Características diferenciales procariotas-eucariotas

Propiedades Bacteria/Archaea (procariotas) Eukarya (eucariotas)

Grupos Bacterias, Arqueobacterias Algas, Hongos, Plantas, Animales, Protozoarios

Membrana nuclear Ausente Presente

Número de 1 >1
cromosomas

DNA Molécula única (no forma complejos Presente en cromosomas

con histonas)

Mitosis y meiosis Ausente Presente

Tamaño Pequeño (2 µ de diámetro) Usualmente grandes (2 a más de 100 µ de

diámetro)

Endosporas Presentes (en algunos) muy Ausentes

termorresistentes

Ribosomas Tamaño 70S 80S (salvo algunos 70S)

(tamaño)

Unicelular vs. Básicamente unicelulares y no Unicelulares & no diferenciados, pluricelulares

pluricelular diferenciados & altamente diferenciados, y muchos grados
intermedios

Cloroplastos y Ausentes Presentes

mitocondrias

Membranas Sin esteroles, contienen lípidos Contiene esteroles y lípidos poliinsaturados

monoinsaturados y saturados

Multiplicación - División binaria, transformación, Asexual, sexual

Reproducción transducción, conjugación
Resumen general de las “formas de vida”

Unidades de replicación Formas de vida

Bacteria*
Celular
Archaea*

Protozoos *
Hongos (*)
Celular Algas (*)
Plantas
Animales

Virus
Virus satélites
No celular *
Viroides
Priones

Arqueobacteria: Halobacterium
salinarum

Bacteria: Bacilius anthracis

ARQUEOBACTERIAS: "fósiles vivientes" pues viven en hábitats que parecen corresponder con los que
existieron en la Tierra primitiva. Por ejemplo, en ambientes termales donde se alcanzan temperaturas por
encima del punto de ebullición del agua. (Ej. Pyrolobus fumarii cuya temperatura óptima de crecimiento es
106°C.) También pueden vivir en medios halófilos (muy salados), (Ej.: Halobacterium salinarum)
BACTERIAS: Son las bacterias típicas. (Escherichia coli) Se trata de microorganismos unicelulares
procariotas, cuyo tamaño oscila entre 0,2 y 50 µ (como son muy pequeñas no necesitan citoesqueleto), y
adaptados a vivir en cualquier ambiente. Las hay autótrofas: fotosintéticas y quimiosintéticas, y heterótrofas:
saprofitas, simbióticas y parasitarias.
Bacterias: clasificación según morfología celular
Las morfologías más comunes:
1) Cocos; 2) Bacilos; 3) Vibrios; 4) Espirilos

Relación entre forma y el modo de vida

Cocos Bacilos Espirilos y Vibrios

Forma redondeada Forma alargada, Forma de hélice y de

(relación superficie cilíndrica (mayor coma
volumen mínima) relación superficie
Viven en medios
volumen)
Poca relación con el viscosos
exterior Obtienen nutrientes de
Pequeño diámetro
manera más eficaz
Viven en medios ricos en
Atraviesan fácilmente las
nutrientes Viven en medios pobres
mucosas
en nutrientes (suelos,
Se transmiten por el aire
aguas) Patógenas por contacto
Muy resistentes directo o mediante
Menos resistentes
vectores
Suelen ser patógenas
Suelen ser saprófitas

Diversidad bacteriana Agrupaciones de cocos

Estructura bacteriana
1) Cápsula; 2) pared celular; 3) membrana
plasmática; 4) mesosomas; 5) ribosomas
6) flagelo; 7) ADN, cromosoma o genoma; 8)
plásmidos.
Elementos estructurales

• Cápsula: Se presenta en muchas

bacterias, sobre todo patógenas. Es una
estructura viscosa compuesta por sustancias
glucídicas. Tiene función protectora de la desecación, de la fagocitosis o del ataque de anticuerpos.
• Pared celular: Formada por peptidoglucanos y otras sustancias. Es una envoltura rígida que soporta
las fuertes presiones osmóticas a las que esté sometida la bacteria. Por la estructura de la pared se
distinguen las bacterias Gram+ y Gram-.
• Membrana plasmática: Similar en estructura y composición a la de las células eucariotas. Presenta
unos repliegues internos llamados mesosomas.
• Mesosomas: Repliegues de la membrana con importantes funciones pues contienen importantes
sustancias responsables de procesos metabólicos como el transporte de electrones, la fotosíntesis o la
replicación del ADN.
• Ribosomas: Similares a los de la célula eucariota, aunque de menor tamaño. Intervienen en la
síntesis de proteínas.
• Cromosoma bacteriano: Está formado por una sola molécula de ADN de doble hélice, circular y no
asociado a histonas.
• Plásmidos: Moléculas de ADN extracromosómico también circular.
• Inclusiones: Depósitos de sustancias de reserva.
• Flagelos: Estructuras filamentosas con función motriz formados por fibrillas proteicas
• Fimbrias adhesivas: Pelos de 4 a 7 nm de diámetro (según especie) repartidas por toda la superficie,
permiten la adhesión a sustratos vivos o inertes.
• Pelos sexuales o Pili: Son más largos y más gruesos (unos 10 nm de diámetro) que las fimbrias
adhesivas. Aparecen en menor número (de 1 a 10 por célula) y su función es la de permitir los
contactos iniciales en la conjugación.
Cápsula

• En numerosas bacterias se forma en la parte externa de la

pared una cápsula viscosa compuesta por sustancias
glucídicas.
• Protege a la célula bacteriana de la desecación y de la
fagocitosis por los leucocitos del hospedador, así como del
ataque de los anticuerpos, lo que aumenta la virulencia de las
bacterias encapsuladas.
• La presencia de la cápsula no es, sin embargo, un carácter diferenciador, pues determinadas bacterias
pueden o no formarla en función de los medios de cultivo.
Pared celular

• Está presente en todas las bacterias. Es una envoltura rígida, exterior a la membrana. Da forma a la
bacteria y según su composición confiere ciertas particularidades a las bacterias, lo que permite su
clasificación en Gram positivas y Gram negativas.
• En las Bacterias Gram-positivas, la pared externa de la envoltura celular tiene como base química
fundamental el peptidoglicano el que junto al resto de sus componentes forman una malla especial
 llamada sáculo de mureína, de vital importancia para conservar la forma y darle rigidez a la célula
bacteriana.
• En las bacterias Gram positivas la red de peptidoglucanos origina varias capas superpuestas, es
gruesa y homogénea y no hay membrana externa.
• En las Bacterias Gram-negativas, la pared casi no contiene peptidoglicano; presenta lipolisacáridos,
lipoproteínas y proteínas: Es una estructura de dos capas: externa (“membrana externa”) e interna
(peptidoglicanos); y entre ellas un espacio periplasmático. La membrana externa funciona
principalmente como una especie de filtro (porinas) y gracias a esta selectividad de sustancias, las
bacterias Gram negativas suelen ser menos susceptibles a los antibióticos, sales biliares, detergentes,
colorantes
• En las bacterias Gram negativas hay una sola capa de peptidoglucanos sobre la que se dispone una
membrana externa constituida por una capa de fosfolípidos y otra de glicolípidos asociados, estos
últimos se asocian a polisacáridos que se proyectan hacia el exterior.

Tincion diferencial de Gram

 Caracteristica Gram + (violeta) Gram – (rosa)
Capa de peptidoglucano Gruesa (capas múltiples) Delgada (una capa)
Ácidos teicoicos Presentes en muchas Ausente
Espacio periplasmático Ausente Presente
Membrana externa Ausente Presente
Contenido de LPS Prácticamente nulo Elevado
Lípidos y lipoproteínas Reducido Elevado (m. externa)
Resistencia a destrucción física Elevada Reducida
Ruptura por lisozima - penicilina Elevada Reducida
Inhibición por colorantes y Elevada Reducida
detergentes
Resistencia a la desecación Elevada Reducida

Cromosoma bacteriano

• El ADN de la bacteria está constituido por una sola molécula en doble hélice (esta
molécula es muy grande en comparación con el tamaño de la bacteria), circular,
súper enrollada y asociada a proteínas no histonas. Suele estar unida a los
mesosomas.
Plásmidos

• En las células bacterianas puede haber también una o varias moléculas de ADN
extracromosómico de menor masa molecular que el cromosoma denominadas
plásmidos. Estos plásmidos en algunas bacterias pueden tener genes que las
protegen de los antibióticos o también genes que intervienen en los procesos de
reproducción (plásmido F).
Flagelos

• Son apéndices filiformes de mayor longitud que la bacteria que permiten su

locomoción. Se presentan en número y disposición variable y estén formados por
fibrillas proteicas compuestas de una proteína llamada flagelina
Fimbrias y pili entre bacterias

• Son filamentos huecos, delgados y rectos, situados en la superficie de

determinadas bacterias y cuya función no esté relacionada con la locomoción, sino
con la adherencia a los sustratos y el intercambio de fragmentos de ADN durante la conjugación.
Funciones de relación de las bacterias
• Las bacterias responden a un número elevado de estímulos ambientales diversos mediante
modificaciones de su actividad metabólica o de su comportamiento. Ciertas clases, ante los estímulos
adversos del ambiente, provocan la formación de esporas de resistencia, que, al ser intracelulares,
se denominan endosporas.
• Las endosporas bacterianas son estructuras destinadas a proteger el ADN y el resto del contenido
protoplasmático, cuya actividad metabólica se reduce al estado de vida latente; pueden resistir
temperaturas de hasta 80°C y soportan la acción de diversos agentes físicos y químicos. En
condiciones favorables germinan y dan lugar a una nueva bacteria (forma vegetativa).
• Pero la respuesta más generalizada consiste en movimientos de acercamiento o distanciamiento
respecto a la fuente de los estímulos (taxias) que pueden ser de varios tipos: flagelar, de reptación o
flexuosos (parecido al de las serpientes, pero en espiral).
Endosporas bacterianas
• Producidas por ciertas bacterias Gram-positivas: Bacillus, Clostridium, Sporosarcina
• Cuando la bacteria detecta bajos niveles de nutrientes (C, N, P) → desencadena el proceso de
esporulación
• La espora se forma dentro de la célula vegetativa Esporangio = célula madre + endospora
• Al final de la esporulación, la célula madre se autolisa, y la espora queda libre
• La endospora soporta prolongados periodos en ausencia de nutrientes. Resiste estrés ambientales
• En condiciones adecuadas, la espora germina y se transforma en una célula vegetativa

Esporas bacterianas
 Característica Célula vegetativa Endospora
Apariencia microscópica Gram + , No refractil, No Cortex grueso, cutícula,
refringente exosporio, refráctil, Refringente
Contenido de calcio Bajo Elevado
Acido dipicolinico Ausente Presente
Actividad enzimática Elevada Baja
metabolismo Elevado Baja o ausente
Síntesis macromolecular Presente Ausente
mRNA Presente Baja o ausente
Tinción por colorantes Teñible Solo mediante métodos
especiales
Acción de la lisozima Sensible Resistente
Contenido en agua Elevado 80-90% Bajo, 10-25% en el centro

Pequeñas proteínas solubles en Ausente Presente

acido
pH citoplasmático pH 7 pH 5,5-6
Estructura Gram + Corteza – Cubierta - Exosporio

Contenido en calcio Bajo Elevado

Ácido dipicolínico Ausente Presente

Resistencia al calor y radiación Baja Elevada

Resistencia a ácidos, lisozima, Baja Elevada

compuestos quimicos

Tinciones especificas

Tiñe selectivamente las endosporas Se cubre la preparación con verde de malaquita

y se calienta a emisión de vapores durante 60
Tinción de
segundos. Se lava con agua durante 30
esporas de
segundos y se tiñe con safranina. Las
Wirtz-Cortitlin
endosporas retienen el color verde; el resto de la
célula toma el color rosa.

Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas, se le anade

Tinción de
una mezcla de ácido tánico (mordiente) y del
flagelos de
colorante rosanilina. El mordiente engruesa los
Leifson
flagelos y el colorante los fine.

Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una
preparación en fresco del espécimen. Las
Tinción particulas de colorante no pueden penetrar en la
negativa cápsula, que se observa como una región clara
alrededor de la célula.
Definición: esterilización

• Es todo proceso a través del cual un objeto o sustancia queda libre de todo organismo viviente,
perdiendo así su capacidad para dividirse (viabilidad).

• Existen varios métodos prácticos de uso dependiendo de la naturaleza y conveniencia del material a
esterilizar.

Métodos físicos:

I. CALOR HÚMEDO (AUTOCLAVE)

• Agente esterilizante: vapor de agua a presión (121ºC- 15 minutos- 1 atm)

• Desnaturalización de Proteínas

Esterilización en autoclave:
• Medios de Cultivo
• Soluciones Salinas
• Buffers
• Instrumentos resistentes al calor
• Descontaminación de materiales

Uso de autoclave

1. Colocar agua dentro del autoclave hasta llegar casi al nivel de la lámina cribada.

2. Apilar sobre la rejilla en forma ordenada los elementos a esterilizar. Los materiales no se deben
compactar para permitir la circulación del vapor de agua entre ellos.

3. Realizar el control químico de esterilización

4. Colocar la tapa y ajustar suavemente con las mariposas (de a pares, diametralmente opuestas).

5. Abrir la espita y controlar la movilidad de la válvula de seguridad.

6. Encender la fuente calórica y calentar el autoclave. El agua que está en el interior comienza a hervir
transformándose en vapor de agua. Este desaloja el aire que queda dentro del autoclave, el cual sale
por la espita. Cuando el vapor desaloja todo el aire comienza a salir por la espita (purgado del autoclave).

7. Cerrar la espita cuando el vapor que sale de la misma, lo hace en forma continua. Este proceso es de
suma importancia ya que, de lo contrario, la temperatura indicada en el termómetro no expresa la
temperatura real existente en el interior. Al sumarse la presión del aire a la presión del vapor.

8. Dejar calentar el equipo hasta la temperatura deseada que generalmente es de 121°C. En este momento
reducir la intensidad de calor para mantenerla constante durante el tiempo de esterilización que se
cuenta a partir de este momento (generalmente 20 minutos).

9. Apagar la fuente calórica concluido el tiempo de esterilización. Abrir levemente la espita para acelerar el
enfriamiento. Abrir la espita solo un poco, debido a que una descompensación rápida provocaría la
ebullición de los medios de cultivo.

10. Una vez frío, abrir la espita totalmente.

11. Abrir la tapa y retirar el material con cuidado de no destruir sus cubiertas o envoltorios
Precauciones al usar el autoclave
• Entre una y otra operación, reponer el agua vaporizada. De lo contrario el equipo explota.

II. CALOR SECO (ESTUFAS U HORNO)

Ciclos variables:
• 1 hora 180ºC o 2 horas a 160ºC
• Material termorresistente

Material de vidrio y acero resistente:

• Pipetas, probetas, erlenmeyers, tijeras, espátulas.

Uso horno de esterilización

1. Colocar el material de vidrio preparado para esterilizar dentro del horno.

2. Prender el horno con el Timer.

3. Controlar que la temperatura del sensor digital sea de 170 ºC.

4. Permitir calentar hasta 170 ºC.

5. A partir del momento en que se alcanza esta temperatura, llevar el timer a 2 horas, para lo cual hay que
hacer girar una vuelta completa.

6. Una vez cumplido el ciclo, el equipo se apaga automáticamente.

7. Dejar enfriar y retirar el material.

III. RADIACIÓN UV

IV. RADIACIÓN IONIZANTE (X O GAMMA)

V. FILTRACIÓN

Controles de esterilización

• Son importantes para comprobar el funcionamiento correcto de cualquier método de esterilización.

• Para certificar la calidad del proceso, y el resultado de la esterilización, se emplean controles de
esterilización de diversos tipos:

1. CONTROLES FÍSICOS

• Los controles físicos de esterilización son implícitos del propio aparataje y se pueden comprobar con
aparataje auxiliar.
• Por sí solos, los controles físicos no garantizan el correcto proceso de esterilizado. En
cambio, tienen la suficiente importancia como para descartar un ciclo de esterilización si alguno
de los indicadores no se cumple.
• Indicadores como la temperatura, la presión o el tiempo son controlados por termostatos, manómetros
y cronómetros.
• Un autoclave automatizado cuenta con indicadores provistos de sensores dentro del propio aparato.
• Además, incluyen alarmas visuales y sonoras que avisan si hay algún problema de funcionamiento.
• Antes de dar por finalizado el ciclo de esterilización y de extraer el material se revisan las gráficas y
registros en la tira de impresora del autoclave.
• Si existe algún indicador o parámetro que no ha alcanzado los valores estipulados, el ciclo se desecha.
 • El material de dicho ciclo deberá ser esterilizado de nuevo (si es posible en algunos casos) o se
desecha todo el lote.

