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PROTOCOLOS DE LABORATORIO BIOLOGIA CELULAR Portada: Elaborado por:

Edición: Los autores

Book · January 2009

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Sello Editorial Universidad del Tolima

Universidad del Tolima-Sello Editorial
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PROTOCOLOS DE LABORATORIO
BIOLOGIA CELULAR

Impresión:

Ediciones Gaira - Ibagué - Colombia

Primera edición 2007 500 ejemplares
Segunda edición 2008 500 ejemplares
Tercera edición 2008 500 ejemplares
Cuarta edición 2009-2014 2000ejemplares
Quinta edición 2015 500 ejemplares

ISBN 978-958-44-1645 - 2

Portada:

Libro Protocolos de laboratorio de Biología

Celular.

Elaborado por:

Leonardo Bonilla
Biológo Universidad del Tolima
Marco Fidel Avila Rodríguez
Licenciado Universidad del Tolima

Edición:

Los autores

El libro protocolos de laboratorio de Biología

Celular es una compilación de protocolos
practicados habitualmente en los cursos de
biología celular y fundamental en los
laboratorios de docencia de la Universidad
del Tolima

Prohibida la reprodución total o parcial de

esta obra, por cualquier medio, sin
autorización escrita de los editores.
Este libro recoge los protocolos que ustedes deben desarrollar en las prácticas de laboratorio.
Documento imprescindible como instrumento de guía para los estudiantes que deberán trabajar
con él, durante todo el semestre.

La elaboración de este material corresponde a una compilación de guías, existentes en el

departamento de Biología de la Universidad del Tolima, al igual que de diferentes fuentes,
enriquecidas con informaciones externas de revisiones actualizadas.
Autores del libro de protocolos:

Liliana Francis Turner Ph.D.

Área de Investigación y experiencia: Neurociencia y Biotecnología, profesora
vinculada a la Facultad de Ciencias de la Universidad del Tolima, Coordinadora
del Diplomado en Ciencia y Experimentación Animal y del grupo de investigación
Modelos Experimentales para las Ciencias Zoohumanas.

Librada Ramírez de Collazos Lic. Esp.

Área de Investigación y experiencia: Neurociencia y Biología celular,
profesora vinculada a la Facultad de Ciencias de la Universidad del Tolima y al
Magisterio.

Fredy Arvey Rivera Páez M. Sc.

Área de Investigación y Experiencia: Parasitología tropical, Biología molecular
y Biología celular, profesor vinculado a la Facultad de Ciencias de la Universidad
de Caldas.

Marco Fidel Ávila Rodríguez Lic. M. Sc.

Área de Investigación y Experiencia: Neurociencia y Biología celular, profesor
vinculado a la Facultad de Ciencias de la Universidad del Tolima.

2
 Queridos estudiantes,
El propósito de este cuaderno es que ustedes, que emprenden hoy el arduo
camino de la formación académica superior y científica, comiencen a crear los
valores y la formación para las carreras que han seleccionado. El trabajo de
laboratorio debe desarrollase de forma responsable, consiente y organizada,
trabajar por protocolos permite fácilmente tener reproducibilidad en los datos
obtenidos.

Aplicar LAS BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, es esencial para el

resultado de nuestro trabajo y su cumplimiento nos garantizará la normatividad,
calidad, fiabilidad y excelencia en los resultados.

Los protocolos que aquí encontrarán los guiarán durante sus actividades
prácticas en las asignaturas de Biología celular y fundamental, el uso de este
documento, le servirá como material de estudio y trabajo sistemático durante
todo el semestre.

Utilícenlo y disfrútenlo,

Éxitos muchachos,

Liliana, Librada, Marcos y Freddy.

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RECOMENDACIONES GENERALES, TÉCNICAS Y MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN UTILIZADOS EN
BIOLOGÍA CELULAR

IMPLEMENTOS NECESARIOS

✓ Bata blanca de laboratorio

✓ Láminas y laminillas en cantidades suficientes
✓ Paquete de cuchillas de afeitar nuevas
✓ Bayetilla
✓ Papel absorbente
✓ Libro de protocolos
✓ Cuaderno de apuntes (opcional)

Nota: los elementos solicitados son imprescindibles y su uso es personal. Deben traerse a
todas las sesiones de prácticas del curso y a las evaluaciones.

INFORMES DE LABORATORIO

Este folleto les servirá como guía de trabajo, en él, podrán plasmar sus observaciones y
conclusiones, por lo que tendrá un doble propósito: enseñar y evaluar, les permitirá a ustedes
autoevaluarse y al profesor evaluar el trabajo que ustedes han realizado.

Los dibujos deben ser hechos a lápiz según lo observado (no es indispensable el uso de colores,
es opcional). Las observaciones deben definir aspectos como: tipo de estructura observada (por
ejemplo, célula de elodea), aumentos, tipo de preparación, tipo de tinción. No debe llevar
descripción, ni explicación si su guía no se lo orienta.

INSTRUCCIONES GENERALES

Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales
que deben ser observadas con toda disciplina.
1. Estar a tiempo en el laboratorio.
2. Usar la bata blanca durante todo el laboratorio. No usar cachuchas en el laboratorio.
3. Mantener apagados los celulares durante el laboratorio.
4. El laboratorio de Biología es un lugar donde se aprende mediante la observación y la
experimentación, es un sitio de trabajo serio y peligroso, si no se conservan las mínimas
normas de seguridad.
5. Leer cuidadosamente las instrucciones de cada práctica. NUNCA LLEGAR SIN SABER
LO QUE VAA HACER.

5
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6. El material utilizado en las prácticas es de propiedad de la Universidad, por lo tanto
debe manejarse con cuidado y una vez usado debe devolverse en buen estado. En caso
de daños o pérdidas, el elemento debe reponerse con uno de las mismas características.

7. No comer, beber, fumar o aplicar cosméticos en el laboratorio.

8. Al iniciar la sesión reportar al auxiliar de laboratorio o al profesor cualquier anomalía en

el microscopio, o material a ser utilizado. Bajar la intensidad lumínica al microscopio
mientras no lo esté usando.

9. En el caso de los microscopios con fuente eléctrica, apagar el equipo tres minutos antes
de guardarlo.

10. Antes de realizar una práctica, lea detenidamente el protocolo para adquirir una idea
clara de su objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre anotados
cuidadosamente apenas se conozcan.

11. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En

consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el
material que se ha utilizado. Cada grupo de práctica se responsabilizará de su zona de
trabajo y de su material.

12. Limpiar adecuadamente el mesón de trabajo con solución de hipoclorito de sodio al 5%

al empezar y al terminar su trabajo.

13. Antes de utilizar un compuesto, fijarse en la etiqueta para asegurarse que es el que
se necesita y evitar riesgos en su manipulación.

14. Nunca devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados
sin consultar con el profesor.

15. No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos. Todo el
material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben
manejarse con mucho cuidado evitando forzar los mecanismos.

16. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados
del fuego. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño
María, nunca directamente a la llama.

17. Si se manejan mecheros a gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso
al apagar la llama.

18. Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con
cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán
bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su
pared.

6
6
19. Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe adicionar agua sobre ellos; siempre
al contrario: ácido sobre agua.

20. Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma
que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se
deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco
posteriormente.

21. No pipetear con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio
que se disponga en el centro. Las pipetas se tomarán de forma que sea el dedo índice
el que tape su extremo superior para regular la caída de líquido.

22. Al enrasar un líquido, con una determinada división de escala graduada, debe
evitarse el error de paralaje, levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos
para que la línea visual al enrase sea horizontal.

23. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen líquidos, debe evitarse
la ebullición violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de
ensayo se acercará a la llama inclinado y procurando que ésta actúe sobre la mitad
superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullición rápida, se
retirará, acercándolo nuevamente a los pocos segundos y retirándolo otra vez
al producirse una nueva ebullición, realizando así un calentamiento intermitente.
En cualquier caso, se evitará dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra
persona.

24. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de

haberlos calentado, esto puede ocasionar fisuras en el vidrio y posterior rotura del
mismo.

25. Los cubreobjetos y portaobjetos deben tomarse por los bordes para evitar que se
engrasen. Siempre que manipule sangre, suero u otro material biológico, cualquiera
sea su procedencia, use guantes.

26. Los desechos infecciosos como agujas y hojas de bisturí, deben ser depositadas en
bolsas de color rojo “sin sacarlos de su guardián”. Los desechos no peligrosos
(Biodegradables y/o inertes) se depositan en bolsas de color verde.

27. Lavar las manos con agua y jabón una vez concluida las labores de laboratorio.

28. Otras observaciones sugeridas por el profesor o el auxiliar de laboratorio.

“LAS NORMAS DE SEGURIDAD, SON NORMAS DE VIDA “

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INTRODUCCIÓN

Para desarrollar un trabajo en el laboratorio, primero hay que conocer bien los
implementos y materiales que vamos a utilizar, su correcto uso y función. Esto permite
realizar un trabajo de forma eficiente, ágil, y calificado.

OBJETIVOS
✓ Identificar los diferentes implementos del laboratorio de biología por su nombre y su
forma.
✓ Diferenciar el uso que se le da a cada uno de los implementos.
✓ Clasificar los implementos según el tipo de material.
✓ Hacer un buen uso del material de laboratorio.

PROCEDIMIENTO

Los materiales utilizados en el laboratorio se pueden clasificar de acuerdo con su

constitución en materiales de: vidrio, porcelana, metálicos, madera, corcho, plástico y
equipos especiales.

Material de vidrio

Refractario: Vasos de precipitados o beaker, erlenmeyer, tubos de ensayo, matraces

(balón de fondo plano, balón fondo redondo, y con desprendimiento lateral).
No refractario: Este grupo está constituido por material de vidrio volumétrico y no
volumétrico. En este grupo se incluyen desecador, frascos, vidrio de reloj, probetas,
pipetas, refrigerantes, embudos de decantación y filtración, termómetros, caja de petri.

Material de porcelana

Refractario: Crisoles, cápsulas de porcelana, triángulo de porcelana.

No refractario: Morteros y mangos, espátulas de porcelana.

Material metálico

Soporte universal, aros metálicos, malla asbesto, mecheros, pinzas metálicas para
crisoles y tubos de ensayo, espátulas metálicas.

Material de madera, corcho y plástico

Mangueras de caucho, tapones de caucho, gradillas para tubos de ensayo, pinza de

madera para tubos de ensayo

Equipos y material especial

Frascos lavadores, churruscos, papel de filtro, balanza, microscopio, estereoscopio,

autoclave, pipetas, micropipetas, incubadora, etc.

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Los conocimientos sobre la célula progresan simultáneamente con los avances tecnológicos del
instrumental de laboratorio, (microscopios, balazas, cristalería) los descubrimientos de
tinciones que facilitan la visualización de tejidos, células y organelos y los avances teóricos que
brindan al investigador elementos de análisis para la interpretación de los procesos.

Con el uso de los microscopios de altos poderes y resolución y de amplificación de las

imágenes, se han perfeccionado los métodos para el uso individual de orgánulos celulares,
observar la interrelación entre los componentes celulares y describir la señalización de las
moléculas que participan en el metabolismo celular.

El desarrollo de los cultivos in vitro contribuye a conocer, en forma más precisa, el

comportamiento celular ya su vez ha contribuido a la selección de modelos biológicos
experimentales enfocados a elucidar la dinámica celular dentro de los organismos. De acuerdo
con los anteriormente mencionados a continuación se expone algunas de las técnicas que
se utilizan en biología celular y la investigación biomédica:

1. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

La observación de organismos es una de las técnicas fundamentales de estudio en biología

celular, se realiza principalmente utilizando como herramienta el microscopio óptico, razón por
la cual, las muestras a ser observadas deben experimentar una serie de pasos para obtener la
máxima información visual de las mismas.

Preparación en fresco: Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso

que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra,
sobre un portaobjetos y cubrirla, sin formar burbujas de aire, con un cubreobjeto.

Técnicas de tinción: En general, el proceso seguido en todas las tinciones se caracteriza por
presentar las siguientes etapas:

1. Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la

muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente
en una gota de agua.

2. Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas
para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra
repetidamente a 10cm de la llama del mechero ó mediante soluciones de fijación como el
Carnoy.

3. Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los
procesos anteriores.

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La mayoría de los colorantes se comportan como bases o como ácidos, en los colorantes
básicos, los cromóforos o grupos químicos responsables del color, son catiónicos, estos se
combinan con los grupos ácidos (aniónicos) de las moléculas celulares.

Por esta razón, los ácidos nucleicos son basófilos, es decir presentan afinidad por
colorantes básicos cuyos radicales se unen a los radicales ácidos del ADN y del ARN. El azul
de Toluidina, el azul de metileno y la hematoxilina son ejemplos de colorantes básicos. En
los colorantes ácidos, los cromóforos son aniónicos (carga eléctrica negativa) y tienden a
unirse con los componentes celulares de carácter básico, que son eléctricamente positivos.

Así las estructuras celulares ricas en grupos básicos son acidófilas por su afinidad con los
colorantes ácidos. La eosina, el orange G y la fuscina, son ejemplos de colorantes ácidos.

Entre los diferentes tipos de tinción están:

Tinción Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo sino el entorno, aumentando de

este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota de colorante (nigrosina-
tinta china).

Tinción Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la
tinción negativa, nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las
células.

Tinción Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura.
El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero,
denominándose colorante de contraste.

2. CORTES DE TEJIDOS

Consiste en la obtención de porciones laminares de tejidos, suficientemente delgadas para

ser visualizadas en el microscopio, como preparados frescos o preparados permanentes.
Los frescos pueden tincionarse o no. Los preparados permanentes requieren de un proceso
de fijación para evitar la autólisis celular, la contaminación fúngica y bacterial, y para
aumentar la afinidad de las estructuras celulares con el colorante.

En general los fijadores deben garantizar que las estructuras y moléculas se mantengan en
la forma más intacta posible. Una vez fijado el tejido, se procede a realizar los cortes, para lo
cual se utilizan equipos con cuchillas especiales entre los que se encuentran los micrótomos
y vibrátomos que facilitan la obtención de cortes de dimensiones micrométricas. Mientras
más potente sea el microscopio, se requieren cortes más delgados. Los cortes se someten
al proceso tinción para tornar visibles los organelos que, generalmente, son incoloros.

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3. CITOQUÍMICA

Esta técnica se utiliza para localizar sustancias componentes de la célula, para lo cual, se
utilizan tinciones. Generalmente, la intensidad del color que muestran las estructuras es
proporcional a la concentración de la sustancia coloreada.

Una técnica citoquímica muy conocida para localizar el ADN es la reacción de Feulgen, que
consta en desnaturalizar el ADN es decir, separar las hebras para posteriormente ser tratadas
con el reactivo de Schiff, formando un complejo de color rojo, por lo tanto la intensidad del rojo es
proporcional a la cantidad de ADN presente. Gracias a la reacción, hoy se sabe que la cantidad
ADN es fija para cada especie y que el ADN se duplica antes que la célula entre en mitosis.

4. HIBRIDACIÓN in situ (Fluorescent In Situ Hybridization FISH)

FISH es una tecnología que utiliza fragmentos marcados de ADN con fluorescencia (sondas)
para detectar o confirmar anomalías genéticas o cromosómicas, esto quiere decir que los
fragmentos marcados se unen al ADN de los cromosomas debido a la complementariedad
entre las secuencias de las bases nitrogenadas, posteriormente se utiliza un microscopio de
fluorescencia, que exhibe una luz especial que permite visualizar las áreas de los cromosomas
que fueron marcadas con la o las diferentes sondas.

