ANALISIS

MICROBIOLÓGICO
DE ALIMENTOS

M.Sc. Virginia Judith Rojas Mercado

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
El alimento es una condición imprescindible para la
existencia de la vida.
Nuestra existencia al final, se sostiene no sólo en
comer, sino en comer alimentos de calidad.

Uno de los tipos de control de calidad más importantes

en este proceso es el análisis microbiológico de los
alimentos, esencial para evaluar las condiciones de
higiene durante la producción, almacenamiento,
procesamiento y distribución para el consumo.

El control microbiológico nos permite conocer el

número total de microorganismos presentes en el
alimento
 NORMATIVA
NORMA
BOLIVIANA

32001 TECNICAS DE MUESTREO DE ALIMENTOS PARA

EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

32002 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

32003 RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS MESÓFILAS

AEROBIAS VIABLES

32005 RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES

32006 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

TOMA DE MUESTRAS
TOMA DE MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO

CONTEO de
UFC
 PESADO DE LA MUESTRAS

Pesado en condiciones
asépticas y en material
estéril de 25 g de muestra
representativa en 225 ml del
diluyente adecuado
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
MUESTRAS HOMOGENEIZADAS
DILUCIONES
DILUCIONES DECIMALES

9 ml sol en c/tubo
DILUCIONES DE LA MUESTRA
 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

https://www.
youtube.com
/watch?v=pt
NG_LmjbY8
DILUCION Y SIEMBRA EN PLACA
SIEMBRA E INCUBACIÓN
SIEMBRA POR VERTIDO EN PLACA

https://www.youtube.com/watch?v=N
MANPl0PftQ
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

48 H
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

MEDIO DE CULTIVO TEMPERATURA TIEMPO

INCUBACIÓN INCUBACIÓN

BACTERIAS AGAR PLATE COUNT 30 24 - 48 H

AERÓBIAS
MESÓFILAS

MOHOS Y ● AGAR SABOURAND 22 - 25 3 - 5 DIAS

LEVADURAS ● AGARA PATATA
DEXTROSA
● AGAR EXTRACTO DE
LEVADURA DEXTROSA
CLORANFENICOL

COLIFORMES AGAR LACTOSA BILIS ROJO 35 24- 48 H

NEUTRO CRISTAL VIOLETA
ANÁLISIS DE AEROBIOS
MESÓFILOS
 RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS
En este grupo se incluyen todas las bacterias capaces de desarrollarse
a 30º C en las condiciones establecidas.

En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de

microorganismos.

Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de

manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima.

Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la

ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento
elevado no significa presencia de flora patógena.
 RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS

Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación,

no son recomendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar:

● Excesiva contaminación de la materia prima -

● Deficiente manipulación durante el proceso de
elaboración -
● La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son
mesófilos -
● La alteración del producto
● El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de
salubridad de algunos alimentos.
 RECUENTO DE AERÓBIOS MESÓFILOS
25 g muestra
225 ml diluyente

48 h
BACTERIAS AERÓBIAS MESÓFILAS
ANÁLISIS DE MOHOS Y
LEVADURAS
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

Los hongos engloban los mohos y las levaduras.

Los mohos son multicelulares filamentosos cuyo

crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto
aterciopelado.

Las levaduras crecen en agregados de células

independientes, cuando crecen en los alimentos forman
colonias características.
 MOHOS Y LEVADURAS

El significado de la contaminación fúngica de los

alimentos viene determinado por su capacidad para
deteriorar los alimentos, produciendo defectos en el
aspecto modificaciones químicas, alterando el valor
nutricional, variando sus características organolépticas y
dificultando su conservación.

Algunos mohos pueden producir infecciones en el

hombre e incluso reacciones alérgicas.

Además, muchos mohos producen gran número de

toxinas a las que el hombre es susceptible
 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
25 g muestra
225 ml
diluyente
ANÁLISIS DE COLIFORMES
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

25 g muestra
225 ml diluyente
AGAR MAC CONKEY
PROCEDIMIENTO A SEGUIR PARA
EL ANÁLISIS DE:

● BACTERIAS AERÓBIAS MESÓFILAS (BAM)

●
● MOHOS Y LEVADURAS (MyL)
●
● COLIFORMES (Coli)
.