2. CONTROLES QUÍMICOS

• Los controles de esterilización químicos están basados en indicadores colorimétricos. Por ejemplo:
tiras reactivas compuestas de franjas con tintas reactivas, compuestas por sales metálicas, que
cambian de color en contacto con el calor.
• Como ocurría con los controles físicos, los controles químicos no garantizan el correcto proceso
de esterilizado. En cambio, tienen la suficiente importancia como para descartar un ciclo de
esterilización si alguno de los indicadores no se cumple.

3. CONTROLES BIOLÓGICOS

• Son dispositivos que utilizan formas de resistencia bacterianas (esporas) atenuadas. Conviene
remarcar que, después de los priones, las esporas bacterianas son las más resistentes ante la
esterilización.
• Los controles biológicos se consideran el único medio de garantía para confirmar la esterilización. Aún
así, conviene apoyarlos con los controles físicos y químicos para garantizar, aún más, la eficacia de la
esterilización.
• Las esporas que se utilizan en los controles biológicos son:
o Bacillus subtilis: Óxido de etileno y calor seco.
o Bacillus atrophaeus: Óxido de etileno, Calor seco y Ozono.
o Geobacillus stearothermophilus: Calor húmedo, Plasma Gas, Formaldehido y Ozono.
o Bacillus pumilus: Radiaciones ionizantes y Rayos UVA

• Se suelen utilizar ampollas o tubos cerrados con esporas, que se someten al proceso de esterilización.
• Sterikon ® plus: Es un bioindicador comercial para el control biológico de autoclaves. Consiste en una
ampolla que contiene caldo nutritivo, azúcar, un indicador de pH y esporas de un organismo no
patógeno Geobacillus stearothermophilus.
• La resistencia térmica es tal que las esporas mueren completamente después de 15 minutos, cuando
se calienta en vapor comprimido a una temperatura de 121° ± 0,5 °C (245 kPa).
• Por tanto, son útiles y eficaces para establecer la capacidad de un ciclo de esterilización en destruir
microorganismos específicos, que se sabe que son más resistentes al proceso que se está
controlando.

Procedimiento:
Etapa de Esterilización
1. Retirar una ampolla de la caja refrigerada y chequear que esté vigente del lote.
2. Homogeneizar la ampolla antes de comenzar el control.
3. Poner la ampolla en un tubo y ubicarlo al centro y al fondo del autoclave.
4. Después del proceso de esterilización, se pasa a la etapa de incubación.

Etapa de Incubación
1. Como testigo del proceso, se debe utilizar simultáneamente otra ampolla que no haya pasado por
el proceso de esterilización.
2. La incubación es a 55° ± 2°C, durante 48 horas.

Evaluación del Control Biológico:

Comparar la ampolla “esterilizada” con la ampolla testigo y verificar el color de la ampolla esterilizada:

A. Ampolla testigo: El color luego de la incubación fue amarillo

B. Ampolla autoclave:
• Resultado NEGATIVO: No hubo crecimiento de esporas El color de la ampolla esterilizada fue
violeta transparente. Indica que el proceso de esterilización DESTRUYÓ a los microorganismos,
 por lo tanto, el proceso se cumplió satisfactoriamente. El material procesado puede ser entregado
a los laboratorios.
• Resultado POSITIVO: Hubo crecimiento de esporas El color de la ampolla esterilizada fue amarillo
turbio. Indica que el proceso de esterilización NO DESTRUYÓ a los microorganismos, por lo tanto,
el proceso fue deficiente. Medidas a implementar: revisar fugas y parámetros del ciclo de
esterilización (T°, tiempo y presión) e instrucciones del fabricante. El material procesado no puede
ser entregado a los laboratorios

Acondicionamiento y descontaminación de material

• El material de vidrio y las placas de Petri descartables una vez utilizadas, deben ser acondicionadas y
descontaminadas para su posterior limpieza o descarte.

• Preparar las placas de Petri de vidrio o plásticas descartables, los tubos de ensayo y las pipetas
utilizadas en ensayos microbiológicos para su posterior limpieza (en caso de material de vidrio), o
eliminación (en caso de material descartable).
o Autoclave
o Bolsas para autoclave.
o Canastos metálicos.
o Cinta autoadhesiva con indicados de autoclavado.
o Control químico de autoclavado.
o Pipetero.
o Solución desinfectante, preparada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

Procedimientos

Placas plásticas descartables

1. Colocar las placas plásticas descartables usadas dentro de una bolsa para autoclavar.
2. Cerrar la bolsa con cinta autoadhesiva con indicador de autoclavado. La bolsa debe cerrarse con una
cinta floja, de tal manera que permita la salida de los gases.
3. Ubicar la bolsa dentro del recipiente rotulado como material para descontaminar

Placas de Vidrio
1. Colocar las placas de vidrio usadas dentro de una bolsa para autoclavar. Las mismas deben colocarse
en forma ordenada, una sobre otra, con el agar hacia abajo.
2. Cerrar la bolsa con cinta autoadhesiva con indicador de autoclavado. La bolsa debe cerrarse con una
cinta floja, de tal manera que permita la salida de gases.
3. Ubicar la bolsa dentro del recipiente rotulado como “Material para esterilizar”

Tubos de ensayo
1. Colocar los tubos usado en canastos metálicos.
2. Colocar en cada canasto una porción de cinta autoadhesiva con indicador de autoclavado.
3. Ubicar el canasto dentro del recipiente rotulado como “Material para esterilizar”.

Esterilización
1. Esterilizar las bolsas y canastos en autoclave a 121ºC durante 30 minutos.
2. Realizar dos controles químicos de autoclavado.
3. Colocar los controles químicos entre las bolsas y/o los canastos.
4. Ubicarlos en el centro del autoclave, uno en la mitad inferior y otro en la mitad superior.
5. Dejar enfriar el material esterilizado.
6. Pinchar aquellas bolsas que contengan residuos líquidos esterilizados y dejar drenar los mismos.
Desechar en la red cloacal. Desechar todo el material esterilizado en bolsas para residuos domiciliarios.
7. Colocar el material de vidrio sobre la mesada del Área de limpieza de material para su lavado.
Pipetas
• Acondicionamiento:
1. Colocar las pipetas usadas en un pipetero con solución desinfectante cuyo nivel siempre cubra las
¾ partes del recipiente.
2. Llevar este pipetero al Área de limpieza de material para el lavado de las pipetas.

• Control Biológico: Cada autoclave es objeto de un control biológico periódico

Definición: Sistema de componentes nutritivos necesarios para el desarrollo de los microorganismos

Características
Existen una diversa variedad y cantidad de Medios de Cultivo dependiendo de:
• Hábitat del Microorganismo
• Necesidad de su aislamiento
• Recuento
• Clase de Microorganismo
• Fisiología del Microorganismo

Clasificación
a) Según su consistencia:
1. LIQUIDOS: Componentes nutritivos en una solución acuosa.
2. SEMISOLIDOS: Con agregado de un agente solidificante al 0,2%
3. SOLIDOS: Con agregado de un agente solidificante al 2%

b) Según su Composición:
1. SINTÉTICOS: Se conoce exactamente la composición de sus componentes.
2. SEMISINTÉTICOS: Algunos de los componentes no tiene una composición definida. Ej: Peptonas,
Extractos.
3. COMPLEJOS: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, (peptona, extracto
de levadura, extracto de carne, etc.) las que son usualmente complementadas por la adición de
minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas
presentes de cada uno de ellos.
c) Según su función: Muchos Medios pueden cumplir más de una función a la vez, predominando muchas
veces alguna de ellas.
1. Generales: No selectivos, líquidos o sólidos
2. De Enriquecimiento: Selectivos o no, Líquidos
3. Selectivos: La mayoría líquidos
4. Diferenciales: La mayoría sólidos
5. Enriquecidos: Líquidos o sólidos

Medios generales
• Tienen los nutrientes necesarios para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos no
exigentes.
• Utilizados principalmente para realizar Recuentos microbianos.
• Ejemplos:
o Tripticasa Soya Agar (TSA) Bacterias
o Plate Count Agar (PCA) Bacterias
o Agar Papa Glucosado (APG) Hongos

Medios de enriquecimiento
• Son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular,
permitiendo aumentar su número. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del
crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
 • Algunos sueles ser Selectivos para inhibir la flora acompañante
• Ejemplo: Caldo Mac Conkey
• Agentes selectivos:
o Sales Biliares
o Cristal Violeta

Medios selectivos
• Son parecidos a los de enriquecimiento, están diseñados para el aislamiento de microorganismos
específicos: poseen agentes selectivos que impiden el desarrollo de la microbiota acompañante
• Tienen el agregado de un agente de selección, orientado a la búsqueda de un grupo o microorganismo
específico.
• Ejemplos de agregados:
o Ácidos
o Sales
o Colorantes
o Inhibidores respiratorios

Medios diferenciales
• Son medios sólidos que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de
los microorganismos y/o inhibidores de crecimiento tal que permiten diferenciar el desarrollo de
microorganismos diferentes.
• Tienen un agregado para diferenciar colonias de microorganismos específicos
• Ejemplos:
o Indicadores ácido-base
o Colorantes
o Campanas de Durham
1. Pesar
o Lecitina
2. Disolver
3. Medición de pH
Medios enriquecidos
4. Acondicionar
• Tienen agregado un nutriente extra para mejorar el desarrollo de ciertos 5. Esterilización
microorganismos nutricionalmente exigentes.
6. Plaqueo
• Ejemplos: 7. Uso
o Agar Sangre 8. Almacenamiento
o Caldo cerebro-Corazón

Preparación de medios de cultivo

1. Según la solicitud de medios de cultivo y materiales estériles, se procede a la preparación del día.
2. Organizar en la mesada, la cantidad de frascos y tubos necesarios.
3. Elegir el medio de cultivo.
4. Pesar la cantidad de medio de cultivo deshidratado comercial o sus componentes, indicada en manual
de la marca correspondiente en un recipiente adecuado (frasco, vaso de precipitados, etc.). Registrar la
masa, en Control de preparación de medios de cultivo.
5. Agregar la cantidad de agua desionizada necesaria en el recipiente contenedor. Empleando para tal fin:
* tubos: Dispenser o bomba perstáltica - frascos: probeta
6. Registrar el volumen, en Control de preparación de medios de cultivo
7. Dejar hidratar los medios de cultivo durante 15 minutos, agitando periódicamente. Controlar el pH
8. Para el caso de medios de cultivo sólidos que contienen agar - agar, tener en cuenta que es un
polisacárido que funde a 90º/100°C y solidifica a 40°/45ºC.
9. Identificar con marcador indeleble el nivel máximo del frasco, disolver con cuidado en un Baño María en
ebullición, agitando frecuentemente. Si ha tenido lugar, durante el calentamiento, una pérdida
significativa de agua, puede ajustarse el volumen por adición de agua calentada desionizada a 45 – 50
ºC, a fin de evitar solidificación parcial de los mismos, teniendo en cuenta la marca inicial realizada.
10. Fraccionar, de ser necesario, los medios de cultivos en frascos o tubos de ensayo según lo requerido.
Tapar los frascos en forma no hermética.
11. Poner a cada grupo de tubos y frascos, un capuchón de papel con etiqueta
 12. Registrar:
o La fecha de vencimiento de cada medio, hay que establecerla
o El relevamiento de fechas de medios de cultivo preparados se realiza semanalmente y se registra
o El registro de uso de medios de cultivo empleados para el análisis de muestras
13. Esterilizar (cuando lo indique el fabricante) según especificaciones indicadas en el rótulo del medio o en
el manual correspondiente, empleando la Autoclave
14. Cuando un medio de cultivo presenta en su composición un compuesto termolábil, se debe esterilizar
este componente por separación mecánica (filtración) y luego añadirlo en forma aséptica, al medio de
cultivo base.
15. Llevar los medios al Laboratorio de preparación de medios de cultivo.
16. Enfriar en forma inmediata los frascos y tubos, sumergiéndolos con cuidado de no ingresar líquido en
los envases con un sistema de agua de red a reflujo continuo.
17. Una vez enfriados, llevar al laboratorio de preparación de muestras para controlar el pH. (Evitar la
solidificación de los medios agarizados)
18. Controlar el pH e indicarlo en la planilla correspondiente (Control de preparación de medios de cultivo).
19. Para medios sin agar: tomar al azar un frasco o tubo de cada tipo de medio de cultivo preparado y
realizar el correspondiente control.
20. Para medios con agar trasvasar bajo flujo laminar, una porción de medio a un recipiente o frasco no
estéril y efectuar sobre ésta el control de pH.
21. En caso de no cumplimentar con el pH especificado del medio de cultivo utilizar para ajustarlo, solución
de NaOH o HCl al 10%. (Controlar nuevamente el pH). Para los medios fraccionados en tubos, descartar
el lote.
22. De ser necesario, distribuir el medio recién preparado y esterilizado en placas de Petri estériles para su
uso en superficie. Empleando aproximadamente 15 ml de medio por cada placa.
23. Secar dichas placas, antes de su inoculación para evitar la difusión y confluencia de colonias, bajo flujo
laminar sin la tapa y con la superficie del agar hacia arriba, entre 15 y 30 minutos aproximadamente.
24. Las placas deben utilizarse inmediatamente o almacenarse refrigeradas y cubiertas con film.
25. Ubicar en cada grupo de placas una etiqueta indicando medio de cultivo, lote, fecha de elaboración y
vencimiento.

AGAR-AGAR
• Principal agente solidificante utilizado.
• Polisacárido (galactanos sulfatados) extraído de algas marinas.
• Propiedades:
o Funde a 100ºC y solidifica a 40ºC.
o No es utilizado por los microorganismos.

Agentes selectivos Microorganismos afectados

SALES Gram negativas
Cloruro de litio, Telurito de potasio, Azida sódica
COLORANTES Gram positivas
Verde brillante, Cristal violeta
AGENTES TENSIOACTIVOS Gram positivas
Sales biliares, Desoxicolato de sodio, Bromuro de cetil trimetil amonio
ANTIBIÓTICOS Amplio espectro (AE)
Ampicilina, Cloranfenicol, Eritromicina, Fosfomicina
Bacitracina, Novobiocina, Penicilina, Vancomicina Gram positivas
Ceftazidima, Colimicina, Polimixina Gram Negativas
Cicloheximida, Natamicina, Pimaricina Hongos
Indicadores de pH

División Binaria

• La célula bacteriana se elonga y duplica su DNA

• Se forma el septum transversal central que divide a la célula en dos partes.
• La división completa da como resultado 2 células hijas idénticas
Tiempo de generación o duplicación

• Tiempo requerido para que se complete un ciclo de fisión binaria

• Cada nuevo ciclo de fisión aumenta la población en un factor 2 (crecimiento logarítmico o exponencial)
• El tiempo de generación puede ser desde minutos a días
Curva de crecimiento
Medida del crecimiento microbiano

• Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los cuales
presentaré a continuación.

• Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse en

directos e indirectos.

• Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas de
plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partículas).

• Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir
información sobre la evolución del número de microorganismos. La elección de un método de
seguimiento del cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso.
Métodos de recuento de microorganismos

• Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fase.
Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula de Petroff-
Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen
que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no permite distinguir células
vivas inmóviles de células muertas.

• Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de estos
sistemas es sencilla y permite rápidamente determinar el número de partículas presentes en una
suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células vivas y
muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente en la suspensión del cultivo.

• Técnicas de recuento en placa basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen

determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación
correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar el número de
células presentes en la muestra sembrada.

• Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio
de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo
antes que solidifique).

• Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que
crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en
suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se
emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por ejemplo).
Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los
valores se suelen denominar valores de densidad óptica. La limitación de este sistema, por otra parte
muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar
densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro.

• Medida de peso seco: El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que
retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no
diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.

