Química Biológica

2023 FCM
Módulo molecular

Lic. Tomás Peralta

Dr. Luis Cuniberti
Estudios de diagnóstico molecular
• Enfermedades hereditarias
 Reacción de polimerasa en cadena (PCR)
FUNDAMENTO
• La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una reacción enzimática in vitro que permite la amplificación de una
secuencia específica de DNA durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.

• La reacción aprovecha la actividad enzimática de la enzima DNA polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar DNA
en las células.

• Esta enzima debe resistir a las altas temperaturas a las cuales se llevan las reacciones de amplificación durante los
diferentes ciclos de la PCR, por lo tanto, se utiliza una enzima proveniente de la bacteria Thermus aquaticus cuya
temperatura óptima de funcionamiento varía entre los 79º y 85º C.
REACTIVOS

• Esta reacción requiere la participación de:

• DNA molde,
• Enzima polimerasa,
• Primers específicos,
• dNTPs (desoxirribonucleótidos tri-fosfatados),
• Ion magnesio (Mg+2),
• Solución buffer, y
• H2O.
CICLOS DE LA PCR

Una PCR consta de 3 ciclos:

1. Desnaturalización

2. Hibridación

3. Extensión
DESNATURALIZACIÓN

• Durante esta etapa las cadenas de DNA se calientan y se separan a una temperatura de 95ºC durante 20

a 30 segundos, este tiempo depende de la secuencia de templado, esto se debe a la cantidad de G-C en

la cadena molde.

• Cuanto más alta sea la proporción de G-C mayor tiempo se necesitará para romper estas uniones y como

consecuencia para separar las cadenas de DNA.

• Esta dependencia de la proporción de G-C se debe al tipo de enlace que estas bases nitrogenadas

poseen. Además de esto, el tiempo de esta esta etapa depende de la velocidad con la que el

termociclador aumenta la temperatura.

• Al finalizar esta fase se obtienen las cadenas separadas que sirven como templado para el siguiente paso.
HIBRIDACIÓN
Los primers se alinean al extremo 3’ del templado e hibridan con su secuencia complementaria.

• Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o

temperatura de melting (Tm) sea la óptima.

• La Tm oscila entre los 50º a 60º C. Si el diseño del primer es el correcto y la temperatura es adecuada, la
estabilidad y la especificidad del complejo será eficiente.
EXTENSIÓN
• En esta fase la Taq-polimerasa actúa sobre el complejo templado-primer y empieza su función catalítica a una

velocidad muy rápida; agrega dNTPs complementarios para crear las cadenas completas de DNA.

• La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis de DNA, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima

para la reacción es de 72º C.

• Al final del ciclo se forman los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb)

que deberá ser conocido por el investigador.

• En una PCR común los ciclos de repiten entre 25 a 30 veces y generalmente lleva de 2 a 4 horas dependiendo

de la longitud de la cadena de DNA a copiar.

• Luego de cada ciclo se obtiene un número de copias de DNA equivalente al doble del ciclo anterior, lo cual se

ve evidenciado en el crecimiento exponencial de las copias de DNA obtenidas.

VISUALIZACIÓN DE LOS AMPLICONES
• Al finalizar la PCR los amplicónes son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa. El porcentaje al

que se prepara el gel de agarosa varía entre el 1,2 al 3%.

• Al gel también se le agrega bromuro de etidio, el cual es una molécula intercalante capaz de unirse al DNA de doble

cadena. Al ser excitado por luz UV el bromuro de etidio emite una señal que permite la visualización de los amplicónes

en forma de bandas.

• Junto con los amplicónes se corre un marcador molecular que contiene un número de segmentos de DNA conocidos, lo

cual permite la identificación de los amplicónes y si su tamaño es el esperado o no.

• El tamaño del amplicón está dado por el número de pares de bases del mismo. Una vez que se termina la corrida

electroforética, el gel se expone a luz UV.

