Leishmania
Leishmania
INFORME DE PRÁCTICA
TÍTULO DE LA UNIDAD
HEMOPARÁSITOS
TEMA DE LA PRÁCTICA LEISHMANIA
Aplicar adecuadamente la metodología para la toma de muestra
OBJETIVO GENERAL
para la investigación de leishmania.
OBJETIVOS ESPECÌFICOS:
Aplicar la técnica de raspado para investigación de leishmania.
Recopilar información de los métodos y tratamientos acerca de leishmania.
FUNDAMENTO TEÓRICO:
Sensibilidad
Sensibilidad variable depende de:
Experiencia del técnico.
Especies del parásito.
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Tejido de donde proviene la muestra.
Técnica usada para toma y procesamiento.
Tiempo de evolución lesiones, contaminación.
Tratamientos previos.
Pruebas Directas
Frotis O Examen Directo
Principio: El objetivo es visualizar las formas amastigotes de Leishmania, en frotis de lesiones de LC y LM
(raspado y biopsias) y aspirados de médula ósea, ganglio o bazo para LVA, coloreadas con tinción de
Giemsa.
Procedimiento para lesiones cutáneas:
1. Limpiar en forma cuidadosa, con un trozo de algodón embebido en etanol al 70%, el borde
indurado, sano y eritematoso de la lesión, en donde se realizará la toma de muestra.
2. Presionar esta zona, apretándola entre el dedo índice y el pulgar, hasta conseguir la isquemia.
3. Efectuar un raspado con bisturí en el borde interno o en el centro de la úlcera o proceder mediante
un corte con bisturí, de 1 a 2 mm de profundidad por 2 a 3 cm de largo (el corte no debe sangrar).
4. Recoger el tejido y líquido que exuda y colocarlo en tres láminas portaobjetos y en cada lámina tres
muestras. Dejar secar espontáneamente.
5. Una vez secas las láminas, fijar con alcohol absoluto o metanol y dejar secar espontáneamente.
6. Rotular la lámina con el nombre del paciente y la fecha.
7. Colocar las láminas en una caja porta láminas, a fin de evitar que se rompan (4)
Recomendaciones:
Seleccionar la lesión que tenga menos tiempo de evolución con bordes bien indurados que indican que la
lesión está activa. Lo ideal es que la lesión esté libre de sobre-infección bacteriana. Si se observa
sobreinfección bacteriana en la lesión se debe informar al médico para el uso de antibióticos y realizar la
toma de muestra para frotis cuando la lesión esté libre de sobreinfección bacteriana una vez que el paciente
terminó el tratamiento con antibióticos. Hacer un total de tres láminas con frotis por pacientes con tres
impresiones por lámina portaobjeto de 8 a 10 mm de diámetro aproximadamente cada impresión.
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Toma de muestra de biopsia de mucosa: Para la toma de biopsia de mucosa se recomienda que sea
realizado por un médico especializado (otorrinolaringólogo) porque se necesita contar con un equipo
médico muy especial como el rinoscopio. Una vez realizado la toma de muestra (biopsia) se recomienda
enviar lo más pronto posible al patólogo, para su procesamiento.
Reporte de resultados
Positivo: Se observa amastigotes de Leishmania sp., en la muestra examinada.
Sugestiva: Se observan cambios inflamatorios, granulomatosis crónica, que sugieren la infección, pero
no la confirma por la ausencia del parásito en la preparación examinada.
Negativo: No se observan amastigotes de Leishmania sp., en la muestra examinada. Ni cambios
compatibles con reacción granulomatosa crónica.
Importante: Los resultados positivos deben ser informados inmediatamente al Servicio de Vigilancia o
al Programa local de Leishmaniasis.
Cultivo
Principio: El objetivo es la observación de formas promastigotes de Leishmania que se desarrollan a partir
de muestras provenientes de pacientes sospechosos de leishmaniasis, en el medio de cultivo NNN.
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Generalidades
Procedimiento costoso, requiere de tiempo para reporte del resultado (cinco días a un mes).
Sensibilidad alrededor 70%.
Medios más usados: NNN, Senekjie, Schneider, RMPI, otros.
Utilidad: en diagnóstico, caracterización de la cepa, investigación.
Muestras usadas: aspirado de lesión y biopsia.