• Medida del ATP: Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la luciferasa de
luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la
concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la
concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida indirecta
detecta únicamente las células vivas.
Recuento en placa – Siembra en profundidad
Materiales
1. Placas de Petri – Estériles
2. Pipetas graduadas estériles (descartables o de vidrio)
3. Medios de cultivo: diluyentes (agua de peptona al 0,1%) – Agar PCA
4. Muestra a ser analizada (liquidas) u homogenato
Preparación del homogenato y de las diluciones

• Pesar asépticamente bajo flujo laminar 10 g de muestra y adicionar 90 ml de agua de peptona al 0.1 %
(homogenato). Homogenizar en Stomacher 2 minutos a potencia media.
• Preparar diluciones seriadas de la muestra a partir del homogenato empleando agua de peptona al 0.1
% con tubos por 9 ml.
Técnica de dilución

• Diluciones seriadas (de 10-1 a 10-3 según el grado de contaminación supuesta) con el mismo
diluyente AP al 0.1%.
• Agitar continuamente el líquido (vortex).
• Transferir con rapidez las alícuotas para evitar la sedimentación.
Recuento de bacterias aerobias mesófilas
Siembra e incubación

• Fundir el Agar PCAL en horno a microondas y templarlo a 45ºC  1ºC en baño termostático. La
temperatura del medio de cultivo se debe controlar cuidadosamente a fin de evitar la lesión o muerte
de microorganismos cuando el agar fundido sea vertido sobre la muestra.
• Realizar las siguientes diluciones 10-1 a 10 -3 (de manera tal de obtener placas que presenten entre 30
y 300 colonias). Tomar 6 placas estériles y transferir en cada una 1 ml de las tres diluciones
seleccionadas.
• Verter aproximadamente 15 ml de PCAL fundido y templado en las placas de Petri. Mezclar
inmediatamente la dilución con el medio fundido por medio de movimientos uniformes de rotación
hacia ambos lados y en cruz. Asegurar solidificar.
• Una vez que el agar haya solidificado, invertir las placas e incubarlas en estufa a 30ºC  1ºC durante
72  3 horas.
Expresión de resultados

• Expresar el resultado como Recuento de bacterias aerobias mesófilas en unidades formadoras de

colonias por gramo o mililitro de alimento (u.f.c./g o ml).
Recuento de coliformes por NMP
Técnica de número más probable (NMP)

• Método estadístico basado en la distribución de los microorganismos en el alimento → estimación del

número de microrganismos viables en un sustrato.
✓ Medios Líquidos – Enriquecimiento: permite realizar recuentos selectivos de distintos m.o o grupos
microbianos. Permite cuantificar bajas concentraciones microbianas ( sensibilidad).
✓ Tiene poca precisión. El resultado expresa la probabilidad de encontrar un número determinado de
microorganismos en la muestra, pero el número real puede estar dentro de un amplio rango.
✓ Fase presuntiva: Utiliza series de 3 tubos inoculados con diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra
→ Incubar a 30°C – 48 hs.
 ✓ Se visualiza desarrollo y producción de gas en
cada tubo.
✓ Fase confirmatoria: de cada tubo presunto
positivo , estriar una ansada en agar Endo.
Luego incubar invertido a 30°C – 24 hs.
✓ Ingresar el valor confirmado en la tabla de
NMP.

Recuento de coliformes totales usando NMP (AGUA) – Método APHA

Muestra
1. Inocular por triplicado 10, 1,0 y 0,1 ml de muestra en tubos de Caldo Lauril Sulfato (CLS) con
campanita de Durham (doble concentración para 10 ml y simple concentración para 1,0 y 0,1)
2. Incubar en estufa ó baño termostatizado a 35-37 ºC durante 24 h
3. Confirmar los tubos positivos (Crecimiento y producción de gas en CLS) transfiriendo un ansa a tubos
de Caldo lactosa-bilis-verde brillante (BRILA) con campanita de Durham
4. Incubar 48 h a 35-37 ºC
5. Leer los tubos positivos (crecimiento y producción de gas). Con el número de tubos positivos de cada
dilución calcular el NMP utilizando la tabla
6. EJEMPLO: Tubos positivos (confirmados) 10 ml 3 (tres)
1,0 ml 1 (uno)
0,1 ml 0 (ninguno)

Resultado: NMP 43 / 100 ml

Filtracion de aire

• Filtros HEPA (High Efficency Particulate Air): compuestos por pliegues de acetate de
celulosa, usados para filtración de aire.
• Remoción de hasta el 99,7% de partículas mayores de 0.3 microns de diámetro
• Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar y gabinetes de seguridad biológica
Gabinetes de seguridad biológica
Tipo I: Gabinete de presión negativa en el cual el aire ingresa por una abertura
frontal. El aire ingresado sale al laboratorio o al exterior después de haber
pasado, en su totalidad, a través de un filtro HEPA. Protege al operador, pero
no al producto.
Tipo II: Protege al operador (presión negativa e ingresa aire por su parte
anterior), al producto (flujo laminar hacia debajo de aire filtrado con HEPA), y al
ambiente (el aire se elimina después de pasar a través de un filtro HEPA).
Tipo III: Mayor nivel de protección al operador, al producto y al ambiente. Herméticamente cerrado. Guantes
sellados a la pared frontal de la cabina. Aire ingresante pasa a través de filtro HEPA. Aire egresante pasa por
2 filtros HEPA colocados en serie o a través de un filtro HEPA y posterior tratamiento con calor.
Para verter el agar en las placas de Petri se debe trabajar en esterilidad. Para ello se puede emplear un
mechero de Bunsen, y trabajar bajo su campana de esterilidad, o bien utilizar alguno de los equipos
mencionados anteriormente.
Procedimiento:

• Colocar las placas en columnas o una al lado de la otra, y destaparlas a medida que se van llenado.
• Verter aproximadamente 15 ml del agar fundido y templado en las placas de Petri. Mezclar
inmediatamente por medio de movimientos uniformes de rotación hacia ambos lados y en cruz.
• Permitir solidificar el medio de cultivo.
• Rotular y utilizar.
• Almacenar.

Objetivo del muestreo: obtener muestras representativas del lote

Etapas
1) Recolección de la muestra:

• Recipientes y utensilios
• Procedimiento y etiquetado
2) Almacenamiento intermedio y transporte

• Rapidez y hermeticidad de envase

• Contaminación cruzada y temperatura
3) Recepción de muestras

• Fecha, descripción y estado de la muestra

• Temperatura
Muestras de ambiente

• Mediante esta técnica se detalla la carga microbiana del aire en el área de trabajo.
• Para la toma de la muestra de aire existen equipos especiales. Sin embargo, una técnica simple y
bastante efectiva consiste en dejar abierta en el ambiente una placa de Petri con el medio selectivo
para el microorganismo que se desea investigar.
Recuento de mohos y levaduras
1. Dejar abierta durante 15 min. una placa de Petri que contenga medio agar YGC.
2. Cerrar la placa e incubar durante unos 4 a 5 días a 25ºC.
3. Realizar el “recuento de mohos y levaduras” en 15 min. de exposición
Recuento de bacterias
1. Dejar abierta durante 15 min. una placa de Petri que contenga medio agar Plate
Count.
2. Cerrar la placa e incubar durante 48 horas a 35ºC.
3. Realizar el “recuento de mesófilos viables” en 15 min. de exposición.
Equipos utilizados para el control ambiental
Este es un método de control ambiental volumétrico. Se mide el impacto del aire sobre las placas de agar
Sabouraud, para la detección de hongos.

Determinaciones analíticas frecuentes:

• Recuento de total de microorganismos. Agar Tryptose Soya Agar (TSA)

• Recuento de hongos y levaduras. Agar Yeast Extract Glucose Chloramphenicol (YGC)
• Recuento de coliformes
Análisis de superficie
Hisopados ambientales o de la superficie de los equipos
1. Humedecer el hisopo con agua peptonada esterilizada al 0.1% o con agua destilada o bufferada.
2. Pasar por las superficies de contacto de los equipos o las superficies ambientales.
3. Colocar el hisopo en caldo de enriquecimiento o en un medio de cultivo para su transporte hasta el
laboratorio.
4. Empacar, rotular y enviar a analizar.
Siembra
Técnica A.
1. En el laboratorio agitar vigorosamente los tubos contenedores de los hisopos antes de la siembra, ya
sea en forma manual o mecánica (Vortex).
2. Sembrar 1 ml y 0,1 ml del tubo que contiene el hisopo mediante el método de siembra en profundidad
usando “TSA” como medio de cultivo, en el caso de recuento de microorganismos totales e “YGC”,
para el recuento de hongos y levaduras.
3. En caso necesario hacer diluciones.
4. Incubar las placas de TSA a 30-35ºC durante 48 -72 hs.
5. Incubar las placas de YGC a 20-25°C durante 4-5 días.
Técnica B
1. Frotar el hisopo por una superficie elegida cubriendo un área determinada.
2. Pasar el hisopo recorriendo la superficie de las placas con medio de cultivo en su totalidad,
comenzando en un extremo y finalizando en el otro.
3. Incubar invertidas las placas:
• Placas de TSA a 30-35ºC durante 48 -72 hs.
• Placas de YGC a 20-25°C durante 4-5 días.
4. Luego del período de incubación, observar, caracterizar y anotar el tipo de colonias.
5. Registrar con la placa cerrada la morfología, la pigmentación y la superficie de las colonias.
División binaria
Masa umbral (inicio replicación DNA)
Longitud umbral (inicio formación septo)
1. La célula bacteriana se elonga y duplica su DNA
2. Se forma el septo transversal central que divide la célula en dos partes (proteínas Fts)
3. La división completa origina 2 células hijas idénticas

• Tiempo de generación o duplicación // velocidad de crecimiento

• Curva de crecimiento
• Crecimiento celular (aumento de tamaño de la célula) – Crecimiento de poblaciones celulares
(aumento del número de células)

Tiempo de duplicación o generación – Velocidad de crecimiento de la población microbiana

• Tiempo de duplicación o de generación («g»): tiempo requerido para que se complete un ciclo de fisión
binaria
• Cada nuevo ciclo de fisión aumenta la población en un factor 2 (crecimiento logarítmico o exponencial)
• El tiempo de generación puede ser desde minutos a días (especie – condiciones de crec.)
• Velocidad de crecimiento: Nº de generaciones por unidad de tiempo (determinar condiciones óptimas
de crecimiento)
• Ejemplo: E. Coli, tarda 20 minutos en condiciones optimas pero en el intestino humano tarda 1 dia,
depende del medio.

Log Nf – log N0 = n log 2 Nf= N0 . 2n

g = tiempo/n v=n/tiempo

g = 200’/10 v = 1/g
Curva de Crecimiento de la Población

Fase estacionaria
Fase Lag (latencia) -Tamaño celular
- No aumenta Nº células
-Composición celular
-Actividad metabólica Fase de muerte
intensa (proteínas y AG)
- Exponencial
-Duración según historia -Endosporas - Agotamiento de
celular: log, estacionaria, ATP
medios de cultivo Fase exponencial
-La célula se está
adaptando al medio -Sensibilidad a factores
que interfieren en el
crecimiento (penicilina,
radiación)

Crecimiento diáuxico

Crecimiento diauxico Cultivo continuo en quimiostato

 Macronutrientes (g o mg/L)
• Carbono
Nutrición • Nitrógeno
Proceso por el cual los seres vivos toman del medio donde habitan las • Fósforo
• Azufre
sustancias químicas (nutrientes) que necesitan para crecer y son utilizadas
• Potasio
para actividades celulares metabólicas (fines energéticos y biosintéticos)
• Magnesio
Composición Química • Calcio
• Sodio
• Una célula bacteriana está compuesta por diferentes compuestos • Oxígeno e Hidrógeno
orgánicos e inorgánicos, siendo los más abundantes, agua (70%) y
proteínas (15%).
• Proteínas: C-H-O-N-S – Ácidos Nucleicos: C-H-O-N-P – Carbohidratos: C-H-O –
Lípidos: C-H-O-P Micronutrientes
(trazas)
Nutrientes → Sustancias necesarias para el crecimiento microbiano que se usan en la
biosíntesis y producción de energía • Cromo
• Cobalto
Macronutrientes → Elementos (10) captados por los microorganismos en cantidades • Cobre
relativamente grandes. 95% de la célula microbiana. Función estructural y metabólica • Manganeso
• Molibdeno
Micronutrientes → Elementos que se requieren en cantidades muy pequeñas. Rol • Níquel
enzimático – Estructura proteica • Zinc
Factores de Crecimiento → Sustancias precursoras de componentes orgánicos que el • Hierro
microorganismo es incapaz de sintetizar. Generalmente se requieren en pequeñas concentraciones.

MACRO
FUNCIÓN FUENTE
NUTRIENTE

CARBONO Material celular (50 % peso seco) Azúcares, péptidos, ac. grasos, CO2

OXÍGENO 20% - Agua – Material celular Agua – Gases – Mol. Org.

Material celular (12% p.seco) Proteínas, péptidos, aminoácidos, NH3,

NITRÓGENO
NO3 -, N2

HIDRÓGENO 8% - agua-mat.cel.- pHi - OR Agua – H+ – Mol. Org.

FÓSFORO Ác. nucleicos - Fosfolípidos ATP Orgánico o inorgánico

AZUFRE Aminoácidos azufrados Vitaminas Proteínas, péptidos, SO4 2-

Cofactor enzimático, Balance osmótico, Á. Inorgánica

POTASIO teicoicos

Cofactor enzimático, estabilizador de Inorgánica

MAGNESIO membranas

Estabiliza la Pared Celular Inorgánica

CALCIO
Resistencia de la espora

B. osmótico – Halófilos Inorgánica

SODIO
MICRONUTRIENTE FUNCIÓN

CROMO Catalizador enzimático

COBALTO Constituyente de Vitamina B12, transcarboxilasa

COBRE Citocromos, fotosíntesis, superóxido dismutasas (SOD)

MANGANESO Cofactor de muchas enzimas (SOD, fotolisis de agua)

MOLIBDENO Cofactor de muchas enzimas (flavoproteinas, nitrogenasa, nitratorreductasa, sulfito oxidasa)

NÍQUEL Hidrogenasas y deshidrogenasas; ureasa

ZINC DNA y RNA polimerasas (estructura), SOD

Citocromos, catalasas, peroxidasas, nitrogenasas, SOD, cofactor, Sideróforos Fuente de

HIERRO energía (Fe+2)

Función fisiológica de sales inorgánicas

Las sales aportan:

• Macroelementos
➢ Función usual
- Función molecular en la célula → P - S – Ca – Mg – Fe
- Material de modulación fisiológica
✓ Mantener presión osmótica → Na+
✓ Activador de enzimas → Mg2+
✓ Estabilizar pH
➢ Función especial
- Fuente de energía para bacterias quimio autótrofas → S - Fe2+ - NH4+
- Aceptor de hidrógeno durante la respiración sin oxígeno → NO3 - SO4
• Microelementos
➢ Activadores de enzimas → Cu2+ - Mn2+ - Zn2+
➢ Moléculas de estructura especial → Co - Mo
Factores de crecimiento
Sustancias precursoras de componentes orgánicos que el microorganismo es incapaz de sintetizar.
Generalmente se requieren en pequeñas concentraciones.

• Vitaminas
• Aminoácidos
• Purinas y pirimidinas
• Ácidos grasos

Microorganismos protótrofos → sintetizan sus Factores de Crecimiento

Microorganismos auxótrofos → requieren fuente exógena de Factores de Crecimiento.

 FACTOR O VITAMINA FUNCIONES PRINCIPALES

p-aminobenzoico (PABA) precursor en biosíntesis del ácido fólico

metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos metilo,

Acido fólico
coenzima en síntesis de bases y AA.

Biotina (vitamina B8/7) biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2. (S) - GP

reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de

Cobalamina (vitamina B12)
desoxirribosa. - GP

Niacina (ácido nicotínico) precursor del NAD; transferencia de electrones en reacciones redox.

Riboflavina precursor de FAD y FMN (transporte e).

precursor de la CoA (metabolismo del piruvato); activación de

Ácido pantoténico
acetilos. Oxidación de ácidos grasos.

Tiamina (vitamina B1) descarboxilaciones; transcetolasas; transaminasas, AP, S

Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) transformaciones de aminoácidos y cetoácidos. GP

transportadores de electrones (ubiquinonas, menaquinonas, etc.).

