procedimiento, la inmovilización tiene lugar durante el ensayo a H.

Instrucciones del Producto utilizadas en la bolsa de aluminio, sellar y almacenar a 2-

nivel de una pozo de micro placas a través de la interacción de Nota 1: No utilizar los reactivos después de la fecha de 8ºC.
la estreptavidina recubierta sobre la pozo y el anticuerpo anti vencimiento 2. Pipetear 0.025 ml (25µl) de la referencia adecuada de
hCG monoclonal marcado con biotina agregado en forma Nota 2: Los reactivos abiertos son estables durante sesenta
suero, control o espécimen dentro del pozo asignado.
exógena. (60) días si se almacenan a una temperatura de 2-8º C.
Al momento de mezclar el anticuerpo monoclonal marcado con Nota 3: Los reactivos anteriores son suficientes para un solo 3. Adicionar 0.100ml (100µl) del reactivo enzimático hCG a
biotina, el anticuerpo marcado con la enzima y el suero que ensayo de placa de 96 pozos. todos los pozos.
contiene el antígeno nativo, producirán una reacción entre el 4. Agitar suavemente la micro placa durante 20-30 segundos
antígeno nativo y los anticuerpos, sin competencia ni MATERIALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS para mezclar y luego tapar
obstaculización estérica, para formar luego un complejo soluble 1. pipeta para 25& 50 µl con una precisión superior a 1.5%.
en sándwich. La interacción se ilustra mediante la siguiente 2. dispensadores para administraciones repetitivas de 0.100 ml 5. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
ecuación: y 0.350 ml con una precisión superior a 1.5 %. 6. Eliminar el contenido de la microplaca por decantación o
Ka 3. lavadores de micro placas o frascos oprimibles (opcionales) aspiración. Si se hace por medio de decantación, secar la
Enz
Ab(x-hCG) + Aghcg + btn Ab( m). Enz
Ab(m) - Aghcg - btn Ab (m) 4. Lector de microplacas con capacidad de absorbancia de placa con papel absorbente.
K-a longitud de onda de 450nm y 620 nm.
btn
Ab (m) = Anticuerpo monoclonal marcado con biotina (cantidad 5. Papel absorbente para secar los pozos de microplacas. 7. Adicionar 350µl del buffer de lavado (consultar Sección
en exceso) 6. Envoltura plástica de cubierta de micro placas para realizar sobre Preparación de Reactivos), decantar, golpear
Aghcg =Antígeno nativo (cantidad variable) los procedimientos de incubación. suavemente y secar o aspirar. Repetir el procedimiento 2
Enz
Ab(x-hCG) = Anticuerpo marcado de enzima (cantidad 7. aspiradora al vació (opcional).para los procedimientos de veces más para un total de 3 lavados. Se puede utilizar
excesiva) lavado. un lavador de placas automático o manual. Seguir las
Enz
Ab(hCG) + Aghcg + btn Ab (m) = Complejo en sándwich de 8. cronómetro instrucciones del fabricante para el uso adecuado. Si
Gonadotropina Coriónica Humana -ß anticuerpos Ag 9. materiales para control de calidad. se utiliza un frasco oprimible, llenar cada pozo
Código de producto: 825-300 Ka =Tasa constante de asociación. oprimiendo el recipiente (evitando la formación de
Ka =Tasa constante de disociación. PRECAUCIONES burbujas) para dispensar el lavado. Decantar el lavado
Uso: Determinación cuantitativa de la concentración de Para uso Diagnóstico in Vitro y repetir el procedimiento 2 veces más.
