División de Ciencias Naturales

y Exactas.

Laboratorio de Genética.

NOMBRE DE LA
PRÀCTICA:

TRAMPAS GENÉTICAS: USO DE TRAMPAS PARA IDENTIFICAR GENES Y

SUS FUNCIONES EN PLANTAS.

Equipo 3:

 Juan Ignacio Olmos Valtierra.

 Carlos Javier Hernández Ramos.
 Perla Andrea Corona Ramírez.

Descripción breve de lo que se hizo:

1. Se nos entregaron 3 tubos Eppendorff ya preparados que contenían las semillas a
utilizar ya preparadas para su cultivo en las placas con el medio correspondiente.
2. Se golpearon suavemente los tubos para despegar las semillas pegadas en las
paredes y para facilitar su dispersión y cultivo.
3. Luego, se procedió al cultivo de las semillas esparciéndolas en medios MS con
Kanamicina tratando de que quedaran lo más separadas posible para su
identificación y facilitar su conteo.
4. Posteriormente, se cerraron las placas y se les cubrió con papel aluminio
completamente.
5. Después, se llevaron a incubar a una temperatura de 4°C esperando hasta la
semana siguiente (sin embargo según indica el protocolo debían ser 2 días).
6. Terminada la incubación de estas se observó su crecimiento o ausencia del mismo
y se llevó a cabo un análisis sobre las causas que determinaron su crecimiento y
así mismo determinar la razón por la cual hubo contaminación de hongos en la
mayoría de las placas.
7. Debido a lo anterior se hizo solo el conteo en aquellas placas donde era
apreciable el crecimiento y por su puesto ausencia de este.
8. Se compararon resultados con compañeros y se pidió a aquellos con ausencia de
contaminación compartieran sus resultados con fines académicos para observar
los resultados esperados y para aprender de nuestros errores.
Resultados:

Equipo: 3

Tabla 1. Crecimiento de Arabidopsis thaliana en medios de cultivo MS con

Kanamicina.

No. Placa (Imagen) Crecimiento

Placa 1. En la placa 1 se observo
un ligero crecimiento, ya
que se apreciaron
diversas radiculas, las
cuales son indicativas de
que la germinacion de la
semilla se ha llevado a
cabo, ademas tambien
se visualiza la aparicion
de hongo.

Placa 2. En la placa 2 se aprecio

un mayor crecimiento,
incluso se propagaron
diversas hojas pequeñas
caracteristicas de esta
planta, sin embargo
dicho crecimiento se vio
afectado por multiples
apariciones de hongos.

Placa 3. En la placa 3 se observó

totalmente
contaminación (múltiples
hongos), por lo cual no
se visualizó
concretamente el
crecimiento.
Tabla 2. Conteo de plantas sensibles y resistentes:
No. de placa No. De sensibles No. De Resistentes PROPORCIONES

Placa 1. 18 ---
Como se puede notar las
únicas semillas No hubo crecimiento
que no llevan la trampa todas son de color Total= 18=100%
germinarán, pero no podrán amarillo o blanco, es
seguir su desarrollo, decir murieron y no se
presentando desarrollaron solo
Resistentes: 0%
coloración amarilla y germinaron
murieron. Sensibles:100%
Así pues las proporciones
son 100% sensibles
Placa 2.
16 56
Total= 72=100%
La cantidad es Aunque con dificultad, se
considerablemente lograron identificar todas Resistentes: 77.77%
apreciable a pesar del hongo las resistentes posibles.
se pueden identificar algunas En un saco ideal donde Sensibles:22.22%
blancas y ligeramente se desprecia la presencia
amarillas. del hongo.

Placa 3. 8 3 Proporciones
Se aprecian apenas la Se aprecian apenas la desconocidas
mayoría sensibles aunque unas pocas resistentes demasiada
debido al hongo no se aunque debido al hongo
observan todas y puede que no se observan todas y contaminación
estén más en esta condición. puede que estén más en apenas apreciable,
esta condición. incluso por debajo
de la placa.

Nota: La presencia de hongo limita el crecimiento, conteo y visualización de las

plantas tanto resistentes como sensibles.

Resultados de otros equipos (de otro grupo):

Equipo: 2 Grupo: A

Tabla 3. Crecimiento de Arabidopsis thaliana en medios de cultivo MS con

Kanamicina.
No. Placa (Imagen) Crecimiento
Placa 1. En la placa 1 se observo
un crecimiento notorio
 sin embargo este se
propago encima de
hongo, puesto que se
apreciaron diversas
hojas respectivas de
esta planta.