El procedimiento para llevar a cabo esta técnica consta de varios pasos, primero, la muestra de
ADN (cromosomas en metafase o núcleos en interfase) se desnaturaliza, proceso que separa
las hebras complementarias de la estructura en doble hélice del ADN, posteriormente se
introduce la sonda de interés marcada con fluorescencia, que se hibridará (unirá) al ADN de la
muestra en el sitio específico, el proceso es denominado templado. La señal de la sonda se
observa mediante un microscopio de fluorescencia y la muestra de ADN se clasifica según la
presencia o ausencia de la señal.

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5. INMUNOCITOQUÍMICA

Mediante el uso de esta técnica se puede localizar proteínas específicas. La técnica se basa en
la reacción antígeno-anticuerpo. Si se toma, por ejemplo, una muestra de tejido de un órgano de
un ratón, se extrae y se purifica una proteína, que se denomine por ejemplo, proteína X,
podemos conocer luego, en que células o partes de la célula está localizada la proteína X, pues
ella se aisló de un órgano completo.

La proteína X purificada actúa como antígeno (es decir, como una partícula extraña) si se
inyecta a otro animal, por ejemplo a un conejo; entonces, el conejo formará anticuerpos contra la
proteína X y se combinarán inmediatamente con ésta proteína. De la sangre del conejo, es
posible extraer el anticuerpo específico de la proteína X. Si éste anticuerpo se marca, por
ejemplo, con una peroxidasa, donde se identifique la peroxidasa estará también el anticuerpo.
Si se coloca un corte del órgano del ratón que contiene la proteína X y se aplica sobre él una
solución de antígeno (proteina X) con su anticuerpo (gammaglobulina anti-X) marcado con
peroxidasa. Este conjunto puede ser identificado bajo el microscopio según la marca que se
coloque al anticuerpo; si es peroxidasa, se observarán puntos color café donde se encuentre el
complejo antígeno – anticuerpo. Del mismo modo la peroxidasa puede reemplazarse por un
colorante fluorescente y entonces se identificará por la emisión de luz. Esta técnica permite la
identificación específica de proteínas mediante el uso de diferentes metodologías de marcaje en
el anticuerpo para posterior detección.

6. AUTORRADIOGRAFÍA

La autorradiografía es una técnica de detección de moléculas marcadas radiactivamente, que

emplea emulsiones fotográficas sensibles a la partícula radiactiva o a la luz producida por una
molécula intermediaria. La emulsión que contiene plata es sensible a la radiación particulada
(alfa, beta) o electromagnética (radiación gamma, luz,...), de forma que se precipita en forma de
plata metálica. El revelado de la emulsión revelará en forma de precipitados oscuros la región en
la que se localizan las proteínas radiactivas

Si se coloca un cultivo de células en un medio con un aminoácido radiactivo o marcado,

podemos conocer a dónde se incorpora estos aminoácidos. Si se inyecta timina radiactiva
marcada con Tritio (H3) a un animal experimental, la timina será incorporada solamente en los
núcleos celulares que estén sintetizando ADN. Para el ARN se utiliza uracilo marcado con Tritio
(H3). Los cortes del tejido experimental se cubren con una emulsión fotográfica que será
impresionada por el material radiactivo. Al revelarse la emulsión fotográfica, aparecen gránulos
negros de plata sobre el sitio específico en el que se encuentra el material radioactivo.

7. CROMATROGRAFÍA Y ELECTROFORESIS

La cromatrografía y electroforesis son técnicas que permiten conocer los tipos de proteínas que
forman parte de una estructura o que son sintetizadas por un órgano o tejido.

La cromatrografía es una técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias puras de
mezclas complejas. Estas técnicas depende dle principio de absorción selectiva.

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La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano, Mijaíl Tswett en 1906,
pero su uso no se generalizó hasta la década de 1930. Tswett separó los pigmentos de las
plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en éter de petróleo sobre una columna de
carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida que la disolución va
filtrándose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad,
quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas
cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente.

Actualmente la cromatografía presentas variables que permiten una mejor y mayor separación
de los compuestos y además tomando en cuenta las necesidades investigativas, entre dichas
variables se encuentran la cromatografía de columna, la cromatografía líquida de alta eficiencia
también llamada HPLC, la cromatografía gas líquido y la cromatografía de papel.

La electroforesis es una técnica analítica de separación de ácidos nucléicos y proteinas. La

separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas
cargadas eléctricamente cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico. es decir si
aplicamos un campo eléctrico negativo a una molécula con carga neta positiva, la molécula será
atraída por este campo. Los ácidos nucleicos son macromoléculas cargadas negativamente,
debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster
de las cadenas polinucleotídicas condiciona la carga de un ácido nucleico, que es
aproximadamente igual al número de grupos fosfato.

La electroforesis generalmente se realiza en una matriz gelatinosa o también denominada gel,

entre estos los más utilizados son los geles de azarosa y los de poliacrilamida, cada uno de ellos
presenta características especiales que deben ser tomadas en cuenta al hacer uso de estos en
los procedimientos experimentales. La electroforesis se realiza en cubetas apropiadas,
generalmente apropiadas, generalmente horizontales, y requiere dos elementos
indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil es el medio tamponado que
permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando
se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria corresponde al gel.

El polímero utilizado para el análisis electroforético de ácidos nucleicos de gran tamaño (100pb-
10kb) es la agarosa. La migración de los fragmentos de ácidos nucleicos (ADN o ARN) en un gel
de agarosa sometido a un campo eléctrico depende tanto del voltaje del campo, como del
tamaño de poro del gel de agarosa. La separación efectiva de los fragmentos de ADN o ARN
(resolución) depende tanto de la masa como de la carga de los distintos fragmentos, en realidad
de la relación carga/masa. Transcurrida la electroforesis, la localización relativa de los
fragmentos se determina mediante distintos métodos de detección. La tinción con bromuro de
etidio, una sonda fluorescente tras iluminación con luz UV, es un método generalizado de
detección de fragmentos de ADN, ya que la sonda se intercala entre la doble hélice de ADN y
emite luz.

La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de

muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína. Las
proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH
diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se
someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las
cargas de la proteína y su masa, cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la
migración.

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8. CULTIVOS CELULARES

Aplicaciones del cultivo celular.

Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y
aproximaciones al estudio del fenómeno celular.

a. Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares,

como por ej. transcripción de ADN, síntesis de proteínas, metabolismo energético.
b. Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los
diferentes procesos fisiológicos, como por ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes
componentes intracelulares, movimientos del ARN: núcleo-citoplasma, movimiento de
proteínas.
c. Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de
la funcionalidad celular, de su diferenciación., como por ej. estudio de las necesidades
nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular (inducidas por virus o agentes
químicos), cinética de la población celular.
d. Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica,
inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.

Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo

celular se encuentran:

1. Virología: Establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas,

producción de vacunas antivirales.
2. Investigación del Cáncer
3. Inmunología: Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la
producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula
somática.
4. Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón,
insulina, hormona de crecimiento.
5. Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo:
Comprende el estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal.
6. Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis
cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de
infecciones virales, ensayos de toxicidad,...
7. Aplicaciones médicas: Mantenimiento y producción de tejidos para trasplante.
8. Aplicaciones industriales y agronómicas: Producción por reproducción "in vitro" de clones de
plantas de interés comercial.

La manipulación de las células en cultivo, requiere en muchos casos la introducción de

moléculas en el interior de las mismas, bien sea para observar el efecto que produce la molécula
en sí (por ejemplo una droga inhibidora de las proteasas citosólicas) o para producir la síntesis
de otras moléculas (por ejemplo la introducción de un plásmido en el que se ha colocado bajo el
control de un promotor que funciona en la célula de elección una secuencia codificante para la
proteína buscada). En este último caso la célula es empleada como factoría de síntesis de
moléculas a la que se le suplementa con la información que precisa.

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Además, las denominadas técnicas de terapia génica se basan en la modificación de las
células de un organismo mediante la introducción de genes normales o modificados. En
cualquier caso supone la incorporación y expresión por parte de las células de un organismo de
nuevos genes. Las células vivas presentan una barrera a la libre difusión de moléculas que es la
membrana plasmática. Esta barrera evita la pérdida de componentes fundamentales de la
célula, impide la entrada de moléculas externas y por ello posibilita la existencia de gradientes
de concentración de productos a través de la membrana. Para poder superar esta barrera a la
difusión se han diseñado muchas estrategias experimentales, unas basada en la formación de
poros u orificios en la membrana, más o menos permanentes, y las otras en la vehiculización de
moléculas hacia el interior celular mediante el uso de las vías naturales de entrada de
macromoléculas, la endocitosis.

Se trata de técnicas que permiten mantener las células vivas, inmersas en una solución durante
un periodo de tiempo que no suele superar las pocas horas en condiciones tales que presentan
gran cantidad de orificios en la membrana. Cualquier molécula añadida a la solución que las
rodea penetra en la célula gracias al gradiente de concentración. Se obtienen mediante
tratamiento suave con detergentes que solubilizan parcialmente las membranas.

Es una técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un
periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las células despolarizan sus membranas y se
forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, ADN,...) que se
encuentran alrededor. Pasada la despolarización muchas células sufren daños irreparables y
mueren (en muchos casos más del 90%) pero algunas (5 al 10% habitualmente) se recuperan y
han incorporado las moléculas deseadas. La ventaja de esta técnica es que se aplica a millones
de células a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del
100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones). Es una técnica que
requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de determinar las condiciones óptimas de
duración y potencia del pulso. Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que
aseguran la entrada en la célula y las que maximizan la viabilidad celular.

La microinyección es una tecnología que permite la introducción mecánica de soluciones en el

interior de la célula mediante una micropipeta que se controla con la ayuda de un
micromanipulador bajo un microscopio. Es una técnica muy sensible, que requiere una gran
especialización del personal que la realiza y un equipo delicado, sofisticado y costoso.

Los instrumentos modernos de microinyección manipulados por personal experto permiten

realizar algunas decenas de inyecciones por hora de trabajo. Es por ello un sistema tedioso que
permite manipular pocas docenas o escasos cientos de células con un gran trabajo.

En la naturaleza existen sistemas de microinyección naturales, realizados por virus que inoculan
a las células su ácido nucleico. Sistemas virales empleados habitualmente en la manipulación
celular son los baculovirus y las células Sf9 (insecto) para la producción de proteínas, los
adenovirus, retrovirus, etc., sobre sistemas de células de mamífero.

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Las técnicas de transfección celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la
introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida
ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los
sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de aproximaciones
experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la selección de líneas celulares
modificadas, etc.

La introducción de una construcción de ADN recombinante en la que se ha situado el CDS

(secuencia codificante) de un gen reportero (luciferasa, 'green fluorescent protein', beta-
galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc.) bajo una secuencia de regulación
que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas de expresión génica en diferentes
situaciones experimentales.

Por el contrario, la introducción de un plásmido que contienen la secuencia codificante (CDS) de

una proteína de interés bajo el control de un promotor (constitutivo, regulado, etc.) permite la
producción de la proteína deseada que puede estar o no etiquetada (tagged). En este caso se
emplea la célula como una factoría de síntesis de proteínas a la que se le introduce en forma de
plásmido la información de la proteína que se desea sintetice.

Tanto en el primero como en el segundo caso, puede ser importante seleccionar las células que
han adquirido el plásmido. Para facilitarlo se incluyen en éstos genes de resistencia a drogas
que permiten a las células que los han adquirido sobrevivir en medios selectivos. Uno de los
sistemas de selección más empleado es el de la resistencia a G418 (resistencia a neomicina)
que permite seleccionar clones celulares de expresión estable. Así diferenciaremos entre la
transfección temporal y la transfección estable o de larga duración.

Una vez introducida la molécula de ADN recombinante en el interior de las células producirá su
efecto permitiendo, por ejemplo:
Seleccionar células que hayan incorporado el ADN. Este sería el caso del aislamiento de
clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto. Es posible por la
incorporación en el propio vector de marcadores de selección, típicamente la resistencia de
G418 (neomicina), a las pocas horas o días detectar la presencia de la proteína codificada por el
plásmido.

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18
Debido a su simplicidad comparativa, las células procariotas (bacterias y algas verde-azules)
son modelos ideales para estudio de biología molecular. La mayoría de los conceptos actuales
de biología molecular, derivan de los estudios realizados en E.coli,
incluyendo la comprensión sobre la replicación de ADN, código genético ,la trascripción y la
síntesis de proteínas.

La bacteria E.coli ha resultado especialmente útil en el campo experimental, debido a su relativa

simplicidad, la facilidad para propagarse y ser estudiada en el laboratorio. El genoma de E. coli
consiste aproximadamente de 4.6 millones de bases pares (bp) y codifica unas 4.000 proteínas
diferentes. El genoma humano resulta 100 veces más complejo, con aproximadamente 3.000
millones de pb que codifican alrededor de 100.000 proteínas diferentes. Por esta razón, ya se
determinó el genoma complejo de E. coli. Esta bacteria se divide cada 20-60 minutos, lo que
posibilita obtener rápidamente poblaciones uniformes derivadas de una sola célula y variantes
genéticas, por ejemplo mutantes resistentes a un antibiótico, como la penicilina. Con medios de
cultivos ricos o deficientes en nutrientes, puede controlarse su reproducción y se puede analizar
sus metabolitos secretados. Sus plasmados son útiles en estudios de biología molecular e
ingeniería genética

Las levaduras se han convertido en modelo para el estudio de muchos aspectos de la célula
eucariota. Saccharomyces cereviae es la levadura más estudiada. Su genoma consiste en 12
millones de pares de bases, organizado en 16 cromosomas lineales y contiene alrededor de
6.000 genes; más práctico para el estudio que el resto de células eucariotas. Contiene, como
toda eucariota, membrana nuclear, citoesqueleto y organelo citoplasmático.

Los modelos experimentales vegetales y animales, buscan presentar características que se

adapten a las diversas necesidades de la investigación científica y que permitan emular en gran
parte los procesos biológicos particulares o completos, entre estas diversas características se
cuenta desde la organización del genoma como en el caso del modelo biológico
vegetal Arabidosis thaliana, por otra parte, tomando como ejemplo la investigación
biomédica y el estudio de enfermedades humanas el uso de modelos experimentales busca
emular la enfermedad como tal, identificar su etiología y una vez se tienen evidencias
suficientes para su tratamiento, se procede a buscar la aplicación de los hallazgos mediante
un proceso de varias etapas que pueden iniciar, con investigación en líneas celulares,
para luego continuar en modelos murinos( ratón(Mus musculus), rata (Rattus novergicus)),
que puede dar paso a la investigación en primates, y por último en pacientes, desde luego el
paso de una etapa a la otra lleva tiempo y un enorme esfuerzo científico.

Se han presentado en resumen algunas de las técnicas más significativas utilizadas en la

investigación biológica, resaltando el hecho de que la fundamentación de todas ellas ha sido un
proceso continuo que ha contribuido con el desarrollo de la ciencia.

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 MICROSCOPÍA:
MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO

La invención de los aparatos de óptica, el telescopio y

el microscopio compuesto, a mediado y finales del
siglo XVI, contribuyó a modificar la concepción que el
hombre tenía del mundo.

Con el primero se comenzó a sondear la profundidad

del cosmos y con el segundo el mundo de lo
infinitamente pequeño. Podemos destacar los
principales momentos históricos que contribuyeron al
desarrollo de la microscopia

Fuente: Angélica Bonilla. 1558- Gesner C. Publica un trabajo sobre la estructura

de los foraminíferos, sugiriendo el empleo de
instrumentos amplificadores, compuestos por lentes.

1590- Francis y Zacharias manufacturaron el primer microscopio compuesto, poseía aumentos

de 10x y 30x y fue empleado para observar estructuras microscópicas de insectos.

1564-1642- Galileo Galilei escribió trabajos de gran relevancia en el área de la microscopia, en

el 1610 construye su propio microscopio y lo utiliza para estudiar los ojos compuestos de los
insectos.

