Metodologia 15

INSTITUTO TECNOLOGICO DE ORIZABA
Manual De Prácticas Del Laboratorio De Ing. Ambiental
Referencia a la Norma ISO
“INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO”
METODOLOGÍA No. 15 FECHA DE REALIZACIÓN__________________
1. COMPETENCIA A DESARROLLAR
El alumno realizara el antibiograma y medir la sensibilidad de una cepa bacteriana

que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos y
seguir la evolución de las resistencias bacterianas.
2. FUNDAMENTO
Se debe realizar un antibiograma siempre que una

toma bacteriológica de finalidad diagnóstica haya
permitido el aislamiento de una bacteria considerada
responsable de la infección.
La determinación de la Concentración Inhibidora

Mínima (CIM) es la base de la medida de la
sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como
la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una
inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de
referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a
diferentes especies bacterianas.
Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:
 Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso

de un tratamiento a la dosis habitual.
 Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida.
No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de
tratamiento.
 Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir
efecto terapéutico en ciertas condiciones
Elaboró: Revisó: Autorizó:

Liliana García Álvarez Q.F.B. Rául Pérez Avila Ing. Arturo Erick
Kevin Ángel González Q.F.B.Jorge Tomas Figueiras Carrillo
Falfán González Rodríguez
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se

inscriben en el DNA bacteriano. Su expresión en el organismo, en donde las
condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso
terapéutico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera
global a fin de descubrir, a través de la comparación de las respuestas para cada
antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente expresado. Así,
gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente sensible será
categorizada como I o R.
3. GENERALIDADES
RESISTENCIA BACTERIANA
Un antibiótico ha sido definido como una sustancia química producida por un

microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. Los
antibióticos modificados por manipulaciones químicas aún se consideran como
tales. Un agente antimicrobiano es activo contra los microorganismos y puede ser
producido en forma natural por microorganismos o sintéticamente en el
laboratorio. El término agente quimio terápico ha sido empleado para referirse a
agentes antimicrobianos sintéticos o no y también se refiere a agentes que actúan
contra células humanas como inmunomoduladores y drogas antitumorales. Los
términos agentes antiviral y agente antimicótico son términos más específicos,
incluidos dentro de la categoría más general de agentes antimicrobianos.
En líneas generales y en función sobre su forma de actuar sobre los

microorganismos, hablamos de dos grandes grupos de antibióticos
 Antibióticos primariamente bactericidas: Ejercen una acción letal e

irreversible sobre el microbio (Fosfomicina Vancomicina. B-Lactámicos
Polimixina. Aminoglucósidos Rifampicina. Ácido Nalidíxico Quinoleinas.
Nitrofurantoinas).
 Antibióticos primariamente bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento, pero no
matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del
huésped pueden eliminar a las bacterias (Tetraciclina Cloranfenicol.
Sulfonamidas Trimetroprim. Lincomicina Clindamicina. Macrólidos). Cada
antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad
antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en

su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por

concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser alcanzadas in vivo.
 La resistencia natural es un carácter constante de todas las cepas de una
misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales
permite prever la inactividad de la molécula frente a bacterias identificadas
o sospechosas.
 La resistencia adquirida es una característica propia de ciertas cepas,
dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio
genético ha sido modificado por mutación o adquisición de genes, son
evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilización de los
antibióticos.
 Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de
resistencia. En general, afecta a varios antibióticos dentro de una misma
familia En ciertos casos, puede afectar a antibióticos de familias diferentes.
 Una resistencia asociada es cuando afecta a varios antibióticos de familias
diferentes. En general, se debe a la. Asociación de varios mecanismos de
resistencia.
EL ANTIBIOGRAMA
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa

bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios
antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para
la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer
lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las

resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de
un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede
adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos
de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el
establecimiento de programas de prevención en los hospitales.
Hay pues un doble interés: Terapéutico y epidemiológico.
SENSIBILIDAD BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS

La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la

medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se
define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que
provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor
fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del
antibiótico frente a diferentes especies bacterianas.
Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y

de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos
automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten
categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al
antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o
Resistente (R) al antibiótico.
Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:
 Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso

de un tratamiento a la dosis habitual.
 Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida.
No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de
tratamiento.
 Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir
efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o
aumento de la posología).
Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados

(S, I, R) obtenidos con estas moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del
grupo, que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la
cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1ª generación que no
es necesario probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la
cefalotina).
Este hecho permite ensayar un número reducido de antibióticos, sin limitar por ello
las posibilidades terapéuticas.
INTERPRETACIÓN DE UN ANTIBIOGRAMA
Ciertos mecanismos de
resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA

bacteriano. Su expresión en el organismo, en donde las condiciones en cuanto a
medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso terapéutico. Para evitar
esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a
través de la comparación de las respuestas para cada antibiótico, un mecanismo
de resistencia incluso débilmente expresado. Así, gracias a la interpretación, una
cepa que aparece como falsamente sensible será categorizada como I o R
(Ejemplo: Una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de BLSE puede
aparecer sensible in vitro a las cefalosporinas de 3" generación. El resultado de
Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya que la utilización de
estos antibióticos correría el riesgo de provocar un fracaso terapéutico).
TÉCNICAS DE ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Los métodos fenotípicos (antibiograma) son los más utilizados. Consisten en

enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a diferentes
concentraciones de antibiótico. La interpretación de los resultados obtenidos
permite clasificar a los microorganismos en categorías clínicas: sensibles,
intermedios o resistentes. Hay que tener en cuenta que no siempre un valor de
CMI más bajo indica mayor actividad de este antimicrobiano, ya que las CMI que
definen la sensibilidad o resistencia son diferentes para cada especie bacteriana y
cada antimicrobiano. Si un microorganismo es sensible indica que con las dosis
habituales se espera una evolución favorable de la infección, siempre que se
alcancen valores adecuados en el lugar de la infección, lo que en ocasiones no es
posible (p. ej., en el sistema nervioso central). Por el contrario, si el
microorganismo es intermedio o resistente, es probable que la evolución sea
desfavorable. La interpretación de la sensibilidad predice mejor el fracaso (cuando
es resistente) que el éxito de un tratamiento.
Las técnicas
de difusión emplean discos de papel impregnados con una solución estandarizada

de antibiótico que se disponen sobre la superficie de un medio sólido previamente
inoculado en su superficie con una suspensión bacteriana. Tras un período de
incubación de 18 h, el diámetro del halo formado está en relación con el grado de
sensibilidad del microorganismo. La carga del disco está ajustada para que los
halos de inhibición permitan diferenciar los microorganismos sensibles de los
resistentes y pueda establecerse una correlación con los valores de CMI: halos
pequeños se relacionan con valores altos de CMI (resistentes) y halos grandes
con CMI bajas.Otra técnica de difusión es el E-test, que además permite la
determinación directa del valor de la CMI. Utiliza tiras de plástico impregnadas con
un antibiótico en concentraciones decrecientes. Al contacto de la tira con el agar,
el antibiótico difunde e impide el crecimiento del microorganismo. Después de la
incubación se observa una zona de inhibición en forma de elipse: el valor de la
CMI es el punto de intersección de la elipse con la tira y está indicado en la escala
impresa sobre la superficie de la tira.
4. MATERIAL
 Cotonetes  Termómetro
 Papel filtro  Cajas Petri
 Antibióticos  Pinzas
 Tubos de ensaye  Mortero con pistilo
 Piseta con agua destilada

5. EQUIPO
 Estufa  Olla
 Incubadora  Parrilla eléctrica
 Cuenta colonias Quebec
6. PROCEDIMIENTO
1. se realiza el medio de cultivo a utilizar
2. se hace la preparación de los antibióticos en manera de suspensión
3.Esterilizar material a utilizar en la estufa durante 30 min
4. dividir cajas Petri en zonas
5. empapar confetis con la suspensión de medicamentos durante un tiempo

determinado.
6. disponer el m.o en el medio de cultivo y colocar confetis
7. incubar durante un tiempo determinado y observar los resultados.
7. PREGUNTAS
1. ¿CUÁNDO REALIZAR UN ANTIBIOGRAMA?
Siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnostica haya permitido el

aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.
Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el bacteriólogo y el

clínico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbiólogo no podrá determinar
con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los
datos clínicos que le aporta el médico. Por ejemplo, una bacteria no patógena
puede ser responsable de la infección de un enfermo inmunodeprimido o en un
lugar determinado del organismo. La presencia de signos clínicos puede ser
también determinante para la realización de un antibiograma (por ejemplo: la
infección urinaria con un número reducido de gérmenes).

¿CUÁLES SON LOS ANTIMICROBIANOS QUE BLOQUEAN MECANISMOS DE

RESISTENCIA?
Los más importantes son los inhibidores de β-lactamasas de serina, que incluyen
ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam. Carecen (habitualmente) de acción
antibacteriana intrínseca de verdadera importancia clínica, pero se unen
irreversiblemente a algunas β-lactamasas, protegiendo de su acción a los
antibióticos β-lactámicos. El sulbactam, además, es activo frente a A. baumannii.
Aunque se conocen sustancias que bloquean in vitro las bombas de expulsión

activa o las enzimas modificadoras de aminoglucósidos, ninguna de ellas ha
podido introducirse en terapéutica.
8. ANEXAR FOTOGRAFÍAS, ESQUEMAS Y OBSERVACIONES PERTINENTES
Se preparo agar de papa

dextrosa el cual se vertió
en 3 cajas Petri esperando
a que se solidificaran. Se pulverizo cada antibiótico en el
mortero los cuales se hicieron
suspensiones en tubos de ensaye con
agua destilada los cuales se les
agrego los confetis ya esterilizados
emergidos durante 30 minutos.
Antibióticos utilizados
1. Paracetamol
2. Aspirina
3. Terramicina
4. Nimesulida