Placa 2. En la placa 2 se aprecio

un buen crecimiento en
todo el medio,
propagandose diversas
hojas pequeñas
caracteristicas de esta
planta, ademas de que
se observan algunas
radiculas indicativas de
que la germinacion de la
semilla se ha llevado a
cabo.

Placa 3. En la placa 3 se observó

un muy buen crecimiento
en el medio,
apreciándose pequeñas
hojas características de
esta planta.

Observaciones y problemas durante la práctica:

Cuando se observaron los 3 medios de cultivo con las semillas de Arabidopsis
thaliana se encontró un grave problema que la mayoría de estas tanto de nuestro
equipo como a la mayoría del grupo entero se nos contaminaron los medios en los
cuales se vio un abundante crecimiento de hongos dada la morfología presentada
además de encontrar abundante liquido dentro las placas, la presencia de los
hongos dificultaba el conteo de las plantas sensibles y/o resistentes por lo que los
resultados no están ni completos ni son confiables y no son útiles, debido a esto
se pidió a compañeros pertenecientes a otro grupo del mismo laboratorio sus
resultados para poder comparar con los nuestros, observar resultados más
confiables y/o correctos y determinar los errores que se pudieron haber cometido o
bien la causa principal de la contaminación de los medios de cultivo.
Dichos errores o razones de los resultados obtenidos se precisaran en la discusión
de los mismos.

Discusión de resultados.
El crecimiento en las 3 placas no fue del todo satisfactorio y correcto ya que todas
presentaron la aparición de múltiples hongos de acuerdo a su morfología, por lo
tanto todas las placas estaban contaminadas; dicha contaminación se pudo haber
propagado desde la preparación de los medios de cultivo, o el mal manejo del
material en este caso las placas y los tubos con semillas en su adicción, o
simplemente porque el área de trabajo no era lo suficientemente estéril, además
las condiciones de humedad pudieron favorecer aun más la formación de hongos.
No obstante haciendo a un lado los diversos factores que pudieron afectar, se
prosiguió a realizar el conteo (no del todo exacto) de las plantas sensibles y
resistentes de las cuales la más representativa en el conteo fue la placa 2,
identificando 2 plantas sensibles y 58 resistentes. Eligiendo la placa 2 debido a
que se aprecio un mayor crecimiento, incluso se propagaron diversas hojas
pequeñas caracteristicas de esta planta, sin embargo dicho crecimiento se vio
afectado por los multiples hongos que se visualizaron.
En comparación con otros equipos sus placas estaban libres de contaminación, lo
cual favoreció al correcto crecimiento de las plantas, y de igual manera favoreció a
un conteo claro y fiable en cuanto a las plantas sensibles y resistentes.
Asi pues, aunque la línea o placa 2 se observaron las proporciones esperadas,
debido a la contaminación presente dichos resultados no son confiables y por lo
tanto no verdaderos, basándose el conteo suponiendo que no había
contaminación o que en el área de la misma no cayeron las semillas.

Conclusión.
Logramos realizar el conteo de las plantas sensibles y resistentes, en las placas
respectivamente, a pesar de los diversos factores, y dificultades que se
presentaron en la práctica, principalmente la contaminación que se propago en
todas las placas (aparición abundante de hongos), lo cual provoco que no hubiera
un buen crecimiento en ninguna de las placas, proporcionándonos conteos
erróneos y resultados incompletos, por esta razón se les pidió sus resultados a
compañeros de otro grupo para compararlos y de esta manera determinar los
errores que se pudieron haber cometido e influyeron en la práctica.
 Cuestionario:
1) ¿Por qué son resistentes algunas de las plantas?
R: Esto se debe a que estas plantas llevan consigo un transposón modificado es
decir una mutación (la trampa genética), este transposón al insertarse en una
posición interrumpió posiblemente un gen en dicha posición pero sin embargo este
transposón (compuesto) lleva consigo otro gen que les permitirá crecer en medios
selectivos con antibiótico.
Cabe mencionar además que de toda lo progenie se esperaría 75% resistentes y
25% sensibles debido al carácter dominante del gen de resistencia por lo que su
genotipo es heterocigoto, de ser homocigoto dominante o recesivo todas serian
resistentes o todas sensibles. Otra posibilidad es que simplemente el transposón
no se insertó o no lo hizo correctamente por lo que no se expresó. Aquellas
semillas que no llevan la trampa germinarán, pero no podrán seguir su
desarrollo, tendrán una coloración amarilla y morirán.

