz, se perdió la
dimensión del tiempo de retención y esta tuvo que ser reemplazada con una nueva
dimensión mediante la creación de un índice lineal; no obstante, las unidades del
índice lineal pueden ser traducidas a las unidades del tiempo de retención.

Como era de esperar, las huellas dactilares aumentadas presentaron más

conjuntos de picos que los exhibidos al usar una sola longitud de onda, permitiendo
una mejor y más simple comparación entre las señales cromatográficas y haciendo
más sencilla la identificación de las especies de valeriana. Así, las huellas dactilares
aumentadas representan un incremento en la información proporcionada por la
variabilidad química de la muestra, no sólo debido al incremento en el número de

102
 Valeriana officinalis

picos, sino también debido a la minimización de la variabilidad no informativa

producida por otros factores, por ejemplo el dispositivo de medición, como resultado
del pretratamiento de los datos.

(a) (d)

Índice lineal Índice lineal

(b) (e)

Índice lineal Índice lineal

(c) (f)

Índice lineal Índice lineal

(g) (h)

Índice lineal Índice lineal

Figura 5.4. Comparación de las huellas dactilares aumentadas de (a) V. officinalis, VOF; (b) V.
edulis, VMX; (c) V. wallichii, VIN; (d) mezcla VOF - VIN; (e) mezcla VOF - VMX; (f) mezcla VOF -
P. incarnata, mezclas preparadas en proporción 9:1; (g) sección de las huellas dactilares
aumentadas de tres muestras de VOF antes de aplicar correlation optimized warping y (h) las
mismas muestras después de la alineación. N. I., valores normalizados de intensidad.

103
 Valeriana officinalis

5.3.3. COW (correlation optimized warping) dirigida mediante PCA (principal

component analysis).

La corrección de los desplazamientos del tiempo de retención fue el último

pretratamiento de datos realizado. La capacidad del algoritmo para realizar
correcciones simultáneas con cromatogramas obtenidos a varias longitudes de onda
no había sido probada. Como parámetros de entrada se utilizó la huella dactilar
aumentada utilizada como referencia, la longitud del segmento y el grado de
flexibilidad (slack size). Utilizando el algoritmo en quince huellas dactilares
aumentadas, obtenidas a partir de material autenticado de V. officinalis, se determinó
como vector de referencia la muestra que presentó el mayor parecido con todas las
huellas dactilares aumentadas en consideración. La optimización simplex proporcionó
una longitud de segmento de 24 y un grado de flexibilidad de 4. La Fig. 5.4g y la Fig.
5.4h presentan los resultados obtenidos con estos parámetros de alineación.

Los cambios del tiempo de retención fueron corregidos adecuadamente, a

pesar de la presencia de picos no comunes entre las réplicas, por ejemplo, el pico
próximo al valor 940. Además, los picos y las características no fueron distorsionados
por el uso del algoritmo COW. Sin embargo, la aplicación de estos parámetros para
alinear otras huellas dactilares aumentadas diferentes a la de V. officinalis (una
posibilidad fácil de aparecer en análisis de rutina con muestras desconocidas) podría
producir alteraciones en las formas de los picos.

Se utilizó el PCA para evaluar la forma de aplicar la alineación a cada huella

dactilar aumentada construida. Se evaluaron tres alternativas: ninguna alineación, la
alineación sobre el triplicado de la muestra (es decir, una de las replicas se utiliza como
referencia para alinear las otras dos) y el uso de una referencia seleccionada para
alinear cada muestra analizada. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 5.2.

104
 Valeriana officinalis

Tabla 5.2. Opciones para la alienación evaluadas por PCA. a

Acción PCs b EV (%) c RMSECV d

Ninguna alineación 14 90.25 0.72

Alineación de los
12 92.16 0.63
triplicados de muestra

Alineación con única

12 87.28 0.70
referencia

a
Para la construcción del modelo PCA se realizó el centrado de los datos y la validación
cruzada, empleando 30 divisiones aleatorias para los subconjuntos y 5 iteraciones; se
incluyeron las 142 huellas dactilares aumentadas.
b
Número de componentes principales usadas en el modelo PCA, seleccionadas con el
criterio del mínimo PRESS.
c
Varianza explicada acumulada.
d
Raíz del error cuadrático medio de la validación cruzada.

La alineación sobre triplicados produjo el modelo de PCA más simple, con la

mayor varianza explicada y el menor valor de RMSECV; indicando que se elimina la
variabilidad no informativa de la matriz de huellas dactilares aumentadas. A pesar de
que era evidente que aún queda una cierta dispersión de las muestras de V. officinalis
en el gráfico de scores, esto no influirá en los resultados de la clasificación debido a
que la variabilidad química entre las especies de plantas estudiadas es mayor que la
variabilidad producida por los desplazamientos que quedan entre los triplicados
corregidos por COW; es decir, esta dispersión se debe principalmente a diferencias en
la información química en cada triplicado en lugar de cambios del tiempo de retención
entre los triplicados, véase la Figura 5.5.

El gráfico de scores reveló dos triplicados sospechosos de V. officinalis situados

cerca de los grupos de las "otras plantas". Ya que los triplicados estuvieron bien
descritos por el modelo de PCA construido, es muy probable que estas muestras hayan
sido etiquetadas erróneamente como V. officinalis en las herboristerías. Por lo tanto,
las muestras sospechosas no fueron utilizadas en el conjunto de calibración y fueron
marcadas como otras plantas para fines de la clasificación.

105
 Valeriana officinalis

Scores on PC 3 (14.16%)
0.5

-0.5

-1

1
0.5 0.5
0 0
-0.5 -0.5
-1 -1
Scores on PC 2 (17.14%) Scores on PC 1 (28.02%)
p
1.5
b

1
Scores on PC 2 (17.14%)

0.5

-0.5

-1
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1
Scorespon PC 1 (28.02%)
c 1

0.5
Scores on PC 3 (14.16%)

-0.5

-1

-1.5
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1
Scores on PC 1 (28.02%)

Figura 5.5. ( ) V. officinalis; (+) Otras plantas. (a) Gráfico 3D de los scores del PCA global de las
huellas dactilares aumentadas después de la alineación. (b) Gráfico 2D de los scores en PC1 vs.
PC2 y (c) PC1 vs. PC3. Aquí, "otras plantas" se refiere a V. wallichii, V. edulis, P. incarnata y las
mezclas. Los triplicados sospechosos de muestras de V. officinalis han sido señalados con un
círculo.

106
 Valeriana officinalis

5.3.4. Comparación de los resultados de los modelos de clasificación.

Los modelos SIMCA y PLS-DA se construyeron utilizando 66 objetos entre

muestras de V. officinalis y de V. edulis, véase la Tabla 5.1. El conjunto de predicción
constaba de 76 objetos. En ningún caso fueron detectadas muestras anómalas durante
la construcción del modelo.