VIDEO PCR: https://www.youtube.com/watch?v=matsiHSuoOw

 Enzimas de restricción

VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=GJrAsW41a64
Diagnóstico de enfermedades Monogénicas
 Restriction fragment length polymorphism
(RFLP)

VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=n2bVFcJP-HY
RFLP en la práctica. Enfermedad arterial
RFLP para MTHFR
HinfI
Introducción a PCR cuantitativa (qPCR)

Video: https://www.youtube.com/watch?v=1kvy17ugI4w
Diagnóstico de infección viral

VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4
Introducción a secuenciación. Sanger automatizado

VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=wdS3j0TgbjM
 Next Generation
Sequencing (NGS).
Illumina

VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
Introducción a secuenciación

Cantidad de publicaciones con RNA-Seq

Diagnóstico de enfermedades Poligénicas
Hipercolesterolemia Familiar
Dutch Lipid Clinic Network (DLCN) score
PSKC9
Reporte de variantes
 Variants of uncertain significance (VUS) are an aspect of genetic testing that is often seen as a challenge.
How do I explain this result to my patient? Does this result change how I manage a patient?

The classification of genetic variants, based on the ACMG guidelines, is usually a five-tiered scheme which
describes the quantity and quality of evidence needed to classify the variant as pathogenic, likely pathogenic, a
variant of uncertain significance (VUS), likely benign, or benign. If the classification of the variant is as a VUS,
it means that, at the time of interpretation, there was not sufficient evidence to determine if the variant is related
to disease or not.
If the variant has been reported in individuals who are affected with disease, but the variant is also seen in a large
number of healthy control individuals, it is often difficult to determine whether this represents reduced penetrance of
the variant or if the variant is a common benign variant that has been identified in clinical genetic testing and is being
falsely attributed to a phenotype

“According to the ACMG guidelines, a VUS should not be used in clinical decision-making. If a patient is identified to
have a VUS, all clinical decisions should be based on personal and family history and not on the presence of the VUS,”
Diagnóstico de enfermedades Poligénicas
 Hipercolesterolemia Familiar

Predicción de patogenicidad de las mutaciones de LDLR Prueba funcional in-vitro de las diferentes
utilizando herramientas bioinformáticas. mutaciones de LDLR.
 Knockout del receptor WT-LDLR en línea
celular con CRISPR-Cas9
Estructura del Sistema CRISPR-Cas9

CRISPR: Repeticiones palindrómicas cortas

agrupadas y regularmente interespaciadas.

sgRNA: single guide RNA.

Mutagénesis dirigida para generar variantes
de patogenicidad incierta (VUS)
 Mutagénesis dirigida. Diseño experimental
Plásmido metilado con inserto expression vector pLDLR-2 (American Type Culture Collection, Manassas,
VA, USA)
del gen LDLR

6 plásmidos
con gen LDLR
Plásmido no mutado en
metilado diferentes
sitios (VUS)