1662- Marcelo Malpighi visualizó al microscopio tejidos embrionarios animales y vegetales por
primera vez.

1632-1732- Anthony Van Leeuwenhoek fue el primero en describir organismos como las
bacterias (bacilos, cocos y espirilos), protozoarios, rotíferos e hidras. Describió por primera vez
el espermatozoide de humanos, perros, conejos, peces e insectos entre otros. Además observó
las células sanguíneas.

1635-1703- Robert Hooke popularizó el microscopio entres los biólogos contemporáneos e hizo
grandes contribuciones al estudio de la célula.

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Actualmente la microscopía se clasifica en dos grandes grupos: la microscopía óptica y la
microscopía electrónica. En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un
sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El
microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético.

En 1982 por Binning y Röhrer presentaron a la comunidad científica un nuevo microscopio, “el
microscopio cuántico” por el que obtuvieron el premio Nobel de física en 1986. El microscopio
cuántico es un microscopio que forma parte de los instrumentos llamados nanoscopios porque
posibilitan “ver” objetos del tamaño en nanómetros y aún menores, se conoce como
"microscopio de barrido de efecto túnel" (STM).

El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que utiliza la luz visible para crear
una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble
con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo
general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se
consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por
encima de las 2.000 veces.

Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra
en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador.
Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una
posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situadas cerca del objeto que se
observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se trasmite
al ocular, donde se realiza el aumento final.

Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres
objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre
la pieza que se llama revolver que puede tratarse para alinear el objetivo deseado con el
condensador.

La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de
microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio
compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio
construido por una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente
como lupas y cristales de aumento.

Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio en su poder resolutivo; esto
es la capacidad de mostrar distintos y separados: muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder
resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son
especialmente buenos para ver pequeñas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio
compuesto depende de longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida
como apertura numérica. Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda
está fijada y es por lo que la resolución de un objeto es nuevo función de la apertura numérica;
cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño.

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23
OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS Figura 3. Microscopio estereoscopio.
El microscopio de luz ultravioleta

Utiliza el rango ultravioleta del espectro

luminoso en lugar del rango visible, bien
para aumentar la resolución con una
longitud de onda menor o para mejorar el
detalle absorbiendo selectivamente
distintas longitudes de onda de la banda
ultravioleta.

Dado que el vidrio no transmite las

longitudes de onda más cortas de la luz
ultravioleta, los elementos ópticos de estos
microscopios están hechos con cuarzo,
fluorita o sistemas de espejos
aluminizados. Además, dado que la
radiación ultravioleta es invisible, la
imagen se muestra con fluorescencia en
fotografía o con un escáner electrónico.

Fuente: Angélica Bonilla.

Se utiliza para identificar y estimar
cuantitativamente los componentes minerales de las rocas ígneas y las rocas metamórficas.
Cuenta con un prisma de Nicol u otro tipo de dispositivo para polarizar la luz que pasa a
través del espécimen examinado. Otro prisma de Nicol o analizador determina la
polarización de la luz que ha pasado a través del espécimen. El microscopio tiene un soporte
giratorio que indica el cambio de polarización acusado por el espécimen.

Utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen.
El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo
recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello, las porciones claras del espécimen
aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando
aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza
para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminación normal.

Ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro.
Sin embargo, en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo
de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad
de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de

24
24
iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen
transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar
tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.

Entre los microscopios avanzados se encuentra el microscopio de campo cercano, con el

que se pueden ver detalles algo menores a la longitud de onda de la luz. Se hace pasar un
haz de luz a través de un orificio diminuto y se proyecta a través del espécimen a una
distancia equivalente a la mitad del diámetro del orificio, formando una imagen completa.

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les
permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de
electrones es de 0,005-0,003 nm, muy corta comparada con la luz visible que es de 426-
750nm (es decir la gama de colores que vemos desde violeta hasta rojo). Es posible con el
microscopio electrónico resolver objetos separados por la distancia de 0,003 µm,
comparado con los 0,25 µm de un microscopio óptico, como consecuencia de esto los
aumentos pueden llegar a ser hasta de un millón de veces.

Atados a la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados;
incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente.

Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. Disponen de un
cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una
imagen aumentada. Se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan
el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios
ópticos no funcionan con los electrones. El sistema de vacío es una parte relevante del
microscopio electrónico. Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de
forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas
características. Por último, todos los microscopios electrónicos cuentan con un sistema que
registra o muestra la imagen que producen los electrones.

Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de

transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrónico de
barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Un TEM dirige el haz de electrones hacia el
objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el
objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar
un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de
angstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto
para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden
aumentar un objeto hasta un millón de veces.

Un microscopio electrónico de barrido y transmisión (Scanning Transmission Electron

Microscope, STEM) combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los
átomos individuales de un objeto. El microanalizador de sonda de electrones, un

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25
microscopio electrónico que cuenta con un analizador de espectro de rayos X, puede
analizar los rayos X de alta energía que produce el objeto al ser bombardeado con
electrones. Dado que la identidad de los diferentes átomos y moléculas de un material se
puede conocer utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de
electrones no sólo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un
microscopio electrónico, sino que suministra también información sobre la composición
química del material, las siguientes imágenes ilustran la resolución que se puede alcanzar
con un microscopio STEM

E. coli Circulo
formado
por átomos
de Bromo

Hay diversos microscopios ópticos para funciones especiales. Uno de ellos es el microscopio
estereoscópico, que no es sino un par de microscopios de baja potencia colocados de forma que
convergen en el espécimen. Estos instrumentos producen una imagen tridimensional. En el
Estereomicroscopio la visión es por reflexión, lo que permite ver los objetos naturales, tiene
un inversor que permite ver la imagen “a derechas”; esto hace más fácil las manipulaciones que
se realizan con lupa.

Su observación generalmente es de conjunto, debido a su gran campo. Así, una

mosca doméstica puesta en la platina del estereomicroscopio, nos da una visión completa del
animal con una talla superior a los 10 centímetros. En el microscopio sólo sería posible ver,
incluso con los aumentos más pequeños, una parte de las alas y por ser éstas muy
transparentes.

La visión estereoscópica, o sensación de relieve, sólo se consigue cuando a cada ojo lleguen
imágenes distintas del objeto; por ello tiene la lupa binocular dos sistemas ópticos distintos.
Cada ojo, recibe una imagen por separado, captada por cada sistema óptico correspondiente
del aparato, y con la convergencia necesaria para producir una visión correcta. Es un aparato
que tiene una amplia capacidad de movimiento; esto le permite observar pequeños animales en
su medio ambiente. Se utiliza la lupa binocular o estereomicroscopio para observarlo todo, un
trozo de papel, un cabello abierto, un tejido, una raya de bolígrafo, otra de lápiz, papel
cuadriculado, etc. El esteromicroscopio debe utilizarse para la observación de los pequeños
detalles, en todas las direcciones, o estudios morfológicos, tanto animales como vegetales.

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Figura 4. Partes de un microscopio óptico

Sistema de aumento

o LENTE OCULAR: Está insertado en forma suelta en el extremo superior del tubo (situada
cerca del ojo del observador). Tiene una señal grabada (por ejemplo 10x) que indica el
aumento individual del ocular.
o LENTE OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Tiene gravadas varias cifras:
aumento (4; 8, 10, 40, 90, 100). El aumento del ocular multiplicado por el coeficiente de
aumento (del objetivo) proporciona el aumento total del microscopio (amplificación total).
Los microscopios compuestos, normalmente están equipados con tres objetivos: menor
aumento, mayor aumento y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre
una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el
condensador.

El objetivo y el ocular permiten finalmente obtener una imagen virtual invertida detallada y
amplificada del objeto.

Figura 5. Lente ocular y lente del objetivo

Fuente: Finn Genesser, Histología, 2002

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Sistema de iluminación

o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Cuando más se
abre el diafragma, más se amplía el ángulo y en consecuencia aumenta el A.N. y se puede
observar detalles más pequeños, sin embargo al mismo tiempo reduce el contraste
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador, puede ser de fuente eléctrica o
natural.
o ESPEJO: refleja los rayos de la fuente luminosa sobre el objeto. Por un lado es de
superficie plana y por el otro de superficie cóncava. El lado cóncavo se utiliza para
observaciones de mayor aumento.
o FILTROS: en algunos microscopios se ajustan filtros de colores debajo del
condensador. Se puede dejar en su sitio o quitarlos, según el tipo de preparación que se
vaya a observar.

Figura 6. Foco

Fuente: Finn Genesser, Histología, 2002

Sistema mecánico

o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico
que consigue el enfoque correcto.

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Figura 7. La platina, el revólver, oculares y tornillos macrométrico y micrométrico

Fuente: Finn Genesser, Histología, 2002

1. PODERES DEL MICROSCOPIO OPTICO

Poder de aumento.
Poder de resolución.
Poder de definición.
Poder de penetración de foco o profundidad de campo.

Poder de aumento. Permite magnificar la imagen. El poder de aumento de cada objetivo se

indica por un número gravado en la manga de la lente: el objetivo 10x aumenta 10 veces - el
objetivo 40x, 40 veces; el objetivo 100x se encuentra generalmente marcado con anillo blanco
en su lente objetivo para indicar que se debe utilizar con aceite de inmersión.
Los aumentos que puede tener el lente ocular son: 6x, 10x, 12x, 15x. El ocular de 10x es el más
usado. En el microscopio compuesto la amplificación total es igual al producto del aumento del
objetivo por el aumento del ocular.

Aumento total = Aumento objetivo x Aumento ocular

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29
Poder de resolución: Se refiere a la capacidad de un sistema óptico de presentar dos puntos
próximos separados. Se especifica por la distancia mínima en que se logra resolver estos
puntos. Por ejemplo el hombre tiene un poder de resolución de 0.1 mm, a la distancia mínima de
visión clara 25 cm. Este poder depende a su vez de la longitud de onda () y de la apertura
numérica del objetivo (A.N). La apertura numérica también se halla gravada en la manga del
lente, junto a la indicación del poder de aumento: -0.30 en el objetivo 10x, -0.65 en 40x, -1.30 en
100x.

La A.N. es directamente proporcional con el poder de resolución. La A.N relaciona el ángulo de

apertura e los rayos de luz que provienen de la fuente con el índice de refracción. En el caso del
objetivo de inmersión, se coloca entre el preparado y la lente el aceite de inmersión, que tiene un
índice de refracción igual al de la lente y evita la refracción de los rayos luminosos.

Para poder entender estos conceptos es importante conocer, que es la refracción de la luz. Los
rayos de luz atraviesan el aire en línea recta, pero al entrar en una sustancia como el agua o el
vidrio, chocan contra la superficie y se desvían o refractan.

Figura 8. Formación de la imagen real.

Fuente: Microsoft Encarta 2005 copyright.

Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es el medio a

través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire, su
apertura numérica nunca será mayor de 1.0, para conseguir aperturas numéricas mayores que
ésta, el objetivo debe ser inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. A estos
líquidos se les denomina aceites de inmersión que se utilizan con los objetivos de inmersión
obteniendo una apertura numérica entre 1.2 y 1.4. Aun así, al utilizarse la luz visible (longitud de
onda) estos microscopios llegan a tener un poder de resolución de aproximadamente 0.25 µm,
lo que significa que las partículas con un tamaño más pequeño de 0.25 µm no pueden
distinguirse unas de las otras.

Los rangos de luz visible van desde las longitudes rojas largas (= 760nm) hasta las
pequeñas ondas azul/violeta (=400 nm). Las ondas ultravioletas pueden ser tan cortas como
230nm

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El poder de resolución es :

2x N.A.

Donde : Longitud de onda y N.A.: Apertura Numèrica.

Por lo tanto si se tiene un objetivo de 100x, con A.N. de 1.30 y una longitud de onda promedio
de 520nm, el poder de resolución será:

520nm = 0,2 m (micrones)

2 x 1,30

Cuanto mayor sea el poder de resolución del objetivo, será más clara la imagen y aumentará
la capacidad de poner de manifiesto los detalles adyacentes muy cercanos, separándolos y
aclarándolos.

Poder de definición: Permite formar imágenes claras con contornos definidos.

Poder de profundidad: da la posibilidad de observar varios planos de la preparación. Sin

variar la posición del enfoque. El microscopio enfoca generalmente un solo plano.

3. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Coloque la preparación sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe

previamente que el objetivo de menor aumento está en posición de empleo.

2. Coloque el objetivo de 10 aumentos (10x) y enfoque:

Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el macrométrico. No
haga esta operación mirando por el ocular, pues correría el riesgo de "introducir" el objetivo
en la preparación con el consiguiente destrozo de ambos.
Desplace la platina lentamente con el macrométrico, observando por el ocular hasta que
obtenga un enfoque nítido.

3. Pase al objetivo de 40 aumentos (40x). Suba ligeramente el condensador. La imagen debe

estar casi enfocada: afine el foco con el micrométrico. Si la imagen no está ni
medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10x. El
objetivo de 40x trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos de
accidentes: ser "introducido" en la preparación cuando se descuidan las precauciones
descritas para su enfoque (p.ej. empleando el macrométrico) y resultar manchado con
aceite de inmersión si se observa una preparación ya usada con este último.

4. Empleo del objetivo de inmersión:

Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de
40x.

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31
 Coloque una gota mínima de aceite de inmersión sobre el punto de luz.
Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión,
asegurándose de que éste no toca la preparación pero sí la gota de aceite.

Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. La preparación debería estar prácticamente

enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con el objetivo de 40x. De no ser así, es
preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto partiendo del objetivo de 10x.
Recuerde que la distancia de trabajo desde la lente frontal del objetivo de inmersión a la
preparación es mínima, por lo que el riesgo de accidente es ahora máximo.

Una vez que haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no puede volver a
colocar el objetivo de 40x sobre ese campo, pues correría el riesgo de mancharlo de aceite.
Por tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el
revólver hacia el objetivo de menor aumento (10x), seleccionando otro campo y empezando a
enfocar desde este último.
Finalizada la observación de la preparación, y antes de retirarla de la platina, se colocará el
objetivo de menor aumento girando el revólver en sentido hacia él. Nunca retire la preparación
con el objetivo de inmersión en posición de observación.
Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente empleando un papel
especial para óptica. Compruebe también que el objetivo de 40x está perfectamente limpio.

MATERIALES
Letras de papel de periódico. Escamas de mariposa. Hilos de colores. Cristales de sulfato de
cobre y azúcar. Microscopio, láminas y laminillas, pipetas y los materiales habituales que debe
traer el estudiante, orientados en la primera clase.

PROCEDIMIENTO

Realice un montaje húmedo o seco según la indicación del profesor de una letra pequeña, un
hilo y otros materiales que están a disposición para la observación.
En el caso de montajes húmedos coloque una gota de agua sobre la lámina. Dentro de la gota de
agua ponga la letra impresa.
Acerque una laminilla en posición oblicua, y apoye una arista sobre la lámina al lado de la gota
de agua, y deje caer suavemente.

Nota: La lámina antes de ser usadas debe estar completamente limpias y secas.
Realice las observaciones siguiendo las recomendaciones dadas en el apartado 3.
Realice las observaciones a 10x y 40x y dibújelas.

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 MEDICIONES CON EL MICROSCOPIO

Fuente: Los autores

INTRODUCCIÓN

Para determinar el tamaño de un organismo y el procesamiento de datos, en la

actualidad existen un sinnúmero de programas que permiten y facilitan al
investigador conocer esta información.
La medición indirecta permite estimar el tamaño de un objeto observado a partir de
la medición del Diámetro Óptico (Φ) mientras que programas de análisis de
imágenes permiten establecer con mayor precisión tamaños y otras muchas
características que se puedan abstraer de los datos que obtiene el investigador.