Grupo Vitamina K, quinonas
Liposoluble. 21

Categorías (tipos) nutricionales de microorganismos

• Fuente de Energía
➢ Luz (fotótrofos)
➢ Comp. Químicos (quimiótrofos, oxidación de compuestos químicos reducidos)
• Fuentes de Carbono (que constituya sus macromoléculas)
➢ CO2 (autótrofos)
➢ Carbono orgánico (heterótrofos)

Categoría Fuentes de energía, Fuente de

Ejemplos
nutricional Carbono

LUZ (fuente de energía) Algas, bacterias verdes y púrpuras,

Fotoautótrofo Cianobacterias
CO2 (fuente de C)

LUZ (fuente de energía) Bacterias no sulfurosas púrpuras y verdes

Fotoheterótrofo
Fuente de C orgánica

Energía química (generalmente Bacterias sulfooxidantes, nitrificantes

Quimiautótrofo inorgánica)
CO2 (fuente de C)

Energía química (generalmente Mayoría de bacterias, hongos, protozoos

Quimioheterótrofo orgánica)
Fuente de C orgánica
Definiciones
Crecimiento vs. Tolerancia

• “ – filo “: crecimiento
• “-tolerante”: supervivencia
• “bacteria termofílica ≠ termotolerante”
Obligado (estricto) vs. Facultativo

• “Obligado”: requerido para el crecimiento

• “Facultativo”: puede haber crecimiento, pero no es requerido
Temperatura
Clasificación de los microorganismos

Grupo Mínima ºC Óptima ºC Máxima ºC

Hipertermófilos 50 – 75 80 – 100 105 - 113

Pyrolobus fumarii (90°C) (105°C) (113°C)

Termófilos 40 - 45 55 - 75 60 - 90

Mesófilos 5 - 15 30 - 45 35 - 47

Psicrótrofos -5 - +5 20 - 30 30 - 35

Psicrófilos -5 - +5 12 – 15 15 – 20
Polaromonas vacuolata (4°C) (14°C)

Tasa de crecimiento de E.coli a distintas temperaturas

Temperaturas óptimas de crecimiento

pH

• Existe un rango de pH en el cual existe crecimiento y un pH optimo

• Valores superiores o inferiores al rango de pH en el cual existe crecimiento son nocivos:
➢ Afectan la estabilidad de la membrana plasmatica, inhiben enzimas y alteran el transporte de
nutrientes
➢ Efecto nocivo por ionizacion de algunos nutrientes → inhibe el transporte pasivo
➢ Efecto nocivo directo por acidifacion o alcalinizacion → proteínas y acidos nucleicos
• Membrana citoplasmática: poco permeable a H + y OH-
• Neutralidad en citoplasma
• Regulación de pHi mediante sistema de transporte de electrones ATP dependiente
• Ácidos fuertes (inorgánicos) y débiles (orgánicos)
• Ácidos fuertes: alteración conformación de enzimas (de pared o de membrana plasmáticas)

CLASIFICACIÓN pH Ambientes

1 Suelos y aguas volcánicas

2 Fluido gástrico

ACIDÓFILOS 3 Drenaje de minas

pHi: 6,5 4 Tomates

5 Quesos, coles

6 Guisantes, maíz, salmón

NEUTRÓFILOS pHi 7,5 7 Agua pura

8 Agua de mar

9 Suelos alcalinos

10 Lagos alcalinos, jabones

ALCALÓFILOS
11 Amoníaco doméstico
pHi: 9
12 Lagos sódicos

13 Cal, sol. saturada

14 -----

Ácidos orgánicos y
pH celular
Microorganismo Óptimo Extremo

6-8 4–9
Bacterias

4,5 - 6 1,5 – 8
Levaduras

Mohos 3-5 1,5 – 11

Actividad acuosa (Aw)

• Medida de la disponibilidad de agua en el medio

• Aw ≠ Humedad (%)
• Aw = 0 – 1
• Relación Aw y presión osmótica

Aw Ambientes Microorganismos

1,000 Agua pura Spirillum sp.

0,995 Sangre humana Streptococcus sp., Escherichia sp.,

0,980 Agua de mar Pseudomonas sp., Vibrio sp.

0,950 Pan Bacilos Gram positivos

0,900 Jamón Cocos Gram Positivos

0,855 Chorizo Levaduras

0,800 Mermeladas Levaduras, Penicillium sp.

0,750 Pescado salado Halobacterium, Halococcus

0,700 Cereales, frutos secos Xeromyces bisporus, Hongos xerófilos Efecto de la Concentración de ClNa

Microorganismos que crecen a baja aW

• HALÓFILOS (Halotolerantes)
• SACARÓFILOS (Osmófilos)
• XERÓFILOS (Xerotolerantes)
Osmosis

• Difusión de solvente (generalmente, agua) a

través de membrana permeable pero selectiva
• El agua tiende a moverse hacia zonas con
mayor concentración de solutos
Tonicidad
Efecto sobre los microorganismos

BAJA aw (Plasmólisis) → Incorporación/síntesis solutos compatibles → Consumo de energía

• Soluto compatible → molécula o ión que se acumula en el citoplasma para regular a w.

• No inhibe procesos bioquímicos, son osmoprotectores
Solutos compatibles

Microorganismo Principales solutos acumulados Aw minima p/crecimiento

Bacterias no fotótrofas Glicina, prolina, glutamato 0,97-0,90

Cianobacterias de agua dulce Sacarosa, Trehalosa 0,90

Cianobacterias marinas Alfa- glucosilglicerol 0,92

Algas marinas Manitol, prolina, glicósidos 0,90

Bacterias halófilas extremas KCl 0,75

Halobacterium sp.

Dunaliella sp. Glicerol 0,75

(alga verde halófila)

Levaduras xerófilas Glicerol 0,83-0,62

Mohos xerófilos Glicerol 0,72-0,61

Efecto de la reducción de aw

• Inhibición del crecimiento

• Inhibición de la germinación de esporas
• Aumento de la fase de latencia (lag)
• Disminución de la velocidad del crecimiento
• Disminución del número final de microorganismos
• Inhibición de síntesis de toxinas; retraso de reacciones enzimáticas
Actividad acuosa en alimentos y microorganismos

ACTIVIDAD ACUOSA (aw) ALIMENTOS MICROORGANISMOS

0,98 y superior Carnes y pescados frescos, Se multiplican la mayoría de los gérmenes

verduras, leche. alterantes y todos los patógenos transmitidos
por alimentos

0,98 – 0,93 Leche evaporada, pan, Se multiplican las enterobacterias incluyendo

embutidos cocidos. Salmonella en los niveles superiores del
rango y flora de alteración como las bacterias
lácticas.

0,93 – 0,85 Carne vacuna desecada, Se multiplican Staphylococcus aureus y

leche condensada hongos productores de micotoxinas.
edulcorada. Levaduras y mohos de alteración.
 0,85 – 0,60 Harina, cereales, frutas No se multiplican bacterias patógenas
secas Alteración por microorganismos xerófilos,
osmófilos y halófilos

Inferior a 0,60 Productos de repostería, No se multiplican los microorganismos,

fideos secos, galletitas, aunque pueden permanecer viables por
leche y huevo en polvo. mucho tiempo

Oxígeno

Clasificación Relación con el O2 Microorganismos Hábitat

Aerobios estrictos Necesario Micrococcus luteus Piel, polvo

No necesario, crecen Escherichia coli Intestino

Anaerobios facultativos
mejor con O2

Necesario a bajas Spirillum volutans Lagos

Microaerófilos
tensiones

Anaerobios No necesario, no crecen Streptococcus pyogenes Tracto respiratorio

aerotolerantes mejor con O2 superior

Anaerobios Dañino o Letal Methanobacterium Sedimentos

estrictos formicicum anóxicos

Clasificación de los microorganismos de acuerdo a su tolerancia al O2

a) Aerobios estrictos
b) Anaerobios estrictos Cultivos en caldo Tioglicolato

c) Anaerobios facultativos (resazurina)

d) Microaerófilos
e) Anaerobios aerotolerantes

Reducción del O2 a H2O – Generación de formas tóxicas del oxígeno

 • La respuesta de un organismo al O2 depende de la presencia de varias enzimas que reaccionan con él
y con varios radicales generados por las células.
• Por ejemplo, la oxidación de las flavoproteínas da origen a la formación de H2O2 como el producto
mayoritario y pequeñas cantidades del radical superóxido que es aún más tóxico. Por lo tanto, todos
los organismos que pueden vivir en presencia del O 2 (ya sea que lo utilicen o no), contienen
superoxido dismutasa. Además la mayoría de estos organismos (aerobios) contienen la enzima
catalasa capaz de descomponer el peróxido (o alguna enzima equivalente en el caso de los
anaerobios aerotolerantes).
• Los anaerobios obligados han perdido la superoxido dismutasa y catalasa y/o peroxidasa por lo que
la presencia del oxigeno es letal.

Reacciones enzimáticas
Enzimas

Presencia de
Clasificación Presencia de Catalasa superoxido Microorganismo
dismutasa

Aerobios estrictos Presente Presente Pseudomonas aeruginosa

Anaerobios facultativos Presente Presente Escherichia coli

(“aerobios facultativos”) Staphylococcus aureus

Microaerófilos Presente Presente Campylobacter jejuni

Anaerobios aerotolerantes Ausente (función cumplida por Presente Streptococcus pneumoniae

(“aerodúricos”) peroxidasas)

Anaerobios estrictos Ausente Ausente Clostridium sp.

Relación Oxígeno – Microorganismos quimiótrofos

Relación con Enzimas Metabolismo

Clasificación Ejemplo
Oxígeno energético
Catalasa Peroxidasa SOD

Respiracion
Aerobios estrictos Necesario + +/- + Pseudomonas
aerobica

Respiracion
Anaerobios anaerobica
No necesario, E. coli;
facultativos
crecen mejor + +/- + Respiracion S. aureus;
“aerobios con O2 aerobica Levaduras
facultativos”
Fermentacion

Necesario a
Respiracion
Microaerófilos bajas + +/- + Campylobacter
aerobica
tensiones

Anaerobios No necesario,
Bacterias lácticas
aerotolerantes no crecen - + + Fermentacion
(Lactobacillus)
“aerodúricos” mejor con O2

Respiracion
Anaerobios anaerobica
Dañino o letal - - - Clostridium
estrictos
Fermentacion
Conceptos básicos metabólicos y bioquímicos
Metabolismo: Conjunto de reacciones químicas llevadas a
cabo en las células
Fases del metabolismo

• Anabolismo: Biosíntesis de compuestos químicos

(“asimilación”) - Reacciones químicas que
consumen energía
• Catabolismo: Degradación o descomposición de
compuestos (“desasimilación”) - Reacciones
químicas que liberan energía
Energía de activación: Cantidad de energía necesaria
para llevar todas las moléculas de una reacción química a
un estado reactivo
Catalizador: Sustancia que disminuye la Energía de activación de una reacción para aumentar su velocidad.
NO se consumen ni se modifican durante la reacción
Enzimas (cofactores: grupos prostéticos-coenzima): Catalizador biológico, proteínas de alta especificidad.
Reacciones químicas y energía producida

• Reacciones Óxido – Reducción (REDOX)

• Dadores y Aceptores de e-
• Transportadores de electrones NAD-NADP
• Compuestos de Alta Energía - Almacenamiento
Reacciones REDOX (dadores y aceptores de e)
Transportadores de electrones - Coenzima Nicotinamida Adenina Dinucleotido (NAD)

Compuestos de alta energía

Generación de ATP: tipos de fosforilación - ADP + P → ATP

Fosforilación a nivel de sustrato → El grupo P se transfiere

de un compuesto metabólico intermedio fosforilado al ADP
 Fosforilación oxidativa

• Cadena de transporte de electrones (NAD)

• Quimioósmosis (ATPasa)
• Membranas

La célula microbiana utiliza la energía química para:

• Sintetizar grandes moléculas a partir de otras más pequeñas.

• Transportar sustancias hacia la célula microbiana y organizarlas en su interior.
• Sacar las sustancias de desecho de la célula microbiana o para realizar la secreción
• El trabajo mecánico de las células microbianas.
Obtención de la energía celular (Catabolismo)
La célula microbiana obtiene su energía de dos maneras:

• Degradando (oxidando) compuestos químicos (reducidos) y liberando su energía (quimiótrofas)

✓ Quimiorganótrofas: oxida compuestos orgánicos
✓ Quimilitótrofas: oxida compuestos inorgánicos
• Almacenando la energía lumínica del sol mediante el proceso de fotosíntesis (fotótrofas)
Nutrición
Proceso por el cual los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas (nutrientes) que
necesitan para crecer y son utilizadas para actividades celulares metabólicas ( fines energéticos y
biosintéticos)
Transporte de Nutrientes

• Transporte Pasivo (TP): no se consume energía

➢ Difusión simple
➢ Difusión facilitada
• Transporte Activo (TA): se consume energía
➢ Transporte simple y cotransporte
➢ ABC-Transporter
➢ Traslocación en grupo
Transporte pasivo
Difusión Simple

• Movimiento de solutos desde zonas de alta concentración a

zonas de baja concentración
• Transporte de pequeñas moléculas no cargadas (H 2O, O2,
CO2)
Difusión Facilitada

• Transporte de moléculas polares y iones a través de

membrana por el gradiente de concentración
• Proteínas Transportadoras (permeasas) → > velocidad
Transporte activo

• Transporte de moléculas a través de la membrana contra

gradiente de concentración (baja → alta)
• Requiere energía (p.e ATP o gradientes de iones) y proteínas
de transporte
• Transporte de azúcares, AA, ácidos orgánicos, fosfatos y
iones metálicos)
• Sistema de “Translocación en grupo”: transporta y modifica
azúcares específicos
Sistemas de Transporte Activo en bacterias
Sistemas de Cotransporte

Transporte de una sustancia desde un área de baja → alta

concentración mientras otra sustancia es transportada
simultáneamente desde alta → baja concentración.
Ejemplo: lactosa permeasa en E. coli: Mientras iones de hidrógeno se
mueven desde alta concentración afuera → baja concentración
adentro, la lactosa se mueve desde baja concentración externa → alta
concentración interna
ATP-binding cassette transporters (Transportadores ABC)
El sustrato se une a una proteína cassette soluble (en periplasma de
Gram -, o ligada en lado externo de membrana plasmática en Gram +).
El complejo sustrato-cassette se une entonces a una bomba de
ATPasa ligada a membrana, que transportará la molécula de sustrato a
través de la membrana plasmática.
Proteína periplásmica de unión
Proteínas trasmembranales
ATPasa (hidrólisis de ATP)
200 sistemas en procariotas
Sistema de translocación en grupo
La molécula que se transporta se modifica
químicamente: se fosforila durante el transporte
Ejemplo: Sistema fosfoenolpiruvato: azúcar
fosfotransferasa (PTS)

PEP + azúcar (exterior) → piruvato + azúcar-

fosfato (interior) (glucosa, manosa, fructosa, N-
acetil glucosamina)
Sistema con varios componentes que transportan
el P de alta energía del PEP al azúcar a transportar

Ahorro de energía metabólica → se gasta un

solo enlace rico en energía para 2 procesos:

transporte y activación de molécula

Obtencion de energía

• Quimiotrofia: oxidación de compuestos químicos

(catabolismo)
➢ Compuestos organicos (quimioorganótrofos)
– Glucosa → CO2
- Fermentacion
- Respiracion (aerobica y anaeróbica)
• Fototrofia: fotosíntesis (catabolismo + anabolismo)
Catabolismo de Hidratos de Carbono
1° Etapa

• GLUCÓLISIS (Ruta de Embden-Meyerhof):

Glucosa → 2 Ac. Pirúvico = 2 ATP & 2 NADH
• Ruta de las Pentosas Fosfato (similar:
fosfocetolasa)
• Ruta de Entner-Dudoroff (sólo en procariotas) →
NADPH + 1 ATP
2° Etapa

• Ácido Pirúvico
➢ FERMENTACIÓN: Sin CTE ni AFEE, no
requiere O2
- Láctica
- Alcohólica
- Acido-mixta
- Butilenglicólica
➢ RESPIRACIÓN: Con CTE y AFEE, O2 y No O2
- Aeróbica
- No aeróbica
Fermentación

• Proceso redox que ocurre en ausencia de un aceptor final de electrones.

• El compuesto final se forma a partir del propio sustrato inicial
• Rendimiento bajo en ATP, formado por Fosforilación a nivel de sustrato.
• PRODUCTOS: Reducción del ácido pirúvico para regenerar NAD +
Fermentación láctica
Fermentación alcohólica
 Principales productos Ejemplo de
Fermentación Utilidad
químicos finales microorganismo
Láctica Ac. láctico Estreptococo Elaboración de yogurt
Homoláctica Ac. Láctico Lactobacillus spp
Hetero láctica CO2, Ac. láctico, Etanol Lactobacillus spp
Acida Mixta Ac. Láctico, Ac. E. Coli
Succínico, Ac. Acético,
Etanol, CO2, H2
Butilenglicolica Etanol, Ac. Láctico, Ac. Enterobacteria
Succínico, Ac. Acético,
CO2, H2
Alcohólica Etanol, CO2 S. cerevisae Elaboración de cerveza
Butírica Acido Butírico, gas Clostridium
Acética Ac. Acético Acetobacter Elaboración de vinagre

Respiración: Flujo de Carbono y Transporte de Electrones

Respiración: proceso catabólico (generación de ATP) en el cual los compuestos químicos son oxidados y el
O2 u otro oxidante actúan como aceptor final de electrones
- Transformación de la cadena carbonada
- Flujo de electrones
1) Vías de transformación de C org. a CO2
2) Transporte de electrones desde comp. org. hasta aceptor terminal, con síntesis de ATP a expensas
de la fuerza motriz de protones (“proton motive force”). F. oxidativa
Etapas de la Glucolisis

1. Etapa: Glucosa → 2 Ac. Pirúvico + 2 ATP + 2 NADH

2. Etapa: Escisión de Ácido Pirúvico → Acetil-CoA
3. Etapa: Ciclo de Krebs (o CAT o CAC)
4. Etapa: Sistema de Transporte de Electrones - Generación de ATP por F. oxidativa
Cadena de Transporte de Electrones
Los sistemas de transporte de electrones que se acoplan al ciclo de Krebs están compuestos por carriers
adosados a membranas.
Tienen 2 funciones básicas:
(1) aceptar electrones del dador de electrones y transferirlos al aceptor en forma secuencial
(2) conservar la energía involucrada durante la transferencia de electrones para la síntesis de ATP por
fosforilación oxidativa (quimiósmosis)

Característica Respiración Anaerobia Fermentación

Cadena de transporte de
Si No
electrones
Aceptor final de electrones Inorgánico Orgánico
Fosforilación Oxidativa Sustrato
Producción de ATP 36-38 ATP 2 ATP
Citosol + Mitocondria
Lugar donde se lleva a cabo Citosol
Citosol + Membrana Plasmática
Inhibidores de la cadena respiratoria

• Monóxido de Carbono (CO) se combina directamente

con la citocromo oxidasa terminal, y bloquea la
entrada de oxígeno a la misma.
• Cianuro (CN-) se une al hierro del citocromo e impide
la transferencia de electrones. (Azida sódica)
Respiracion anaerobica

• Proceso catabólico realizado cuando el aceptor final

de electrones NO es el oxígeno molecular.