2) ¿Qué proporciones de resistentes y sensibles encontraste entre las líneas

analizadas?
R: Debido a la contaminación presente en nuestras placas de petri los datos no
son confiables y obviamente las proporciones no son las esperadas o bien no hay
confianza en las proporciones obtenidas, sin embargo también se analizaron las
placas de otro equipo perteneciente a otro grupo ya que la gran mayoría de
nuestras placas en nuestro grupo se contaminaron y en el caso del otro grupo esto
fue en menor magnitud.
Sin embargo la líneas aun así contaminadas se analizaron aunque los resultados
no son nada confiables pues la contaminación pudo alterar el crecimiento: Línea 1:
un total de 18 plantitas de las cuales: Resistentes: 0%, Sensibles: 100%, línea 2:
de un total de 72 =100% son resistentes: 77.77% y sensibles: 22.22%, y en
cuanto a la línea 3 esta posee las proporciones menos confiables debido a la
cantidad de contaminación presente en toda la placa, observando apenas un total
de 11, de las cuales sensibles: 72.73% y resistentes: 27.27% pero por razones
obvias esto no se toma como valido.

3) ¿Todas las líneas segregan en proporciones 3:1?

R: No todas las líneas debido a las complicaciones antes mencionadas. Sin
embargo, la línea 2 o placa 2 aparenta tener una proporción muy cercana 3:1 en
relación al total de plantas germinadas + crecidas o desarrolladas (verdes) de
22.22% de sensibles y 77.77% resistentes indicando lo que parecería ser
contaminación una proporción 3:1 (75%R: 25S)
4) ¿Alguna tiene distorsión de la segregación?, ¿A qué crees que se debe?
R: Posiblemente las distorsiones en la segregación se deban a que como ya se
había mencionado antes, los transposones no se hayan insertado correctamente
en algunas de las plantas, además cabe mencionar que el proceso de
transposición está muy regulado y el fenómeno de transposición ocurre con una
frecuencia muy baja.
Otra razón podría ser la presencia de contaminación de hongos que impedía el
crecimiento de algunas plantas tuvieran o no el transposón o bien puede ser que
aceleraran su muerte.
También está la posibilidad de que existan mutantes gametofíticas donde la
transmisión de genes es reducida y por lo tanto el transposón no fue adquirido con
la frecuencia esperada.
También la pérdida de la transposasa es importante porque los elementos
transpuestos inestables se revertirán o transpondrán germinalmente causando
confusión en el análisis de la progenie. También se revertirán o transpondrán
somáticamente, lo que podría ocultar algunos fenotipos mutantes causados por la
inserción.

Aplicación en el área de QFB:

Identificación y caracterización de mutantes afectados en caracteres del

desarrollo temprano en líneas T-DNA de tomate

Fundamento:
La mejora en especies de tomates esta principalmente dirigida para la obtención
de fenotipos deseables a fin de obtener frutos más grandes, con mejor sabor o
bien que su producción sea más rápida y eficiente donde también se pueda evitar
el uso prolongado de pesticidas además puede ser útil para lograr que estos
proporcionen mayor cantidad de nutrientes e incluso los tomates pueden utilizarse
como modelos genéticos en el área de investigación, para lo cual se han llevado a
cabo técnicas de mutagénesis insercional por medio de trampas génicas o
genéticas.

Las trampas génicas son una tecnología de mutagénesis insercional basada en el

uso de construcciones que se integran al azar en el genoma de un organismo
etiquetando genes con elementos reporteros. Sus ventajas son: 1) la identificación
de genes basada en la expresión de un gen reportero, que se puede observar en
tejidos y células específicas; 2) no se necesita un fenotipo mutante para la
identificación del gen; 3) permite la identificación de genes que tienen funciones
 redundantes; 4) si la trampa génica interrumpe un gen, el patrón de expresión y el
fenotipo observado (si lo presenta) podrían sugerir la función de dicho gen.

La identificación y caracterización se llevó a cabo utilizando una trampa genética

de tipo intensificador (T-DNA) que actúan como múgatenos insercionales para la
obtención de plantas transgénicas de interés agronómico y comercial.