Los riesgos de la punción de médula ósea son muy raros, en el caso de la punción del esternón se podría
traspasar el hueso y alcanzar los vasos sanguíneos importante detrás del mismo (si la punción es en el
manubrio del esternón, el riesgo es menor); en el caso de la cresta iliaca el riesgo es alcanzar alguna porción
del intestino; además existen riesgos de producir osteomielitis, hematomas, abscesos subcutáneos y
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fracturas.
Envío de las Muestras: Los frotis secos deben ser remitidos al laboratorio de referencia lo antes posible,
para su análisis parasitológico.
Interpretación: Se considera positiva a toda muestra que presenta al menos una forma amastigote de
Leishmania en por lo menos 2000 campos observados, utilizando el objetivo de 100 aumentos en el
microscopio óptico.
Un resultado positivo por frotis, realizado por un profesional capacitado, confirma un caso de leishmaniasis.
Reacción En Cadena De La Polimerasa
Principio: La PCR se fundamenta en la reacción específica de un fragmento conocido de ADN del parásito
(o “sonda”), con el ADN extraído de una muestra biológica, en la cual se desea averiguar la presencia del
agente; y la posterior producción de varias copias del ADN de dicho agente (amplificación), contenido en la
muestra, por intermedio de una ADN-polimerasa.
Pruebas Indirectas:
Los métodos indirectos detectan en el organismo anticuerpos principalmente del tipo IgG, específicos contra
Leishmania. Esto se realiza mediante pruebas serológicas, o través de la evaluación de la respuesta celular
con la prueba cutánea de hipersensibilidad retardada, más conocida como prueba de *Montenegro o
leishmanina.
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Para Leishmaniasis
Principio: La IFI es un método utilizado para todos los tipos de leishmaniasis, para detectar y medir los
anticuerpos (inmunidad humoral), en contra de antígenos de Leishmania sp., por medio de una reacción in
vitro, que utiliza como antígenos a formas promastigotes de Leishmania sp. Obtenidas de cultivo axénicos.
En el método se utiliza un microscopio con luz ultravioleta que incide sobre la reacción serológica, en una
lámina portaobjetos, interpretándose como positivas las muestras que emiten fluorescencia.
Toma de muestra: Para la realización de la prueba serológica por IFI, se debe obtener sangre venosa. La
sangre extraída debe ser centrifugada y el suero sanguíneo debe ser separado lo antes posible (no más de
una hora) en un recipiente limpio y seco, con tapa, con la correcta identificación del paciente. Los sueros así
separados se pueden refrigerar (2 a 8º C) o congelar (-10 a -20º C) hasta su procesamiento o su envío al
laboratorio de referencia. El envío de las muestras al laboratorio de referencia debe ser realizado en una
conservadora con suficiente material refrigerante, a fin de evitar la desnaturalización de la misma.
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Tratamiento
Antimoniales Pentavalentes.
Anfotericina B.
Pentamidina.
Aminosidina.
Miltefosina.
Alopurinol.
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipos Materiales Reactivos
Microscopio Normas de bioseguridad como el gorro, guantes, Reactivo de
mascarilla, gafas, mandil. Wright, giemsa
Kit de extracción sanguínea aceite de
Algodón inmersión
Alcohol
Gradillas,
tubos de ensayo,
placas portaobjetos
bisturí
PROCEDIMIENTO / TÉCNICA
TECNICA
RASPADO DE PIEL
1. Limpiar en forma cuidadosa, con un trozo de algodón embebido en etanol al 70%, el borde
indurado, sano y eritematoso de la lesión, en donde se realizará la toma de muestra.
2. Presionar esta zona, apretándola entre el dedo índice y el pulgar, hasta conseguir la isquemia.
3. Efectuar un raspado con bisturí en el borde interno o en el centro de la úlcera o proceder mediante
un corte con bisturí, de 1 a 2 mm de profundidad por 2 a 3 cm de largo (el corte no debe sangrar).
4. Recoger el tejido y líquido que exuda y colocarlo en tres láminas portaobjetos y en cada lámina tres
muestras. Dejar secar espontáneamente.
5. Una vez secas las láminas, fijar con alcohol absoluto o metanol y dejar secar espontáneamente.
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6. Rotular la lámina con el nombre del paciente y la fecha.