TIPO DE MEDICIÓN CARACTERÍSTICAS

Directo Uso del micrométrico o rejilla ocular como escala de referencia

Indirecto

A través de la adquisición de una imagen y el establecimiento de su

Programa escala, las herramientas del programa permiten conocer tamaño y
otras características del elemento observado.

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OBJETIVOS

- Desarrollar el concepto de medida y estimación del tamaño de los

microorganismos.
- Utilizar el método de medición indirecta con base en el diámetro del campo
óptico.
- Procesar imágenes con el programa de análisis Fiji y establecer el tamaño de
objetos u organismos.

MATERIALES
Grano de polen, cristales de permanganato de potasio, papel mantequilla
milimetrado, computador, programa Fiji, cámara de Neubauer, microscopio e
implementos habituales.

PROCEDIMIENTO

- Medición Indirecta
o Determinación del diámetro del campo óptico (Φ) a menor aumento.
o Tome una muestra del papel milimetrado, luego agréguele una gota de
agua y enfoque en menor aumento un cuadrado, dejando el margen
hacia algún extremo del campo visual, como indica la figura.

Figura 9. Medición del campo óptico

Para realizar la medición aproximada de un objeto u organismo, es necesario

primero estimar el diámetro del campo óptico, que se podrá realizar ubicando el
cuadrado en el plano diametral y midiendo 31 el diámetro con los objetivos de 4x y
10x, o 8x. 29
Realice el cálculo para conocer el Φ en mm en los objetivos de 10x, 40x o 100x
complete la siguiente tabla en los espacios donde aplique.

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Tabla Nº1 Diámetro aproximado y calculado de los objetivos de 4X, 10X, 40X y 100X
Objetivo de ocular Diámetro aprox. Diámetro calculado

10x

40x

100x

Entonces podemos observar que a medida que la imagen se aumenta tantas veces,
el campo óptico se reduce proporcionalmente con el aumento empleado,
teóricamente se podría calcular de la siguiente manera:

Después de haber determinado el del campo óptico a menor aumento y haberlo

calculado a mayor aumento, realice micropreparados indicados por el auxiliar del
laboratorio, obsérvelos y determine el tamaño de la célula o del objeto muestra, a
menor y mayor aumento.

Realice los dibujos de sus observaciones y complete la tabla con sus resultados:

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- Programa Fiji
o Tome la cámara de Neubauer y ubicándola en el microscopio tome una
foto en cada aumento.

Figura 10. Cámara de Neubauer a 40x

Fuente: Los autores

Posteriormente se realiza el montaje del objeto u organismo a medir y se toma una

fotografía en el aumento que se enfoque mejor. Se realizan los siguientes pasos:

1. Descargar las fotografías en el computador y abrir el programa Fiji.

2. Inicialmente se debe establecer la escala en la que se va a realizar la

medición, por lo tanto se selecciona en qué aumento se observa mejor el
objeto u organismo a medir y se abre en Fiji la imagen de la cámara de
Neubauer correspondiente al mismo aumento con el siguiente comando:
File - Open y se selecciona el archivo.

3. Una vez abierta la imagen de la cámara de Neubauer con la herramienta de

“Straight” que permite realizar líneas rectas, seleccionamos un segmento
de línea en la imagen (Figura 11).

4. A continuación vamos a “Analyze” – “Set Scale”. En el recuadro que

aparece, dentro de la opción “Known distance” se coloca la medida del
segmento de la cámara de Neubauer que se conoce, y en “Unit of leght” se
apunta la unidad de medida que se está usando, en este caso milímetros, y
se selecciona la opción “Global” para que este parámetro se aplique a todas
las imágenes en adelante al pulsar “Ok” (Figura 12 a).

5. Finalmente, se cierra la imagen de la cámara de Neubauer y se abre la

imagen donde se encuentra el objeto u organismo a medir y se realiza la
medición de la misma manera pero en lugar de elegir la opción “Set scale” se
elige la opción “Measure” que inmediatamente despliega un cuadro de
resultados donde se puede ver la medida del objeto u organismo (Figura 12
b).
35
29
Figura 11. Selección de un segmento de longitud con el programa Fiji

Figura 12. Recuadros que se despliegan (a) al entrar a “Set scale” y (b) al obtener
los resultados

31
29

30
29 30
29
Ahora establezca el tamaño del objeto u organismo:

Muestra Aumento Tamaño

Finalmente, establezca una comparación entre los dos métodos de medición.

Halle ventajas, desventajas y márgenes de error en cada metodología.

35
29
 DETERMINACIÓN DE BIOMOLÉCULAS: GLÚCIDOS Y LÍPIDOS

Fuente. J. Gualtero

Todos los seres vivos están constituidos cualitativa y cuantitativamente por los mismos
elementos químicos. De todos los elementos que se hallan en la corteza terrestre, sólo unos 25
son componentes de los seres vivos. Esto confirma la idea, que la vida se ha desarrollado sobre
unos elementos concretos que poseen unas propiedades físico-químicas idóneas, acordes con
los procesos químicos que se desarrollan en los seres vivos.

Se denominan elementos biogénicos, bioelementos a aquellos elementos químicos que forman

parte de los seres vivos (C, H, O, N). Son los elementos mayoritarios de la materia viva,
constituyen el 95% de la masa total y al formar enlaces covalentes dan lugar a biomoléculas muy
importantes para la vida como son los glúcidos, lípidos, proteínas y ADN.

Los carbohidratos comúnmente llamados glúcidos o azúcares, son derivados aldehídos o

cetónicos de alcoholes polivalentes, es decir de varios grupos OH en su estructura. Las
unidades más pequeñas de los carbohidratos, son los monosacáridos, cuyo principal
representante es la glucosa. Cuando dos o más unidades de monosacáridos se unen entre sí
mediante enlaces glucosídicos se forman los compuestos más complejos como disacáridos
(con dos monosacáridos), los oligosacáridos (3 a 15 unidades) y los polisacáridos (con más de
15 unidades) cuyos principales representantes son el almidón (en vegetales) y el glucógeno (en
animales).

45
Los lípidos son macromoléculas esenciales para las células porque hacen parte fundamental de
su estructura. Químicamente son ésteres formados por la reacción entre un alcohol con varios
ácidos grasos, estableciéndose entre ellos un enlace éster. Los lípidos se clasifican en dos
grandes grupos de acuerdo a la complejidad de sus moléculas, lípidos simples y lípidos
compuestos.

Los lípidos son moléculas que contienen una gran cantidad de energía potencial almacenada, 9
Kcal/mole, mientras que los carbohidratos y las proteínas contienen 4 Kcal/mole. Esta energía
potencial se encuentra almacenada en los ácidos grasos que están esterificados con el alcohol,
los cuales pueden ser saturados (sin doble enlaces) o insaturado (con doble enlaces); los
primeros abundan en las grasas y los segundos en los aceites.

Figura 12. Biomoléculas.

Fuente: Lehninger, 2005.

46
OBJETIVOS

✓ Comprender el papel fisiológico que tienen las biomoléculas en todos los organismos.

✓ Conocer algunas pruebas bioquímicas específicas para identificar las biomoléculas.

✓ Reconocer mediante pruebas sencillas la presencia de biomoléculas en algunas muestras

de origen orgánico.

RECONOCIMIENTO DE GLÚCIDOS

MATERIALES

Tubos de ensayo, gradilla, pinzas, mechero, pipetas, solución de Lugol, solución de Fehling
A y B, solución alcalina (sosa, potasa, bicarbonato, etc.), HCl diluido, soluciones al 5% de
glucosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa y almidón.

1. ESTUDIO DE AZÚCARES

REDUCTORES Fundamento
Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que deben al
grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de
manifiesto por medio de una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de cobre
(II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido reductor se
forma óxido de cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha
producido la citada reacción y que, por lo tanto, el glúcido presente es reductor.

Técnica

1. Poner en los tubos de ensayo 3ml de la solución de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o
sacarosa (según indique el profesor).
2. Añadir 1ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1ml de Fehling B (lleva NaOH
para alcalinizar el medio y permitir la reacción)
3. Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan.
4. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo y será negativa si queda
azul o cambia a un tono azul-verdoso.
5. Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de prácticas con las distintas
muestras de glúcidos.

47
2. HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

Fundamento

La sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres, por lo que carece de
poder reductor y la reacción con el reactivo de Fehling es negativa, tal y como ha quedado
demostrado en el experimento 1. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se
hidroliza, es decir, incorpora una molécula de agua y se descompone en los monosacáridos que
la forman, glucosa y fructosa, que sí son reductores. La prueba de que se ha verificado la
hidrólisis se realiza con el reactivo de Fehling, y si el resultado es positivo, aparecerá un
precipitado rojo. Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se ha realizado correctamente y si en
el resultado final aparece una coloración verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrólisis
parcial de la sacarosa.

Técnica

1. Tomar 3ml de solución de sacarosa y añadir 10 gotas de HCl diluido.

2. Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos.
3. Dejar enfriar.
4. Neutralizar añadiendo 3ml de solución alcalina. (NaOH al 20%)
5. Realizar la prueba de Fehling como se indica en el experimento 1.
6. Observar y anotar los resultados.

3. INVESTIGACIÓN DE POLISACÁRIDOS (ALMIDÓN)

Fundamento

El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la

amilopectina. La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reacción
química sino a la adsorción o fijación de yodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo cual
sólo ocurre en frío. Como reactivo se usa una solución denominada lugol que contiene yodo y
yoduro potásico. Como los polisacáridos no tienen poder reductor, la reacción de Fehling da
negativa.

Técnica

1. Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución de almidón.

2. Añadir 3 gotas de la solución de lugol.
3. Observar y anotar los resultados.
4. Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
5. Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color azul.

48
49
Fundamento Teórico

En la orina se pueden encontrar diversos carbohidratos, el más común es la glucosa en

volúmenes apreciables, constituye el fenómeno conocido como glucosuria o glicosuria y es
consecuencia de un aumento de glucosa en la sangre (hiperglicemia). Puede presentarse
glucosuria producto de emociones violentas (ira, temor, ansiedad) lo cual obedece a una mayor
secreción de adrenalina, con la movilización consiguiente a la glucosa almacenada
anteriormente como glucógeno.

Después de un largo y difícil examen, puede aparecer glucosa en la orina, de un número

considerable de estudiantes; también suelen producirse glucosuria después de ingerir
carbohidratos en exceso (glucosuria alimentaría) el límite de asimilación varía según el
individuo y las condiciones del ejercicio físico.

Generalmente se estima el límite de glucosa pura entre 100 y 200 gramos pero, recientemente
se ha comprobado que en muchos individuos, cantidades mayores, hasta la máxima que el
estómago puede tolerar (400-500g) no provoca glucosuria.

La glucosa que sigue a la ingestión de 100g o menos, es anormal e indica un umbral renal bajo,
disminución de la capacidad del hígado para almacenar glucosa como glicógeno o trastorno del
metabolismo glucídico.

La cantidad de glucosa eliminada en la diabetes, es considerable, y en ocasiones hasta de 500g

o más de 24h, aunque no guarda relación con la gravedad de la dolencia.

Por ultimo debemos señalar que como resultado de la actividad física puede aparecer glucosa
en la orina, considerándose un proceso eminentemente funcional. En el caso de cargos físicos
intensos y de corta duración, en las cuales la movilización del glucógeno hepático se intensifica
y se incrementa el nivel de glucosa sanguínea, se puede observar manifestaciones de glucosa.
La glucosa se puede regular casi totalmente, restringiendo con cuidado la dieta.

Principios:

Todos los azucares (glucosa, levulosa, galactosa, etc) reducen con rapidez, por medio de calor
al sulfato de cobre en solución alcalina (reactivo Benedict) haciéndolo pasar a oxido cuproso
insoluble, de color amarillo a rojo.

Materiales

Reactivo: Benedict cualitativo

Muestra Orina

Técnica

1. Vierta 8 gotas de orina en un tubo de ensayo resistente al calor.

2. Añada 3 ml del reactivo de Benedict cualitativo y mézclelos.

50
3. Someta el tubo al calor y déjelo hervir durante 2 o 3 minutos. No debe derramarse.
Déjelo enfriar espontáneamente.

La lectura de esta práctica se realiza observando el color que toma la muestra y que puede
dar uno de los siguientes resultados.

Color Azul sin Precipitado …………………………………………………...Negativa

Ligero Precipitado Verde ………………………………………….. Ligeros Indicios
Aproximadamente Amarillo…………………………………… Débilmente positivo
Color Naranja…..…………………………………………………………….Positiva
Rojo Ladrillo……………………………………………………Fuertemente Positiva

Realice la prueba utilizando Comburtest. Indique en el diagrama algunas de las pruebas

realizadas y coloree su resultado.

RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS
MATERIALES

Tubos de ensayo, gradilla, varillas de vidrio, mechero, vasos de precipitados, pipetas,

solución de NaOH al 20%, solución de Sudán III, tinta china roja, éter, cloroformo o
acetona, aceite de oliva.

SAPONIFICACIÓN
Fundamento
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose
en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos.
Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en
consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la
hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicas (lipasas)
que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina.

51
Técnica
. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%.
. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.
. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene
la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que
es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado.

2. TINCIÓN

Fundamento
Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III.

Técnica

1. Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite.

2. Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III.
3. Al otro tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja.
4. Agitar ambos tubos y dejar reposar.
5. Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer
teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará
teñido.

3. SOLUBILIDAD

Fundamento

Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en
pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues
desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su
menor densidad, se sitúa sobre el agua.
Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo,
acetona, benceno, etc.

Técnica

1. Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo.

2. Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de éter u otro disolvente orgánico.
3. Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
4. Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y, en
cambio no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad.

Escribas los resultados obtenidos y sus conclusiones en las hojas en blanco

52
RESULTADOS
(Apoyarse con un diseño de lo observado)

1. SAPONIFICACIÓN

2. TINCIÓN

3. SOLUBILIDAD

53
 DETERMINACIÓN DE BIOMOLÉCULAS: PROTEÍNAS Y ADN

Fuente: Audesirk- Audesirk 2003

Las proteínas son moléculas compuestas de una o más cadenas de aminoácidos. Las proteínas
desempeñan muchas funciones. Las enzimas son proteínas importantes que dirigen casi todas
las reacciones químicas que se llevan a cabo dentro de las células, dado que cada enzimas
ayuda sólo en una o unas cuantas reacciones específicas, casi todas las células contienen
cientos de enzimas distintas.

Hay otros tipos de proteínas que se utilizan para fines estructurales como la elastina, que
confiere la elasticidad la piel; la queratina, que es la principal proteínas del pelo, de los cuernos
de los animales y de las uñas. Hay también proteínas que se usan para almacenar energía y
materiales (álbumina), para transporte (hemoglobina) y para movimiento celular (proteínas
contráctiles de los músculos), hormonas (insulina, hormona del crecimiento), anticuerpos (que
ayudan a combatir las enfermedades e infecciones) y muchos venenos (como el de la serpiente
cascabel) también son proteínas.

56
Las proteínas son polímeros de aminoácidos. Todos los aminoácidos tienen la misma estructura
fundamental que consiste en un carbono central unido a cuatro grupos funcionales distintos: un
grupo amino (-NH3), que contiene nitrógeno; un grupo carboxilo; un hidrógeno; y un grupo
variable (representado por la letra R). El grupo R difiere entre los aminoácidos y confiere a cada
uno sus propiedades distintas.

En las proteínas de los organismos se hallan comúnmente 20 aminoácidos. Algunos

aminoácidos son hidrofilacios; sus grupos R son polares y solubles en agua. Otros son
hidrofóbicos, con grupos R no polares que son insolubles en agua. Otro aminoácido, la cisteína,
tiene azufre en su grupo R y puede formar un enlace con otra cisteína. Estos enlaces entre los
grupos R de la cisteína se llaman puentes disulfuro.