BAM

MyL

Coli
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

MEDIO DE CULTIVO TEMPERATURA TIEMPO

INCUBACIÓN INCUBACIÓN

BACTERIAS AGAR PLATE COUNT 30 24 - 48 H

AERÓBIAS
MESÓFILAS

MOHOS Y ● AGAR SABOURAND 22 - 25 3 - 5 DIAS

LEVADURAS ● AGARA PATATA
DEXTROSA
● AGAR EXTRACTO DE
LEVADURA DEXTROSA
CLORANFENICOL

COLIFORMES AGAR LACTOSA BILIS ROJO 35 24- 48 H

NEUTRO CRISTAL VIOLETA
RECUENTO DE UFC
RECUENTO DE UFC
https://www.youtube.com/
watch?v=qMOK-h6vzyw
 Las pruebas bioquímicas han sido
BATERÍA ampliamente utilizadas para diferenciar
BIOQUÍMICA bacterias.

Estas pruebas se fundamentan en demostrar

si el microorganismo es capaz de:
● fermentar azúcares,
● la presencia de enzimas,
● la degradación de compuestos,
● la producción de compuestos coloreados,
etc.
 IMVIC

ROJO DE VOGES
INDOL PROSKAUER CITRATO
METILO
 PRUEBA DE INDOl

A. MEDIOS DE CULTIVO B. REACTIVOS

AGUA TRIPTONADA AL L 1% REACTIVO DE KOVAC

• Triptona 10 g • Alcohol tetramilico 75 ml

• Cloruro de sodio 5 g •p-dimetilaminobenzaldehido 5g

Triptófano 1g • HCI concentrado 25 ml•

• Agua destilada 1000 ml •

 PRUEBA DE INDOL

● PROCEDIMIENTO
RESULTADO
● Sembrar con asa de platino la
solución triptonada con el Indol:
microorganismo Positivo: Anillo rojo
● Iincubar a 35 °C durante 18 a 24 en la superficie del
horas. medio
Negativo: No se
● Una vez transcurrido este tiempo,
produce color
agregar gotas del reactivo haciendo
que se deslicen por la pared del tubo.

AGUA
PRUEBA DE INDOL
 PRUEBA DEL ROJO DE METILO

A. MEDIOS DE CULTIVO B. REACTIVOS

CALDO ROJO DE METILO INDICADOR ROJO DE METILO

VOGES PROSKAUER
• Rojo de metilo 0.04 g
● Peptona 7g
● Glucosa 5g • Etanol absoluto 60 ml
● Cloruro de sodio 30 g
• Agua destilada 40 ml
● Fosfato ácido dipotásico 5 g
● Agua destilada 1000 ml •
 PRUEBA DE ROJO DE
METILO
se basa en el uso de un indicador de pH (rojo de
metilo) para determinar la concentración de ion
hidrógeno posterior a la fermentación de glucosa
por las vías de ácidos mixtos: láctico, acético,
succínico y fórmico. RESULTADO

● ROJO DE METILO POSITIVO: si el

PROCEDIMIENTO microorganismo es MR positivo el
indicador permanece rojo brillante en
1. Se inocula el medio de Clark y Lubs, también llamado la superficie del medio. Lo que indica
caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (MR/VP) con que el pH está por debajo de 4.4.
un crecimiento puro de 18 a 24 horas.
● NEGATIVO: se observa un color
amarillo en la superficie del medio.
2. Se incuba a 35°C por un mínimo de 48 horas. Ésto indica un pH de 6.
3. Para revelar la prueba se añade directamente a una
alícuota incubada 5 gotas de indicador de Rojo de
Metilo.
PRUEBA ROJO DE METILO
PRUEBA ROJO DE METILO

MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS
POSITIVOS NEGATIVOS

• Escherichia coli • Enterobacter

aerógenes •
• Especies de Yersinia
Enterobacter cloacae

• Klebsiella
 VOGES - PROSKAUER

MEDIOS DE CULTIVO B. REACTIVOS •

El medio utilizado con
mayor frecuencia es el A. CALDO VP/RM SOLUCIÓN AL l 5% DE ALFA
caldo de rojo de metilo- NAFTOL
Voges-Proskauer •Peptona 7g
•Alfa naftol 5g
(MR/VP) segun la
• Glucosa 5g • Alcohol etilico absoluto 100 mL
formula de Clark y Lubs.
• Fosfato dipotasico 5 g SOLUCIÓN DE KOH AL 40 %