7. Colocar las láminas en una caja porta láminas, a fin de evitar que se rompan
GOTA GRUESA:
1. Limpiar con alcohol el dedo medio de la mano
2. Puncionar con lanceta o aguja el borde lateral del dedo más debajo de la uña
3. Limpiar la primera gota con gasa o alcohol seco
4. Presionar para obtener una nueva gota de sangre
5. Recoger la gota de sangre con un porta-objetos (2 o 3 gotas)
6. Distribuir la sangre con la punta de otra porta objetos formando un rectángulo llegar hasta los bordes
7. Recoger otra gota con la punta del porta-objetos
8. Hacer otro rectángulo por debajo del anterior
9. Limpiar el sitio sangrante
10. Dejar secar la sangre y colorear con Wright o Giemsa
11. Observar al microscopio.
Extendido :
Pasos 1 al 5 igual al anterior
6. Se realiza un frotis o extendido de la sangre de la misma forma como se hace para los diferentes
estudios hematológicos
7. Recoger otra gota de sangre y hacer otro extendido
8. Limpiar el sitio sangrante
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9. Dejar secar el frotis
10. Colorear con Wright o Giemsa
Tinción giemsa
Colocamos la gota gruesa en la gradilla de tinción, en posición horizontal.
Para fijar la muestra cubrimos el porta con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al
aire.
Se cubre el portaobjetos con el colorante Giemsa, dejándolo actuar de 10-15 minutos.
Escurrimos y lavamos con agua destilada y se deja secar. Posteriormente se le coloca una gota de aceite
de inmersión y se observa al microscopio.
Tinción Wright
Teñir el frotis con colorante Wright por 3 minutos
Sin tirar el colorante, añadir agua destilada por dejarlo reposar por 1 minutos
Realizar la técnica del espejo
Enjuagar con abundante agua destilada y observar al microscopio.
RESULTADO (Gráficos, cálculos, etc.)
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OBSERVACIONES
GLOSARIO
1. VECTOR
Es cualquier agente (persona, animal o microorganismo) que transporta y transmite un patógeno a otro
organismo vivo
2. PROTOZOO
Grupo de animales eucariotas formados por una sola célula, o por una colonia de células iguales entre
sí, sin diferenciación de tejidos y que vive en medios acuosos o en líquidos internos de organismos
superiores.
3. LA TINCIÓN DE FIELD
Colorantes A y B de Field sirve tanto para la gota gruesa como para el frotis. Debido a su rapidez y
sencillez, es la preferida por los laboratorios de los hospitales tropicales que analizan gran número de
muestras. Sin embargo, no siempre permite observar el punteado de Schüffner presente en P. vivax y P.
ovale.
4. ACNEIFORME
Afección de la piel por la que se producen bultos pequeños sobresalientes parecidos al acné, que a
menudo surgen en la cara, el cuero cabelludo, el pecho y la parte superior de la espalda.
5. HOMÓLOGA
Que es semejante a otra cosa por tener en común con ella características referidas a su naturaleza,
función o clase.
6. EL MÉTODO DE LEISHMAN
Incluye metanol por lo que sólo puede utilizarse para el frotis.
7. EL SISTEMA DE QBC
(Quantitative Buffy Coat System, Becton Dickinson) se basa en la concentración por gradiente de
densidad de los eritrocitos parasitados mediante la centrifugación de un capilar impregnado de heparina
y naranja de acridina, al que se añade un flotador
8. LA METACICLOGÉNESIS
Es un proceso que experimentan naturalmente los promastigotes de Leishmania en el tracto digestivo
del insecto vector y cuya finalidad es transformar los promastigotes en formas altamente infectivas y
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capaces de sobrevivir en el hospedero vertebrado, donde es sometido a los ataques por parte del sistema
inmune. (5)
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
Utilizar todas las medidas de prevención para manipular los materiales, con el correcto uso de las
normas de bioseguridad como: gorro, guantes, mascarilla, mandil para evitar accidentes.
Realizar paso a paso todos los procedimientos para obtener una buena lectura de la muestra a través
del microscopio.
Realizar una correcta tinción respetando los tiempos adecuados.
Al concluir la práctica dejar limpios todos los instrumentos del laboratorio.
Bibliografía
1. Pndcdl. L. Diagnóstico Y Tratamiento De Las Leishmaniosis. Paraguay: Viceministerio De Salud Pública,.
Ministerio De Salud Pública Y Bienestar Social. 2011.