Los aminoácidos difieren en sus propiedades químicas y físicas, como tamaño, solubilidad en
agua, carga eléctrica, debido a sus diferentes grupos R. Por ello, la sucesión exacta de
aminoácidos dicta la función de cada proteína, si es soluble o no en agua, si es una enzima, una
hormona o una proteína estructural. La sucesión alterada de aminoácidos dan al traste con la
función. En algunos casos basta un error en un aminoácido para que la proteína no funcione
correctamente.

Los ácidos nucleicos son largas cadenas de subunidades similares, pero no idénticas, llamadas
nucleótidos. Todos los nucleótidos tiene una escritura de tres partes: un azúcar de cinco
carbonos (ribosa o desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada que difiere entre los
nucleótidos.

Hay dos tipos de nucleótidos, los que contienen el azúcar ribosa y los que contienen el azúcar
desoxirribosa. Estos últimos llevan unidos cuatro grupos de bases nitrogenadas: adenina,
guanina, citosina y uracilo, en vez de timina. Los nucleótidos se pueden enlazar en largas
cadenas para formar ácidos nucleicos como el ARN y el ADN.

El ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación. Se

llama síntesis de proteínas a la producción de las proteínas que necesita la célula o el virus para
realizar sus actividades y desarrollarse. La replicación es el conjunto de reacciones por medio
de las cuales el ADN se copia a sí mismo. En casi todos los organismos celulares el ADN está
organizado en forma de cromosomas, situados en el núcleo de la célula.

Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas o bandas formadas por un elevado
número de compuestos químicos llamados nucleótidos.

Estas cadenas forman una especie de escalera retorcida que se llama doble hélice. Cada
nucleótido está formado por tres unidades: una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un
grupo fosfato y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados ya mencionados adenina
(abreviada como A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). La molécula de desoxirribosa ocupa el
centro del nucleótido y está flanqueada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El
grupo fosfato está a su vez unido a la desoxirribosa del nucleótido adyacente de la cadena.
Estas subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases
están enfrentadas por parejas, mirando hacia el interior, y forman los travesaños.

57
Los nucleótidos de cada una de las dos cadenas que forman el ADN establecen una asociación
específica con los correspondientes de la otra cadena. Debido a la afinidad química entre las
bases, los nucleótidos que contienen adenina se acoplan siempre con los que contienen timina,
y los que contienen citosina con los que contienen guanina. Las bases complementarias se
unen entre sí por enlaces químicos débiles llamados enlaces de hidrógeno.

En 1953, el bioquímico estadounidense James Watson y el biofísico británico Francis Crick

publicaron la primera descripción de la estructura del ADN. Su modelo adquirió tal importancia
para comprender la síntesis proteica, la replicación del ADN y las mutaciones, que los científicos
obtuvieron en 1962 el Premio Nobel de Medicina por su trabajo.

Objetivos:

1. Determinar el papel que juegan algunas sustancias en el proceso de desnaturalización de las

proteínas.
2. Describir la técnica bioquímica utilizada para reconocer la presencia de proteínas en
muestras orgánicas.
3.Extraer mediante técnica sencilla el ADN de una muestra
vegetal.
4.Adquirir destreza en el manejo de equipo de laboratorio.

Estudio de Proteínas

Materiales

Tubos de ensayo, gradilla, mechero, vasos de precipitados, pipetas, solución de HCl

concentrado, alcohol etílico, solución de CuSO4 al 1%, NaOH al 20%, clara de huevo o
leche, solución de albúmina al 1-2%.

1. COAGULACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Fundamento

Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones
coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas
superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc.
La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización
por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por destrucción de
sus estructuras secundaria y terciaria.

Técnica

1. Colocar en tres tubos de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo (puede
diluirse en un poco de agua para obtener una mezcla espesa) o 2-3ml de leche.
2. Calentar uno de los tubos al baño María, añadir a otro 2-3ml de HCl concentrado y al
tercero 2 o 3ml de alcohol etílico.
3. Observar los resultados.

58
2. REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET)

Fundamento

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su
identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las
proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH
que se destruye al liberarse los aminoácidos.El reactivo del Biuret lleva Sulfato de cobre (II) y
sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos
formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la
concentración de proteínas.

59
Extracción de ADN de Kiwi

Materiales:

Vaso o beaker plástico de 5 onz

1 set cucharas medidoras
Cuchillo plástico
Cuchara plástica para mezclar y macerar el kiwi
Papel filtro
30 ml de agua destilada
Champú claro (poco coloreado)
½ kiwi
Sal
Pipeta o gotero plásticos
Etanol 95%.

Procedimiento

Se debe preparar una solución que contenga kiwi, agua destilada, sal y champo. La sal permite
que el ADN precipite en una solución fría de alcohol. El detergente disuelve los lípidos y
proteínas de la membrana celular, y además rompe enlaces que mantienen la membrana
integra, provocando su ruptura. El detergente forma un complejo con los lípidos y las proteínas
haciendo que precipiten en la solución.

1. En un vaso o beaker plástico de 5 oz, prepare una solución que consiste en una cucharadita
de champo y dos cucharaditas de sal. Añada agua destilada para obtener un volumen final de
30ml o aproximadamente 1/3 del volumen del vaso. Revuelva la sal y champo suavemente para
evitar que forme espuma.
2. Use el cuchillo plástico, pele y corte ½ del kiwi en pequeños pedazos y añádalos a la solución
preparada en el paso 1. Aplaste el kiwi contra las paredes del recipiente con la cuchara usando
su parte posterior por espacio de 10 minutos (el detergente disuelve los lípidos de la membrana,
lo que hace que se libere el ADN dentro de la solución. El detergente causa la precipitación de
los lípidos y las proteínas y deja sólo el ADN en la solución. La sal se une al ADN)
3. Mientras un miembro del grupo aplasta y revuelve el kiwi en la solución, otro miembro
preparará un cono de papel de filtro en otro vaso plástico de 5 oz. Coloque el cono de filtro sin
que este toque el fondo del vaso.
4. Filtre la solución. Esta se filtrará lentamente, destilando gotas durante unos minutos hasta
obtener aproximadamente unos 5 ml de solución filtrada (tape la boca del vaso durante este
proceso).
5. Prepare un tubo con alcohol frío. Para obtener mejores resultados, el alcohol debe estar lo
más frío posible.
6. Llene una pipeta plástica con la solución de kiwi y vacíela en la solución de alcohol frío (el ADN
no es soluble en alcohol. Cuando el alcohol es unido con esta mezcla, los componentes de la
mezcla excepto el ADN se mantendrán en la solución, mientras el ADN precipitará en la capa de
alcohol.
Deje que la solución de asiente por 2 ó 3 minutos sin agitar o revolver. Usted podrá observar el
ADN blanco precipitar en la capa de alcohol. Cuando se obtienen buenos resultados, será
posible sacar el ADN con la punta de una pipeta de Pasteur. El ADN tiene el aspecto de un moco
pegajoso blanco.

60
61
 CÉLULA PROCARIOTA

Fuente: Lehninger, 2005.

Las bacterias son organismos unicelulares que se reproducen por fisión binaria. Las
bacterias se encuentran prácticamente en todos los ambientes de la tierra, desde las
profundas fosas oceánicas o el interior de rocas sólidas hasta las camisas refrigerantes de
los reactores nucleares, ni que decir del resto de los hábitats. La mayoría de ellas son
capaces de una existencia independiente pero existen especies como Chlamydia y
Rickettsia que son organismos intracelulares obligados.

El reino taxonómico Morena comprende entre otros, a las eubacterias (las bacterias
“verdaderas” y las cianobacterias, o bacterias fontosintetizadoras). Entre las
características generales de este grupo podemos notar que:

1. No poseen organelas rodeadas por membranas ( como las formas superiores de vida) y
se conocen como procariotas.

2. Procesos bioquímicos que en eucariotas ocurren normalmente en los cloroplastos o

mitocondrias, tienen lugar en la membrana citoplasmática.

3. El cromosoma bacteriano está constituido por ADN circular que se ubica en la región
denomida nucleoide.

64
4. Distribuidos en el citoplasma bacteriano se encuentran pequeños lazos de ADN conocidos
como plásmidos.

5. Lo genes bacterianos se encuentran organizados en un sistema conocido como operón.

6. Su pequeño tamaño, velocidad de reproducción (escheriachia coli se reproduce pòr fisión

binaria cada 15 ó 20 minutos), y “la ocupación” de diversos habitas y modos de existencia hacen
de moneras el reino más abundante y diversificado sobre la tierra.

PARED CELULAR

Las bacterias presentan pared celular que se encuentra revistiendo a la célula. No posee
celulosa como en el caso de las plantas, sin embargo su pared está formada por ácidos como el
murámico, diaminopimélico y por peptidoglicanos que constituyen una pared resistente que le
permite a las bacterias vivir en cualquier medio..

IDENTIFICACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS

Los sistemas de clasificación de las bacterias suelen basarse en varios aspectos entre los
cuales se encuentra:

Según su forma:

COCOS BASILOS ESPIRILOS

DIPLOCOCOS DIPLOBASILOS VIBRIOS

ESTREPTOCOCOS ESTREPTOBACILOS COCOBASILOS

ESTAFILOCOCOS EN “V”

TÉTRADAS EN EMPALIZADA

SARCINAS LETRAS CHINAS

65
Debido a la constitución química diferencial de su pared celular se clasifican en:
Gram positivas: se tiñen de color violeta, con reactivo de violeta de genciana, como
estafilococos, micrococos, neumococos, enterococos, bacilos de la difteria y bacilos del ántrax.
Gram negativas; se tiñen de color rojo o rosado con el reactivo fucsina, como gonococos,
meningococos, bacilos coliformes, shigela, salmonelas o vibriones del cólera.

Muchos otros aspectos pueden tenerse en cuenta para la clasificación de las bacterias por
ejemplo:
La presencia o no de flagelos, de pelos, de cápsula, de esporas, por las características de las
colonias y el requerimiento de determinados nutrientes en el cultivo, por el tipo de nutrición, por
la presencia y el tipo de hemólisis, por las características de la colonia y por las relaciones con
los demás seres vivos.

La coloración Gram es ampliamente utilizada para identificar bacterias, ya que el

comportamiento de las células bacterianas frente a este tipo de coloración refleja características
típicas de la pared celular que a su vez determina la diferente susceptibilidad para determinados
antibióticos, pudiéndose decir que en general son más susceptibles a la mayoría de estas
drogas las bacterias Gram positivas que las Gram negativas.

Las Cianobacterias: pertenecen al grupo de las cyanophytas, son conocidas como algas verde
azules a las cuales pertenecen el género nostoc, anabaena, oscilatoria, policitis.
Son muy importantes en los ecosistemas acuáticos porque proporcionan oxígeno y alimento a
otros organismos. Constituyen la base de las cadenas alimenticias acuáticas. Por su gran
capacidad fotosintética se denominan productores primarios de materia orgánica.

66
OBJETIVOS

✓ Identificar algunas características de las células procariotas.

✓ Identificar bacterias Gram positivas y Gram negativas.
✓ Aplicar algunas técnicas de montaje y tinción para microorganismos.

MATERIALES

Cultivo de bacterias, nódulos de bacterias nitrificantes, algas (Nostoc, Oscillatoria, Anabaena),

Lactobacilos de kumis o yogurt, aceite de inmersión, colorantes de Gram (cristal violeta,
solución de yodo, alcohol, acetona, solución de safranina o fuscina), Asas, tapabocas, fósforos,
mechero y material habitual.

PROCEDIMIENTO

Las técnicas de tinción diferencial permiten observar diferencias entre células bacterianas
mediante la aplicación de uno o más reactivos. Una de las técnicas de tinción diferencial para
bacterias es la tinción Gram.

1. TINCIÓN SIMPLE

Haga un extendido de la muestra y realice el procedimiento de tinción simple con un solo

colorante de contraste para identificar la forma de las bacterias y su agrupación

Con la ayuda del profesor o auxiliar de laboratorio monte la lámina en el microscopio hasta el
objetivo de inmersión.

Aumento:

Clasificacion:

67
 1. TINCIÓN GRAM

El procedimiento que se debe seguir para esta técnica y los resultados de cada paso se
encuentran resumidos en la tabla a continuación.

Pasos para la coloración diferencial de Gram

1.-Haga un extendido de la muestra. Fíjela por calor.

2.-Inunde el extendido con cristal de violeta de genciana (colorante básico). Déjelo reposar 1
minuto. Enjuague con agua corriente por el revés y déjelo escurrir.
3.-Bañe el portaobjeto con solución de yodo o lugol (fijador del colorante). Déjelo reposar por 1
minuto. Escurra la solución y enjuague el portaobjetos con agua corriente.
4.-Bañe completamente el portaobjetos con alcohol-cetona (decolorante). Déjelo reposar por 1
minuto. Enjuague con agua corriente y déjelo escurrir.
5.-Vierta solución de safranina (colorante de contraste) n el portaobjetos. Déjela reposar 1
minuto.
6.-Enjuague con agua corriente. Escurra y déjelo secar al aire libre.

SOLUCIÓN EN EL REACCIÓN Y ASPECTOS DE LAS BACTERIAS

ORDEN DE SU
APLICACIÓN Gram-positivas Gram-negativas

Las células se tiñen de Las células se tiñen de

1. Cristal violeta (CV)
violeta. violeta.
Se forma un complejo CV-I Se forma un complejo CV-I
2. Solución de yodo
dentro de las células. Las dentro de las células. Las
(I)
células continúan violetas. células continúan violetas
Las paredes celulares se
Se extraen los lípidos de las
deshidratan, los poros
paredes celulares, los poros
merman; la permeabilidad de
se agrandan y el complejo
la pared celular y de la
3. Alcohol-acetona CV-I es eliminado de la
membrana disminuye, el
célula, las células quedan
complejo CV-I no puede salir
incoloras.
de las células; las células
permanecen violetas.
Las células toman este
Las células no se afectan,
4. Safranina colorante y se ponen color
permanecen de color violeta.
rojo-rosado.

Observaciones

Observar con los diferentes objetivos, hasta 90x o-100x utilizando aceite de inmersión.

68
 Dibuje las bacterias Gram – y Gram+ observadas con el objetivo 90x o 100x.
 Clasifique a que tipo de bacterias corresponden cada una de ellas según forma, agrupación y
coloración Gram.

Aumento:

Clasificacion:

3. TINCIÓN NEGATIVA

Aumento:

Clasificacion:

Realice otro frotis con las bacterias, a continuación esparza una capa de tinta china negra
uniformemente en el preparado, permita que la tinta se seque completamente y observe con el
objetivo de inmersión.

4. OBSERVACIÓN DE BACTERIAS NITRIFICANTES

Con un gotero coloque una gota de macerado en la lámina y cúbralo con la laminilla.
Observe la preparación en mayor aumento y dibuje.
Describa las características observadas: forma, movimiento, color.

69
 Aumento:

Clasificacion:

5.- OBSERVACIÓN DE ALGAS Nostoc

• Realice un montaje húmedo de algas Nostoc.
• Observe y dibuje a 40x.
• Describa las características observadas: forma, color.

Aumento:

Clasificacion:

6.- OBSERVACIÓN DE ALGAS Anabaena

• Realice un montaje húmedo de las algas Anabaena.
• Observe y dibuje a 40x.
• Describa las características observadas: forma, color.
• Indique las diferencias con el alga Nostoc.

Aumento:

Clasificacion:

70
7.- OBSERVACIÓN DE LACTOBACILOS

• Realice un montaje con una gota de yogurt o kumis en un portaobjeto.

• Fije el montaje con calor.
• Haga una tinción simple con un colorante de contraste.
• Observe utilizando el objetivo de inmersión.