Al construir el modelo SIMCA con las huellas dactilares aumentadas se

necesitaron 9 PCs para definir correctamente la clase VOF y 6 para la clase VMX;
obteniendo una varianza explicada > 95% y un valor de RMSECV < 0.27. El gráfico de
Hotelling T2 vs. residuales Q mostró que todas las muestras de calibración estaban
dentro de los límites con un nivel de confianza del 95%. Todas las variables incluidas en
la construcción de SIMCA exhibieron una buena capacidad de modelado, tal como se
concluyó de la interpretación del gráfico de loadings de cada sub-modelo de clase.

En PLS-DA, las variaciones en la matriz X y el vector de variables categóricas Y

fueron descritas con 8 variables latentes (LVs), presentando una varianza explicada del
91% y el 99%, respectivamente. Los estadísticos de la regresión mostraron un RMSEC
de 0.015, un RMSECV de 0.025 y un r2 de la CV de 0.997. El intervalo para la aceptación
de una muestra en una determinada clase fue calculado empleando la ecuación 3.1 y
se estableció en ± 0.20. Esto significa que todas las muestras calculadas con un valor de
Y de 0.80 a 1.20 y que caen dentro de los límites establecidos por el valor de Hotelling
T2 y el valor de los residuales Q, para un nivel de confianza del 95%, serán clasificadas
como pertenecientes a la clase VOF.

Con el fin de comprobar las ventajas de utilizar varias longitudes de onda, los
resultados obtenidos por el procedimiento propuesto fueron comparados con los
obtenidos por la aplicación del mismo tratamiento de datos pero a cromatogramas
registrados a una sola longitud de onda (226 nm). En la Tabla 5.3 se muestra el
comportamiento de cada método de clasificación en los dos casos.

107
 Valeriana officinalis

Tabla 5.3. Comparación de los resultados de la clasificación.

Tipo de Clasificada en b Sensibilidad Especificidad MCC GSR
Modo Modelo na
muestra VOF AHG (%) (%) (%) c (%) d

SIMCA 97
Huellas dactilares aumentadas

VOF 36 34 2 94
OHs e 31 0 31 100
Mezclas 9 0 9 100

PLS-DA 100
VOF 36 36 0 100
OHs e 31 0 31 100
Mezclas 9 0 9 100
Longitud de onda única (226 nm)

SIMCA 90
VOF 36 36 0 100
OHs e 31 0 31 100
Mezclas 9 8 1 11

PLS-DA 97
VOF 36 36 0 100
OHs e 31 0 31 100
Mezclas 9 2 7 78

a
Número de huellas dactilares aumentadas o número de huellas dactilares convencionales empleadas
en la predicción.
b
VOF, V. officinalis; AHG, otro grupo de plantas.
c
Porcentaje de mezclas correctamente clasificadas como ajenas a la clase VOF.
d
Tasa general de éxito en la clasificación.
e
Otras plantas, aquí se incluye V. wallichii, V. edulis, P. incarnata y las dos muestras sospechosas
descritas en la sección 5.3.3.

Siempre se obtuvo alta sensibilidad y especificidad, independientemente del

modo o el modelo utilizado para realizar la clasificación. Esta situación puede
presentarse porque las diferencias químicas entre las plantas en estudio son grandes y
porque los modelos de clasificación hacen estas diferencias más evidentes para el
analista. La principal diferencia entre el uso de una o varias longitudes de onda para el
desarrollo de las huellas dactilares, se produjo al clasificar de las muestras adulteradas.
Los resultados obtenidos con huellas dactilares aumentadas fue mejor que el
conseguido empleando huellas dactilares a una sola longitud de onda. Incluso si el
adulterante se encuentra aproximadamente a un 5% y es de la familia Valerianaceae,

108
 Valeriana officinalis

el resultado muestra una mejora en la detección de muestras adulteradas. Debido a

los mejores resultados para los valores de MCC, el enfoque de las huellas dactilares
aumentadas también alcanzó los valores más altos de GSR en cada modelo construido
con esta metodología. Comparando los modelos SIMCA y los modelos PLS-DA en cada
modo de establecimiento de la huella dactilar, es evidente que la última técnica
proporciona mejores resultados.

5.4. Conclusiones del capítulo.

El método propuesto de utilización de huellas dactilares cromatográficas

aumentadas representa una buena alternativa para mejorar los resultados de
clasificación de especies de plantas con cromatogramas complejos. La clave para el
correcto uso de esta metodología es la selección de las k longitudes de onda a utilizar
para obtener, en los cromatogramas registrados a cada una de ellas, picos no
coincidentes de los componentes químicos detectables de las plantas estudiadas y con
alta señal (en este caso 226, 254, 280 y 326 nm); además, es necesaria la aplicación de
unos pretratamientos adecuados para eliminar las variaciones no deseadas en los
cromatogramas, entre las que se incluye la corrección de la línea base, la
normalización y la corrección de los desplazamientos en el tiempo de retención.
La combinación de COW y el PCA ha permitido la alineación de cromatogramas
complejos compilados utilizando varias longitudes de onda. Así se evitó la introducción
de ruido y artefactos matemáticos.
Los dos métodos de clasificación utilizados, SIMCA y PLS-DA, permitieron hacer
una buena discriminación entre V. officinalis y otras plantas, presentando una
sensibilidad y especificidad superior al 94%. Las pruebas con mezclas preparadas en el
laboratorio mostraron que los modelos de clasificación utilizados son sumamente
útiles para la detección de falsificaciones y adulteraciones cuando se utilizan las huellas
dactilares aumentadas. PLS-DA proporcionó los mejores resultados, ya que su valor
GRS fue mayor que el obtenido con SIMCA.

109
 Valeriana officinalis

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 Valeriana officinalis

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112
 6

Turnera diffusa.
 Turnera diffusa

6.1. Introducción.

6.1.1. Descripción de la planta medicinal.

Turnera diffusa Wild. Ex Schult, también conocida como damiana, es un

pequeño arbusto perteneciente a la familia Turneraceae, que crece de 1 a 2 metros de
altura y tiene hojas serradas aromáticas de 10 a 25 cm de largo. En verano la damiana
exhibe unas pequeñas flores amarillas, que son seguidas por pequeños frutos con un
olor dulce y un sabor similar al higo. La parte medicinal de la planta son sus hojas, las
cuales son cosechadas, de acuerdo con las prácticas de la etnofarmacia, durante la
época de floración [1,2]. El arbusto de damiana se puede encontrar por todo México,
América Central, las islas del Caribe y partes de América del Sur. Tiene varios usos
tradicionales como afrodisíaco, para las dolencias hepáticas, depresión, ansiedad,
neurosis, como expectorante, estimulante y tónico; también se utiliza para dar sabor a
postres, bebidas, dulces, etc [3]. Además, se ha informado que la parte aérea (tallos y
hojas) presentó una buena actividad antioxidante, similar a la exhibida por la
quercetina, utilizada como control [4]. Los antioxidantes son conocidos para reducir el
riesgo de padecer ciertos tipos de cáncer y muchas enfermedades crónico-
degenerativas; por eso existe un creciente interés en la búsqueda de antioxidantes
naturales, a fin de obtener diversos productos que son utilizados principalmente como
suplementos dietéticos [5,6].