Digestión Extracelular de Polímeros orgánicos (proteínas y lípidos)

Catabolismo de los lípidos

Catabolismo de proteínas

• Las proteínas son demasiado grandes para atravesar las membranas

• Los microorganismos excretan proteasas (Sec) que hidrolizan las proteínas exógenas a péptidos.
• Desaminación (prueba de identificación)
• Esqueletos carbonados entran en el ciclo CAT para sufrir una mayor oxidación vía acetil CoA, ácido
cetoglutárico, ácido succínico, ácido fumárico o ácido oxalacético
• Proteínas → (proteasas) Peptidos → (peptidasas) Aminoácidos
Quimiolitotrofos

• La capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa a partir de donadores inorgánicos de

electrones sólo se presenta en ciertos grupos de procariotas.
• Cada grupo fisiológico de quimiolitótrofos usa un tipo de dador de electrones inorgánico
• bacterias de hidrógeno (H2) Desulfovibrio sp.
• bacterias del hierro (Fe2+) Thiobacillus ferrooxidans
 • bacterias del azufre (S2-) Thiobacillus denitrificans
• Aceptores de e-: O2 (aerobiosis)
• Otros: sulfatos, nitratos (oxidados)
• bacterias nitrificantes, con dos subtipos:
➢ oxidadoras de amoníaco (“nitrosas”:
Nitrosomonas sp.)
➢ oxidadoras del nitrito (“nítricas”: Nitrobacter
sp.).
Fotótrofos
Fotofosforilación
A. CÍCLICA
• No dador externo e
• Fotoheterótrofas
• No fijación CO2
• Bacterias. rojas no sulfurosas. y verdes no
sulfurosas, Rhodopseudomonas; Chloroflexus
B. ACÍCLICA
• Dador externo de e “H2A”
• Oxigénica: H2O
• Anoxigénica: H2S
• Fijación de CO2
• Fotoautótrofas
Fotosíntesis

• La fotosíntesis es el proceso que convierte la

energía lumínica en energía química
• Fotosíntesis oxigénica: cianobacterias
Fotosíntesis anoxigénica

• Dadores alternativos: S – H2
• Bacterias verdes: Chlorobium
• Bacterias púrpuras: Chromatium
Fases de la fotosíntesis
Ciclo de Calvin – Benson:

• Independiente de luz
• Uso de energía y poder de reducción para
formar enlaces covalentes entre Carbonos
• Ídem quimioautótrofos

Anabolismo (Biosintesis)
Biosintesis de Peptidoglucano

• Molécula con residuos alternados de N-acetilglucosamina

(NAG) y ácido N- acetilmurámico (NAM).
• Tetrapéptido - NAM
• Uniones interpeptídicas entre cadenas tetrapeptídicas
 1. Fase: Síntesis NAG-UDP y NAM-UDP;
adición peptídica en NAM
2. Fase: Unión Lip-P con NAM; unión NAG
3. Fase: traslocación de disacárido y
polimerización
4. Fase: unión nueva cadena con PG
preexistente por transpeptidación

Relación Catabolismo - Anabolismo

La taxonomía es la ciencia de la clasificación biológica
Comprende tres áreas independientes pero relacionadas:
1. Clasificación: ordenamiento de los seres vivos en grupos o taxones en función de semejanzas o
parentesco evolutivo.
2. Nomenclatura: asignación de nombres a los grupos taxonómicos de acuerdo con criterios y normas
establecidos internacionalmente.
3. Identificación: proceso mediante el cual se determina a que grupo taxonómico reconocido
previamente establecido pertenece un organismo que se aísla.

(“Aspecto práctico de la taxonomía → uso de esquemas de clasificación para determinar la identidad de un

organismo aislado ”)
Clasificación y nomenclatura

• Caracterización exhaustiva: datos fenotípicos, genotípicos (“taxonomía clásica”) y filogenéticos

(“taxonomía polifásica”)
• Aplicación de teoría y método de clasificación
• Formación de grupos taxonómicos (taxones)
• Nomenclatura
Identificación

• Caracterización del organismo aislado usando número limitado de tests adecuados al problema
• Comparación con spp. conocidas
• Asignación a una sp.
• No identificado: studio taxonomico
Clasificación
- Al preparar un sistema de clasificación, se ubican todos los microorganismos en grupos
homogéneos, que a su vez pertenecen a otro grupo más amplio siguiendo una estructura jerárquica sin
superposiciones horizontales.
- Una categoría de cualquier rango une grupos de nivel inferior en función de propiedades comunes→
categoría + alta: >N° de unidades taxonómicas, <N° de propiedades compartidas
- En la taxonomía bacteriana los niveles o rangos utilizados son los siguientes (en orden ascendente):
• ESPECIE (species)
• GÉNERO (genus)
• FAMILIA (family)
• ORDEN (order)
• CLASE (class)
• FILO (phylum)
• (REINO) NO ASIGNADO PARA BACTERIAS ni ARCHAEA
• DOMINIO (domain) (Bacteria – Archaea – Eukarya)
Especie

• ESPECIE es un grupo de poblaciones naturales que se reproducen entre sí y que están aisladas de
otros grupos desde el punto de vista de la reproducción.
• ESPECIE BACTERIANA es una colección de cepas que comparten numerosas propiedades estables y
que difieren de forma significativa de otros grupos de cepas.
• Una CEPA es una población de microorganismos que desciende de un único organismo o de un
aislamiento en cultivo puro.
 • Cada especie se asigna a un GÉNERO, el siguiente rango de la jerarquía taxonómica.
• Un GÉNERO es un grupo bien definido de una o más especies que está claramente separado de
otros géneros.
Nomenclatura

• Los microbiólogos asignan nombre a los microorganismos de acuerdo con el SISTEMA BINOMIAL del
botánico sueco C. Linnaeus (1735).
• El nombre latinizado y en cursiva consta de dos partes:
1. El primer nombre, escrito con mayúscula, es el nombre genérico.
2. El segundo nombre, en minúscula, es el epíteto de la especie
Estructuración jerárquica en taxonomía

Subespecie

• Basada en variaciones fenotípicas y genotípicas menores, pero constantes.

• Es la categoría más baja aceptada oficialmente en la nomenclatura
• Nombre trinominal
➢ Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
➢ Lactobacillus casei subsp. casei
Categorías de clasificacion a nivel de infrasubespecie (tipificación)
Variedades o tipos

• serovariedad o serotipo (antígenos distintos)

• fagovariedad (tipificación por fagos)
• biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)
• patovariedad (patogenicidad)
• morfovariedad (diferencias morfológicas)
• genomovariedad (grupos con ADN similares)
• Salmonella enterica subsp. enterica serov Typhi
Clasificación - Ordenamiento de los organismos

• Sistemas de clasificación (criterios), ubicación en taxones

• Estudio de la historia evolutiva de los organismos
➢ Semejanzas: Fenotípicas - Genotípicas
➢ Patrón evolutivo: SISTEMATICA (FILOGENIA)
Características empleadas en TAXONOMIA (clásica): CLASIFICACIÓN - IDENTIFICACIÓN
Fenotípicas

• Morfológicas: morfología celular y colonia (forma-tamaño-color), esporas ultraestructura, tinción, cilios

y flagelos, movilidad, inclusiones
• Fisiológicas y metabólicas: fuentes de energía, C y N, componentes de la pared celular (tipo de
peptidoglucano, ácidos teicoicos), productos de fermentación, tipo nutricional, pH, temperatura de
crecimiento, luminiscencia, tolerancia osmótica, relaciones con el oxígeno, pigmentos fotosintéticos,
necesidad y tolerancia a la sal, metabolitos secundarios, sensibilidad a antibióticos
• Ecológicas: Ciclo vital, Relaciones simbióticas, Patogenicidad, Preferencia de hábitat (pH; oxígeno; aw)
• Serología – Fagotipia
Genotípicas (ácidos nucleicos)

• Composición % G + C
• Hibridación de Ácidos Nucleicos (DNA-DNA; Tm; ARN/ADN)
Características genotípicas clásicas
Contenido G+C
𝐺+𝐶
%𝐺 + 𝐶 = . 100
𝐺+𝐶+𝐴+𝑇
• Determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía
• Amplio rango en procariotas: 20 al 80%
• Poca información para la caracterización taxonómica
• Criterio de exclusión:
➢ ∆%GC > 3, probablemente especies diferentes
➢ ∆%GC > 10, probablemente géneros diferentes
• Es una característica del genoma de un organismo o de cualquier pedazo de ADN o ARN. G y C
denotan guanina y citosina, respectivamente. Expresado generalmente como porcentaje, representa la
cantidad de pares Guanina-Citosina en la molécula de ADN o genoma que está siendo investigado. Se
utiliza para clasificar microorganismos en taxonomía, también nos sirve para saber la complejidad del
genoma de un organismo, como bacterias.
Desnaturalización térmica

• Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalización

• Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN- ADN o de ADN- ARN

Hibridación ADN-ADN

• Depende de la secuencia completa del genoma

• Útil en organismos estrechamente relacionados
• Determinación por:
 ➢ % hibridación de ADN1 - ADN2
➢ Δ Tm del híbrido
• Es el criterio actual de definición de especie

Definición metodológica estándar:

• % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

• ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)
Hibridación de ácidos nucleicos
1. Aislar DNA de μo a comparar
2. Cortar DNA y marcar 1
3. Desnaturalizar (Ø)
4. Mezclar DNA marcado con DNA μo a comparar (exceso)
5. Enfriar mezcla
6. Medir radiactividad en DNA bicatenario
Estabilidad térmica del híbrido

• Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b

• Curvas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex
Especie bacteriana

• Concepto en revisión continua

• Definición metodológica estándar:
➢ % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%
➢ ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)
• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas y genómicas)
Taxonomía polifásica
Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres:
Fenotipicos

• Clásicos (morfología, nutrición, etc)

• Marcadores quimiotaxonómicos
• Perfil de proteínas totales y enzimas
• Perfil de ácidos grasos
Genotipicos
Clasicos

• % G+C
• Hibridación dna-dna
Nuevos

• Fingerprinting (perfiles moleculares por restricción)

• Pcr (amplificación de adn)
• Secuenciación de ácidos nucleicos

Filogeneticos → basados en secuenciación gen ARNr 16S

Caracteres fenotípicos
Marcadores quimiotaxonómicos

• Análisis químicos con equipamiento especializado

• No son universales, muy útiles dentro de algunos grupos
• Alto grado de discriminación
• Presentes en distintas estructuras celulares
➢ Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo en Planctomyces y Mycoplamas
➢ Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos
➢ Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), ácidos micólicos en un
grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias
fotótrofas anoxigénicas.
➢ Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.
➢ Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.
➢ Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas
Caracteres genotípicos

• Fingerprinting de ácidos nucleicos

• Enzimas de restricción
• Sondas marcadas
• PCR
Caracteres filogenéticos

• Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies) →

CLASIFICACIÓN
• Compara la secuencia de moléculas (que se comportan como “cronómetros evolutivos”) y establece
la relación entre ellas à las secuencias son registro histórico de la evolución
Propiedades de un buen cronómetro evolutivo

• Distribución universal (presente en todos los organismos, con función homóloga)

• Secuencias que permitan identificar regiones homólogas y heterogéneas
• La tasa de cambio de la secuencia de la macromolécula debe estar en correlación con la distancia
evolutiva
Cladogramas
Molécula usada para determinar relaciones
filogenéticas de organismos: ARNr 16S (Carl
Woese), Secuenciamiento directo – 1500
nucleótidos
Árboles filogéneticos

• Uso de programas para alinear

secuencias (BLAST) y construir
árboles filogenéticos
• Longitud de la línea entre organismos
es proporcional a la distancia
evolutiva
• Similitud de secuencias implica
similitud en los genes
Relación entre la definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S

• Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

• En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S
difiere en más del 3% con el resto de las secuencias
conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-
ADN es menor al 70%
Criterios para diferenciación de especies y géneros en sistema
de clasificación actual

Criterio %G+C DNA/DNA ∆ Tm 16 r

RNA
= especie ∆ < 3% > 70% ∆ < 5°C ∆ < 3%
= género ∆ < 10% > 20%
< 5%
distinto
género

Clasificación del dominio bacteria

Caracterización completa de géneros

• Morfología celular y de colonia, movilidad, coloración de Gram, estructura celular

• Requerimientos ambientales (de oxígeno, etc.), nutricionales. Fisiología y
• metabolismo
• Genética (% G+C), mutantes, plásmidos, fagos, bacteriocinas, antibióticos
• Tratamiento filogenético, datos moleculares
• Estructura antigénica, serotipificación – Patogenicidad - Ecología
• Metodología de enriquecimiento, aislamiento, mantenimiento, ensayos especiales
• Diferenciación de otros géneros - Comentarios taxonómicos – Listado descripción y diferenciación de
sp. y subsp.

Gram negativas → 20 Filos

Filo XII - Proteobacteria (vol. 2): Se divide en cinco clases, según los estudios de las secuencias de ARNr,
que se denominan según las letras griegas de alpha a épsilon
• Alfa Proteobacteria: incluye géneros fotótrofos, géneros que metabolizan compuestos C1
(Methylobacterium), simbiontes de plantas, fijadores de N2 (Rhizobium) y patógenos (Rickettsia,
Brucella).
• Beta Proteobacteria: incluye géneros quimioheterótrofos pero también quimiolitótrofos (Nitrosomonas,
oxidante de amonio), algunos fotótrofos y fijadores de N2. Dentro de esta clase se incluyen patógenos
como Neisseria (gonorrea y meningoencefalitis) y algunas especies de Burkholderia
• Gamma Proteobacteria: incluye los diversos órdenes de bacterias de importancia médica y científica
(Pseudomonadales -al que pertenece Azotobacter -, Legionellales, Vibrionales, Enterobacteriales,
Pasteurellales). Este grupo incluye varios patógenos importantes, como, por ejemplo, Salmonella
(enteritis y fiebre tifoidea), Yersinia (peste), Vibrio (cólera), Pseudomonas aeruginosa (infecciones del
pulmón en pacientes hospitalizados o con fibrosis quística).
• Delta Proteobacteria: incluye los géneros Myxococcus y Bdellovibrio, parásitos de otras bacterias, y el
género Desulfovibrio
 • Epsilon Proteobacteria: incluye los patógenos humanos Campylobacter y Helicobacter. La mayoría de
las especies pertenecientes a esta clase habitan en el tracto digestivo de seres humanos y animales
Bacterias Gram negativas No-proteobacteria
1. El phylum Cyanobacteria corresponde a los fotoautótrofos que utilizan la luz como fuente de energía y
CO2 como fuente de carbono y producen O2 durante la fotosíntesis
2. Los quimioheterótrofos incluyen Chlamydia (phylum Planctomyces), Bacteroides (phylum
Bacteroides), Fusobacterium (phylum Fusobacteria) y Treponema, Borrelia y Leptospira (phylum
Spirochetes). Muchos de ellos patógenos humanos
Bacterias Gram positivas
El Manual Bergey divide a las bacterias Gram Positivas de acuerdo a su contenido de G+C
1. Bacterias Gram Positivas de alto contenido de G+C (phylum Actinobacteria) incluye el importante
género Mycobacterium y los géneros filamentosos Actinomyces y Streptomyces. También incluye
Corynebacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium y Micrococcus
2. Bacterias Gram Positivas de bajo contenido de G+C (phylum Firmicutes) incluye los órdenes
Clostridiales (Clostridium), Bacillales (Bacillus) Lactobacillales (Staphylococcus, Streptococcus,
Listeria y Lactobacillus).
Identificación

• Esquema de Identificación ≠ Esquema de clasificación (determinativo ≠ sistemático)

• Los caracteres para la identificación deben ser pocos y fácilmente determinables (rápidos y baratos)
• Tinciones – Tests fisiológicos y bioquímicos (baterías de tests)
• Reacciones serológicas (aglutinación; anticuerpos fluorescentes; ligados a reacción de color),
Fagotipificación
• Sondas genéticas (“DNA probes”)
• Métodos Estandarizados: tamaño y tipo de inóculo, medios, temperaturas y tiempo de incubación,
criterios para interpretar resultado de reacción
• Empleo de cepas de referencia y controles + y -
Dificultades en la identificación

• Trabajar con un cultivo PURO

• Trabajar desde categorías mayores a menores específicas (Gram – morfología celular – movilidad –
tipo general de metabolismo – O2)
• Aplicar el sentido común en cada paso
• Usar el menor número de pruebas
• Comparar el aislamiento con cepas tipo o de referencia
Cuando no se logra identificar el aislamiento:

• Controlar pureza
• Asegurarse que se han realizado las pruebas apropiadas
• Controlar que los métodos sean confiables
• Que se han usado correctamente las distintas claves y tablas
Identificación de género y especie

• Proporciona esquemas de identificación (listas de características que permiten ubicar el

microorgansimo aislado en sistema de clasificación concebido con anterioridad – FINES PRÁCTICOS)
• 35 grupos de microorganismos
➢ Grupo 4: Bastones y cocos Gram negativos aerobios
 ➢ Grupo 5: Bastones Gram negativos anaerobios facultativos
➢ Grupo 17: Cocos Gram positivos
• Criterios
➢ Morfología – tinción – requerimientos de oxígeno – pruebas bioquímicas → procedimientos
habituales de laboratorio
Algunos grupos microbianos habituales en alimentos

Claves dicotómicas de identificación Sistema de identificación tradicional

Agar baird parker

• Cloruro de litio y telurito de potasio: inhibir desarrollo de flora microbiana acompañante

• Piruvato de sodio y glicina: estimular selectivamente el crecimiento de estafilococos.
• Yema de huevo: colonias convexas negros rodeadas de zona transparente debido a la lipólisis y
proteólisis.
 Microorganismos Crecimiento Apariencia

E. coli Ninguno Ninguno

P. mirabilis Bueno Marrón

S. aureus Bueno a excelente Negras con borde blanco, rodeado de una zona clara.

S. epidermidis Escaso o bueno negra, tamaño irregular. Zona opaca alrededor de la

colonia sin zona clara alrededor.