Gonadotropina coriónica en suero humano Mediante Simultáneamente el complejo es depositado en el pozo a través No utilizar en forma interna o externa en humanos o 8. Adicionar 0.100 ml (100µl) de sustrato de trabajo a todos
inmunoensayo enzimático de microplacas. de la reacción de alta afinidad de la estreptavidina y del animales los pozos (consultar Sección sobre Preparación de los
anticuerpo marcado con biotina. Esta interacción se ilustra de la Los productos que contienen suero humano han demostrado Reactivos). Adicionar siempre los reactivos en el
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO siguiente manera: que no son reactivos para antígeno de superficie de hepatitis B, mismo orden para minimizar las diferencias en tiempo
La concentración de gonadotropina coriónica humana (hCG) se anticuerpos VIH 1 y 2 y HCV de acuerdo con reactivos de reacción entre los pozos.
aumenta notoriamente en sangre y orina durante el periodo Enz
Ab(x-hCG) + Aghcg + btn
Ab(m) + estreptavidinacw = complejo licenciados por la FDA. Debido a que ningún ensayo puede
normal de embarazo. La hCG es secretada por el tejido NO AGITAR LA PLACA DESPUES DE LA ADICIÓN DEL
inmovilizado ofrecer garantía total en el sentido de ausencia de agentes SUSTRATO
placentario, iniciando con los trofoblastos primitivos, casi desde infecciosos, todos los productos que contengan suero humano
el momento del implante, y actúa como soporte del cuerpo luteo Estreptavidina cw= estreptavidina inmovilizado en la pozo deben ser manipulados como potencialmente peligrosos y 9. Incubar a temperatura ambiente durante quince (15)
durante las primeras semanas del embarazo. La gonadotropina Complejo inmovilizado= complejo en sándwich unido a la pozo. capases de trasmitir enfermedades. Los buenos procedimientos minutos.
hCG o las glico-proteínas similares a la hCG pueden ser de laboratorio para la manipulación de productos de sangre se 10. Adicionar 0.050 ml (50µl) de solución de parada de a cada
también producidas por una amplia gama de tumores Después de lograr el equilibrio, el enlace de la fracción del encuentran en el centro de Control de Enfermedades/ Instituto pozo y mezclar suavemente durante 15-20 segundos.
trofoblasticos y no trofoblasticos. La medición de hCG, por anticuerpo es separado mediante decantación o aspiración. La Nacional de Salud, “Bio seguridad en Laboratorios Agregar siempre los reactivos en el mismo orden para
sistemas de ensayo con adecuada sensibilidad y especificidad actividad enzimática, en el enlace de la fracción del anticuerpo Microbiológicos y Biomédicos”, 2da Edición, 1988, Publicación minimizar las diferencias en tiempo de reacción entre los
a demostrado ser de gran valor en la detección de embarazo y es directamente proporcional a la concentración de antígeno HHS Nº (CDC) 88-8395. pozos.
en el diagnóstico de trastornos tempranos del embarazo. nativo. Al utilizar diversas referencias de suero de valores
11. Leer la absorbancia en cada pozo a 450nm (utilizando una
conocidos de antígeno, se podrá generar una curva de RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
De acuerdo con la literatura especializada, la hCG se detecta en longitud de onda de referencia de 620-630nm para
respuesta de dosis a partir de la cual se establecerá la Se deben emplear las precauciones en la recolección de
forma temprana incluso a los 10 días después de la ovulación, minimizar imperfecciones de las pozos) en un lector de
concentración de antígeno de una muestra desconocida. muestras por punción venosa para las muestras de suero o
llegando así a 100mlU/ml para el primer periodo faltante. En el microplacas. Los resultados deben leerse dentro de los 30
sangre. Para establecer una comparación precisa con respecto
momento de la siguiente ovulación, el nivel hCG es de 200 minutos a partir de la adición de la solución stop.
REACTIVOS de valores normales, se debe sacar una muestra de suero del
mlU/ml (aproximadamente 28 días después de la concepción) A. Calibradores hCG – 1ml/vial- Iconos A-F paciente por la mañana y en ayunas. La sangre se debe
(1) se logra un pico de 50.000 o incluso 100.000 mlU/ml al Seis (6) viales de referencias para el antígeno hCG a niveles recoger en un tubo de muestras corriente que tenga una franja CONTROL DE CALIDAD
tercer mes, luego se observa un descenso gradual (2,3). de 0 (A), 5 (B), 25 (C), 50 (D) 100 (E) y 250(F) mlU/ml. roja en la sección superior, sin aditivos ni anticoagulantes. Se Los laboratorios deberán ensayar los controles de nivel bajo,
Almacenar a 2-8ºC. Se agregó preservante debe permitir que la sangre se coagule. Centrifugar el normal y alto para monitorear el desempeño de los ensayos.