6.1.2. Problemática con el control de calidad de Turnera diffusa.

Esta planta fue seleccionada porque las organizaciones (EMA, FDA, etc.) todavía
tienen que recomendar una metodología analítica definitiva para su control de calidad
y porque se ha demostrado que muchos de los productos que dicen contener T.
difussa en el mercado mexicano contienen en realidad otras especies, de acuerdo a los
trabajos realizados a partir de huellas dactilares obtenidas por TLC y CLAR-DAD [1,7,8].

115
 Turnera diffusa

6.1.3. Antecedentes.

Además de estudiar las identidades de las especies de las plantas medicinales,

algunas publicaciones exploran la utilidad de las huellas dactilares obtenidas por CLAR-
DAD, como una herramienta para predecir las propiedades terapéuticas de las mismas.
Por ejemplo, Dumarey et al. [9] y Van Nederkassel [10] mostraron una correlación
entre la huella dactilar cromatográfica (a 280 nm) de las muestras de té verde y su
capacidad antioxidante, como una medida de los efectos protectores originados por el
té. Sin embargo, en la correlación de las huellas dactilares con una posible actividad
biológica, los químicos suelen utilizar un solo cromatograma a una longitud de onda
fija, de modo que una gran cantidad de información contenida en otras longitudes de
onda puede ser descartada, soslayando picos cromatográficos que pueden ser útiles
para caracterizar las propiedades de una planta medicinal.

Un estudio previo sobre la correlación entre las huellas dactilares

cromatográficas de T. difussa (a 254 nm) y su actividad antioxidante utilizando PLSR
fue realizado por Garza-Juárez et al. [11]; sin embargo, las limitaciones cuando se
utiliza una sola longitud de onda se hicieron evidentes en los resultados del modelo
matemático y en las predicciones, obteniendo un r2 de la validación cruzada de 0.80,
un claro sesgo con tendencia a valores negativos y un deficiente resultado del modelo
al predecir un conjunto externo de muestras. Además, la corrección de los
desplazamientos del tiempo de retención se realizó manualmente, por lo que el
preprocesamiento para la alineación era muy laborioso.

En el capítulo 5, se ha descrito una estrategia que implica el uso de varias

longitudes de onda para la construcción de huellas dactilares aumentadas para plantas
medicinales. Con el fin de mostrar la utilidad de este enfoque con múltiples longitudes
de onda en la predicción de la actividad biológica de las fitomedicinas, se ha aplicado el
procedimiento en cromatogramas de Turnera difussa.

116
 Turnera diffusa

6.1.4. Descripción del estudio.

La actividad antioxidante podría ser una medida de la eficacia y de la calidad de

la planta, si se considera que los efectos terapéuticos atribuidos a la damiana están
relacionados, al menos en cierta medida, con dicha actividad. Las huellas dactilares
cromatográficas construidas con múltiples longitudes de onda son una buena opción
para predecir la actividad antioxidante de damiana y otras plantas medicinales, ya que
representan la mayoría de los componentes de las plantas y porque es ventajoso
manejarlas usando varios métodos quimiométricos. Así, en este trabajo se ha utilizado
la estrategia de huellas dactilares aumentadas para mejorar la predicción de la
actividad biológica de las plantas medicinales como parte de su control de calidad
total. Se pretende mejorar el modelo de regresión PLSR y obtener predicciones más
robustas para T. difussa. Para facilitar la alineación de los cromatogramas se aplicó el
algoritmo de alineación optimizada mediante correlación (COW).

6.2. Metodología específica.

6.2.1. Descripción de las muestras.

Con el fin de incluir en las muestras tantas fuentes de variabilidad como sea
posible, independientemente del origen geográfico específico, se recolectaron
cuarenta muestras de Turnera diffusa en diferentes regiones de México entre
diciembre de 2005 y enero de 2009; las muestras fueron autenticadas y fue obtenido
un comprobante de los especímenes depositados en el herbario de la Facultad de
Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León (México). Las muestras de
damiana se almacenaron protegidas de la luz intensa y de la humedad a temperatura
de laboratorio (27 °C aprox.) y se dejaron secar.

6.2.2. Reactivos.

El metanol grado HPLC (MeOH) fue adquirido a Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ,
EE.UU.). El agua desionizada se obtuvo de Laboratorios de Monterrey S.A. de C.V.

117
 Turnera diffusa

(Monterrey, NL, México). El ácido trifluoroacético (TFA), el MeOH y el etanol (EtOH)

grado reactivo fueron adquiridos a Fermont (Monterrey, NL, México). El 2,2-difenil-1-
picrilo-hidrazil (DPPH) y la 2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxichromen-4-ona
(quercetina), utilizados para obtener la actividad de captación de los radicales por
espectrofotometría, fueron adquiridos a Sigma (Monterrey, NL, México).

6.2.3. Preparación de los extractos.

Las partes aéreas de las plantas secas (hojas y tallos) fueron trituradas y luego
pasadas a través de un tamiz de 40 mesh. Cada muestra en polvo (1.00 g) se pesó con
precisión y se extrajo tres veces con 5 mL de una solución de etanol-agua 9:1 (v / v) en
cada vez, a 27 ° C, mediante un mezclado en vórtice durante 3 min y las respectivas
soluciones fueron combinadas. El extracto final se filtró a través de un filtro de papel
Whatman No. 40 y se evaporó hasta sequedad a presión reducida empleando un
evaporador rotatorio a 37 ± 2 °C. Antes del uso, se disolvieron 15 mg del extracto de la
muestra, en 1 mL de MeOH y se filtró a través de un acrodisco de nylon de 0.45 μm
(Waters Corporation).

6.2.4. Instrumentación y procedimientos analíticos.

Los análisis por CLAR se realizaron con un sistema Waters Alliance 2695,
equipado con un detector UV-Vis de diodos en línea 2996, un inyector automático, un
compartimiento de columna con temperatura controlada, un desgasificador de vacío y
un ordenador equipado con el programa de control y tratamiento de datos Empower.
La actividad de captación de radicales libres de los extractos de damiana se obtuvo
usando un espectrofotómetro UV-Vis Beckman DU-7500.