E. faecium Escaso Igual al anterior

Micrococcus Escaso Colonias marrón a negro.

Pruebas Bioquímicas para Identificación de Bacterias

Prueba Principio Método

Utilización del citrato Utilización de citrato como única Citrato + BTA

(“C”) fuente de C alcaliniza el medio
Color azul indica pH alcalino

Prueba de Indol (“I”) Conversión del AA triptófano en Indol Detección de Indol en el medio con
dimetil- amino benzaldehído (rojo)

P. Rojo de Metilo Producción de ácidos en fermentación Crecimiento en caldo glucosa – Añadir

(“M”) disminuye el pH por debajo de 4,3 indicador Rojo de Metilo (rojo)

Prueba de Voges Se produce acetoína a partir de Detección de acetoína en el medio

Proskauer (“VP”) fermentación de azúcares utilizando a-naftol

Identificación de cepas específicas de una especie dada - TIPIFICACIÓN

Metodos tradicionales

• Serotipificación: aglutinación, ELISA (directa: bact+ac; indirecta: bact + ac) – Western blot (bact + ac)
• Fagotipificación
Metodos basados en DNA fingerprinting

• DNA fingerprinting + AGE + sonda (RFLP)

• DNA fingerprinting usando PFGE (sin sonda-BE)
• Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) strain typing (primers de 10 bp – separación por
electrophoresis en gel de agarosa)
Criterios y métodos taxonómicos para clasificación e identificación de bacterias

Criterio o Método Utilizado para

Clasificación Identificación

Morfología X X

Tinción X X

P. bioquímicas X X
 Serología X

Fagotipificación X

Perfiles de ácidos grasos X

Composición Bases DNA X

Huella del DNA (análisis de restricción) X X

PCR X X

Hibridación de Ácidos Nucleicos X X

Secuenciación de rRNA X

Rama de la Biología, que estudia los mecanismos de defensa de los organismos superiores, frente a
microorganismos patógenos y a estructuras moleculares que no son reconocidas como propias

Inmunidad innata Inmunidad adquirida (específica)

(inespecífica) 3° línea de defensa (anticuerpos)

1° Línea de 2° Línea de ACTIVA PASIVA

defensa defensa
El individuo genera linfocitos Los Ac se generan en otro
especializado y anticuerpos (Ac) organismo

Piel Mucosas Leucocitos Natural Artificial Natural Artificial

Microbiota Inflamación
Fiebre Soportar con Inducida Ac de madre a Ac se obtienen
Sustancias éxito una mediante hijo (placenta – a partir del
antimicrobianas infección vacunas (moo o calostro) suero de
toxinas persona o
inactivadas) animal
inmunizado

Antígeno

• Toda sustancia ajena al organismo capaz de desencadenar la respuesta inmune de generación de

anticuerpos.
• La región inmunológicamente activa de un antígeno (por donde se une al Ac) se denomina
determinante antigénico o epítopo.
Concepto y naturaleza de los antígenos

• Antígeno → cualquier sustancia que es reconocida como extraña y que es capaz de inducir una
respuesta inmunitaria.
• Macromoléculas
➢ Naturaleza: proteica (unidos a glúcidos o lípidos) o polisacáridos complejos
➢ Estado: Libres o forman parte de estructuras biológicas (m.p, glucocálix, flagelos, fimbrias,
pared y capsula bacteriana, cápside y envuelta viral)
• Haptenos → sustancias de bajo PM no inmunogénicas, que pero unidas a ciertas proteínas
portadoras, activan a las células productoras de Ac. Ej.: Penicilina
Estructura de anticuerpos

• Una región variable que constituye el sitio de unión al antígeno

(parátopo), y se puede unir al menos a dos moléculas de un mismo
antígeno.
• Una región constante, integrada por el tallo y una parte de ambas
ramas.
• Dos cadenas L (ligeras) más cortas y también idénticas entre sí.
• Dos cadenas H (pesadas) iguales entre sí, y de gran tamaño.
Tipos de inmunogloublinas

• En mamíferos, 5 tipos (según cadenas H): G-D-E-A-M

Reacciones Antígeno-Anticuerpo

• Los anticuerpos, al reconocer a los antígenos, se unen a ellos mediante enlaces de

Van der Waals, fuerzas hidrofóbicas o iónicas, en una reacción denominada antígeno-
anticuerpo.
• La unión se lleva a cabo entre las porciones variables de
las cadenas H y L del anticuerpo y los determinantes
antigénicos del antígeno
• Es extraordinariamente especifica: el anticuerpo sólo
reconoce los determinantes antigénicos que son
complementarios
• No se establece ningún enlace covalente entre antígeno
anticuerpo, por lo que la reacción es reversible
Son utiles por su aplicación práctica (vacunación-diagnóstico)
Precipitación. Cuando se unen antígenos solubles con varios
determinantes anticuerpos solubles forman un precipitado
insolubles.
Aglutinación (directa o indirecta). Los anticuerpos se unen a antígenos presentes en la superficie de ciertas
células (microorganismos, «antígenos particulados»). Se forman así aglomerados de células. Antígenos
«aglutinógenos» y anticuerpos «aglutininas».
Inmunomarcación. Se une los anticuerpos a determinadas moléculas (enzimas, fluoróforos, isotopos
radioactivos, etc.), que permiten evidenciar la presencia del anticuerpo sobre un antígeno. Primarias
Neutralización. La unión del anticuerpo al antígeno provoca que éste no pueda realizar alguna función o
actividad vital (se bloquea la acción).
Anticuerpos monoclonales
Son anticuerpos producidos en el laboratorio por cultivo de un clon celular que produce un anticuerpo
específico.
Obtención
1. Inmunización de animales contra el antígeno
para el que se desea producir anticuerpos →
Linfocitos B específicos
2. Aislamientos y fusión de los linfocitos con
células de mieloma formando hibridomas
3. Selección de aquellos hibridomas que sean
productores de las inmunoglobulinas
específicas deseadas
4. Clonación
TEST ELISA - Ensayo de inmunoabsorción
ligado a enzimas
Inmunomarcación enzimática
Barato,preciso, rápido.
Cualitativo - cuantitativo
Utiliza placas polipropileno (se adhieren
firmemente las proteinas).
Directo e indirecto
Directo (sandwich) para detectar antígenos
1. Se coloca antisuero con anticuerpos
primero en los pocillos
2. Se agrega los antígenos (bacterias que
se aislaron, por ejemplo)
3. Si la bacteria se reconoce con
anticuerpo (a través de los
determinantes), se fijará al anticuerpo
4. Lavado con buffer para eliminar el
exceso de antígeno que no se ha fijado
5. Se agrega otro anticuerpo específico para el microorganismo ligado a una enzima (peroxidasa,
beta galactosidasa, fosfatasa alcalina)
6. Lavado que elimina el exceso de anticuerpos ligados a enzimas que no fueron fijados
7. Agregado de sustrato de la enzima: enzima actúa sobre sustrato y se produce coloración positiva. Se
puede medir intensidad de color
Indirecto (para detectar HIV en pacientes: se detecta
anticuerpos)
1. Se coloca el antígeno pegado al pocillo
(estructuras que tiene el virus, que ha sido lisado)
2. Se agrega el suero del paciente (que puede
tener anticuerpos si estuvo en contacto con HIV,
que quedarán fijados al antígeno)
3. Lavado con buffer para eliminar el exceso de suero que no se ha fijado
4. Agregar gammaglobulina antisuero humana ligada a una enzima (peroxidasa, beta galactosidasa,
fosfatasa alcalina)- reconoce al anticuerpo como antígeno.
5. Lavado que elimina el exceso de gamma ligados a enzimas que no fueron fijados
6. Agregado de sustrato de la enzima: enzima actúa sobre sustrato y se produce coloración positiva. Se
puede medir intensidad de color
Inmunofluorescencia - Inmunomarcación

• Identificar microorganismos (Ag: directa) en muestras o anticuerpos específicos en suero (Ac:

indirecta) usando colorantes fluorescentes como marcadores.
• Microscopio de luz UV – Cualitativo: colorante utilizado: isotiocianato de fluoresceína (fitc)
• Directa: rabia, campylobacter, listeria, clostridium, micobacterium.
• Indirecta: rabia, virales respiratorias, sifilis (treponema pallidium)

Los hongos son organismos eucariotas, con núcleos bien organizados y su membrana nuclear está bien
definida son aerobios, heterótrofos y no motiles, se reproducen por esporas sexuales y asexuales.
Los hongos están constituidos por:
• HIFAS (unidad funcional del hongo).- Estructuras filamentosas de forma tubular, cuyo agrupamiento
constituye el MICELIO.
Todos los hongos son heterótrofos (quimiorganotrofos): tienen que alimentarse de materia orgánica
preformada que utilizan como fuente de energía y de carbono.
Tienen una pared celular formada por quitina; esta pared es rígida, por lo que no pueden fagocitar alimentos
si no que absorben nutrientes simples y solubles que obtienen al desintegrar polímeros mediante enzimas
extracelulares llamadas despolimerasas.
Talo
Constituido por dos partes:
a) Talo vegetativo .- asegura el desarrollo, nutrición,
fijación y edificación de la parte reproductora.
b) Talo reproductor.- pueden estar representadas por
hifas, levaduras o pseudohifas.
Si el talo esta disociado, se producen colonias de
levaduras de crecimiento rápido y de consistencia
cremosa. Si el talo es filamentoso da lugar a colonias de
mohos de crecimiento.
Fases
Los hongos que tienen una fase parasitaria levaduriforme y una soprofitica micelial, y que en respuesta a
cambios ambientales pasan de esta fase de 20 a 25°C a la fase de levadura a 37°C o viceversa, se llaman
dimorfos.
Presentan diferencias en su forma y constitución:

• Dilataciones o vesículas
 • Órganos de resistencia o clamidosporas
• Órganos de fijación como rizoides
• Hifas en espiral o tirabuzón
• Órganos nodulares formados por hifas torcidas en forma de nudos
Clasificacion
La clasificación tradicional de hongos se ha modificado en base a datos filogénicos
Las divisiones actuales contempladas en el reino Fungi:
1. Chytridiomycota
Contiene a los hongos verdaderos más sencillos
Son microscópicos unicelulares, masas multinucleadas o verdaderos micelios.
Presentan reproducción asexual, mediante zoosporas (esporas flagelares móviles) y también sexual
generando zigotos de pared dura y gruesa (zigosporas) que permanecen latentes en ambientes hostiles hasta
convertirse en esporangios.
Son terrestres y acuáticos Algunos saprofíticos sobre materia orgánica muerta. Otros parásitos de algas, de
otros hongos plantas e invertebrados.
Géneros representativos: Rhizophydium y Allomyces
2. Glomerulomycota (incluida anteriormente en zygomycota)
Es una división recientemente separada de Zygomycota Filogénicamente más parecida d las divisiones
Basidiomycota y Ascomycota.
Carecen de reproducción sexual y son simbiontes obligados de plantas terrestres
Tienen hifas no septadas y esporas grandes y multinucleadas
Se nutren de carbohidratos simples y vitaminas de las raíces de plantas e inducen a dicotomías de raíces
aumentando la superficie de absorción de nutrientes del suelo.
Géneros representativos: Arqueospora y Glomus
3. Zygomycota
Están constituidos por hifas cenocíticas con muchos núcleos aploides.
Presentan reproducción asexual , mediante esporas que se producen en los esporangios ubicados en el
extremo de las hifas aéreas y se dispersan por el viento y también sexual generando zigotos de pared dura y
gruesa (zigosporas) que permanecen latentes en ambientes hostiles
Viven en materia vegetal y animal en descomposición en el suelo
Interés industrial : se los utiliza para producir alimentos: tempeh, tofu, sustancias anestésicas, alcoholes
industriales, etc..
Géneros representativos: Rhizopus y Mucor
4. Ascomycota
Grupo muy amplio y variado al que pertenecen especies unicelulares como las levaduras y otras de
crecimiento filamentoso.
Reciben este nombre por su estructura reproductora características en forma de saco (ASCA)
 Están formados por hifas tabicadas
Presentan reproducción sexual , mediante conidioesporas que se disponen en cadena en el extremo del
conidioforo
Viven en hábitat terrestre y acuáticos sobre materia vegetal en descomposición sustratos de madera queratina
(uñas , plumas, cuernos y pelos) suelo y alimentos, etc..
Interés industrial las levaduras que se utilizan para producir alimentos y antibióticos
5. Basidiomycota
Clasificación Características Hifas Esporas Ejemplo
Reproducción asexual:
Rhizophydium y
Contiene a los hongos Hifas mediante zoosporas
Chytridiomycota Allomyces
verdaderos más sencillos cenocíticas Reproducción sexual:
generando zigosporas
Se nutren de carbohidratos
simples y vitaminas de las Hifas no
Carecen de reproducción
raíces de plantas e inducen septadas y
sexual y son simbiontes Arqueospora y
Glomerulomycota a dicotomías de raíces esporas
obligados de plantas Glomus
aumentando la superficie de grandes y
terrestres
absorción de nutrientes del multinucleadas
suelo
Reproducción asexual:
Rhizopus y
mediante esporas que se
Mucor - Se los
producen en los
utiliza para
esporangios ubicados en
Viven en materia vegetal y Hifas producir
el extremo de las hifas
animal en descomposición cenocíticas con alimentos:
Zygomycota aéreas y se dispersan por
en el suelo muchos núcleos tempeh, tofu,
el viento
aploides sustancias
Reproducción sexual:
anestésicas,
generando zigosporas que
alcoholes
permanecen latentes en
industriales
ambientes hostiles
Reproducción sexual: S. cereviseae -
Reciben este nombre por su
mediante conidioesporas se utilizan para
estructura reproductora
Ascomycota Hifas tabicadas que se disponen en producir
características en forma de
cadena en el extremo del alimentos y
saco (ASCA)
conidioforo antibióticos
Reproducción asexual: se
Hongos comestibles, produce mediante
hongos tóxicos, hongos Hifas septadas conidios Agaricomycotina
Basidiomycota
alucinógenos y hongos dicarióticas (setas)
fitopatógenos Reproducción sexual:
plasmogamia
Levaduras