Aumento:

Clasificacion:

71
Figura 14. Cianobacterias.

En el siguiente esquema se ilustran algunas de las cianobacterias más comunes que podría
hallar en su preparado.

Fuente: Needham y Needham, 1991

72
 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS, LEVADURAS Y PROTISTOS

Fuente: L. Bonilla

Los Hongos, son un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan
mediante la absorción directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que
secretan los hongos; después se absorben a través de la fina pared de la célula y se distribuyen
por difusión simple en el protoplasma.

Junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefacción y descomposición de
toda la materia orgánica. Hay hongos en cualquier parte en que existan otras formas de vida.
Algunos son parásitos de organismos vivos y producen graves enfermedades en plantas y
animales. La disciplina científica que estudia los hongos se llama micología.

Los hongos figuraban en las antiguas clasificaciones como una división del reino Plantas
(Plantae). Se pensaba que eran plantas carentes de tallos y de hojas que, en el transcurso de su
transformación en organismos capaces de absorber su alimento, habían perdido la clorofila, y
con ello, su capacidad para realizar la fotosíntesis. Sin embargo, en la actualidad los científicos
los consideran un grupo completamente separado, que evolucionó a partir de flagelados sin
pigmentos, por lo que se sitúan en el reino Hongos (Fungi).

75
La mayoría de los hongos están constituidos por finas fibras que contienen protoplasma,
llamadas hifas. Éstas a menudo están divididas por tabiques llamados septos. En cada hifa hay
uno o dos núcleos y el protoplasma se mueve a través de un diminuto poro que ostenta el centro
de cada septo. Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La
proliferación de hifas, resultante de este crecimiento, se llama micelio. La mayoría de los hongos
se reproducen por esporas, diminutas partículas de protoplasma rodeado de pared celular.

Los principales métodos aplicados para la observación microscópica de los cultivos son: la
observación en fresco, con una solución adecuada, y las preparaciones en cinta adhesiva

Las levaduras hacen referencia a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares
que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono,
produciendo distintas sustancias. Las levaduras son abundantes en la naturaleza, y se
encuentran en el suelo, sobre las plantas, se reproducen por gemación. La mayoría de las
levaduras que se cultivan pertenecen al género Saccharomyces, como la levadura de la
cerveza, que son cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Los protistos son organismos eucariotas unicelulares, como la mayoría de las algas y los
protozoos, y sus descendientes más inmediatos, como son las algas pluricelulares, que se
incluyen en este grupo por su estructura simple y las claras relaciones con las formas
unicelulares. El reino Protista fue propuesto por primera vez por el biólogo alemán Ernst
Heinrich Haeckel, debido a la dificultad que entrañaba la separación de los organismos
unicelulares animales de los vegetales. Los protistas están representados por muchas líneas
evolutivas cuyos límites son difíciles de definir.

La mayoría de estos organismos son unicelulares y microscópicos, aunque también los hay que
forman colonias, como los foraminíferos. Esta organización, ya más compleja, está más cerca
de los organismos pluricelulares superiores e indica que éstos evolucionaron a partir de
ancestros protistas.
Los protistas pueden considerarse un reino intermedio, y agrupan desde los organismos
unicelulares eucariotas y las colonias simples, hasta algunas algas superiores y grupos de
transición (de clasificación dudosa).

Estos últimos son pluricelulares, pero carecen de la organización compleja en tejidos, típica de
las plantas, animales y hongos superiores. Aun así, dentro de los grupos de transición hay
formas que comparten ciertas características de las plantas, como las algas pardas, verdes y
rojas; otras que están más cerca de los animales, tales como los mesozoos, placozoos y
esponjas, y las que son semejantes a los hongos, como los mohos plasmodiales del fango y los
quitridiales.

76
OBJETIVOS

✓ Realizar preparaciones en fresco de distintas especies de mohos.

✓ Observar la división asexual por gemación de levaduras.
✓ Observar placas fijas.

MATERIALES

Portaobjetos y cubreobjetos, cubetas de Tinciones, Aguja enmangada o lanceta, Levadura,

agua azucarada, trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos ,cultivo de protistos y
fitoplancton marino. Solución azul de lactofenol, algodón, microscopio, safranina.

PROCEDIMIENTO

OBSERVACIÓN DE MOHOS

Preparación en fresco de mohos

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande

para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la
misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra.

2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas
procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los
portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios
que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa,
los conidióforos.

3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el
definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior
por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se seccionarán con
un bisturí.

4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede
amontonado. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar
que se formen burbujas entre los dos vidrios.

77
1. Dibujar la observación a 10x y 40x.

Aumento:

Clasificación:

Aumento:

Clasificación:

Aumento:

Clasificación:

78
REPRODUCCIÓN ASEXUAL POR GEMACIÓN EN LEVADURAS

TÉCNICA

1. Disolver con ayuda de una aguja un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3
gotas de agua ligeramente azucarada.

2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.

3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa de la

levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una
doble finalidad:
Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina.
Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción
desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.

Dibujar la observación a 10x y 40x.

79
OBSERVACIÓN DE PROTISTOS

Monte gotas de los cultivos de protistos y fitoplancton marino e identifique en menor aumento,
mediante guías adicionales determine diferentes tipos de protistos, como Paramecium y
Euglena.

Se sugieren las siguientes figuras para ayudar a identificar los organismos tanto en la parte
relacionada con los hongos como en la parte relacionada con los protistos.

Aumento:
Observación:

Aumento:
Observación:

80
Figura 17. Hongos

81
80
Figura 18. Protozoos.

Fuente: Needham y Needham, 1991.

82
 Fuente: Needham y Needham, 1991

83
Figura 19. Diatomeas

Fuente: Needham y Needham, 1991

84
Figura 20. Algas verdes.

Fuente: Needham y Needham, 1991

85
Figura 15. Imágenes de hongos

1. Moho del tomate 2. Aspergillus

3. Penicilium 4. Penicilium

Figura 16. Levaduras y proceso de gemación

Fuente: figuras 15 (1,3) y figura 16 www.Joseacortes.com. Figura15 (2,4): los autores.

86
 CELULAS EUCARIOTAS: RECONOCIMIENTO DE CELULAS VEGETALES

Fuente: A. Bonilla.

El sello distintivo principal de la célula eucariota es la existencia de compartimientos delimitados

por membranas que están formadas físicamente separadas del plasmalema. El compartimiento
más notable es el núcleo, en el ADN se encuentra organizado en cuerpos complejos de
nucleoproteínas llamados cromosoma. En los cromosomas de las células eucariotas a
diferencia de las procariotas existe más de un cromosoma.

La célula eucariota está limitada por un plasmalema. Entre el plasmalema y la envoltura nuclear
está el citoplasma, que cuenta con un sistema de endomembranas. A través del citoplasma se
extiende un sistema de canales llamado Retículo endoplasmático o RE. Hay regiones del RE en
la que encontramos ribosomas (retículo endoplasmático rugoso) que es donde se sintetizan las
proteínas. Cuando no hay ribosomas adheridos al RE, se le denomina RE liso. El aparato de
Golgi es como una continuación del RE. Este compartimiento membranoso actúa como una
estación de procesamiento y empaque de proteínas, que irán a diferentes destinos celulares o
se exportarán de las células y el procesamiento de los lípidos.

88
Los lisosomas son los procesadores de desecho de la célula intracelulares. Presentan enzimas
digestivas que reciclan el material de desecho después del procesamiento. Con la excepción de
algunos protozoos anaeróbicos, todas las demás células eucariotas poseen mitocondrias,
notables organelos citoplasmáticos de doble membrana. Dentro de las mitocondrias ocurre la
producción de trifosfato de adenosina (ATP), la molécula portadora de energía más importante
de las células. Las mitocondrias poseen su propio ADN, y su propia maquinaria de síntesis de
proteínas.

Además de la diversidad de compartimientos membranosos las células eucariotas también

poseen varios elementos no membranosos tales como los ribosomas, centríolos, y el
citoesqueleto.

Ciertas características se encuentran solamente en algunos grupos eucariotes, Todas las algas
eucariotas, los protistas verdes y vegetales que forman tejidos, poseen una o más clases de
plastidios. El más conocido cloroplasto de las células verdes fotosintéticas, que convierten la
energía luminosa en energía química utilizable. La fotosíntesis ocurre dentro de los cloroplastos.

Otra característica común de las algas, hongos y vegetales terrestres y diferencia con las células
animales es la presencia de la pared celular muy visible, que rodea el protoplasto en células viva
o que queda como una armazón estructural después que ha muerto la célula. La vacuola como
organelo especializado de las células consiste en un saco que funciona como almacén de clases
de moléculas en soluciones o suspensiones diluidas es otra de las distinciones de estas células.
La existencia de una gran vacuola en la célula es indicador de que la célula ya alcanzó su
madurez y en estos casos pueden llegar a ocupar casi todo su volumen.

OBJETIVOS

✓ Elaborar cortes a mano alzada.

✓ Incrementar el sentido de observación de las estructuras vegetales.
✓ Comprobar la diversidad y especialización de las células vegetales y sus
agrupaciones.
✓ Verificar que las células vegetales poseen tamaños y formas variables .

MATERIALES
Cebolla cabezona, hojas de panameña, hojas de elodea, tallo de pasto y verbena, hojas de lirio,
loto, y caucho de la India, safranina, cuchillas de afeitar nuevas.

PROCEDIMIENTO

OBSERVACIÓN DE CÉLULAS VEGETALES

1.- Corte de bulbo de cebolla (Allium cepa): De un bulbo de cebolla cabezona desprenda una
porción de catáfilo (epidermis), agregue una gota de solución de lugol. Observe a menor
(10x) y mayor (40x) aumento. Dibuje el tejido epidérmico de la cebolla a mayor aumento.
Identifique las estructuras observadas en una de las células. Nombre el colorante utilizado.
Describa la forma de la célula observada.

90
 Aumento:

Clasificación:

2.- Cortes de hoja Panameña. (Zebrina pendula)

Del envés de una hoja panameña realice un corte longitudinal (epidermis inferior), colóquelo en
el portaobjeto y añada una gota de agua. Observe a menor (10x) y mayor a (40x) aumento.
Dibuje el tejido observado a mayor aumento. Identifique las estructuras observadas en una de
las células. Enfoque un estoma, dibuje separadamente e identifique sus partes. Seguidamente
realice el corte en la epidermis superior y busque los estomas.

Aumento:

Clasificación:

3. Como complemento a la observación anterior realice cortes de la epidermis superior e inferior

de hojas de Lirio y Loto (esta última puede ser reemplazada por buchón de agua) y ubique los
estomas.

91
 Aumento:

4.- Observación de hojas de Elodea (Elodea canadienses)

Seleccione una hoja de Elodea y límpiela de las algas que puedan estar recubriéndola, coloque
en una gota de agua una. Observe a menor (10x) y mayor (40x) aumento. Dibuje lo observado a
mayor aumento. Identifique estructuras u otros elementos observados. Describa la forma y
demás características.

Aumento:

Clasificación:

92
5.- Observación de vacuolas en Ginger o pétalos
Seleccione una hoja de Ginger o un pétalo, realice un corte fino del haz del tejido seleccionado y
coloque sobre una lámina, agregándole una gota de agua y cubriéndola con una laminilla.
Observe a menor (10x) y mayor (40x) aumento. Dibuje lo observado a mayor aumento.
Identifique estructuras u otros elementos observados. Describa la forma y demás
características

Aumento:

Clasificación:

6. Observación de tejidos vegetales (composición y distribución). Realice cortes transversales

de tallos de pasto y Verbena e identifique los tejidos, observe la constitución de estos y la
localización en cada uno de los cortes.

Aumento:

93
 Figura 21. Complejo estomático. Figura 22. Células de elodea.

Fuente: los autores

Figura 23. Corte transversal tallo de monocotiledóneas y dicotiledóneas (ver sección color)

Fuente: los autores

94
 CÉLULA ANIMAL Y HEMOCLASIFICACIÓN

Fuente: www.cscattle.com/t.quarter_horses.html

La célula animal comparte muchas características con las células vegetales, en cuanto a su
metabolismo y organización, sin embargo, la división de la línea filogenética, hace millones de
años, estableció características y funciones especiales que se observarán en el siguiente
protocolo.

En comparación con las células vegetales, las células animales carecen de una pared celular y
sistemas de autosuficiencia energética, sin embargo se encuentran en formas tan diversas que
esta hace convergencia con la función a realizar, como en el caso de los glóbulos rojos, las
neuronas o las células contráctiles musculares.

97
Los grupos sanguíneos (A, B, AB, O) fueron descubiertos por Landsteiner en el año 1900; no
obstante, para esa época no se conocía aún el por qué tales diferencias. Gracias al avance
tecnológico se pudo determinar que lo que hacia particular a cada grupo sanguíneo era la
distinta organización molecular de uno de los componentes de la membrana plasmática de los
eritrocitos, los carbohidratos. Para comprender adecuadamente la manera como de determinan
los distintos grupos sanguíneos es necesario recordar la estructura de la membrana plasmática
de las células.

Pues bien, recuérdese que las membranas celulares están conformadas por una doble capa
lipídica en la que se encuentran inmersas diferentes tipos de proteínas, algunas dispuestas
periféricamente y otras integradas a la bicapa, esto de acuerdo al modelo en mosaico fluido.

Los carbohidratos, en forma de oligasacáridos, también hacen parte de dichas membranas al

asociarse con los lípidos y las proteínas, formando complejos macromoleculares denominados
glucolípidos y glucoproteínas que en conjunto reciben el nombre de glucocálix. Es importante
recalcar que este complejo está orientado exclusivamente hacia el exterior de las células.

En el glucocálix de los glóbulos rojos abundan una glucoproteína denominada glucoforína (hay
aproximadamente un millón por eritrocito), que consta de una parte proteica siempre constante
en todas las glucoforínas, y otra parte oligosacárida en la que se encuentran residuos de
glucosa, galactosa, fructosa, N-acetilgalactosamina, manosa, ácido siálico, etc., todos ellos
unidos mediante enlaces glucosídicos. Al complejo constituido por la parte proteica y la parte
oligosacárida se le conoce con el nombre de sustancia H.

El ácido siálico generalmente se encuentra en las partes terminales de las cadenas

oligosacáridas de la sustancia H, acompañado por la N-acetilgalactosamina o por la galactosa.
Estas unidades terminales son antígenos de superficie que permiten clasificar la sangre en
diferentes grupos, así: cuando se halla presente N-acetilgalactosamina en la parte terminal se
dice que es del grupo sanguíneo A; si es la galactosa la que se encuentra en esta posición se
dice que es el grupo B; si aparecen ambas unidades entonces será el grupo AB y si no aparece
ninguna de estas dos unidades terminales la sangre será del grupo O.

Factor Rh

Fue descubierto por Landsteiner y Weiner en el año 1940 y consiste en la presencia de otro
antígeno diferentes localizados también en la membrana plasmática de los eritrocitos. Aquellas
células que los presentan son Rh positivos (Rh+), las que no los tienen son Rh negativo (Rh-).
Estos antígenos se manifiestan de manera independiente a los sistemas ABO, es por eso que se
habla de grupos sanguíneo A y Rh positivo, o grupo A y Rh negativo; lo mismo acontece con los
demás grupos sanguíneo.
Es bueno aclarar que todos los sistemas de grupo sanguíneo, incluidos el factor Rh, están
determinados genéticamente.

98
OBJETIVOS:

✓ Identificar la célula animal comparándola con la vegetal.

✓ Comprender la correlación de forma de la célula animal con su función.
✓ Aplicar el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo en la identificación del grupo
sanguíneo.