6.2.4.1. Procedimiento por CLAR-DAD.

La separación se consiguió utilizando una columna C18 AccQ Tag de 3.9 x 150
mm con 4 µm de tamaño de partícula (Waters Corporation) utilizada a 30 °C. La fase
móvil consistió en (A) TFA al 0.1% en agua y (B) MeOH. Antes del uso, los componentes

118
 Turnera diffusa

de la fase móvil fueron desgasificados y filtrados a través de un filtro de nylon de 0.45

µm (Waters Corporation, Milford, MA, EE.UU.). La secuencia del gradiente de elución
fue realizada como sigue: inicio con 30% de B, incrementando el porcentaje de B desde
30 hasta 70% durante 30 min y manteniéndolo constante durante 5 min. Cada
separación fue seguida por un período de equilibrio de 10 min a las condiciones
iniciales (70% A, 30% B). Antes de la primera inyección, la columna fue
preacondicionada durante 1 h con la fase móvil inicial. El flujo de la fase móvil se
mantuvo a 0.4 mL min-1 y el volumen de inyección fue de 10 µL. La longitud de onda
del detector se estableció a 254 nm para seguir el perfil de elución. Los espectros UV
se obtuvieron en el rango de 210 a 400 nm en intervalos de 1.2 nm y el tiempo de
muestreo del detector fue 0.01667 min.

6.2.4.2. Determinación de la actividad captadora del radical libre DPPH mediante

espectrofotometría.

Se llevó a cabo un ensayo de la actividad captadora del DPPH utilizando

espectrofotometría de acuerdo a Leu et al. [12], con algunas modificaciones. Primero,
el extracto se volvió a disolver en etanol (1 mg mL-1) y se utilizaron diferentes
concentraciones (0.2 a 200 µg mL-1) de cada extracto. En un volumen total de 1 mL, la
mezcla de ensayo contenía 500 µL del extracto y 500 µL del DPPH (125 µM en etanol).
La mezcla de ensayo se agitó y se dejó reposar a temperatura ambiente en la oscuridad
durante 30 min; a continuación, se midió la absorbancia a 517 nm. La quercetina se
utilizó como control positivo. El fundamento del ensayo se ilustra en la Figura 6.1. La
capacidad del radical DPPH para captar electrones se calculó como sigue:

A− B
Actividad captadora del radical=
(%) ×100 (6.1)
A

donde A es la absorbancia del control negativo (DPPH más etanol), y B es la

absorbancia de la muestra (DPPH, etanol más la muestra). Se realizó el gráfico de la
concentración vs. el porcentaje de captación y la concentración efectiva del extracto
que captó el 50% de los radicales DPPH (EC50) fue calculada por interpolación,

119
 Turnera diffusa

expresando la actividad como EC50. Las actividades antioxidantes de las muestras y los
respectivos cromatogramas fueron obtenidos simultáneamente, para evitar posibles
variaciones en los resultados de la prueba del DPPH, debido al tiempo de
almacenamiento de los extractos.
Absorbancia

517 nm

Longitud de onda (nm)

Figura 6.1. El radical estable DPPH (color violeta) capta un átomo de hidrógeno del
antioxidante, formando DPPH-H (color amarillo).

6.2.5. Análisis multivariante.

Se utilizaron los datos de un estudio realizado por Garza-Juárez et al. [11]. Los
datos CLAR-DAD de cuarenta muestras de damiana fueron exportados del programa
Empower en formato ASCII e importados a MATLAB 7.9 (The MathWorks, Inc.); que fue
utilizado para el manejo de las matrices cromatográficas y para realizar el escalado.
Utilizando el programa PLS-Toolbox 6.2 (Eigenvector Research), se realizó la
combinación de datos adyacentes, la corrección de la línea base, el desdoblamiento de
la matriz de datos y la construcción de los modelos matemáticos.

La selección del cromatograma de referencia utilizado en la alineación, la

optimización simplex para establecer la longitud del segmento y el grado de
flexibilidad (slack size) y la alineación mediante COW fueron realizados utilizando los
códigos para Matlab desarrollados por Skov [13] y por Tomasi [14].

120
 Turnera diffusa

Se llevó a cabo un PCA para verificar la utilidad de la alineación realizada

mediante la evaluación de los resultados del modelo antes y después de efectuar la
alineación.

Para construir el modelo PLSR, la matriz X se compone de las huellas dactilares

aumentadas y el vector Y está construido con los valores de referencia de la actividad
antioxidante (EC50) obtenidos por el ensayo con DPPH. Se utilizó la validación cruzada
(CV) en la construcción de los modelos de calibración de PCA y PLSR. El número óptimo
de factores del modelo se determinó con el criterio del valor mínimo de PRESS [15].
Los estadísticos calculados para los modelos de calibración incluyeron el RMSECV y
coeficiente de determinación r2.

6.2.6. Construcción de las huellas dactilares con múltiples longitudes de onda.

El procedimiento general del enfoque utilizado para la construcción de huellas

dactilares aumentadas para plantas medicinales ha sido descrito en las secciones 5.1.4
y 5.2.6. La Figura 5.1 presenta los pasos de manera esquemática. La matriz de huellas
dactilares aumentadas, ya corregida, es utilizada para construir los modelos de
exploración y de regresión por medio del PCA y la PLSR. Tal como se mencionó en el
capítulo 5, esta estrategia permite la inclusión de tantas longitudes de onda como
seleccione el investigador; así, la mayoría de la información cromatográfica relevante
puede ser considerada en la construcción de los modelos matemáticos y por lo tanto,
este enfoque puede alcanzar un mejor desempeño que el obtenido usando una sola
longitud de onda; especialmente en los resultados cuantitativos del PLSR al predecir
una actividad biológica específica.

6.2.7. Alineación de las huellas dactilares aumentadas mediante COW.

En la sección 5.2.7 se describe el procedimiento para la optimización de los

parámetros en la alineación de las huellas dactilares aumentadas.

121
 Turnera diffusa

En el caso de las huellas dactilares de damina, el espacio de optimización para

obtener los valores de la longitud del segmento y el grado de flexibilidad fue definido
como sigue: segmento de 45 a 135 y grado de flexibilidad de 4 a 40. El número de
puntos de inicio en la red de búsqueda se ajustó a 5, el número máximo de pasos de
optimización a 50 y la fracción de la máxima desviación del centro en la alineación
COW al 15%.

6.3. Resultados y discusión.

6.3.1. Resultados del ensayo con DPPH y del método CLAR.

Se determinó el porcentaje de reducción del radical DPPH exhibido por las

diferentes concentraciones de una muestra dada y, posteriormente, fue calculado su
EC50; cada muestra se midió por triplicado, obteniendo valores de RSD entre 0.1 y
18.1%.