Se hizo un esparcimiento Se coloco el confeti Se llevo a incubación durante

con un cotonete empapado del medicamento 48 hrs para que halla un
esterilizado del en medio de la zona. Cada crecimiento microbiano y así
microorganismo en toda la los antibióticos actúen ante
zona contiene un
caja Petri m.o.
medicamento que actuara
El m.o utilizado es E. Coli contra el m.o colocado en
toda la caja.
9. RESULTADOS

En este equipo se observa 53 U.F.C en 20

cuadros
53 U.F.C---- 20 cuadros
X= 318 U.F.C
X---- 120 cuadros
En dilución en 0.5 ml
318 U.F.C ------ 0.5 ml
X-------1 ml
X=636 U.F.C/ ML  VIVAS
CONCLUSIÓN
Al momento de realizar esta actividad experimental, algunos de los métodos o de

las instrucciones indicadas fueron hechas mal, ya que a las 24 horas no se
presentó ningún crecimiento de bacterias, ni la presencia de los halos de
inhibición, pensamos en la teoría de que eran demasiado buenos los antibióticos
utilizados, rechazando este teoría ya que los demás equipos si presentaron
cambio y halos de inhibición, a las 48 horas se obtuvo un crecimiento mayor de
microorganismo un leve halo de inhibición en uno de los antibióticos.
DISPOSICIÓN FINAL Y TRATAMIENTO DE RESIDUOS
Al término de la fermentación se dispuso a esterilizar la muestra la cual se vertió a

una de las plantas dentro de la institución, ya que no es dañino para su ambiente y
es un nutriente para el mismo.

BIBLIOGRAFÍA
Nombre del Libro, Nombre del autor, Edición y Páginas consultadas.
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/
https://es.slideshare.net/AlexisQuirozFrausto/practica-halosdeinhibicion
LISTA DE COTEJO PARA EL REPORTE DE LA PRÁCTICA DE

LABORATORIO
El reporte es un recuento breve de las actividades realizadas en la práctica,

identificando los pasos del método científico que se hayan aplicado, incluyendo los
resultados y las conclusiones, junto con las respuestas a las preguntas que se
hayan planteado
Competencias Estándares Sí No Observaciones
1) Empleo adecuado del material de vidrio
2) Empleo adecuado del instrumental

electrónico o mecánico
Científico
3) Utilizó la ropa de trabajo
Técnicas
adecuadamente.
4) Cuidado y limpieza del instrumental
5) Sigue las indicaciones del docente al

respecto del manejo de algunos productos
peligrosos o delicados.
Metodológicas 6) Secuencia lógica de los pasos a seguir
7) Capacidad de análisis e interpretación

de resultados

8) Correcta expresión, redacción y

ortografía; elaboración de un informe final
conforme a los pasos del método
científico; cuestionario contestado
correctamente.
9) Empleo de vocabulario técnico

adecuado
10) Cumplimiento de la tarea en el tiempo

asignado
11) Consulta sus dudas de forma clara y

concisa
12) Mantenimiento del orden en el lugar

de trabajo
13) Comunicación con los integrantes del

Sociales
grupo de trabajo
14)Respeto por las normas de seguridad e

higiene


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El alumno realizara el antibiograma y medir la sensibilidad de una cepa bacteriana

Se debe realizar un antibiograma siempre que una

La determinación de la Concentración Inhibidora

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:

 Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso

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Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se

Un antibiótico ha sido definido como una sustancia química producida por un

En líneas generales y en función sobre su forma de actuar sobre los

 Antibióticos primariamente bactericidas: Ejercen una acción letal e

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su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las

SENSIBILIDAD BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS

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La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la

Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:

 Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso

Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados

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resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA

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Los métodos fenotípicos (antibiograma) son los más utilizados. Consisten en

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de difusión emplean discos de papel impregnados con una solución estandarizada

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1. se realiza el medio de cultivo a utilizar

2. se hace la preparación de los antibióticos en manera de suspensión

3.Esterilizar material a utilizar en la estufa durante 30 min

4. dividir cajas Petri en zonas

5. empapar confetis con la suspensión de medicamentos durante un tiempo

6. disponer el m.o en el medio de cultivo y colocar confetis

7. incubar durante un tiempo determinado y observar los resultados.

1. ¿CUÁNDO REALIZAR UN ANTIBIOGRAMA?

Siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnostica haya permitido el

Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el bacteriólogo y el

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¿CUÁLES SON LOS ANTIMICROBIANOS QUE BLOQUEAN MECANISMOS DE

Aunque se conocen sustancias que bloquean in vitro las bombas de expulsión

8. ANEXAR FOTOGRAFÍAS, ESQUEMAS Y OBSERVACIONES PERTINENTES

Se preparo agar de papa

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Se hizo un esparcimiento Se coloco el confeti Se llevo a incubación durante

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