DNA POLIMÓRFICO AMPLIFICADO AL AZAR (RAPD)

Andrés Felipe POLO-ÁLVAREZ1

1Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Básicas. Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

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RESUMEN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una novedad técnica que permite la síntesis in
vitro de millones de copias de un segmento específico del ADN. Su alta especificidad y
sensibilidad han hecho de esta sencilla, pero ingeniosa metodología una herramienta que ha
evolucionado el análisis y la manipulación del material genético. Actualmente la aplicación
de artículos científicos donde se refiere la utilización de esta técnica es exponencial, por ello
se hace esta revisión con el objetivo de informar al lector sobre los principios de este
procedimiento, los requerimientos de laboratorio para su realización, sus posibles
aplicaciones y sus ventajas. En este laboratorio se nos mostró la manera cómo implementar
esta técnica en laboratorio.

Palabras claves: ADN, replicación.

ABSTRACT
The Polymerase Chain Reaction is a technical novelty that allows the in vitro synthesis of
millions of copies of a specific segment of DNA. Its high specificity and sensitivity have
made this simple, but ingenious methodology a tool that has evolved the analysis and
manipulation of genetic material. Currently, the application of scientific articles that refer to
the use of this technique is exponential, so this review is done in order to inform the reader
about the principles of this procedure, the laboratory requirements for its implementation, its
possible applications and its advantage. In this laboratory we were shown how to implement
this technique in the laboratory.
Keywords: DNA, replication.
INTRODUCCIÓN desarrollado independientemente por 2
grupos en 1990 (Welsh & McLelland
El método de ADN polimórficos
1990, Williams et al. 1990). Eso
amplificados al azar. (RAPDs) fue
Originalmente fue visto como un método

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para biotipos de bacterias. Sin embargo, alguno de los fragmentos y producir un
fue rápidamente reconocido como útil para patrón multibanda diferencial entre ambos
estudios de población y ha sido empleado individuos. También las inserciones y
con éxito como tal (Caetano-Anolles et al. deleciones entre sitios de unión del
1991, Chapco et al. 1992). RAPDs es una cebador resultan en la amplificación de
adaptación de la reacción de la cadena de fragmentos de tamaño diferencial. Los
la polimerasa (PCR) (Innis et al., 1990). marcadores RAPD se utilizaron por
Cuando amplificamos por PCR un primera vez en 1990, en varios organismos
fragmento de ADN específico solemos (humanos, distintas especies vegetales y
emplear dos cebadores distintos, de microorganismos) (Williams, J.C et al.
secuencia complementaria a sus dos 1990).
extremos, lo que implica el conocimiento
METODOLOGÍA
previo de la secuencia a amplificar. Los
marcadores RAPD se basan en una En un tubo de eppendorf de 1.5 mL se
sencilla estrategia que permite obviar este adicionaron los reactivos agua bd estéril,
requerimiento. En la PCR se emplea un buffer, MgCl2, Dntp´, BSA, primer, taq
único cebador, corto y de secuencia polimerasa, esto para formar un coctel,
arbitraria. Se utilizan ciclos de hibridación luego se agregó el coctel a cada una de las
del cebador a baja temperatura para muestras, en tubos para PCR, en cada tubo
amplificar un conjunto de fragmentos se agregó 15um, luego a cada uno de estos
genómicos. Tras la amplificación, los se le agrego ADN. Ya por último se
fragmentos se separan por su tamaño tomaron los tubos en el termociclador el
mediante electroforesis en gel. De esta cual se programó, según las indicaciones
forma, en cada PCR se amplifica un del profesor
conjunto de fragmentos distribuidos
RESULTADOS Y ANÁLISIS
aleatoriamente por el genoma del
individuo analizado. Todos ellos. Tienen Actualmente sabemos que la misión de la
en común que se encuentran flanqueados PCR es copiar millones de veces una
por la secuencia del cebador empleado, en secuencia específica de ADN blanco
orientación directa y reversa- mediante una poderosa catálisis llevada a
complementaria, respectivamente. cabo por una enzima conocida como ADN
polimerasa, de tal manera que cantidades
La separación mediante electroforesis en
pequeñas de ADN pueden ser sintetizadas
gel de los fragmentos amplificados genera
y copiadas fielmente para analizarse con
un patrón multibanda, característico de
diferentes fines. El desarrollo de esta
cada uno de los individuos analizados. Si
técnica permitió estudiar y manipular
entre dos individuos existe polimorfismo,
mejor al ADN, facilitando el
es decir variación en la secuencia, en
establecimiento de protocolos
alguna de las zonas de unión del cebador
experimentales en biología molecular
empleado, este polimorfismo puede
(Ibarra et al. 2013). El objetivo de la
resultar en un fallo de amplificación de
práctica de PCR se realizó principalmente