La precisión del método cromatográfico fue evaluada considerando los tiempos

de retención relativos, las alturas de los picos relativas y las áreas relativas de 12 picos
comunes a todos los cromatogramas, los cuales abarcaron toda la región
cromatográfica, utilizando la metodología de [1]. Los resultados expresados como RSD
estuvieron entre 0.1 y 2.8% para los tiempos de retención; 2.3 y 12.0% para las áreas
relativas y entre 2.6 y 16.0% para las alturas relativas. Así, todos los resultados
indicaron un comportamiento aceptable de los procedimientos analíticos utilizados.

6.3.2. Construcción de las huellas dactilares aumentadas.

Los cromatogramas fueron muy complejos, presentando unos 46 picos. Para

cada muestra, se obtuvo una matriz de datos cromatográficos con dimensiones 2700 x
158 (tiempo de retención x longitudes de onda).

122
 Turnera diffusa

6.3.2.1. Selección de las longitudes de onda de trabajo.

La Figura 6.2a muestra un gráfico 3D de un cromatograma sin tratar de una

muestra de damiana y su correspondiente gráfico de contorno. Usando el gráfico de
contorno de los datos cromatográficos originales, era difícil obtener información
debido a la alta intensidad de una señal ancha y ruidosa a tiempos de retención
inferiores a 7.66 minutos y que corresponde al frente de elución, que contiene varios
compuestos no resueltos; por lo tanto esta zona de tiempos de retención fue
eliminada de los cálculos posteriores. Además, los tiempos de retención por encima de
35.86 minutos fueron eliminados porque sólo había señal de fondo (línea base). De
esta manera, en el intervalo de tiempo de retención seleccionado, fueron conservados
los picos mejor resueltos y más estables en términos de área y se evitó la inclusión de
ruido o de señales sin información en los modelos matemáticos, quedando ahora
descrita cada muestra por una matriz de dimensiones (1692 x 158).

Figura 6.2. Arriba, cromatograma en 3D (min x nm x absorbancia [A.U.]) de una muestra de

damiana y abajo su respectivo gráfico de contorno; (a) cromatograma completo y (b) después
de la selección del intervalo de tiempo de retención (retention time).

La Figura 6.2b muestra el cromatograma en el intervalo de tiempo de retención

seleccionado. A partir del gráfico de contorno es posible observar que a longitudes de
onda concretas hay diferentes picos con diversas intensidades. La mayoría de los

123
 Turnera diffusa

constituyentes químicos detectados en los extractos de damiana mostraron las

mayores respuestas en cuatro longitudes de onda: 216, 238, 254 y 345 nm; en
consecuencia, los cromatogramas a estas longitudes de onda se utilizaron para
construir la huella dactilar aumentada de cada muestra, nótese que no todos los picos
están presentes en todas las longitudes de onda, véase la Figura 6.3a. De esta manera
se consiguió incluir un gran número de picos con altas intensidades, mientras que las
longitudes de onda con información redundante fueron excluidas.

Figura 6.3. Cromatogramas de una muestra de T. diffusa a las longitudes de onda empleadas
en la construcción de la huella dactilar aumentada.; (a) antes del pretratamiento de datos y (b)
después de la combinación de datos, la corrección de línea base y el escalado. A.U.
corresponde a unidades de absorbancia y Arb. units indica unidades arbitrarias. (c) Aspecto
típico de una huella dactilar aumentada de T. diffusa.

124
 Turnera diffusa

6.3.2.2. Efecto de los pretratamientos.

Se realizó la traspuesta de la matriz de datos que describe cada muestra y se

co-adicionó la dimensión del tiempo de retención. En este caso las variables
adyacentes fueron combinadas de dos en dos, conservando el valor medio;
obteniendo una nueva matriz para representar la muestra de (158 x 847, [longitudes
de onda x tiempo de retención]). Se extrajeron las cuatro longitudes de onda de
trabajo y las dimensiones finales de la matriz fueron (4 x 847).

La Fig. 6.3a muestra las variaciones presentadas por los cromatogramas de una
muestra de T. diffusa a las longitudes de onda seleccionadas para construir las huellas
dactilares aumentadas. La más evidente de estas variaciones fue el cambio en la
pendiente de la línea base; que también fue evidente en el cromatograma 3D de la Fig.
6.2b. Aparece una ligera pendiente a valores negativos a 238, 254 y 345 nm y una
mayor tendencia a valores negativos a 216 nm. En tales condiciones, no era viable
desdoblar la matriz cromatográfica para construir el vector de la huella dactilar
aumentada, de modo que, los datos tuvieron que ser corregidos. Se eliminó la señal de
fondo por medio de WLS utilizando un polinomio de tercer grado. Los principios del
método WLS han sido expuestos en la sección 1.6.1.5 y su aplicación descrita en el
Capítulo 5; se pueden hallar más detalles sobre el método en [16]. La variabilidad en la
escala entre las muestras de damiana se minimizó aplicando para cada variable un
rango de escala de tal manera que, en los vectores con la línea base corregida, el valor
más alto fuera +1 y el más bajo 0. La Fig. 6.3b muestra los resultados de la aplicación
de los pretratamientos a los vectores que forman la matriz cromatográfica. La
combinación de los datos mantiene la información cromatográfica, es decir, no afecta
a las características del cromatograma, y reduce el número de datos de la matriz en la
dimensión del tiempo de retención. La corrección de la línea base eliminó con éxito las
tendencias mostradas por la señal de fondo de los cromatogramas, mientras que al
llevar a la unidad la escala de las huellas dactilares aumentadas permitió mantener las
proporciones de intensidad entre las cuatro longitudes de onda utilizadas para
construir la huella dactilar aumentada, evitando así discontinuidades en los valores de
absorbancia cuando las cuatro longitudes de onda fueron desplegadas.

125
 Turnera diffusa

Finalmente., la matriz corregida se desplegó a lo largo de la dimensión del

tiempo de retención para generar un único vector de datos con dimensiones de 1 x
3388, que es la huella dactilar aumentada de la muestra; Figura 6.3c. Como era de
esperar, la huella dactilar aumentada presentó más conjuntos de picos que los
exhibidos a una sola longitud de onda. Debido al despliegue de la matriz se pierde la
dimensión del tiempo de retención, la cual es sustituida con un índice lineal que
fácilmente se puede traducir otra vez a unidades de tiempo de retención. Las huellas
dactilares aumentadas de todas las muestras se ordenaron en una única matriz para la
posterior alineación y la construcción de los modelos.

6.3.2.3. Alineación.

La corrección del desplazamiento del tiempo de retención fue el último

pretratamiento de datos realizado; los parámetros de entrada fueron la huella dactilar
aumentada utilizada como referencia, la longitud del segmento y el grado de
flexibilidad. La optimización simplex empleada para encontrar los parámetros de
trabajo para la alineación proporcionó una longitud de segmento de 45 y un grado de
flexibilidad de 23; las Fig. 6.4a y Fig. 6.4b presentan las huellas dactilares aumentadas
de varias muestras antes y después del alineamiento utilizando estos parámetros. Los
cambios del tiempo de retención aparecen corregidos correctamente y los picos y
características de los cromatogramas no fueron distorsionadas por el uso del algoritmo
COW.

