Practica 8 Mitocondria

Universidad de Sucre
Facultad de Educación y Ciencias

Biología Celular
Ph.D Eydyeliana Month Juris
Practica No. 8 Aislamiento de mitocondrias
Introducción
Las mitocondrias son orgánulos dinámicos, cuya función principal es la generación de

ATP a través de un sistema de fosforilación oxidativo. También participan en
numerosas rutas metabólicas, como son: la síntesis de nucleótidos, genera como
subproducto la mayor parte de las especies reactivas de oxígeno, generación y
modulación de las señales de Ca2+ y la muerte celular programada denominada
apoptosis. Según la Teoría de la Endosimbiosis Seriada, “Las mitocondrias son
orgánulos intracelulares derivados de la endosimbiosis de un organismo del grupo de las
proteobacterias con un ancestro de las células eucariotas que contenía un núcleo”. Una
característica importante en la que se basa esta teoría, es el sistema de doble membrana
que poseen las mitocondrias, constituido por una membrana mitocondrial externa y otra
interna separadas por un espacio intermembrana. La membrana externa la separa del
citoplasma y permite el paso de moléculas pequeñas, mientras que la membrana interna
es una barrera muy selectiva, lo que permite el mantenimiento del gradiente de protones
para la síntesis de ATP y presenta una serie de pliegues denominados crestas que le
proporcionan una gran superficie.
Otra característica importante de las mitocondrias, y que sustenta la propuesta antes
mencionada es que ellas poseen su propio genoma, denominado ADN mitocondrial
(mtDNA) el cual codifica para proteínas, tRNA y ribosomas; por lo tanto, el resto de las
proteínas mitocondriales están codificadas por genes nucleares y traducidos mediante su
ARN mensajeros con lo que se obtienen proteínas precursoras mitocondriales. Debido a
la estructura de doble membrana de las mitocondrias, el importe de proteínas es un
proceso complejo ya que las proteínas dirigidas a la matriz deben cruzar la membrana
mitocondrial externa y la interna. El mtDNA es altamente polimórfico, ya que presenta
numerosas diferencias en la secuencia entre individuos del mismo grupo étnico, se ven
incrementados entre individuos de grupos distintos. Los haplotipos de mtDNA se basan
en patrones específicos de polimorfismos y algunos de ellos, parecen estar
relacionados con diversos procesos como la motilidad espermática, el envejecimiento, la
susceptibilidad a diversas enfermedades o la expresión de algunas mutaciones. Debido a
la importancia biológica de estas partículas intracelulares, se han desarrollado diversos
métodos para su aislamiento. La mayoría de estos métodos se basan en el tamaño,
relativamente grande de las mitocondrias y utilizan para su purificación la
centrifugación de tejidos homogeneizados. En esta práctica del Laboratorio del Curso
Biología Celular se realizará un procedimiento para el aislamiento de mitocondrias de
corazón de res con el fin de observar las diferencias en relación a sus patrones de
sedimentación y tinción con colorantes indiferentes, ácidos y
básicos. Este conocimiento es fundamental para que el biólogo que realice
investigaciones bioquímicas, poblacionales o histológicas por citar algunos de ellos
tenga los elementos
básicos para la purificación de mitocondrias.
Competencias
 Comprende los procesos metodológicos para la purificación de mitocondrias.
 Aprende los elementos básicos de centrifugación para la purificación de mitocondrias.
 Aíslala mitocondrias de tejidos animales.
 Diferencia mitocondrias de órganos animales por tinción.
Materiales y reactivos para la práctica