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para conocer e identificar el paso a paso partir de una o unas cuantas copias de la
del protocolo que se realizó, conocer de región blanco.
mejor forma la eficiencia, la precisión de
Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR
las medidas, los cálculos a realizar a la
se puede secuenciar, visualizar
hora de hacer el proceso de preparación del
por electroforesis en gel o clonar en un
coctel de reactivo y poder realizar la PCR.
plásmido para otros experimentos (Reece
El termociclador brinda tres pasos básicos
et al. 2011).
para lograr esta amplificación:
CONCLUSIÓN
-Desnaturalización: En esta etapa, las
cadenas de ADN son calentadas y La PCR o Reacción en cadena de la
separadas a una temperatura de 95 °C Polimerasa genera a partir de un único
durante 20-30 segundos; el tiempo fragmento de DNA un gran número de
depende de la secuencia del templado copias de ella misma. Es importante tener
en cuenta que cuando se vaya a utilizar
-Templado: En esta etapa, los primers se
PCR la secuencia de oligonucleótidos que
alinean al extremo 3’ del templado
se usará como cebador es uno de los
previamente separado e hibridan con su
parámetros más importantes debido a su
secuencia complementaria. Para que se
alta sensibilidad y a que puede ser muy
forme el complejo templado-primers, es
susceptible a contaminarse, por eso es
importante que la temperatura de
importante tener un ADN de control
hibridación o temperatura melting (Tm)
negativo para controlar esta variable, se
sea la óptima; ésta generalmente oscila
deben separar las áreas de las muestras pre
entre 50-60 °C.
PCR, los productos de la reacción post
-Extensión: En esta etapa, la Taq PCR, las soluciones y esterilizar los
polimerasa actúa sobre el complejo materiales. Por otro lado, también es
templado-primers y empieza su función importante el uso de los materiales como
catalítica a una velocidad muy rápida; las micropipetas, para así tener una mayor
agrega dNTP’s complementarios para exactitud para conseguir mejores
crear las cadenas completas de ADN. La resultados
extensión de las cadenas es en dirección de
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La
temperatura óptima para la reacción es de Williams, J.C; Kubelik, A.R; Livak, K.J;
72 °C, ya que a esa temperatura la enzima Rafalski', J.A; Tingey1, S.V. (1990). DNA
es funcional (Ibarra et al. 2013). polymorphisms amplified by arbitrary
primers are useful as genetic markers
Este ciclo se repite 25-35 veces en una
Nucleic Acids Research, 18, 22↑
reacción de PCR típica, que generalmente
tarda 2-4 horas, según la longitud de la Caetano-Anolles, G., Bassam, G. J.,
región de ADN que se copia. Si la reacción Gresshof, P M. (1991). IHigh resolution
es eficiente (funciona bien), puede DNA amplification fingerprinting uslng
producir miles de millones de copias a

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very short arbitrary oligonucleotide
primers. Biotechnol. 9: 553-55
Chapco, W., Ashton, N. W. Martel, R. K.
B., Antonishyn, N. (1992). A feasibil~ty
study of the use of random amplified
polymorphic DNA in the population
genetlcs and systematics of grasshoppers.
Genome 35: 569-574
Innis, '&l. A., Gelfland, D. H., Sninsky, J.
J., LYhite, T. J. (1990). PCR protocols. a
guide to practical appllcat~ons. Academ.ic
Press, Inc., New Yor
Anexo. Termocliclador.
Ibarra et al. 2013. Fundamentos de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y de la PCR en tiempo real [ARCHIVO
PDF]. Recuperado de
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis
/ir-2013/ir132d.pdf
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L.,
Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y
Jackson, R. B. (2011). Forensic evidence
and genetic profiles (Evidencia forense y
perfiles genéticos). (10° ed., págs. 430-
431). San Francisco, CA: Pearson.
Anexo 1. Cuadro de información de la preparación del
coctel de reactivo para PCR.
ANEXOS

Anexo1. Tubo control más 4 tubos de PCR.

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