MATERIALES

Alcohol antiséptico70% montaje con tejido sanguíneo, lancetas, papel absorbente o filtro,
aguja de disección, hisopos, porta y cubre objetos, herramientas habituales, placas fijas de
tejido humano

OBSERVACIÓN DE CELULAS ANIMALES

1.- Monte una gota de sangre en un extremo del portaobjeto, inmediatamente haga un
extendido según indicaciones del docente. Deje secar. Fije la placa inundando el extendido con
metanol, deje secar por unos minutos. Tiña durante 3 minutos el extendido con Giemsa. Lave y
seque la placa. Observe con el objetivo de 100x (inmersión). Dibuje le tejido sanguíneo a mayor
aumento. Identifique los glóbulos rojos y blancos. Dibuje lo observado.

CLASIFICACIÓN DE LOS LEUCOCITOS

Figura 24. Células sanguíneas.

Neutrófilo Linfocito Eosinófilo Monocito

Eritrocitos Plaquetas Basófilo

(glòbulos rojos)

99 98
 Aumento:

Clasificación

2- Realice un raspado de epitelio bucal en la zona interna de la mejilla con la ayuda de un

hisopo y realice un extendido de la muestra sobre una lámina, agregue dos gotas de azul de
metileno, cúbrala con la laminilla y retire el exceso de colorante con papel absorbente.
Enfoque a menor (8x ó 10x) y mayor aumento (40x) y dibuje lo observado a 40x.

OBSERVACIÓN DE PLACAS FIJAS DE TEJIDO HUMANO

✓ Observe y detalle las características de los diferentes tejidos y asociar con su función

100
HEMOCLASIFICACIÓN

MATERIALES

Solución anti-A, solución anti-B, solución anti-D (anti Rh), material punzante estéril, algodón,
agua oxigenada, una gota de sangre

TÉCNICA

Colocar en un portaobjeto una gota de suero anti-A, una de anti-B, una mezcla de anti-A y anti-
B, y una gota de anti-D, cada una en su casilla correspondiente, como se indica en la figura.
 Pinchar la yema del dedo, previa desinfección con alcohol o agua oxigenada.
 Depositar una gotita de sangre en cada casilla y mezclar con los sueros.

Observar los resultados. El grupo sanguíneo del individuo corresponderá con el de la

casilla en la que la sangre esté hemoaglutinada. Si el individuo es del grupo AB, la sangre
coagulará en las tres primeras casillas. Además, si la sangre coagula en la casilla "anti-D", el
individuo será Rh positivo, de lo contrario será Rh negativo.
Personalmente, prefiero hacer la determinación del factor Rh en un porta, en el que puedo
observar mejor la coagulación sanguínea.

Anti D

Anti B

Anti A

En este caso en particular se presenta un ejemplo de un individuo de grupo A y factor

Rh negativo, debido a que solo se presenta hemoaglutinación contra el anticuerpo Anti
A

101
El punto central de esta práctica se encuentra en los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos o
hematíes son células sanguíneas, por lo tanto todos los tenemos. Sin embargo, en la
membrana de los glóbulos rojos pueden existir unas proteínas especiales: son las
glucoproteínas A y B. Así, un glóbulo rojo puede tener proteína A, proteína B, tener ambas o no
tener ninguna. De manera que un individuo tendrá grupo sanguíneo A si sus glóbulos rojos
tienen la glucoproteína A en su membrana, siguiendo el mismo criterio para el resto de los
grupos (si no existe proteína, entonces será de grupo sanguíneo O). Estas proteínas
corresponderían a lo que denominan antígenos.
Ahora bien, en el plasma sanguíneo tenemos anticuerpos. Evidentemente, un individuo del
grupo A no podrá tener anticuerpos anti-A, pues esto no sería viable (la sangre coagularía).
Así:
✓ los individuos A tendrán anticuerpos anti-B
✓ los individuos B tendrán anticuerpos anti-A
✓ los individuos AB no tendrán anticuerpos de este tipo
✓ los individuos O tienen los dos tipos de anticuerpos.

Figura 27. Reacción de los grupos sanguíneos.

Grupo A B AB O
sanguíneos
o

Glóbulos rojos

En la membrana Antígeno A Antígeno B Antígenos A y B No antígenos

En el plasma Anti-B Anti-A No anticuerpos Anti-A y Anti-B

De la misma manera, el factor Rh es otra proteína que existe en los glóbulos rojos de algunas
personas. Su nombre viene del mono en el que fue descubierta, el Macacco rhesus. El factor Rh
positivo es un factor hereditario dominante

Este asunto tiene especial importancia en donaciones de sangre. Como hemos visto, un
individuo A tiene en su plasma anticuerpos anti-B, así que no podrá recibir sangre de un individuo
B, pues estos anticuerpos provocarían la coagulación de la sangre del donante en los vasos
sanguíneos de la persona receptora.

102
 TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA

Fuente: /www.uc.cl/sw_educ/biologia/bio100/html/portadaMIval2.5.html

Toda célula posee un sistema complejo de membranas, cuya función general es el intercambio
de materiales entre la célula y el medio acuoso externo o fluido extracelular (FEC), y entre los
organelos y el citoplasma de la célula. Las membranas sirven igualmente para compartimentar
enzimas y metabolismo celulares.

En la célula vegetal se encuentran: el PLASMALEMA o membrana plasmática, que constituye el

límite exterior del protoplasma próximo a la pared celular, el TONOPLASTO o membrana
vacuolar, que será el contenido de cada vacuola del citoplasma; normalmente existe una gran
vacuola en las células vegetales maduras, LAS MEMBRANAS DE LOS ORGANELOS, como
cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplasmático, etc. Es de anotar que las células vegetales,
además de la membrana plasmática poseen una pared celular de celulosa, gruesa y porosa,
que da rigidez al tejido vegetal.

En las células animales también encontramos un sistema de endomembranas que garantiza un

transporte organizado intra y extracelular, carecen de vacuolas y de pared celular, pero presenta
su sistema de endomembranas que compartimentan los diferentes organelos celulares y una
membrana plasmática selectiva que garantiza la entrada y salida de sustancia de la célula
según sus necesidades y el medio en que se encuentre.

105
Las membranas biológicas pueden ser diferentes en cuanto a estructuras y función, sin
embargo tienen en común ciertas propiedades, por ejemplo su estructura laminar de naturaleza
fluida, su composición lipo-proteíca, con partes hidrofílicas e hidrofóbicas.
Los primeros forman bicapas.

La bicapa lipídica obstaculiza el fluido de moléculas polares. Entre los lípidos se encuentran los
fosfolípidos, glucolípidos y el colesterol. Las proteínas sirven de compuerta, receptores,
transductores de energía y enzimas. Estas responden a la mayoría de los procesos dinámicos
que se llevan a cabo en las membranas, y así las membranas biológicas que ejercen funciones
diferentes poseen proteínas diferentes.

Las membranas poseen la propiedad funcional de PERMEABILIDAD SELECTIVA, por ser

permeables a algunas sustancias y a otras no dependiendo fundamentalmente a su tamaño,
composición química y concentración. Tal permeabilidad puede verse afectada por cambios de
temperatura, tóxicos, solventes orgánicos y la composición química del medio que rodea a la
célula.
Difusión.

Es el movimiento de partículas o moléculas desde una región más concentrada hacia la de

menos concentración, ejemplo al abrir un perfume su aroma de difunde rápidamente en el
recinto; una gota de tinta agregada a un recipiente con agua pigmenta el líquido completamente
o bien, al dejar un terrón de azúcar en un tinto (sin agitar), transcurrido un tiempo se endulza el
contenido.

Osmosis y presión osmótica.

La ósmosis en la difusión de agua a través de la membrana con permeabilidad selectiva.

Cuando una solución acuosa en diferentes concentraciones se separa mediante una
membrana, con permeabilidad selectiva, una solución concentrada de una diluida, se origina
una difusión de agua a través de la membrana, proceso denominado ósmosis.

En este proceso se crea una difusión de agua en una dirección tal que las concentraciones se
igualen a ambas partes de la membrana, o sea desde la región de mayor concentración de agua
o mayor potencial de agua hacia la región de menor concentración de agua o menor potencial de
agua. La difusión de agua desde el solvente puro hacia la solución o desde la solución más
diluida hacia la solución químicamente más concentrada, da como resultado un incremento en
el volumen y la fuerza de empuje de las moléculas de agua creando una presión denominada
presión osmótica.

106
OBJETIVOS

✓ Determinar el efecto de la concentración del soluto y de la temperatura sobre el

tiempo de difusión.
✓ Visualizar y establecer diferencias entre ósmosis, diálisis, difusión en células y
modelos de membranas semipermeables.
✓ Resolver situaciones relacionadas con los fenómenos de transporte a través de
la membrana.

MATERIALES

Tubos de ensayo, solución de KMnO4 (0.1%, 1.0% y 10%); papel milimetrado, estufa,
osmómetro, solución de NaCl (0.85%), agua destilada, solución de NaCl (5%), hoja de Elodea,
sangre, y material habitual.

I.- EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SOLUTO EN EL TIEMPO DE DIFUSIÓN

Tome tres tubos de ensayo limpios y que sean de igual tamaño y vierta en ellos la misma
cantidad del agua del grifo, de tal manera que se ocupe aproximadamente ¾ partes del volumen
total. Márquenlos del 1 al 3 y depositen en cada uno de ellos una gota de permanganato de
potasio de distinta concentración con intervalos de un minuto y en el centro de la superficie de
agua, así: en el tubo 1, permanganato de potasio 0.1%; en el tubo 2, permanganato de potasio al
1.0% y en el tubo 3, permanganato de potasio al 10%. Anote en cada caso el tiempo transcurrido
desde el momento en que deposita el colorante hasta que su distribución en el agua sea
uniforme. Consigne sus datos.

[KMnO4] TIEMPO DE DIFUSIÓN

Tubo
Tubo
Tubo

 Haga una gráfica en papel milimetrado (preferiblemente en barras) colocando en la ordenada

el tiempo de difusión y en las abscisas los diferentes grupos definidos por las concentraciones.
 Establezca la relación de proporción concentración y tiempo de difusión.

Nota: Al final de la sesión de experimentos in vitro se dejará espacio para los gráficos y
respuestas

107
II.- EFECTO DE LA TEMPERATURA EN EL TIEMPO DE DIFUSIÓN

 Con base en el análisis de la experiencia anterior, diseñe y realice en el laboratorio otra

experiencia que le permita observar el efecto que ejerce la temperatura sobre el tiempo de
difusión de una sustancia. Defina los objetivos del experimento diseñado.
 Haga una gráfica sobre un papel milimetrado teniendo en cuenta los parámetros
necesarios, para esto debe definir su variable independiente (eje de las abscisas) y
variable dependiente (eje de las ordenadas)
 Qué efecto tiene la temperatura sobre la velocidad de difusión? Establezca una relación de
proporción entre estas variables.

III. OSMOSIS: Prepare el montaje que se ilustra a continuación

Figura 28. Osmómetro

Pipeta Graduada
Soporte
Pipeta Graduada
Membrana
semipermeable

Sln. Hipertónica Sln. Hipotónica

Fuente: los autores

El efecto de la presión osmótica se puede apreciar fácilmente en un osmómetro, un

aparato sencillo que se construye con un segmento de intestino de cerdo que entre otras
funciones, puede servir como modelo de membrana semipermeable. Se amarra un
extremo del intestino y se llena con una solución azucarada u otra. Tendremos tres
osmómetros que contenga estas soluciones a diferentes concentraciones: Ej. melaza.
En el extremo libre se coloca una pipeta delgada sujeta a un soporte y se introduce el
sistema en un vaso o beaker que contenga agua destilada.

108
Debe anotar la altura de la solución en la pipeta al comienzo del experimento e ir registrando
cada 5 minutos, el volumen de la solución en la pipeta. Realice los registros de esta manera
durante 20 a 30 minutos en los tres sistemas, auxiliándose de la siguiente tabla.

No.registro Volumen
(30 min) Volumen total Velocidad de osmosis
(segmento)
1 O-I O-II O-III O-I O-II O-III O-I O-II O-III
(Inicio)
2
3
4
5
6

✓ Haga una gráfica en un papel milimetrado con la evolución de los tres osmómetros y
determine los parámetros que debe tener en cuenta para colocar en el eje de las
ordenadas y en el eje de las abscisas de su gráfica.
✓ Calcule la velocidad final de ósmosis en cada osmómetro.

IV- DIALISIS.
Prepare el montaje que se ilustra a continuación

Figura 29. Diálisis.

Papel celofán
Soluciones
Soporte Universal

Fuente: los autores

Agregar en una bolsa de papel celofán que contiene agua, las siguientes sustancias: azúcar,
almidón, sales en proporciones iguales y se sumerge la bolsa en agua destilada (este montaje
se debe hacer con 24 horas de antelación al experimento).
Se realiza la prueba para identificación de azúcares, almidones y sales, tomando tres muestras
del agua destilada de la cubeta en tubos de ensayos.

109
✓ Prueba para azúcares
✓ Prueba para almidón
✓ Prueba para sales

Describa los cambios ocurridos y justifique

V- TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANA BIOLÓGICAS

A. Coloque en el portaobjeto una hoja de Elodea, cúbralo con una laminilla y observe.
Seguidamente coloque al lado izquierdo de un portaobjetos una gota de solución
hipotónica y sobre esta una hoja de Elodea, luego cubra el montaje con una laminilla (en
caso necesario complete el volumen del líquido agregando solución en el límite entre la
laminilla y el portaobjetos, la cual se difundirá por capilaridad. Repita el mismo
procedimiento utilizando solución salina isotónica e hipertónica.
✓ Haga el dibujo de lo observado en las diferentes situaciones a 40x.
✓ Defina el fenómeno que ocurre en la célula (para ello por lo menos el 50% de las células de
la preparación deben estar manifestando la misma situación).

110
 Aumento:

B.- Coloque sobre un portaobjetos una gota de sangre y haga un extendido de ella, cúbrala
con una laminilla, móntela al microscopio y obsérvela empleando el objetivo de 40x. Haga un
dibujo de los glóbulos rojos. Seguidamente adicione una gota de solución hipotónica en el
límite entre la laminilla y el portaobjetos, la cual se difundirá por capilaridad. Observé lo que
ocurre con los glóbulos rojos haga el dibujo. Desarrolle el mismo procedimiento, pero esta
vez adicione en un extendido solución isotónica y en otro solución salina hipertónica.
✓ Observe, dibuje y compare que sucede con los glóbulos rojos.
✓ Defina el fenómeno que ocurre en los eritrocitos (para ello por lo menos el
50% de las células de la preparación deben estar manifestando la misma
situación).

111
 LABORATORIO 11

MITOSIS Y MEIOSIS

Fuente: http:\\users.design.ucla.edu/ ~egoto/crawling%20baby.jpg

El ciclo celular comprende las etapas de crecimiento, desarrollo, diferenciación, maduración y

reproducción para dar como resultado la formación de dos células hijas, las que a su vez repiten
de nuevo y por separado todo el proceso anterior, de ahí el nombre de ciclo celular. Por lo tanto el
ciclo celular abarca dos grandes períodos, el de interfase y el de división celular o mitosis.

MITOSIS:

Una vez duplicado el material nuclear y citoplasmático, la célula se encuentra ahora capacitada
para repartir su contenido en dos células hijas. Dicha repartición se da en forma secuencial,
comenzando primero a dividirse el núcleo, luego el citoplasma y por último ocurre una
separación territorial.
 La división del material nuclear se denomina cariocinesis y se realiza de tal manera que
cada núcleo de las células queda con la misma cantidad de material genético que la célula
madre que le dio origen.