Se degrada
con DpnI
Se recupera
 Mutagénesis dirigida. Diseño experimental

Pruebas
funcionales
con I125-LDL
6 plásmidos
con las VUS
de LDLR

Líneas celulares KO para LDLR (LDLR-deficient CHO-ldlA7 cells do not express the LDLR)
 Aplicación Forense y maternidad
Medicina Forense. Análisis de ADN mitocondrial
DNA mitocondrial
 Pedigrí Análisis
Medicina Forense. familiar.dePatrón
ADNdemitocondrial
heredabilidad del DNA mitocondrial
 EsquemaAnálisis
Medicina Forense. del genoma mitocondrial
de ADN mitocondrial
humano. Regiones hipervariables
(1 al 3% entre individuos no-relacionados)
 Forense.Análisis
Medicina Forense. Procesodede evaluación
ADN de
mitocondrial
muestras de mtDNA
Epigenética
¿Cómo estudiar la Epigenética? CHIP-Seq
Estudios de expresión génica. RNA-Seq.
Estudios de expresión génica. RNA-Seq.
Controversia en el uso de Rosuvastatina
 A BIOINFORMATIC ANALYSIS OF THE AORTIC VALVE STENOSIS TRANSCRIPTOME REVEALS CHANCES OF ROSUVASTATIN TREATMENT
T. M. Peralta 1 , C. N. Nuñez Pedrozo 2 , M. Porto 3 , M. Imperatori 3 , M. Belmonte 3 , G. A. Giunta 4 , L. A. Cuniberti 2
1
Departamento de Biología Comparada, Celular y Molecular, FICEN, Universidad Favaloro. 2 Laboratorio de Medicina regenerativa cardiovascular, IMETTYB-Universidad
Favaloro-CONICET. 3 Carrera de Ciencias Biológicas, FICEN, Universidad Favaloro. 4 Servicio Cardiología, Hospital Universitario de la Fundación Favaloro.

Introduction Results A B

There is epidemiological evidence that associates By comparing the nondiseased vs fibrotic stage,
cardiovascular risk factors with aortic valve 229 genes were found to be differentially
stenosis (AVS). The drug treatment of choice are expressed. While between nondiseased and
beta-blockers and ACE inhibitors, although there is calcific, 1099 genes were significantly altered
a constant demand to optimize it1. On the basis of (FDR ≤ 0.05, logFC < 1 or > 1). These set of genes
the recently published transcriptomes on the were intersected with Rosuvastatin, beta-
progression of AVS2, we proposed a bioinformatic blockers and ACEi related genes and the
analysis to identify vacant molecular targets and resulting ones underwent a KEGG enrichment
treatment timing for Rosuvastatin. analysis. The overall fibrotic stage analysis
showed PPAR (p: 0.011) and JAK-STAT* (p:
0.0001), whereas the calcific stage revealed
Material and Methods Fluid shear stress and angiogenesis (p: <0.0001),
TNF (p: 0.025), HIF-1 (p: 0.0003) and Osteoclast
The transcriptomes were retrieved from the CICS differentiation (p: 0.002) signaling pathways
database of Brigham and Women’s hospital and (*exclusive of rosuvastatin).
represented different stages of disease
progression: nondiseased, fibrotic and calcific. A B
Differential gene expression analysis was Figure 2 A-B. Biological pathways obtained by KEGG enrichment analysis of the intersected genes for
performed employing OmicsBox using the EdgeR the Fibrotic (A) and Calcific (B) stages, respectively. The PPAR signaling pathway in the Fibrotic stage
package with FDR correction ≤ 0.05, logFC < 1 or > involves PPARG and ADIPOQ genes, both known for their antifibrotic effect.
1. The raw counts were normalized with the TMM
method. Genes related to beta-blockers, ACEi and
Rosuvastatin were retrieved from GeneCards and Conclusion
intersected with the differentially expressed genes
using Venn Diagrams. The tool PathfindR was used Figure 1 A-B. Intersected genes related to a The biological pathways identified in the present study reinforce the importance of a
to perform enrichment analysis (Fold Enrichment; valve disease stage and Rosuvastatin. The pharmacological treatment with anti-inflammatory and antioxidant effects. Early administration of
p-value) on the intersected genes. intersection shows 17 and 61 genes for the rosuvastatin would attenuate the AVS propagation phase by inhibiting the JAK-STAT signaling
Fibrotic (A) and Calcific (B) stages, respectively. pathway, thus preventing the differentiation of valvular interstitial cells to osteoblasts.

1
Borer JS, Sharma A. Drug Therapy for Heart Valve Diseases. Circulation. 2015 Tomás Peralta:
With thanks to the EAS for support in the
2
Schlotter F, Halu A, Goto S, et al. Spatiotemporal Multi-Omics Mapping Generates a Molecular Atlas of the Aortic peraltatomasm@
form of a Young Investigator Fellowship
Valve and Reveals Networks Driving Disease. Circulation. 2018 gmail.com