De acuerdo con este método, el calibrador hCG, la muestra o espécimen para separar el suero unido a las células. Estos controles deben tratarse como muestras desconocidas y
control del paciente se adicionará en primer término a un pozo Nota: los calibradores, basados en suero humano, se calibraron determinar los valores para cada procedimiento de prueba que
recubierto con streptavidina. Los anticuerpos monoclonales utilizando una preparación de referencia, la cual se ensayo Las muestras pueden ser refrigeradas a 2-8ºC por un periodo se realice. Se dispondrá de gráficos de control de calidad para
biotinados y marcados con enzimas (que se dirigen contra los contra las directivas de la organización mundial de la salud máximo de cinco (5) días. Si los espécimen no se pueden hacerle un seguimiento al desempeño de los reactivos
epítopes claramente diferenciados de hCG) se adicionan y WHO 3rd (75/537). estudiar durante este periodo, las muestras podrán suministrados. Se utilizarán métodos estadísticos pertinentes
luego se procede con la mezcla de los reactantes. La reacción almacenarse a temperaturas de -20ºC por un periodo máximo para evaluar las tendencias. Una desviación significativa con
entre los distintos anticuerpos hCG y el hCG nativo formara un B. Reactivo Enzima hCG – 13 ml/vial – Icono de 30 días. Evitar la congelación y descongelación repetidas. respecto con el desempeño establecido podrá indicar la
complejo en sándwich que se enlaza con la estreptavidina Un (1) vial que contiene anticuerpo purificado afín marcado con Cuando el ensayo se hace en duplicado, se requiere una presencia de cambios no detectados en condiciones
recubierta al pozo. una enzima, IgG monoclonal de ratón marcado con biotina, en cantidad de 0.050ml del espécimen. experimentales o bien la degradación de los reactivos del kit. Se
buffer, colorante y preservante. Almacenar a 2-8º C. utilizaran reactivos frescos para determinar el motivo de las
Luego de terminar el periodo requerido de incubación, el PREPARACION DEL REACTIVO variaciones
anticuerpo de gonadotropina coríonica enzimática enlazada, se C. Placa recubierta con estreptavidina – 96 pozos 1. Buffer de lavado
separa del conjugado sin enlazar compuesto por la enzima- Una microplaca de 96 pozos cubierta con estreptavidina y Diluir el contenido del concentrado de lavado en 1000ml con CALCULO DE RESULTADOS
gonadotropina coríonica mediante aspiración o decantación. La empacada en una bolsa de aluminio con un agente secante. agua destilada o desionizada en un recipiente adecuado de Se utiliza una curva de respuesta de dosis para evaluar la
actividad de la enzima presente en la superficie del pozo se Almacenar a 2-8 º C. almacenamiento. Almacenar el buffer diluido a temperatura concentración de la Gonadotropina Coríonica Humana (hCG)
cuantifica mediante reacción con un sustrato adecuado para ambiente de 20-27ºC. Hasta por 60 días. en muestras desconocidas.
producir color. D. Solución de lavado Concentrado -20 ml- Icono 1. Registrar la absorbancia obtenida de la impresión del
Un vial (1) que contiene un surfactante en tampón salino. Un 2. Sustrato de solución de trabajo. lector de micro placas según se señala en el Ejemplo 1.