• Son HONGOS UNICELULARES pertenecientes a los ASCOMICETOS

• Son ovales. esféricas o cilindricas
• La mayoria son unicelulares pero algunas pueden formar filamentos (Cándida albicans)
• Se dividen asexualmente por gemación o fisión y algunos géneros presentan un ciclo sexual mediante
conjugación ( Saccharomyces cerevisiae)
• Son tipicos de hábitat con azúcares: frutos, flores. corteza de árboles
• Hay especies simbiontes con animales y también patógenas para el hombre
• Algunas tienen gran importancia a nivel industrial : obtención de vino, cerveza, y alcohol
Hifas
Por su origen las hifas se dividen en dos
1. Hifas verdaderas: son propias de los hongos mohos o filamentosos y se forman a partir de la
germinación de una conidia o espora
2. Pseudohifas: son propias de las levaduras y se forman a partir de germinaciones (blastoconidias) estas
no se desprenden de la célula madre.
Micelio
Por su forma el micelio se clasifica en
1. Filamentoso: propio de los hongos mohos
2. Unicelular: propio de las levaduras.
Pigmentos
De acuerdo a la ausencia o presencia de pigmentos
1. Micelio hialino: es aquel que carece de pigmento. Hongos hialohifimicetos (Aspergillus)
2. Micelio pigmentado: es aquel que posee pigmento del tipo melánico lo presentan los hongos
dematiáceos o fuliginosos (cladosporium) (cromomicosis)
Micotoxinas

• Metabolitos secundarios tóxicos generados por ciertas especies fúngicas que pueden contaminar
alimentos que ingiere el hombre y los animales (Frisvad y Thrane, 1996)
• Producidas a medida que el hongo madura.
• Son moléculas que varían desde simples anillos heterocíclicos hasta grupos de 6 a 8 dispuestos
irregularmente. Relativamente pequeñas → TERMOESTABLES
• No son esenciales para el crecimiento. Posible defensa del hongo
• Son producidas por hongos filamentosos (mohos). No participan los hongos venenosos que
pertenecen a la clase Basidiomicetos (hongos macroscópicos).
• Alteran, además, calidad organoléptica, sabor, aspecto, etc.
• Los principales géneros de hongos productores de toxinas son Aspergillus, Fusarium y Penicillium.
Son organismos ubicuos que ocupan un amplio rango de hábitat compitiendo con otros hongos o
asociados a ellos.
➢ Aspergillus: Aflatoxinas – Ocratoxinas – Esterigmatocistinas
➢ Penicillium: Ocratoxina- Patulina
➢ Fusarium: Tricotecenos – Zearalenona - Fumonisinas
Micotoxicosis primaria

Vegetales → infección fúngica → formación de micotoxinas → consumo por el hombre o animales →

enfermedad
Micotoxicosis secundaria

Vegetales → infección fúngica → formación de micotoxinas → consumo por animales

→ Unión a tejidos → productos cárneos

→ Secreción de leche → productos lácteos
Toxicidad de micotoxinas
 • Las micotoxinas se encuentran en diversos alimentos y piensos y se han con diversas enfermedades
de animales y personas.
• La exposición a micotoxinas puede producir toxicidad tanto aguda como crónica, con resultados que
van desde la muerte a efectos nocivos en los sistemas nervioso central, cardiovascular y respiratorio y
en el aparato digestivo. Las micotoxinas pueden también ser agentes cancerígenos, mutágenos,
teratógenos e inmunodepresores. Actualmente está muy extendida la opinión de que el efecto más
importante de las micotoxinas, particularmente en los países en desarrollo, es la capacidad de algunas
micotoxinas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y, por consiguiente, de reducir la resistencia
a enfermedades infecciosas.
• Clases básicas: Aguda, Crónica, Mutágena y Teratógena.
➢ Aguda : deterioro de las funciones hepática y renal, pudiendo llevar a la muerte. Algunas
micotoxinas perjudican la síntesis de proteínas y generan efectos de hipersensibilidad y
necrosis de la piel hasta inmunodeficiencia grave. También hay neurotoxinas que pueden
generar temblores en animales y en > dosis lesión del cerebro y muerte.
➢ Crónica: los efectos de ingesta en dosis bajas a largo plazo son variados y el más grave es el
cáncer de hígado.
• Algunas toxinas afectan la replicación del ADN y generan efectos mutágenos o teratogénicos.
• Por ser moléculas relativamente pequeñas, generalmente no se detectan por los sistemas inmunes del
hombre. El principal peligro en la dieta reside en la incapacidad de detectarlas biológicamente en el
organismo.
Género Aspergillus

• Contaminan productos almacenados (granos de cereales, oleaginosas, nueces, especias).

• Muy asociados con deterioro de alimentos y otros sustratos en climas cálidos tropicales y
subtropicales.
• Crecen fácilmente con Aw bajos 0,80 / 0,85 (xerófilos).
• Algunas especies se emplean en la elaboración de ingredientes de alimentos en la industria
alimentaria. A. oryzae para el koji y A. niger para fabricar ácido cítrico.
• Recuento buenos se logran con un medio con antibacteriano y con inhibidores adecuados para la
dispersión de la colonia. Se recomienda Agar dicloran rosa de bengala cloranfenicol (DRBC).
• Para la identificación puede ser medio Czapek o agar extracto de malta.
Especies toxicogénicas mas comunes

• A. clavatus Patulina (manzana)

• A. flavus Aflatoxinas B1, B2, G1y G2 (maní, maiz) M1 y M2 al ingerir B1 y B2
• A. ochraceus Ocratoxinas (OTA) / Ácido penicílico (vegetales descomposición)
• A. parasiticus Aflatoxinas (patógeno de insectos y saprófito de vegetales)
• A. versicolor Esterigmatocistina /Acido ciclopiazónico (quesos maduros y carnes curadas; cereales,
café)
Género Penicillium

• Género predominante asociado con el deterioro de alimentos en regiones de climas templados.

Especies psicrótrofas
• Varias especies son xerófilas.
• Usos industriales (quesos y antibióticos)
• A partir de 1929 con la penicilina se buscaron otros compuestos similares, identificándose la patulina,
citrinina y la griseofulvina, determinándose luego como micotoxinas. En la década del 90 se detectan
unos 120 metabolitos de hongos comunes con toxicidad demostrada.
• Actualmente hay una clasificación minuciosa de relaciones especies-micotoxinas (Pitt y Leistner,
1991).
• Recuentos buenos se logran con Agar DRBC
Especies toxicogénicas mas comunes

• P. citrinum Citrinina (Biodeterioro de alimentos, materia vegetal en descomposición).

(Monogástricos. Cereales-Jamón)
• P. cyclopium Ac. Ciclopiazónico/Ac. Penicílico/ Ocratoxina A (Cereales y otros alimentos).
• P. expansum Patulina/Citrinina (Manzana, peras y otras frutas).
• P. roquefortii PR toxina /Roquefortina (Elaboración de queso azul y otros alimentos refrigerados)
• P. verrucosum Ocratoxina /Citrinina /Xantomegnina/Viomelleina (ex viridicatum ) (Cereales y
subproductos).
Ocratoxina

• Cereales y derivados, zumo de frutas, cerveza, vino tinto, uvas y pasas, café, leguminosas, cacao,
derivados de carne de cerdo y aves - Fenilalanina
Género Fusarium

• Contaminación frecuente de precosechas de cereales (trigo y maíz), oleaginosas y leguminosas.

• Asociados con vegetales y a sus requerimientos de alta Aw, contaminan generalmente cultivos antes
de la cosecha.
• Se inhiben con Aw < 0,90.
• Algunas especies pueden crecer y generar toxinas a bajas temperaturas.
• Se conocen al menos 50 tricotecenos. El mas común es la toxina T-2, que es responsable de la ATA.
• Recuentos buenos se logran con Agar papa dextrosa + cloranfenicol y alta Aw. También se usa el
Agar dicloran cloranfenicol peptona.
• Síntomas: Difíciles de catalogar. Vómitos, diarrea, y también necrosis cutánea hemorragia,
degeneración de células nerviosas, etc.

Aflatoxinas

• Toxicidad aguda y crónica

• Carcinogénicas - Mutagénicas -Teratogénicas
• Órgano crítico: hígado - pulmón - riñones
• Límites: 20ug/kg (en alimentos)
Efectos agudos
Fiebre - Ictericia - Ascitis - Degeneración grasa - Necrosis del
parénquima hepático - Cicatrización centrolobulillar - Colestasis
Síntomas de hepatitis infecciosa - Elevada mortandad
Efectos cronicos
Cáncer Hepático Primario: evolución lenta y silenciosa - Pérdida de
peso - Decaimiento - Dolor abdominal - Sensibilidad en zona
hepática – Diagnóstico sobrevida: 4 meses
Visualizacion y confirmacion

• Bajo luz ultra violeta (onda larga: 360nm), B1 B2: manchas azules - G1 G2: manchas verdes.
• Confirmación: Pulverizar con H2SO4 al 25% - Las cuatro aflatoxinas se observan amarillas a la LUV
Alimentos implicados

• Maíz • Alimentos balanceados

• Maní
 • Carnes (fresca, • Cerveza • Zumo de manzana
chacinados y • Cacao • Corteza de quesos
embutidos) • Soja
• Leche • Pan integral
Conservantes anfigúngicos empleados en alimentos

• Ácido sórbico • Ácido benzoico • Dióxido de azufre

• Ácido propiónico • Ésteres del ácido p- • Natamicina
hidroxibenzoico
Hongos resistentes a conservadores

• Penicillium
• Trichoderma
Conservadores químicos

• Conservación: permite el consumo en tiempo y lugar escogido.

• Alteración de un alimento: cuando presenta cambios sustanciales o cualquier tipo de modificaciones que
limitan su aprovechamiento.
• Causas: Fisicoquímica, biológica o microbiológica
• Alteración microbiana: cuando los microorganismos, con su multiplicación y metabolismo, han
modificado de tal manera las características organolépticas de un alimento, que perjudican su valor para
el consumo o impiden prácticamente que sea empleado para el fin que se destinaba.
• Posibilidad de alteración microbiana:
➢ Existencia del sustrato adecuado para el desarrollo microbiano.
➢ Contaminación con la flora microbiana correspondiente.
➢ Condiciones de vida favorables (temperatura, aw, p Redox, pH, atmósfera adecuada)
➢ Tiempo de almacenamiento prolongado.
• El empleo de conservadores químicos es una práctica muy antigua pero, sin embargo, los alimentos
conservados con ellos no son imperecederos, tan sólo se mantienen inalterados por un período de
tiempo limitado pues el crecimiento de los microorganismos se ve retardado pero no inhibido
totalmente. El grado de inhibición final va a depender del tipo de sustancia y de su concentración.
• Como norma general la eficacia de un conservador depende de su concentración en el alimento, es
decir, cuanto mayor sea su nivel, mayor será la muerte celular y más lento su crecimiento. El empleo
de conservadores solo tiene sentido cuando se utiliza en concentraciones suficientes para neutralizar
el crecimiento microbiano, en su fase inicial, nunca en fase exponencial porque en este caso harían
falta cantidades muy elevadas de conservador.

Protoplasma → Enzimas organizadas que permiten el metabolismo → 3 Etapas

1. Membrana: Separa el protoplasma del medio exterior y posee propiedades selectivas.
2. Enzimas: Regulan el metabolismo celular.
3. Mecanismo genético: Regula la reproducción
Los conservadores químicos pueden alterar una o más, de estas etapas, inhibiendo la actividad celular

Tipos de interferencias
Interferencia de membrana

• Se produce todo el transporte selectivo y semipermeable

• La parte mas externa de la célula es altamente activa a los grupos hidrófilos o hidrófobos
• Cloro, sales de amonio cuaternario (productos tensioactivos) ácidos grasos, alcoholes, aldehídos y
fenoles
• Actúan sobre membrana citoplasmática, dependiendo de la tendencia a concentrarse alrededor de la
célula, según grupos hidrófilos o hidrófobos.
Interferencia en la actividad enzimática

• Las enzimas son proteínas con grupos activos unidos con un sustrato molecular. Las interferencias a
través de:
o Precipitación de la proteína
o Bloqueo de grupos activos
• Esto genera inhibición o muerte de los microorganismos por la modificación de alguna de las
propiedades vitales de la célula.
Interferencia en el mecanismo genético

• Los microorganismos poseen cromosomas y dentro de estos, están los genes formados por moléculas
de proteínas.
• Cualquier alteración de estas últimas origina:
o Inhibición
o Mutación
o Muerte
• Interfieren en el mecanismo genético: los rayos UV que producen mutaciones y perdida de capacidad
de síntesis de vitaminas, de igual manera que los rayos X. También interfieren los colorantes básicos
en los nucleótidos.
Conservadores inorgánicos

• NaCL: Su acción se debe:

o Disminuye el Aw del sistema.
o Aumento de la presión osmótica
o Sensibiliza a los microorganismo ante la presencia de CO2 y ácido sórbico
o Disminuye la solubilidad del O2 en el agua.
o Usos: Lácteos, cárnicos, pescado, verduras, etc..
• Nitrato: Su acción se debe:
o Al ácido nitroso y a los óxidos que se forman a partir del el, los cuales se unen al grupo amino
del sistema deshidrogenasa de las células.
o La reacción con hemoproteinas (citocromos) y con –SH de enzimas.
o Usos: Productos cárnicos, salazones, chacinados, etc..
• Cloro:
o Fuerte acción oxidante y rápida combinación con las proteínas. Estas reacciones producen
alteraciones en el metabolismo de los m.o. Su acción se incrementa con el calor. Las esporas
se destruyen 10 veces mas rápidos a 50 °C que a 20 °C, con una misma concentración de
cloro. Se debe añadir en exceso, dada su fácil combinación con materia orgánica.
• H2O2:
o Acción oxidante que ocasiona alteraciones irreversibles en sistemas enzimáticos de la célula.
o Usos: Países tropicales en leche, el residuo se elimina por calor o con enzima catalasa. En
materiales de envasado (tetrapack) se sumerge y luego se calienta a 250 °C.
• Dióxido de azufre:
 o Fuerte acción inhibidora sobre enzimas con grupos SH--. Muy importante el pH del alimento.
Junto con el gas hay tres formas disociadas en equilibrio: Ácido sulfuroso no disociado
(SO3H2), SO3H- y SO32- que actúan según el rango de pH.
o Usos: Jugos de frutas, frutas desecadas, vino, cárnicos.
o El anhídrido sulfuroso es un gas, comercializado en forma líquida a presión.
o Es un aditivo autolimitante en su uso, en el sentido de que por encima de una cierta dosis altera
las características gustativas del producto. Es especialmente eficaz en medio ácido, inhibiendo
bacterias y mohos, y en menor grado, levaduras. Actúa destruyendo la tiamina (vitamina B1),
por lo que no debe usarse en aquellos alimentos que la aporten en una proporción significativa
a la dieta, como es el caso de la carne; sin embargo, protege en cierto grado a la vitamina C.
o Durante el cocinado o procesado industrial de los alimentos el anhídrido sulfuroso y sulfitos se
pierden en parte por evaporación o por combinación con otros componentes. Los límites
legales se expresan siempre en contenido de anhídrido sulfuroso. El anhídrido sulfuroso y los
sulfitos son muy utilizados para la conservación de zumos de uva, mostos y vinos, así como
para la de la sidra y vinagre. También se utiliza como conservante en salsas de mostaza y
especialmente en los derivados de fruta (zumos, etc.) que van a utilizarse como materia prima
para otras industrias, de los que desaparece en su mayor parte durante el procesado posterior.

Conservadores orgánicos
Ácidos y sus sales: (poder germicida y baja de pH)

• Cítrico: Salmueras y enlatados vegetales

• Láctico: Aceitunas y encurtidos
• Acético: panificados, mayonesa y pescados
• Propiónico: harinas
• Ácido benzoico y benzoatos:
o Inhibidor a pH bajo (5) y deja de actuar en la neutralidad por disociarse. Actúa bien sobre
bacterias y levaduras, no así sobre hongos. Se emplea al 0.1 % (1.000 ppm) en jugos de frutas,
conservas y alimentos ácidos. Comunica cierto sabor picante a partir de aprox.. 500 ppm.
• Ácido sórbico y sorbatos:
o Actúa sobre hongos, levaduras y bacterias. Se metaboliza en organismo igual que los ácidos
grasos. Similares características al ácido benzoico. Se usa al 0.1 % en jugos y en gran cantidad
de otros alimentos, con la ventaja de además, a altas concentraciones le sabor extraño en
menor.
• Ácido fórmico:
o Se emplea en jugos en 0.4 % otorgando sabor picante.
• Pirocarbonato de etilo
o Se usa al 0.1 % en jugos coadyuvado por refrigeración. Sabor no agradable.
• Formaldehído:
o Existe en el humo de la madera. Activo frente a hongos, bacterias y levaduras.
• Azucares:
o Aumenta la presión osmótica. Leche condensada, almíbares, mermeladas, frutas escarchadas,
etc..
• Alcoholes:
o Desnaturalizan las proteínas del protoplasma. Mejor uso entre 65 a 70 % como desinfectante y
en alimentos entre el 10 al 20 %.
• Nisina
o La nisina es una proteína con acción antibiótica producida por un microrganismo inofensivo
presente en la leche fresca de forma natural y que interviene en la fabricación de diferentes
 productos lácteos. Solo es eficaz contra algunos tipos de bacterias y se utiliza en casi todo el
mundo como conservante de ciertos tipos de quesos procesados, especialmente los fundidos.
o Sobre todo en oriente medio, se utiliza como conservante de la leche y de otros derivados
lácteos ante los problemas para mantener estos productos siempre en refrigeración. No tiene
aplicaciones médicas como antibiótico, y es por esto por lo que se utiliza en tecnología
alimentaria.
o La nisina ingerida es destruida rápidamente durante la digestión y sus aminoácidos
constituyentes se metabolizan junto con los procedentes de las otras proteínas. Prácticamente
carece de toxicidad o de poder alergénico.
Causas y formas de alteración
Químicas, Físicas y bioquímicas

• Procesos autolíticos pardeamiento enzimático

• Influencia atmosférica, O2, luz, temperatura, humedad, sequedad.
• Factores tecnológicos.
• Medio ambiente productos químicos del entorno, polvo, olor.
Microbiológica

• Acción enzimática de microorganismos con o sin crecimiento de los mismos.