 3 Cajas de Petri.
 Probeta de 50 ml.
 Filtro de malla de tela.
 Gasas (traer los estudiantes).
 Embudo.
 Gradilla
Tubos de fondo cónico, en polipropileno transparente de 15 ml.
 Tubos Eppendorf de 1.5 ml.
 Balanza analítica.
 Vaso de precipitado.
 Centrífuga.
 Rotor con cabezal oscilante.
 Adaptador para rotor de cabezal oscilante para tubos de
15 ml.
 Propipeta automática.
 Pipetas de 5 y 10 ml.
 Micropipetas con puntas desechables de 0.1-1ml y0.02-0.2 ml.
 Pipetas Pasteur.
 Procesador de alimentos (Traer los estudiantes).
 Láminas porta y cubre objetos (Traer los estudiantes).
 Microscopio marca NIKON modelo ECLIPSE E200.
 Lámpara de alcohol.
Tejidos y soluciones:
 Corazón de res (traer los estudiantes).
 Amortiguador fosfatos (HPO4/H3PO4 pH 7.4).
 Gradiente discontinuo de sacarosa al: 30%, 25%, 20%, 15% y 10% disuelta en
amortiguador fosfatos (peso/volumen). Nota el gradiente puede ser también en Percol a
una concentración 60%, 50%, 40%, 30%, 20%disueltas en amortiguador fosfatos.
Sudán IV al 2%, Azul de Metileno al 2% y Eosina al 2%,
disueltos en amortiguador fosfatos.
 Agua desionizada.
Material requerido por los estudiantes:
 Bata de laboratorio.
 Guantes.
 Las personas con cabello largo emplear cofia.
 Tijeras quirúrgicas.
 Pinza hemostática.
Desarrollo de la práctica
Al inicio de la práctica los estudiantes discutirán en grupo la respuesta a cada una
de las siguientes preguntas:
¿Para qué me sirve el saber la forma de aislar mitocondrias en el laboratorio?
¿Qué utilidad tienen el tener mitocondrias aisladas?
¿Existen otros métodos para aislar mitocondrias además de la centrifugación?
¿Puedo usar el conocimiento de mitocondrias en biotecnología u otras áreas
¿Cuál es la utilidad del conocimiento de las mitocondrias en la biología?
Procedimiento de laboratorio.
1. Lave gentilmente con agua corriente 250 gramos corazón de res.
2. Con unas tijeras corte cada uno de los tejidos en fragmentos pequeños y coloque en
su respectiva caja de Petri.
3. Coloque 25 ml de amortiguador fosfatos en el procesador de alimentos junto con 15
fragmentos de corazón de res.
4. Aplique un pulso por 3 min a temperatura ambiente.
5. Realice un frotis y observe en el microscopio para verificar el
rompimiento celular.
6. Filtre el lisado con una malla de tela y con 6-8 gasas hasta obtener 10 ml del lisado.
7. Equilibre en balanza cada uno de los tubos que contienen en lisado.
8. Centrifugue a 1000 gravedades por 10 min a temperatura ambiente.
NO CENTRIFUGUE SI LOS TUBOS CON LA MUESTRA NO ESTÁN
EQUILIBRADOS
9. Transfiera el sobrenadante que contiene las mitocondrias a un nuevo tubo.
10. Coloque 3 ml en la parte superior del gradiente de sacarosa 30, 25, 20, 15, 10 en una
proporción 1:1:1:2:2.
11. Centrifugue a 3500 g por 45 min.
12. Equilibre y centrifugue la fracción recuperada a 3500 x g durante 10 min a
temperatura ambiente.
13. Coloque las mitocondrias a cuatro tubos Eppendorf y afore con 900 microlitros de
amortiguador fosfatos.
14. Adicione 100 l de los colorantes Sudán IV, Azul de Metileno y Eosina y mezcle
suavemente con vortex por 30 segundos.
15. Incube las mezclas por 5 min a 50 grados centígrados.
16. De cada tinción realice un frotis de 50 l en el cubre objetos y fije la muestra por
calor.
17. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitado con agua desionizada para retirar
el exceso de colorante y observe sus muestras en el microscopio.
Resultados preliminares e informe de la práctica.

Las mitocondrias se rompen en contacto con agua desionizada por choque osmótico, es
fundamental que sus extractos y proceso de purificación no entren en contacto con ella
para
garantizar el éxito de su metodología. Si se homogeniza por mucho tiempo, muchas de
las mitocondrias se romperán disminuyendo la calidad de la preparación. En la tinción
con el colorante Sudán IV observará la tinción que corresponde a las grasas y
membranas de las mitocondrias. Mientras que la tinción con Azul de Metileno
corresponderá la tinción del genoma, RNA mitocondrial y proteínas. Finalmente, la
tinción Eosina es únicamente con proteínas. Es importante no traer fracciones de otras
regiones de la centrifugación que pueden contaminar la muestra la representación de los
patrones de centrifugación se indica en la Figura 1.
Figura 1. Representación del patrón de centrifugación para el aislamiento de

mitocondrias. Los valores corresponden al procedimiento experimental.
Referencias de apoyo
Almeida A, Medina JM. A rapid method for the isolation of metabolically active
mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Res Brain Res
Protoc. 1998 Mar;2(3):209-14.
Blan Sanmartín C. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades
mitocondriales. En Repositorio Institucional de Documentos de la Universidad De
Zaragoza España.
Chaiyarit S, Thongboonkerd V. Comparative analyses of cell disruption methods for
mitochondrial isolation in highthroughput proteomics study. Anal Biochem. 2009 Nov
15;394(2):249-58.
Guo W, Jiang L, Bhasin S, Khan SM, Swerdlow RH. DNA extraction procedures
meaningfully influence qPCR-based mtDNA copy number determination.
Mitochondrion. 2009 Jul;9(4):261-5.

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