La utilización de diversas referencias de suero de niveles preservante ha sido adicionado. Almacenar a 2-30ºC. Verter el contenido del vial ámbar marcado como solución “A”
conocidos de gonadotropina coríonica permite la construcción dentro del vial transparente marcado como solución “B” colocar 2. Graficar la absorbancia para cada suero referencia en
de una curva de respuesta de dosis para la actividad y la tapa amarilla en el vial transparente para facilitar su duplicado vs la concentración correspondiente de hCG en
concentración. A partir de la comparación con la curva de E. Sustrato A - 7ml/ vial – Icono SA identificación. Mezclar y etiquetear según corresponda. mIU/ml en papel para gráficos lineales. (No promediar el
respuesta a la dosis, se puede correlacionar una actividad de Un (1) frasco que contiene Tetrametilbenzidina (TMB) en buffer. Almacenar a 2-8ºC. duplicado de las referencias de suero antes de la
espécimen desconocido con la concentración de la Almacenar a 2-8º C. Nota: no use la solución de trabajo si tiene una apariencia azul. graficación)
gonadotropina coríonica.
3. Trazar la curva de mejor adecuación a través de los
F. Sustrato B – 7 ml/vial- Icono SB PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO puntos graficados.
PRINCIPIO Un (1) frasco que contiene peroxido de hidrogeno (H2O2.) en Antes de seguir adelante con el ensayo, hacer que todos los
Ensayo inmuno enzimométrico (TIPO 3): buffer. Almacenar a 2-8ºC. reactivos, referencias y controles de suero alcancen la 4. Para determinar la concentración de hCG para muestras
Los reactivos esenciales que se requieren para lograr un temperatura ambiente (20-27ºC). desconocidas, ubicar la absorbancia promedio para cada
ensayo inmuno enzimométrico incluyen anticuerpos de alta G. Solución stop – 8ml/vial – Icono muestra desconocida en el eje vertical del grafico,
afinidad y especificidad (enzimáticos e inmovilizados), con 1. Marcar los pozos de la microplaca para cada una de los encontrando el punto de intersección en la curva y leer la
Un (1) frasco que contiene un ácido fuerte (1N HCl). Almacenar
reconocimiento de epítopes claramente diferenciados, en calibradores, controles y muestras de paciente para que se concentración en (mlU/ml) a partir del eje horizontal del
a 2-30ºC.
exceso y un antígeno nativo. De acuerdo con este prueben por duplicado. Colocar las tiras micro pozos no grafico (entendiéndose que los duplicados de la muestra
 desconocida pueden promediarse según se indica). En el 4. Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva RANGOS ESPERADOS DE VALORES Se indican tan solo valores pequeños de sesgo entre este
siguiente ejemplo, la absorbancia promedio (1.745) se dosis respuesta. Se realizó un estudio de población de adultos aparentemente procedimiento hCG ELISA y el método de referencia, por la
intercepta con la curva de respuesta de dosis en (157 5. La adición de la solución sustrato inicia una reacción normales para determinar los valores esperados utilizando el proximidad de los valores medios. La ecuación de regresión de
mlU/ml) de la concentración hCG (ver figura 1). sistema de prueba de hCG AccuBind ELISA. En la tabla uno se mínimos cuadrados y el coeficiente de correlación indican un
cinética, la cual es terminada por la adición de la solución
Nota 1: El software de reducción de datos por computador de paralización. Por tanto, la adición de los substratos y la presenta valores de la media (X), desviaciones estándar (σ) y excelente acuerdo entre los métodos.
rangos esperados (±2 σ), presentados en la tabla 1.
diseñado para ensayos IEMA /ELISA también se puede utilizar solución de detención serán adicionadas en la misma
para reducción de datos. secuencia para eliminar cualquier desviación durante la TABLA I C. Sensibilidad
Valores Esperados para el sistema de prueba hCG El sistema de ensayo ELISA hCG AccuBind tiene una
EJEMPLO 1 reacción.
ELISA sensibilidad de 0.02 mIU. Este valor es equivalente a una
6. Los lectores de placa miden verticalmente. No tocar el (En mlU/ml -3rd en 75/537) muestra que contenga una concentración de 0.8 mIU/ml hCG.

(mIU/ml)
Muestra

Número

Abs (A)

Abs (B)
Media
fondo de los pozos.

Valor
Pozo
I.D.