El gráfico de scores del PCA realizado antes de la alineación (Fig. 6.4c) muestra
dos grupos principales de muestras separadas por la PC1; el grupo en valores negativos
de score en PC1 está también dividió en dos subgrupos. El análisis de los loadings de
este modelo sugirió que el gráfico de scores observado se debe principalmente a los
cambios del tiempo de retención, ya que un gráfico de los loadings presentó un
aspecto distorsionado y exhibió formas similares a las obtenidas cuando se calcula una
derivada; Fig. 6.4e.

126
 Turnera diffusa

Figura 6.4. (a) Sección de varias huellas dactilares aumentadas antes de COW y (b) las mismas
muestras después de la alineación. (c) y (d) Gráficos de score de PC1 vs. PC2 de un PCA global
antes y después de la alineación, respectivamente. (e) y (f) Gráficos de loadings, antes y
después de efectuar COW. (g) Representación de los valores de score de PC1 vs. la actividad
antioxidante (EC50) para cada muestra antes de la alineación y (h) después de efectuarla.

127
 Turnera diffusa

La Fig. 6.4d es el gráfico de scores obtenido después de realizar la corrección de

los desplazamientos del tiempo de retención; la división de los dos subgrupos ya no
está presente y el gráfico de loadings tiene más semejanza a un cromatograma (Fig.
6.4f), lo que sugiere que se corrigieron con éxito los cambios del tiempo de retención.

Con el fin de averiguar si existe algún tipo de relación entre las componentes
principales y la actividad antioxidante, se representaron gráficamente los scores de
cada componente principal calculado por el PCA frente a la actividad antioxidante. La
proyección de las muestras en el eje PC1 está relacionada con los valores de EC50; al
representar los scores de la PC1 vs. la actividad antioxidante, después de la alineación,
fue evidente una relación lineal, véase la Fig. 6.4h. Sin embargo, el mismo gráfico antes
de la alineación no muestra ninguna relación aparente; Fig. 6.4g. No hubo ninguna
relación evidente entre los otros componentes principales y los valores de EC50.

6.3.3. Predicción de la actividad antioxidante (EC50) por PLSR.

Se construyó un modelo PLSR para relacionar la actividad antioxidante y los

datos cromatográficos a partir de las huellas dactilares aumentadas de 30 muestras.
Para evaluar el comportamiento del modelo, se utilizaron 10 muestras no empleadas
para la calibración como un conjunto de predicción externa; los valores de estas
muestras se extienden por todo el intervalo de calibración de la actividad antioxidante.

La matriz X de las huellas dactilares aumentadas tenía dimensiones (30 x 3388)

y su respectivo vector Y de actividades (30 x 1). Los datos de X fueron centrados (mean
centering) y se realizó una validación cruzada, aplicando el método de persianas
venecianas, con 6 divisiones de los datos [17]. Fue elegido un modelo con cuatro
variables latentes (LV) aplicando el criterio del mínimo PRESS, consiguiendo una
varianza explicada del 52.5% para las variables X y de 98.4% para Y; se obtuvo un
RMSECV de 6.02 y un r2 de la CV de 0.928. En ningún caso fueron detectadas muestras
anómalas durante la construcción del modelo.

128
 Turnera diffusa

La Figura 6.5 muestra el gráfico de los valores de EC50 medidos frente a los
valores de EC50 calculados, incluyendo los conjuntos de calibración y de predicción, con
una pendiente de 0.972 (s = 0.022) y una ordenada en el origen de 0.88 (s = 0.94),
indicando que los valores calculados son coincidentes con los medidos.

90

80

70

60
EC50 Predicted

50

40

30

20

10
10 20 30 40 50 60 70 80 90
EC50 Measured

Figura 6.5. ( ) Calibración; ( ) Valor calculado. Representación de los valores de referencia vs.
los valores calculados de la actividad antioxidante (EC50) de cada muestra; se presenta la línea
de regresión.

El error relativo estándar de predicción (RSEP) se calculó como sigue:

∑( y − y )
2
calc exp
=% RSEP ×100 (6.2)
∑y 2
exp

donde ycalc es el valor de EC50 calculado por PLSR, yexp el valor de actividad encontrado
con el ensayo del DPPH; la suma se extiende a todas las muestras de predicción [18]. El
valor de RSEP obtenido utilizando las huellas dactilares aumentadas fue 7.8%, mientras
que el valor calculado a partir de los datos publicados en la referencia [11], utilizando
cromatogramas a 254 nm, fue 20.5%.

129
 Turnera diffusa

La primera variable latente explica el 91.3% de la varianza de Y (EC50), lo que

sugiere que la LV1 contiene la mayor información para predecir la actividad
antioxidante. Las Figuras 6.6a y 6.6b muestran el gráfico de loadings de la LV1 y un
gráfico de la puntuación de la importancia de las variables en la proyección (variable
importance in projection (VIP) scores) para EC50, respectivamente. El VIP estima la
importancia de cada variable utilizada en un modelo PLS en la proyección y se utiliza a
menudo para la selección de variables. Las variables que tienen una contribución
importante en el loading y un valor alto de VIP pertenecen a los compuestos que están
muy relacionadas con la actividad antioxidante. Sin embargo, no puede ser deducido
directamente si estas variables aumentan o disminuyen el valor calculado de EC50, ya
que los valores negativos de loadings no significan necesariamente que las variables en
cuestión tengan una influencia negativa en el resultado calculado, de modo que no es
posible asignar un papel antagonista o sinergista a los picos relacionados a dichas
variables.

Después de reconstruir los cromatogramas a partir de las respectivas huellas

dactilares aumentadas, fue posible asignar las variables importantes encontradas en la
regresión (VIP > 5) a tiempos de retención específicos en cada una de las longitudes de
onda. Estos tiempos de retención se correspondieron con el máximo de los picos. La
Figura 6.6c muestra los cuatro cromatogramas de una muestra; todos los picos
encontrados como relevantes estudiando las Figuras 6.6a y 6.6b fueron marcados,
independientemente de si el pico está presente o no en esta muestra en particular.
Recientemente, Pérez-Meseguer et al. [7] purificaron a partir de extractos de damiana
un compuesto que mostró la mejor actividad antioxidante en un ensayo de CCF a 254
nm; se identificó como 8-C-β-[6-desoxi-2-O-(α-1-ramnopiranosil)-xilo-hexopiranos-3-
ulosido]. Esta es la única fuente natural de donde se ha reportado este compuesto;
estuvo presente en 41 muestras analizadas de damiana nativa y es uno de los
señalados en este trabajo como importante en la misma longitud de onda (en el
tiempo de retención de 19.40 min), pero hay otros compuestos influyendo en la
predicción del valor EC50. Cualquier compuesto marcado como "importante", en
cualquier longitud de onda, contribuye significativamente a la regresión, por lo que
merece mayor investigación.