La división del contenido citoplasmático se da en forma equitativa, con el fin de que cada
célula quede con un volumen más o menos igual de citoplasma y una dotación básica de
orgánulos celulares; a este fenómeno se le denomina citocinesis. La separación
territorial de las dos células hijas que se están originando se da por estrangulación de la
membrana citoplasmática a nivel de la línea ecuatorial de la célula madre, en células
animales; en las plantas superiores este fenómeno es diferente ya que ellas se encuentran
rodeadas de una pared celular rígida. En vez de ser estranguladas y divididas en dos por
el anillo contráctil, estas células se dividen mediante la formación de una nueva pared
celular y una membrana plasmática dentro de la célula; a este fenómeno en ambos
casos que permite independizar las dos células hijas le denomina citodiéresis.

Todos los fenómenos antes mencionados ocurren de una manera gradual y continua, que
para los efectos didácticos se han agrupado en cuatro etapas que en su orden son:
profase, metafase, anafase, telofase.

MEIOSIS

Los únicos órganos que utilizan la meiosis como mecanismo de reproducción celular son
las gónadas, siendo estas el lugar donde se forman las células germinales o gametos
(espermatozoides y óvulos). Pero antes de que se inicie la meiosis cada célula
progenitora, espermatogonio u ovogonio, debe pasar por un período de interfase, durante
el cual se prepara para la división duplicando su material genético y aumentando su
volumen citoplasmático, tal como acontece en la mitosis.

La meiosis comprende una serie de eventos que traen como consecuencia la

variabilidad genética y la reducción a la mitad del número de cromosomas formándose
gametos de constitución genética haploide. A diferencia de la mitosis, la meiosis supone
la división de una célula parental diploide en una progenie haploide, de tal manera que
cada célula contiene sólo un miembro del par de cromosomas homólogos presentes en el
progenitor diploide.

Esta reducción en el número de cromosomas se realiza mediante dos rondas

consecutivas de división nuclear y celular denominadas meiosis I y meiosis II, que ocurren
tras la única ronda de replicación del ADN.

MEIOSIS I

Durante la Meiosis I, los cromosomas homólogos primero se emparejan unos con otros y
luego segregan a células hijas diferentes. Las cromátidas hermanas permanecen unidas,
por lo que tras la meiosis I se obtiene células hijas que contienen un único miembro de
cada par cromosómico (constituido por dos cromátidas hermanas).

MEIOSIS II
Después de terminada la telofase I cada célula hija entra en un período de aparente reposo,
mal llamado interfase II, en el cual la célula se prepara de nuevo para una nueva división,
pero sin que ocurra duplicación del material genético.
OBJETIVOS

✓ Identificar las fases de la mitosis y correlacionarlas con el proceso de

reproducción celular.
✓ Reconocer las diferencias morfológicas entre la célula sexual femenina y
masculina y vincularlas con su función biológica.
✓ Comparar la reproducción de células somáticas y células sexuales.

MATERIALES:

Microscopio, Estereoscopio, portaobjetos, cubreobjetos, cuchilla de afeitar, pinzas, caja de

petri, cebolla cabezona, tijeras, papel de filtro, vidrio de reloj, colchicina, orceína acética,
ácido clorhídrico (1N), alcohol 90 º, ácido acético. Ovarios de res o cerdo, jeringas, pajilla,
hisopos, colorantes (hematoxilina-eosina, papanicolau).

PROCEDIMIENTO
(Mitosis)

Para La observación de las distintas etapas de la mitosis se acostumbra utilizar los

meristemos terminales de la cebolla cabezona y la forma de obtenerlos se puede consultar en
los siguientes link:
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/ccnn/banco4/Laboratorio_mitosis.pdf
http://farmaciaulat.blogspot.com/p/mitosis-en-meristemas-vegetal.html

Figura 32. Mitosis en células de raíz de cebolla

Fuente: https://inakiresa.wordpress.com/category/practicas/page/5/
I. En la figura 32 identifique las fases de la mitosis y complete el siguiente cuadro. En la
columna correspondiente a fase escriba la fase señalada en la figura y en las
observaciones describa los cambios morfológicos que se observan.

FASE OBSERVACIONES

1.

2.

3.

4.

II. En la siguiente lámina (figura 33) cuente al menos 100 células en total, identificando
separadamente cada una de las fases, esta información se empleará para determinar
el índice mitótico y el índice de fase utilizando la siguiente formula:

Células en mitosis Células en Fase

IM= -------------------------- X 100 IF= ----------------------------------- X 100
Total de células Total de células en mitosis

Figura 33. Fases de la mitosis en corte de meristemo de cebolla.

Fuente: http://barresfotonatura.com/otros/biologia/foto/mitosis-2
Los resultados consígnelos en la siguiente tabla.

Número Índice
Fases de células (mitótico/fase)
Interfase
Profase
Metafase
Anafase
Telofase
Total

PROCEDIMIENTO (Meiosis)

Para la observación de las células que dirigen este proceso de división meiótico se procederá a
realizar la aspiración de ovocitos de ovarios de res, cerdo o ratón (o rata) mediante el uso de
jeringas con agujas de calibre grueso para evitar dañar las células. Posteriormente se
procederá a realizar la observación y selección de los ovocitos, determinando la etapa del ciclo
en la que se encuentran. (Ver esquemas página).

Figura 34. Extracción de ovocitos

 III. En el siguiente campo óptico dibuje el ovocito aspirado, describa forma y tamaño
de la célula (empleando el programa fiji), señale e identifique las siguientes
estructuras: células del cumulus, zona pelucida y núcleo y describa sus funciones.

Aumento:
Observaciones:

IV. Es también opcional en este laboratorio la observación de células espermáticas

de mamífero mediante el uso de pajillas que son utilizadas en procesos de
inseminación artificial en animales de granja o una muestra tomada por un
donante mediante masturbación. Describa forma y tamaño de la célula
comparándola con el ovocito, dibuje un espermatozoide y señale: cabeza pieza
media y flagelo (describa la función de cada estructura). Observe su movimiento y
señale si todos se mueven igual o de diferentes formas.

Aumento:
Observaciones:

En el siguiente link
http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab3/concepts2.html, encontrará
un ejercicio sobre crossing over en el hongo del género Sordaria, primero revise los
conceptos básicos, luego lea el diseño del experimento y con base en lo leído conteste las
preguntas que se encuentran en el apartado de análisis de resultados.
GALERIA DE IMÁGENES
Figura 35. Mitosis Tinción con acetorceína

Fuente: Angélica Bonilla

Fuente:
www.joseacortes.com/galeriaimag/citologia/index.htm

Figura 36. Diferentes tipos de Oocitos.

Vaca Ratón por hiperovulación

Fuente: CECOLFES 2003

Humano Oocito fecundado se observan
los dos pronúcleos en el centro

Fuente: CECOLFES 2003

Figura 37. Espermatozoide

Fuente: www.joseacortes.com/galeriaimag/citologia/index.htm
124
 SUSTANCIAS PRODUCIDAS POR EL PROTOPLASTO

Fuente: L. Bonilla.

El protoplasto se definió como la materia viva es su forma más simple del griego proto =
primero, por lo tanto se puede definir como protoplasto la parte de la célula que está delimitada
e incluida dentro de la pared celular y que contiene todos los elementos celulares necesarios
para el mantenimiento de la célula.

El protoplasto vegetal ha cobrado en la actualidad una gran importancia en los procesos

biotecnológicos ya que puede ser utilizado para la obtención de híbridos, cíbridos o asimilar
información genética nueva ya sea a través de vectores o directamente. Una de las
características de estos protoplastos aislados es que tienen la capacidad de regenerar su
pared celular, lo que le ha dado una importancia primordial en la biotecnología agraria y el
cultivo de tejidos vegetales in vitro.

130
Entre los componentes protoplasmáticos encontramos: el citoplasma, núcleo, plastidios,
mitocondrias entre otros.

Los componentes no protoplasmáticos: vacuola y diversas inclusiones sólidas como: cristales,

granos de almidón y goticas de aceite. Las sustancias no protoplasmáticas del citoplasma y de
las vacuolas constituyen materiales nutritivos o bien otros productos metabólicos designados
con el nombre de sustancias ergásticas (del griego Ergón = trabajo).

Al clasificar las partes del protoplasto, se consideran a los componentes protoplasmáticos como
vivos, mientras que a los no protoplasmáticos, se le considera como no vivos, aunque
establecer una clara distinción es bastante difícil, pues existe una interrelación estrecha entre
uno y otros componentes.

En el grupo de componentes protoplasmáticos estudiaremos los plastidios y entre los no

protoplasmático las vacuolas y las sustancias ergásticas.

Componentes protoplasmáticos: Plastidios

Plastidios o plastos: son cuerpos protoplasmáticos claramente delimitados, de estructura y

función especializadas. Las plantas inferiores pueden carecer de plastidios o pueden contener
uno o dos en una célula, pero en las plantas superiores cada protoplasto contiene comúnmente
numerosos plastidios. Es típico de las células vegetales, ya que las animales no tienen un
componente exacto que mimetice la función que realizan estos elementos en la célula.

Los plastidios se clasifican según la presencia o ausencia de pigmento en:

AMILOPLASTOS (almidón)
Incoloros- LEUCOPLASTOS OLEPLASTOS (aceite)
PROTEINOPLASTOS
(proteína)
PROPLASTOS
PLASTIDIOS
CLOROPLASTOS (verde)
Pigmentados- CAROTENOIDES (naranja)
CROMOPLASTOS XANTOFILAS (amarillo)
LICOPINA (rojo)

131
Componentes no protoplasmáticos: Vacuola y sustancias ergásticas

La formación de la vacuola indica el fin de la fase embrionaria de una célula y la iniciación de su

crecimiento y diferenciación. En las vacuolas de células vegetales se han identificado sales,
azúcares, ácidos orgánicos y otros compuestos solubles, proteínas e incluso sustancias grasas.
Los materiales presentes en las vacuolas se clasifican como ergásticos. Son sustancias de
reservan que son utilizadas por el protoplasto en sus actividades vitales, o también pueden ser
sustancias de desecho, producto de metabolismo celular, las cuales aparecen y desaparecen
en diferentes estadios de la vida de una célula. Se puede resumir entonces como productos de
reserva o de desecho de la actividad celular.

Algunas sustancias ergásticas:

Secreciones y otras sustancias ergásticas.

Las sustancias que se secretan son depositadas en la vacuola de la célula o en otros sitios
celulares como secreciones sin un valor obvio para la planta. No obstante existen también
células u órganos vegetales con función glandular, que son capaces de segregar sustancias al
exterior.

132
 Cristales de sales insolubles, de carbonato y oxalato de
calcio
SECRECIONES (cristales solitarios monocíclicos, Kystis (bolsas), cistolitos
(piedras),
Drusas (hexagonales), rafideos, arena cristalina

Antocianinas = colores: azul, mora do,

rojo

Flavonas= colores amarillos

PIGMENTOS

Ficobilinas= Ficocianinas (azules)

Ficoeritrinas (rojas)

LATEX

Bolsas oleíferas lisógenas

Bolsas oleíferas esquizógenas
ESENCIAS Pelos glandulares insectívoros
Gutación

OBJETIVOS

 Diferenciar los materiales de reserva de las sustancias ergásticas.

 Observar los diferentes plastidios que se encuentran en las células vegetales y sus
pigmentos respectivos.

 Identificar las características esenciales entre las vacuolas de las células vegetales y de
otros microorganismos.

 Diferenciar las diferentes clases de sustancias ergásticas en cuanto a su forma.

MATERIALES

Pétalos de flores, (clavel, ginger, etc.), hoja de caucho de camellones, pecíolo de begonia, tallo
de besito antioqueño, zanahoria, tomate, granos de maíz o arroz, papa, semillas de higuerilla o
maní, fríjol, cuchillas nuevas, portaobjetos y cubreobjetos, gotero, microscopios.

133
PROCEDIMIENTO

Observación licopeno, carotenos

Realice un montaje de epidermis de tomate y de corte fino de zanahoria. Observe al microscopio
en menor (10x ó 8x) y a mayor aumento (40x) y dibuje a mayor aumento, fije su atención en las
estructuras observadas y el color que presentan.

Aumento:

Observación de cristales de carbonato y oxalato de calcio: Cistolitos

De una hoja de caucho de camellones realice un fino corte transversal. Observe al microscopio
en menor (10x ó 8x) y a mayor aumento (40x) y dibuje a mayor aumento. De la bráctea realice
un fino corte y observe el microscopio en menor (8x ó 10x) y mayor aumento (40x).

Aumento:

134
Observación de cristales de oxalato de calcio:

Drusas
Haga un fino corte del pecíolo de la begonia y realice un montaje húmedo. Observe en menor (8x
ó 10x) y en mayor (40x) aumento.
La forma de los cristales depende del sistema de cristalización, pudiendo ser tetragonal (drusas)

Aumento:

Rafideos

Haga un corte transversal del tallo de panameña. Realice un montaje húmedo. Observe en
menor (8x ó 10x) y en mayor (40x) aumento.
Haga un corte transversal del besito antioqueño. Realice un montaje húmedo. Observe en
menor (8x ó 10x) y en mayor (40x) aumento.
Las sales de cristalizan en sistemas monocíclicos tomando el aspecto de agujas.

Aumento:

135
Látex

Realice un corte del pecíolo de la hoja de caucho o de cualquier otra planta que tenga color.
Monte en una placa un gota de látex, observe en menor (8x ó 10x) y en mayor (40x) aumento.

Aumento:

Modificaciones de células epidérmicas

Realice el montaje de una hoja de drosera o pringamosa y observe a 10x y a 40x y dibuje lo
observado a 40X. Ponga nombre de estructura observada.

Aumento:

136
Biocompuestos de Reserva

Amiloplastos

Realice un raspado con la cuchilla en los granos de maíz o arroz, y de igual manera en la papa
con el fin de poder identificar diferentes tipos de amiloplastos, monte en una lámina, tiña con
lugol (La tinción de estas estructuras se hará con lugol diluido considerablemente).

Aumento:

Oleoplastos

Para la observación de estas estructuras proceda a raspar el interior de las semillas de higuerilla
(también puede utilizarse maní) con la cuchilla, monte en un portaobjetos y tiña con sudam III

Aumento:

137
Proteoplastos

En este caso la observación de proteoplastos se puede realizar en granos de fríjol, con la

misma técnica de raspado con la cuchilla, el cual se lleva a una lámina y se tiñe con eosina y
cubriéndose con una laminilla posteriormente.

Aumento:

138
AMILOPLASTOS CISTOLITOS ESTOMAS
ANTOCIANOS

TRICOMAS RAFIDEOS

DRUSAS LICOPENOS

139 138
141 138
 BIBLIOGRAFÍA

AUDESIRK, AUDESIRK and BYERS. Biología 1. Prentice Hall, 6th ed. México,
2003.

Célula vegetal: una guía práctica, Eds. Roberto Dávila y Bibiana Dávila. Dávila &
Dávila. Bogotá, 2003.

COOPER, G.C. La Célula. Marbán 2da ed. 2002.

DAVID L.Neison, MICHAEL M. COX Lehninger. Principles of Biochemestry. Fourth

Edition. 2004, 1100 pp.

Guías de laboratorios existentes entre los profesores y auxiliares de Biología

celular.

http://farmaciaulat.blogspot.com/p/mitosis-en-meristemas-vegetal.html

http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/ccnn/banco4/Laboratorio_mitosis.
pdf

JUNQUEIRA, L. C, CARNEIRO. J. Biología Celular y Molecular McGraw-Hill 1998.

Mundo científico, no. 199, marzo, 1999: p: 24-26.

Mundo científico, no. 201, mayo, 1999: p: 22-25.

NEEDHAM, J.G. Guía para el estudio de los seres vivos de las aguas dulce.
Barcelona Reverté, 1991, p. 131.

www.iespana.es

www.josecortes.com/prácticas.

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