7. La falla en remover la solución adherente adecuadamente Numero 25 D. Especificidad

en los pasos de aspiración o lavado por decantación Media (x) 2.9 La reactividad cruzada de hCG AccuBind ELISA con respecto
puede resultar en una pobre replicación y resultados Desviación estándar (σ) 1.4 de sustancias seleccionadas se evaluó agregando la sustancia
A1 0.002 falsos. Rangos esperados (±2 σ) 0.1-5.7 interfiriente a una matriz de suero a diversas concentraciones.
Cal A 0.004 0 La reactividad cruzada se calculo derivando una proporción
B1 0.005 8. Usar componentes del mismo lote. No mezclar los Los niveles esperados para hCG durante el embarazo normal entre la dosis de sustancia interfiriente con respecto de la dosis
reactivos de diferentes lotes. (3) se encuentran enumerados en la tabla 2. de gonadotropina coríonica necesaria para producir la misma
C1 0.073 TABLA 2 absorbancia.
Cal B 0.071 5 9. Muestras pacientes con concentraciones de hCG mayores a
D1 0.069 250 mUI/ml pueden ser diluidas con suero normal de Valores Esperados para los niveles hCG (3rd en Sustancial Reactividad cruzada Concentración
hombres (hCG <1 mUI/ml) y analizadas nuevamente. 75/537) durante embarazo normal (en mlU/ml) Gonadotropina coríonica (hCG) 1.0000 --
E1 0.340 Multiplicar el valor obtenido por el factor de dilución para Sub-unidad B- hCG < 0.0001 100ng/ml
Cal C 0.350 25 obtener el valor correcto. 1ra semana 10-30 folitropina (hFSH) <0.0001 100ng/ml
F1 0.360 2 da semana 30-100
10. Es esencial un pipeteo preciso y exacto así como seguir el Hormona lutropina (hLH) <0.0001 100ng/ml
3 da semana 100-1000 Tirotropina (hTSH) <0.0001 100ng/ml.
G1 0.637 tiempo exacto y la temperatura requerida. Cualquier 4 da semana 1.000-10.000
Cal D 0.650 50 desviación de las instrucciones de uso puede arrojar
H1 0.663 2do y 3er mes 30.000-100.000 REFERENCIAS
resultados inexactos. 2 trimestre 10.000-30.000
A2 1.223 11. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio todos 3 trimestre 5.000-15.000
Cal E 1.212 100 los estándares nacionales aplicables, regulaciones y leyes
B2 1.199 de manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso Es importante tener en cuenta que el establecimiento de un
adecuado del dispositivo. rango de valores que puede encontrarse utilizando un método
C2 2.518 dado para una población de personas “normales” dependerá de
Cal F 2.502 250 12. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo:
D2 2.486 toda una serie de factores entre los cuales están los siguientes:
pipetas, lectores, lavadores y/o instrumentos
especificidad del método, población estudiada y precisión del
automatizados con este reactivo y realizar un
E2 0.075 método que maneje el analista. Por estas razones, cada
Ctrl 1 0.076 5.8 mantenimiento preventivo rutinario
laboratorio deberá basarse en el rango de valores esperados
F2 0.077 13. El análisis de riesgo – como lo requiere la directiva IVD establecidos por el fabricante únicamente; hasta cuando los
98/79/EC de la marca CE- para estos y otros dispositivos analistas puedan determinar un rango dentro del laboratorio,
G2 0.280 elaborados por Monobind, pueden ser solicitados vía
Ctrl. 2 0.290 21.9 utilizando el método como una población propia del área en la
H2 0.301 Email: [email protected] cual se encuentre ubicado el laboratorio.