Biológicas

• Desviaciones fisiológicas, huevos embrionados

• Infestaciones parasitarias, ácaros, larvas,moscas, etc..
• Depredadores, ratas, cucarachas, etc..
Acciones
Aspecto /Color

• Decoloraciones
• Madurado anómalo
• Quemadura fría
Consistencia Textura

• Mucus
• Reblandecimiento
• Licuefacción
• Gases.
Olor y sabor

• Putrefacción
• Acidificación
• Rancidez

Las reacciones bioquímicas celulares o las enzimas que las catalizan suelen ser empleadas como criterio
taxonómico para identificar a los microorganismos.
Las reacciones de IMVIC son cuatro pruebas bioquímicas (prueba del indol, prueba del rojo de metilo, prueba
de Voges Proskauer y prueba del citrato) que permiten identificar a Escherichia coli de otros coliformes y
también son parte de las reacciones que se realizan para identificar al resto de las enterobacterias y otros
microorganismos.
Las reacciones se realizan sobre una cepa o colonia aislada pura, a la cual ya se le realizó la tinción de Gram,
a partir de un cultivo puro desarrollado en Agar nutritivo durante 24 h a 37°C (cultivo joven). En el caso de
aplicar las reacciones de IMVIC para identificación de E. coli y otras enterobacterias, la coloración de Gram
debe dar bacilos Gram (-).
Prueba del Indol
La reacción del Indol pone en evidencia a la enzima triptofanasa, que produce la molécula de indol, más ácido
pirúvico y amoníaco a partir del triptófano. Es una desaminación del tipo reductor y se pone en evidencia con
el reactivo de Kovacs. El indol más el aldehído del reactivo produce color rojo debido a la estructura pirrólica
presente en el indol. La capa alcohólica extrae y concentra el complejo rojo.
Procedimiento
1. Sembrar la cepa en Agua de Peptona al 1%, incubar a 37ºC durante 24 a 48 h.
2. Luego agregar 0,5 ml de reactivo de Kovacs para revelar, homogeneizar y dejar descansar unos
minutos.

• Reacción positiva: anillo rojo-cereza.

• Reacción negativa: anillo amarillo del color del reactivo.
Prueba del Rojo de Metilo
La reacción del Rojo de Metilo pone en evidencia la fermentación ácido mixta: es una prueba cualitativa de la
producción de ácido a partir de la fermentación de la glucosa. Se usa el indicador de pH rojo de metilo. Las
enterobacterias fermentan la glucosa; pero algunas producen un pH menor a 4,2, luego de 48 h de
incubación. Estos microorganismos son considerados “fermentación ácido mixta +”, mientras que los
negativos, siguen metabolizando los productos iniciales dando acetoína con un pH mayor a 6.
Procedimiento
1. Sembrar la cepa en Caldo MRVP, incubar no menos de 40 h a 37ºC.
2. Luego agregar 5 gotas del reactivo Rojo de Metilo.
• Reacción positiva: color rojizo.
• Reacción negativa: color del caldo.
Prueba de Voges Proskauer
Voges Proskauer es la reacción donde se detecta la acetoína como producto final neutro derivado del
metabolismo de la glucosa. Tanto la acetoína como el 2,3 butilenglicol son oxidados a diacetilo.
El primer reactivo agregado es el alfa naftol, actúa como intensificador del color; se combina con el compuesto
de tipo guanidina, arginina, de la peptona del medio y con el producto de la reacción del diacetilo. El segundo
reactivo agregado es el hidróxido de potasio al 40% (oxidante) acelera el paso de acetoína a diacetilo.
Procedimiento
1. Sembrar la cepa en Caldo MRVP, incubar no menos de 48 h a 37ºC.
2. Luego adicionar en el siguiente orden:
3. 0,5 ml solución alcohólica de Alfa Naftol al 5%.
4. 0,5 ml solución acuosa de hidróxido de potasio al 40%.
5. Agitar y dejar reposar 15 minutos a 37ºC
• Reacción positiva: anillo rojo-cereza.
• Reacción negativa: color de los reactivos.
Prueba del Citrato
En la reacción del Citrato, se pone en evidencia la enzima citratasa que permite que el microorganismo utilice
el citrato como única fuente de carbono.
El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas. Un
organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono, utiliza también sales de amonio
como su única fuente de nitrógeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoníaco con la siguiente
alcalinidad.
El citrato pasa a oxalacetato y acetato dependiendo de la alcalinidad del medio, esto pasa si el medio es
alcalino, si en cambo el medio es ácido se produce acetoína y lactato.
El azul de bromotimol es el indicador de pH en el medio Agar Citrato de Simmons.
Procedimiento
1. Sembrar la cepa en Agar Citrato de Simmons, incubar 48 h a 37ºC.
• Reacción positiva: desarrollo y viraje de coloración del medio a azul.
• Reacción negativa: el medio queda color verde.

Pruebas con Agar TSI

Se determina la capacidad de un organismo de utilizar un hidrato de carbono (HC) específico (lactosa,
sacarosa y glucosa), con producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido
sulfhídrico, SH2.
En el medio, la concentración de la lactosa y la sacarosa es del 1% y la glucosa al 0,1%. El indicador de pH es
Rojo de Fenol.
Algunos microorganismos fermentan todos los azúcares, otros sólo la glucosa y otros no fermentan ninguno.
La fermentación del HC puede producirse con producción o no de gases (CO2 + H2).
En el pico de la flauta se utilizan los azúcares en forma aerobia y en el fondo del tubo en anaerobiosis. En el
pico de flauta, la glucosa es catabolizada inicialmente por la glucólisis (vía utilizada tanto por aerobios como
anaerobios), para dar CO2 + H2O + energía. En la capa profunda (columna) existen condiciones anaerobias
por lo cual la glucosa es metabolizada también a ácido pirúvico, que después es convertido en diversos
productos finales estables: ácidos orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2 + H2 y energía. Los microorganismos
que fermentan la sacarosa son fermentadores tardíos de la lactosa.
Si al cabo de la incubación, en el tubo se observa el pico de flauta alcalino (rojo) y el fondo ácido (amarillo),
esto es indicador de que el microorganismo sembrado es fermentador de glucosa y no de lactosa, como por
ejemplo las enterobacterias no fermentadoras de lactosa. Si tanto el pico de flauta como la columna se
observan ácidos (amarillo), el microorganismo ha fermentado los tres azúcares, como ocurre con los
coliformes.
Algunas bacterias como por ejemplo los bacilos no entéricos Gram (-), son incapaces de fermentar azúcares,
obtienen los nutrientes de las peptonas del medio. Estas bacterias pueden utilizar la peptona aerobia o
anaeróbicamente. Un microorganismo que da un pico de flauta alcalino y la columna alcalina (rojo/rojo)
degrada las peptonas tanto aerobia como anaeróbicamente. Una reacción de pico de flauta alcalina y sin
cambio en la capa profunda (rojo/ sin cambio) es el resultado de un microorganismo que solo utiliza
aeróbicamente las peptonas.
Además, el medio contiene sales de hierro: si el microorganismo es productor de SH2, este se combina con el
hierro de las sales dando un precipitado de color negro.
Importante: la lectura de los resultados se debe realizar entre las 18-24 horas de incubación.
Procedimiento
1. Sembrar la cepa en Agar TSI. Primero se siembra en la superficie inclinada y, a continuación, por
picadura en la columna de agar e incubar a 35ºC durante 18-24 h.
Resultados:

• La columna y pico de flauta amarillo

• La columna amarilla y pico de flauta rojo
• La columna y la estría roja o estría roja y columna sin variación.
• Presencia o no de gases.
• Precipitado negro por formación de SH2.
Pruebas con Agar LIA
Permite observar la capacidad de un microorganismo para decarboxilar la lisina por medio de la enzima lisina-
decarboxilasa (LD).
Esta enzima es formada por microorganismos sólo en medio ácido en presencia de un sustrato específico, y
los productos de la decarboxilación provocan una desviación del pH hacia la alcalinidad.
La lisina sufre la decarboxilación para dar cadaverina (diamina) y CO2 por acción de la lisina- decarboxilasa.
La cadaverina es estable en condiciones de anaerobiosis.
El agar LIA posee glucosa al 0,1%, lisina, el indicador de pH púrpura de bromocresol y sales de hierro.
Si el microorganismo es lisina-decarboxilasa positivo, el tubo dará todo alcalino (púrpura), debido a que en la
columna se produce la fermentación de la glucosa, por lo tanto el medio se vuelve ácido y puede actuar la
lisina-decarboxilasa; mientras que en el pico de flauta, la glucosa al encontrarse en una baja proporción (la
lectura se realiza entre las 18-24 h) es consumida y el microorganismo comienza a utilizar las peptonas.
Los microorganismos LD-negativos, pero fermentadores de glucosa, producen un viraje al ácido (amarillo) en
la columna y en el pico de flauta se produce alcalinidad (púrpura). Las cepas del grupo Proteus-Providencia
desaminan la lisina a ácido alfa-cetocarbónico. Esto último forma compuestos pardo-rojizos en la región
superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y la baja influencia del O2.
Además, el medio contiene sales de hierro: si el microorganismo es productor de SH2, este se combina con el
hierro de las sales dando un precipitado de color negro.
Importante: la lectura de los resultados se debe realizar entre las 18-24 horas de incubación.
Procedimiento
1. Sembrar la cepa en Agar LIA. Primero se siembra en la superficie inclinada y, a continuación, por
picadura en la columna de agar e incubar a 35ºC durante 18-24 h.
• Reacción positiva:
o El medio permanece de color púrpura en estría y columna.
• Reacción negativa:
o Amarillo en la columna y la estría púrpura.
o Violeta en la columna y la estría pardo-rojiza.
Prueba de la Coagulasa
El objetivo de esta prueba es comprobar la presencia de la enzima coagulasa. Es una enzima termoestable
que resiste 80ºC durante 30 minutos. Esta enzima interviene en la coagulación del plasma formando un
coágulo de fibrina. Es un activador para convertir el fibrinógeno en fibrina. La coagulasa está presente en dos
formas: ligada a la célula y la coagulasa libre. Ambas se detectan en la reacción.
Esta prueba es el diagnóstico final para la identificación de Staphylococcus. Es el índice de patogenicidad.
Procedimiento
1. Sembrar 0,5 ml de un cultivo en Caldo Cerebro Corazón (BHI) de 18 a 24 h de incubación, con 0,5 ml
de plasma EDTA reconstituido. Hacer girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del
microorganismo, no agitar.
2. Incubar en baño de agua a 37ºC durante 4 h, observando cada 30 minutos, si se produce el coagulo.
3. No agitar ni sacudir el tubo.
• Reacción positiva: formación del coagulo. Si al cabo de 4 h no hay formación del mismo, colocar a
temperatura ambiente durante 24 h más.
• Reacción negativa: no hay formación del coagulo.
Prueba de la Catalasa
El objetivo de esta prueba es comprobar la presencia de la enzima catalasa.
La enzima catalasa se encuentra en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas.
Procedimiento
1. Con un ansa tomar una porción de la cepa y colocar sobre un portaobjeto de vidrio limpio. Agregar una
sola gota de H2O2 al 30% sobre el organismo del portaobjetos.
• Resultado positivo: inmediata formación de burbujas (liberación de gas).
• Resultado negativo: no formación de burbujas.
Prueba de la Oxidasa
El objetivo de esta prueba es determinar la presencia de las enzimas oxidasas.
La reacción de oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del
citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la etapa
terminal del sistema de transferencia de electrones.
Procedimiento
1. Se utilizan tiras impregnadas con reactivo para la prueba de la oxidasa. Extender con un ansa una
porción de la cepa sobre la tira.
2. Observar el resultado a los pocos segundos.
• Resultado positivos: hay reacción colorimétrica.
• Resultado negativo: no hay reacción colorimétrica.

Vogues
Características Indol Rojo de Metilo Citrato
Proeskauer
Pone en evidencia Pone en evidencia la Se detecta la Se pone en
a la enzima fermentación ácido acetoína como evidencia la enzima
triptofanasa, que mixta: es una prueba producto final citratasa que
produce la cualitativa de la neutro derivado permite que el
molécula de indol, producción de ácido a del metabolismo microorganismo
más ácido pirúvico partir de la fermentación de la glucosa. utilice el citrato
y amoníaco a partir de la glucosa. Se usa el Tanto la acetoína como única fuente
Fundamentos del triptófano. Es indicador de pH rojo de como el 2,3 de carbono.
Bioquímicos una desaminación metilo. Las butilenglicol son El medio utilizado
del tipo reductor y enterobacterias oxidados a para la fermentación
se pone en fermentan la glucosa; diacetilo. del citrato contiene
evidencia con el pero algunas producen El primer reactivo también sales de
reactivo de Kovacs. un pH menor a 4,2, agregado es el amonio inorgánicas.
El indol más el luego de 48 h de alfa naftol, actúa Un organismo que
aldehído del incubación. Estos como es capaz de utilizar
reactivo produce microorganismos son intensificador del citrato como su
 color rojo debido a considerados color; se combina única fuente de
la estructura “fermentación ácido con el compuesto carbono, utiliza
pirrólica presente mixta +”, mientras que de tipo guanidina, también sales de
en el indol. La capa los negativos, siguen arginina, de la amonio como su
alcohólica extrae y metabolizando los peptona del única fuente de
concentra el productos iniciales medio y con el nitrógeno. Las sales
complejo rojo dando acetoína con un producto de la de amonio se
pH mayor a 6. reacción del desdoblan en
diacetilo. El amoníaco con la
segundo reactivo siguiente
agregado es el alcalinidad.
hidróxido de El citrato pasa a
potasio al 40% oxalacetato y
(oxidante) acetato
acelera el paso dependiendo de la
de acetoína a alcalinidad del
diacetilo. medio, esto pasa si
el medio es alcalino,
si en cambio el
medio es ácido se
produce acetoína y
lactato.
El azul de
bromotimol es el
indicador de pH en
el medio Agar
Citrato de Simmons
Comprobar que el Comprobar que el Determinar si un Determinar si un
microorganismo microorganismo microorganismo microorganismo
problema posee la problema metaboliza los problema utiliza problema utiliza el
Objetivo
enzima hidratos de carbono por la glucosa por la carbono del citrato
triptofanasa. la vía ácido-mixta vía como fuente de
butilénglicólica. carbono
Agua de Peptona al Caldo MRVP Caldo MRVP Agar Citrato de
Medio de cultivo
1% Simmons
Temperatura y 37ºC durante 24 a Incubar no menos de 40 Incubar no Incubar 48 h a 37ºC
tiempo de 48 h h a 37ºC menos de 48 h a
incubación 37ºC
Reactivo de Kovacs Reactivo Rojo de Metilo Solución
alcohólica de Alfa
Naftol al 5%
Reactivos
Solución acuosa
de hidróxido de
potasio al 40%
Reacción positiva: Reacción positiva: color Reacción Reacción positiva:
anillo rojo-cereza. rojizo. positiva: anillo desarrollo y viraje
Reacción negativa: Reacción negativa: color rojo-cereza. de coloración del
resultados anillo amarillo del del caldo. Reacción medio a azul.
esperados color del reactivo. negativa: color de Reacción negativa:
los reactivos. el medio queda
color verde.

Microorganismos E. Coli: + E. Coli: + Serratia spp: + Salmonella spp: +

control + y - Salmonella spp: - Serratia spp: - E. Coli: - E. Coli: -