130
 Turnera diffusa

Figura 6.6. (a) Gráfico de los loadings en LV1 de las variables cromatograficas utilizadas. (b)
importancia de las variables en la proyección (VIP) para EC50; se consideraron importantes
para el modelo las variables con un valor superior a 5. (c) En los cromatogramas que integran
una huella dactilar aumentada de una muestra de T. diffusa, se señalan con un asterisco los
picos relevantes para la predicción del valor de EC50.

6.4. Conclusiones del capítulo.

El enfoque de toma de huellas dactilares cromatográficas aumentadas utilizado

en este trabajo, junto con PLSR, produce muy buenos resultados en la predicción de la
actividad antioxidante a partir de los datos cromatográficos complejos de las muestras
de damiana. Los cromatogramas de cuatro longitudes de onda (216, 238, 254 y 345
nm) fueron compilados en un vector de datos único para construir la huella dactilar
aumentada.

131
 Turnera diffusa

El gráfico de contorno es una herramienta útil para la selección de las

longitudes de onda de trabajo adecuadas para la construcción de las huellas dactilares
aumentadas; los pretratamientos apropiados pueden eliminar las variaciones no
deseadas de línea base.

La alineación de cromatogramas complejos compilados a partir de varias

longitudes de onda fue posible empleando alineación optimizada mediante correlación
(COW), evitando la introducción de ruido y de artefactos matemáticos.

El modelo PLSR construido explica una gran cantidad de la varianza de X e Y

(52.5%, 98.4%; respectivamente); con 4 LVs se obtuvo un valor de 6.02 para el
RMSECV. Para evaluar la fiabilidad, el modelo se aplicó a un conjunto de predicción
externa, obteniendo un RSEP del 7.8%; casi tres veces inferior al obtenido utilizando
sólo la longitud de onda de 254 nm.

Un estudio de la puntuación de la importancia de las variables de regresión en

la proyección y de los loadings de LV1 (con mucho la variable latente más importante
para explicar los valores de Y) hace que sea posible encontrar qué picos
cromatográficos son más importantes para la regresión en las longitudes de onda
elegidas, lo cual es una pista para encontrar compuestos que están relacionados con la
actividad antioxidante.

132
 Turnera diffusa

Referencias.

(1) Garza-Juárez, A.; Waksman-De-Torres, N.; Ramírez-Durón, R.; Salazar Cavazos, M.

Development and validation of fingerprints of Turnera diffusa extracts obtained by use of
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methods. Acta Chromatographica 2009, 21, 217-235.
(2) Alcaraz-Meléndez, L.; Real-Cosío, S.; Robert, M. L. Morphological comparison of damiana
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 Turnera diffusa

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134
  
 
 
7 
 
Conclusiones Generales. 
 
 
 
 Conclusiones Generales 

 
  Se  han  desarrollado  y  validado  métodos  para  el  control  de  calidad  de  cuatro 
plantas  medicinales  con  amplio  uso  comercial,  para  las  cuales  existen  informes  de 
confusiones,  adulteraciones  o  presentación  de  reacciones  adversas  en  los 
consumidores. 
 
  Además  de  los  criterios  empleados  tradicionalmente  para  comparar  los 
resultados de los modelos de clasificación, los cuales se limitan a indicar el número de 
muestras  clasificadas  de  forma  correcta  o  incorrecta,  se  han  utilizado  otros  que 
permiten  obtener  mayor  información  cuando  se  analizan  los  resultados.  Se  han 
establecido  criterios  de  medición  claros  para  la  comparación  de  la  efectividad  de  los 
diferentes modelos de clasificación construidos. En particular, la tasa general de éxito 
en la clasificación, al ser un parámetro que evalúa la efectividad global de los modelos, 
es un criterio sumamente útil. 
 
  Se han ensayado los modelos de clasificación propuestos con mezclas formadas 
por  el  producto  de  interés  y  diferentes  proporciones  y  tipos  de  adulterantes, 
consiguiendo obtener información sobre la capacidad de detección de adulteraciones 
de  los  distintos  métodos  utilizados  y  la  proporción  mínima  de  adulterante 
discriminada. Esto representa un avance frente a la forma convencional de emplear los 
métodos  de  clasificación,  donde  regularmente  se  acota  el  estudio  a  la  diferenciación 
entre especies. 
 
  La  espectroscopia  NIR  ha  demostrado  ser  una  técnica  útil  para  realizar  la 
identificación de las plantas medicinales. En el desarrollo de un método de clasificación 
con  esta  espectroscopia  se  deben  incluir  muestras  que  sean  representativas  del 
material  herbal  a  analizar  y  que  aporten  variabilidad  a  los  modelos  matemáticos,  de 
esta  manera  se  pueden  obtener  buenas  predicciones  de  las  muestras  desconocidas. 
Para  las  plantas  medicinales  analizadas  con  esta  metodología  (E.  senticosus  y  P. 
ginseng), las bandas espectrales procedentes del agua, no aportan una variabilidad útil 
para la construcción de los modelos de clasificación, por lo que esta información debe 
ser  removida  para  obtener  modelos  con  un  resultado  satisfactorio.  El  porcentaje  de 

137
 
 Conclusiones Generales 

adulterante detectado en el descubrimiento de muestras adulteradas fue dependiente 
tanto de la especie de planta presente en la mezcla como del modelo de clasificación 
utilizado. Para las dos especies estudiadas con espectroscopia NIR, DA proporciona una 
capacidad de detección de adulteraciones menor que empleando SIMCA o PLS‐DA. 
 
  La  cromatografía  de  líquidos  de  alta  resolución  acoplada  a  un  detector  de 
diodos  es  una  herramienta  muy  versátil  para  el  control  de  calidad  de  las  plantas 
medicinales, ya que proporciona más información (cromatogramas y espectros) que la 
espectroscopia  de  infrarrojo  cercano  (sólo  espectros).  Aprovechando  esta 
característica de CLAR, fue posible incrementar la información de las huellas dactilares 
combinando  cromatogramas  registrados  a  diferentes  longitudes  de  onda.  El  enfoque 
de  múltiples  longitudes  de  onda  representa  un  incremento  en  la  información 
proporcionada  por  la  variabilidad  química  de  la  muestra,  debido  al  incremento  en  el 
número de picos y a la minimización de la variabilidad no informativa de los datos. Por 
ello,  es  una  buena  alternativa  para  mejorar  los  resultados  tanto  de  una  clasificación 
compleja,  como  para  la  predicción  de  la  actividad  biológica,  tal  como  fue  observado 
para  los  casos  de  V.  officinalis  y  T.  diffusa.  Para  obtener  buenos  resultados,  ya  sea 
usando  múltiples  longitudes  de  onda  como  a  una  única  longitud  de  onda,  es 
imperativo  corregir  las  variaciones  presentadas  de  un  análisis  a  otro  mediante  la 
aplicación  de  pretratmientos.  En  el  caso  de  la  alineación  mediante  COW,  la  correcta 
selección  de  los  parámetros  (vector  de  referencia,  longitud  de  segmento  y  grado  de 
flexibilidad)  es  indispensable  para  evitar  afectar  las  características  de  los 
cromatogramas, previniendo la introducción de artefactos matemáticos. 
 