Metodología que se sigue según la investigación:

1. Obtención del material vegetal con líneas T-DNA de Solanum lycopersicum, con
una trampa de intensificadores incluida en el plásmido pD991 y la obtención de
sus semillas.

2. Esterilizar las semillas utilizando pequeños recipientes con lejía con unas gotas de
Tween 20 y la preparación de medios de cultivo.
Ilustración 1 Tabla que muestra los medios de cultivo usados

Descripción de los medios de cultivo utilizados indicando nombre o designación y composición.

3. Clonación de plantas mutantes y silvestres sembrando ápices meristemáticos en

medios MB3 o α.

4. Germinación y obtención de plántulas y plantas axénicas en placas de petri con

papel filtro y 10 ml de agua destilada estéril incubando en oscuridad en una estufa
a 28°C y una vez emergió la radícula se sembraron en medios MG.

5. Los explantes obtenidos en la se pasan a medios IKZ para analizar su

regeneración adventicia.

6. Luego se lleva a cabo aclimatación de las plantas sembrándolas en una maceta

con sustratos y humedecida con agua tapándola con un vaso y retirándolo
después poco a poco.
7. Luego se hicieron cruces sexuales entre S. lycopersicum y la especie silvestre S.
pimpinellifolium para realizar una autofecundación de la descendencia del cruce.

8. Después se llevó a cabo el análisis de modo de herencia en base a las

proporciones genotípicas.

9. Posteriormente se realizó el análisis del número de insertos de T-DNA presentes,

su cosegregación y el fenotipo mutante a partir de la resistencia a kanamicina por
el gen nptII pocedente del T-DNA (en medios β o ε) analizando las proporciones
fenotípicas.

10. Por último se realiza un test de chi-cuadrada para realizar el tratamiento

estadístico de los datos obtenidos.

Según los resultados que se obtuvieron se identificaron 3 líneas nuevas de

tomates con mutaciones favorables para su producción y comercio, por ejemplo la
línea 561-ET-73 presentó un fenotipo de compacidad, causado por un menor
número de entrenudos o bien la línea 2657-ET-MM la cual no presenta en su
mayoría clorosis (producción insuficiente de clorofila) esta condición es letal ya
que está relacionada con el desarrollo incompleto de la raíz y la absorción de
nutrientes de la planta es afectada provocando su muerte prematura, mal
desarrollo haciendo sus frutos inadecuados para su comercialización como
producto alimenticio entre otros usos.

ANEXO: Transposones, sistemas o genes que permiten la mutagénesis en

Arabidopsis y su consecuente resistencia al antibiótico Kanamicina.

La mutagénesis se puede llevar a cabo por medio de transposones o genes

provenientes de Zea mays.

Nombre del gen: Ds (Disociación) 

Función: Designador para factores transponibles regulados por Ac; Modifica la
función de los genes y / o la rotura de los cromosomas.
Localización: Es un elemento Transponible.
Fenotipos: Mutabilidad.

Nombre del gen: As (activador)

Función: Elemento transponible autónomo, regula la transposición y disociación
Ds.
Localización: Elemento transponible.
Proteína (s): Proteína 12 kDa o activador de elemento transponible no
caracterizada proteína de 12 kDa: Esta proteína está codificada por el elemento de
control de maíz transponible "Activador" (Ac), que es capaz de activar la ruptura
del cromosoma en una ubicación específica.
Proteína 23 kDa: misma función que la anterior.
AC putativo transposasa o TPase: es capaz de activar la ruptura del cromosoma
en una ubicación específica.
Fenotipo: Mutabilidad

Nombre del gen: Spm (Supresor-mutador) o En (Enhancer).

Función: Elemento transponible autónomo (En equivalente); regula dSpm (= I) la
transposición y la función en a1-m1, a1-m2, bz1-m13, etc.

Codifica TnpA, su regulador positivo y negativo y elicitor de la transposición

Localización: Elemento transponible.
Proteínas (s): TNP (A, B y C) o Elemento transponible autónomo EN-1 proteína
mosaico: la función mutadora (M), para escisión y transposición; la función
supresora (S), que inhibe la actividad génica residual de ciertos alelos en los que
están integrados los elementos inhibidores; Se propone una función activadora
(A), ya que la SPM inactiva se puede activar con una segunda SPM.
Fenotipo: Mutabilidad.