A3 1.736 B. Interpretación
Paciente 1.745 157 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
B3 1.754 1. Los resultados de laboratorio por si solos son únicamente un A. Precisión Revisión: 2 Fecha: 112210
aspecto para determinar el cuidado del paciente y no deben ser La precisión intra e inter ensayo para el estudio hCG AccuBind Cat #: 825-300
* Los datos presentados en el ejemplo 1, figura 1 son para la única base para una terapia, particularmente si los resultados ELISA se determinaron mediante análisis de tres niveles
ilustración únicamente, y no deben ser utilizados en lugar de están en conflicto con otros determinantes. distintos de sueros de control. El número, valor medio,
una curva de respuesta de dosis, preparada con cada uno de 2. Para resultados de pruebas válidas, los controles adecuados desviación estándar y el coeficiente de variación para cada uno
los ensayos. y otros parámetros deben estar dentro de los rangos listados y de estos sueros de control se presentan en las Tablas 3 y Tabla
Figura 1 requerimientos del ensayo. 4.
TABLA 3
3. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por mezcla de
Precisión al interior de los Ensayos (Valores en
partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados de
mlU/ml)
prueba falsos o si los resultados son interpretados
Muestra N X σ C.V.
incorrectamente, Monobind no tendrá responsabilidad.
Nivel 1 20 2.8 0.15 5.4%
4. Si se utiliza el sistema de reducción de datos controlados por Nivel 2 20 15.2 0.65 4.2%
Computador para interpretar los resultados del ensayo, es Nivel 3 20 178.0 10.50 5.9%
necesario que los valores de predicción para los calibradores se
ubiquen dentro del 10% de las concentraciones asignadas. TABLA 4
5. Pueden presentarse resultados falsos positivos en presencia Precisión inter - Ensayo (Valores en mlU/ml)
de una gama de variedades de tumores trofoblasticos y no Muestra N X σ C.V.
trofoblasticos que secretan hCG. Por lo tanto, deberá eliminarse Nivel 1 10 3.1 0.17 5.5%
la posibilidad de una neoplasia que secrete hCG con Nivel 2 10 15.4 0.81 5.3%
PARÁMETROS DE CONTROL DE CALIDAD
anterioridad al diagnostico de embarazo. Nivel 3 10 185.6 11.10 6.0%
Para que los resultados del ensayo puedan ser considerados
como válidos deberán satisfacerse los siguientes criterios: 6. Igualmente, los resultados falsos positivos se pueden * Según mediciones hechas en 10 experimentos por
observar, cuando se ensayan muestras tomadas de personas duplicado.
1. La absorbancia OD del calibrador F debe ser > 1.3. que consuman los medicamentos Pergonal* Clomid**.
2. 4 de 6 pools de control de calidad deberán estar ubicados Adicionalmente el pergonal estará seguido frecuentemente de B. Precisión
dentro de los rangos establecidos. una inyección de hCG. Este sistema de ensayo ELISA hCG AccuBind se comparó con
ANALISIS DE RIESGOS 7. El micro-aborto espontáneo y el embarazo ectópico tienden a un radioinmuno ensayo de referencia. Se estudiaron igualmente
A. Desempeño de la prueba presentar valores inferiores a lo esperado durante el embarazo muestras biológicas provenientes de poblaciones normales y de
1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea normal, en tanto que con mucha frecuencia se observan valores embarazo. El número total de estas muestras fue de 110. La
sostenido en forma constante para resultados un tanto mas elevados en embarazos múltiples ( 5, 6, 7) ecuación de regresión de mínimos cuadrados y el coeficiente de
reproducibles. correlación se calcularon para el hCG ELISA en comparación
8. Después de un aborto terapéutico, el hCG detectable puede con el método de referencia. Los datos obtenidos se muestran a
2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10 persistir hasta por 3 a 4 semanas. El promedio de desaparición continuación.
minutos para evitar derivaciones. de hCG, después de un aborto espontáneo, variará de acuerdo Método Media (X) Análisis de regresión coeficiente
con la cantidad de trofoblastos residuales viables (4, 5, 6 ,7). Mínimos cuadrados de correlación
3. No se deben emplear muestras altamente lipémicas,
hemolizadas o contaminadas *Pegonal es marca registrada de serono laboratorios inc. Este Método 14.8 y=-0.081+0.93 (x) 0.989
Referencia 15.1
**Clomid es marca registrada de merriel-National Laboratories.