  La aplicación de quimiometría es fundamental para potenciar las herramientas 
de  control  de  calidad  de  las  plantas  medicinales.  La  técnica  quimiométrica  a  usar 
depende  no  sólo  del  propósito  para  el  cual  fue  estructurado  el  algoritmo,  también 
depende  del  material  herbal  sometido  a  análisis.  Este  hecho  quedo  reflejado  en  la 
clasificación del P. ginseng; para esta raíz medicinal, el mejor método para controlar su 
calidad  fue  SIMCA,  mientras  que  para  E.  senticosus  y  V.  officinalis  la  técnica  más 
adecuada  fue  PLS‐DA.  Los  diferentes  pretratamientos  disponibles  y  la  posibilidad  de 
editar  las  matrices  de  datos  potencian  la  calidad  y  robustez  de  los  resultados 

138
 
 Conclusiones Generales 

obtenidos,  tal  como  fue  observado  con  la  importante  mejora  en  la  predicción  de  la 
actividad  antioxidante  (EC50)  de  T.  diffusa  cuando  fueron  empleados  los 
pretratamientos  adecuados  de  los  datos  y  múltiples  longitudes  de  onda  en  la 
construcción del vector usado como huella dactilar cromatográfica. 
 

139
 
  
 
 
8 
 
Perspectivas. 
 
 
 Perspectivas 

  Este  trabajo  abre  la  posibilidad  de  desarrollar  una  estrategia  para  realizar  el 
control de calidad total de los productos a base de plantas medicinales. El mismo perfil 
cromatográfico o espectroscópico empleado para lograr la identificación de la especie 
correspondiente, puede ser utilizado en la predicción de sus propiedades terapéuticas. 
Sin  embargo,  para  lograr  esta  aplicación  es  necesario  desarrollar  métodos  que 
permitan  medir  objetivamente  la  propiedad  de  interés;  lo  cual  no  siempre  resulta 
sencillo, en especial en las determinaciones in vivo. En el caso de las propiedades que 
puedan ser evaluadas in vitro, debe realizarse un exhaustivo estudio fitoquímico con el 
fin  de  poder  relacionar  el  perfil  químico  (componentes  específicos)  con  la  propiedad 
medicinal  de  interés;  este  es  el  caso  de  T.  diffusa.  Esta  forma  múltiple  de  aplicar  las 
huellas dactilares, permitiría asegurar la llegada al usuario de un producto que no sólo 
es  seguro,  al  recibir  la  planta  correcta,  sino  también  eficaz,  ya  que  su  actividad 
terapéutica ha sido evaluada. Asimismo, estas  estrategias pueden ser aplicadas en la 
detección de señales analíticas relacionadas con una acción sinérgica o antagonista de 
la  actividad  biológica  en  estudio  presentada  por  los  múltiples  constituyentes  de  un 
extracto; por ejemplo, picos específicos en una huella dactilar cromatográfica. 
 
  En esta tesis se utilizaron múltiples longitudes de onda para la construcción de 
un  vector  cromatográfico  que  fue  empleado  como  huella  dactilar  aumentada; 
obteniendo  buenos  resultados.  No  obstante,  el  uso  simultáneo  de  la  información  de 
los  cromatogramas  y  los  espectros  contenida  en  una  matriz  de  datos  en  tres 
dimensiones, es un área de oportunidad para el desarrollo de métodos de control de 
calidad  de  productos  fitoterapéuticos  a  través  de  métodos  quimiométricos 
multidimensionales. 
 
  La  continuación  de  esta  línea  de  investigación  se  enfrenta  al  reto  de  la 
identificación de especies de plantas con perfiles químicos aún más semejantes que los 
encontrados en esta Tesis, que probablemente necesiten de técnicas quimiométricas 
de  clasificación  más  avanzadas  como  máquinas  de  soporte  vectorial  (SVM,  support 
vector machine), redes neuronales y otros. 
 

143
 
  
 
 
 
 
Anexo. 
 
 Anexos 

Los trabajos realizados en esta tesis han dado lugar a los siguientes artículos: 
 
1. Application  of  near  infrared  spectral  fingerprinting  and  pattern  recognition 
techniques for fast identification of Eleutherococcus senticosus.  
J. Ricardo Lucio‐Gutiérrez, J. Coello, S. Maspoch. 
Departament  de  Química,  Universitat  Autònoma  de  Barcelona,  E‐08193 
Bellaterra, Barcelona, Spain. 
Food Research International 44 (2011) 557–565. 
 
2. Enhanced  chromatographic  fingerprinting  of  herb  materials  by  multi‐
wavelength selection and chemometrics. 
J. Ricardo Lucio‐Gutiérrez, J. Coello, S. Maspoch. 
Departament  de  Química,  Universitat  Autònoma  de  Barcelona,  E‐08193 
Bellaterra, Barcelona, Spain. 
Analytica Chimica Acta 710 (2012) 40– 49. 
 
3. Multi‐wavelength  high‐performance  liquid  chromatographic  fingerprints  and 
chemometrics to predict the antioxidant activity of Turnera diffusa as part of its 
quality control. 
J. Ricardo Lucio‐Gutiérreza, Aurora Garza‐Juárezb, J. Coelloa, S. Maspocha, M.L. 
Salazar‐Cavazosb, Ricardo Salazar‐Arandab, Noemi Waksman de Torresb. 
a
  Departament  de  Química,  Universitat  Autònoma  de  Barcelona,  E‐08193 
Bellaterra, Barcelona, Spain. 
b
  Departamento  de  Química  Analítica,  Facultad  de  Medicina,  Universidad 
Autónoma de Nuevo León, C.P. 64460, Monterrey, Nuevo León, Mexico. 
Journal of Chromatography A, 1235 (2012) 68– 76. 
 
4. Expeditious identification and semi‐quantification of Panax ginseng using near 
infrared spectral fingerprints and multivariate analysis. 
J. Ricardo Lucio‐Gutiérrez, J. Coello, S. Maspoch. 
Departament  de  Química,  Universitat  Autònoma  de  Barcelona,  E‐08193 
Bellaterra, Barcelona, Spain. 
(Enviado). 

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