Estos genes que se pueden insertar en Arabidopsis para aumentar la probabilidad

de mutagénesis y/o transposición en Arabidopsis los cuales pueden ser
modificados con genes de resistencia a antibióticos (transposones compuestos) o
bien la misma mutagénesis puede provocar sobre expresión en algún gen de
Arabidopsis que codifique para la resistencia a Kanamicina causada por un
potenciador o enhancer, también por medio de la mutación o transposones se
pueden inhibir genes inhibidores o bien reguladores de otros genes para que no se
sobreexpresen.

La mutagénesis se inicia con el elemento Ds o dSpm ubicado en el líder no

traducido de un gen de resistencia a los antibióticos. La biogénesis del cloroplasto
en plantas es sensible al crecimiento en un medio suplementado con algunos
antibióticos, lo que resulta en plántulas inviables blanqueadas. La escisión del
transposón del gen de resistencia da como resultado la restauración de la
expresión del gen marcador, de modo que las plántulas verdes pueden
seleccionarse para la resistencia a los antibióticos.

Genes que proporcionan resistencia a antibióticos (específicamente

Kanamicina)
Es el gen de la neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5 de Escherichia coli
K12, que confiere resistencia a varios antibióticos aminoglucósidos, como la
kanamicina y la geneticina.
 Nombre del gen: Tn5.
Función: Resistencia a neomicina, kanamicina, geneticina y estreptomicina.
Localización: Elemento transponible
Proteínas: Transposasa
Fenotipo: Resistencia a neomicina, kanamicina, geneticina y estreptomicina.

También se encuentran en plásmidos que una vez expresados en E.coli pueden

usarse para construir transposones modificados para Arabidopsis thaliana.

Nombre del gen: Alpha1 o NPTII es un codificador de proteínas.

Función o descripción: aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (Kanamicina quinasa,
tipo I) (Neomicina-kanamicina fosfotransferasa tipo I) (APH (3 ') I) (APH (3') - I)
Localización: plásmido pRAx, coordenadas: NC_012886.1 (33682..34497pb
complemento), Secuencia genómica: NC_012886.1.
Proteínas: aminoglucosido-3'-fosfotransferasa: Resistencia a la kanamicina y a
los aminoglucósidos relacionados estructuralmente, incluida la amikacina.
Fenotipo: Resistencia a neomicina, amikacina, kanamicina, geneticina y
estreptomicina.

Genes de Arabidopsis que provocan resistencia a Kanamicina.

Nombre del gen: AT3G55130 o ABCG19, CASSETTE DE UNIÓN ATP G19,

ATWBC19, WBC19. Gen codificador de proteínas
Función o descripción: Codifica una proteína localizada en la vacuola de la
familia White-Brown Complex (WBC) del transportador ABC. Cuando se
sobreexpresa en planta, confiere resistencia a la kanamicina.
Localización: Cromosoma 3:

Proteínas: Los transportadores ABC pertenecen a la superfamilia Casete de unión

a ATP (ABC), que utiliza la hidrólisis de ATP para energizar diversos sistemas
biológicos. La función principal de los sistemas de importación ABC es
proporcionar nutrientes esenciales a las bacterias.
Fenotipo: Resistencia a kanamicina.

Bibliografía:

 Trejo-Saavedra, Diana L., Rodríguez-Negrete, Edgar A., Vielle-Calzada, Jean P.,

& Rivera-Bustamante, Rafael F.. (2015). Trampas génicas como herramienta para
identificar genes en plantas que responden a la infección por
 virus. Agrociencia, 49(6), 593-612. Recuperado en 24 de abril de 2019, de
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1405-
31952015000600001&lng=es&tlng=es.

 SÁNCHEZ LÓPEZ, J. Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum

lycopersicum) para la identificación de mutantes de inserción alterados en la
morfogénesis y el desarrollo vegetal. doi: 10.4995/thesis/10251/78617,  de
http://hdl.handle.net/10251/78617.

 Watson, J. D., Berry, A., & Davies, K. (2018). ADN: El secreto de la vida (Revisada
ed., Vol. 1). Barcelona: Taurus. Sección 20.

 https://www.maizegdb.org

 https://www.uniprot.org

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 http://www.plantgdb.org/AtGDB/cgi-bin/getRecord.pl?
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 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8094921#general-protein-info

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