• Agua destilada 1L
● Hidroxido de potasio 40 g
● Agua destilada 100 mL
• pH final = 6,9
VOGES - PROSKAUER
PROCEDIMIENTO

Sembrar un tubo de caldo MR/VP con Es esencial que los reactivos

un cultivo puro del microorganismo sean agregados en ese
orden.
. Incubar 24 horas a 35 °C.
Agitar suavemente el tubo
Finalizada la incubación, transferir 1 ml
para exponer el medio al
del caldo a un tubo de ensayo limpio.
oxígeno atmosférico y dejar
Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, el tubo en reposo durante 10
seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. a 15 minutos.
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

RESULTADOS

Positivo: desarrollo de
color rojo 15 minutos o
mas después del
agregado de los reactivos,
que indica la presencia de
diacetilo, el producto de
oxidación de la acetoina
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS
POSITIVOS NEGATIVOS

• Klebsiella pneuminiae • Escherichia coli

• Yersinia enterocolítica • K. ozaenae

 CITRATO DE
SIMMONS PROCEDIMIENTO

Se toma una colonia bien

La formula del medio de citrato de Simmons aislada de la superficie de un
es la siguiente: medio de aislamiento primario y
se siembra en forma de estría
• Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g única en el pico de flauta (agar
• Fosfato dipotasico 1g
• Cloruro de sodio 5g
inclinado) del tubo de agar
• Citrato de sodio 2g citrato.
• Sulfato de magnesio 0 ,20 g El tubo se incuba a 35 °C
• Agar 15 g durante 24 a 48 horas.
• Azul de bromotimol 0 ,08 g
• Agua destilada 1L
• pH final = 6,9
 PRUEBA DEL CITRATO

Se inocula el agar citrato (inclinado) con aguja de inoculación

Se incuba a T de 35 ° C durante 24 horas y se realiza la lectura de la
prueba
 PRUEBA DEL CITRATO
MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS
POSITIVOS NEGATIVOS

• Salmonella • Edwarsiella
• Arizona • Yersinia enterocolítica
• Citrobacter • Escherichia coli
• Enterobacter • Shigella
• Klebsiella • Yersinia pseudotuberculosis
• Serratia licuefaciensis • Otras especies de Moraxella
• Pseudomonas cepacia • Proteus morganii
BATERIA BIOQUÍMICA

https://www.youtube.com/watch?v=EUKac9m
I-ts&feature=youtu.be
BATERÍA BIOQUÍMICA

https://www.youtube
.com/watch?v=YWuT
wBuqQrA&feature=e
mb_rel_pause
PRUEBAS BIOQUÍMICAS IMVIC
.
INTERPRETACIÓN IMVIC
 TS I - Triple sugar iron

ESTA PRUEBA TIENE COMO OBJETIVO

COMPOSICIÓN
DIFERENCIAR ENTRE;
Peptona 15 g
Bacterias fermentadoras de GLUCOSA Extracto de levadura 3g
Bacterias fermentadoras de LACTOSA Extracto de carne 3g
Proteosa de peptona 5g
Bacterias fermentadoras de SACAROSA Glucosa 1g
Bacterias productoras de SH2 Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Sulfato de hierro 0,20 g
Cloruro sódico 5g
Tiosulfato de sodio 0,30 g
Rojo fenol 0,024g
Agar 12 g
Agua 1L
 TSI

FUNDAMENTO:
PROCEDIMIENTO:
El extracto de carne y peptona
aportan los nutrientes para el Se inocula los tubos de TSI
desarrollo bacteriano. con aguja de inoculación.

La lactosa, sacarosa y glucosa son 2.- Se introduce la punta hasta

los HC fermentables. 3 a 5 mm del fondo del tubo.
3.- Luego de retirar el asa del
El rojo de fenol es el indicador de
pH. fondo, se estría el pico con un
movimiento en zigzag, de un
Por la fermentación de los lado al otro.
azúcares, se producen ácidos que
se detectan por el indicador de pH. 4.- Se incuba a 35 - 37°C
durante 24 horas.
 TSI
INTERPRETACIÓN: Si el microorganismo sólo
fermenta la glucosa, el ácido Si hay formación de gas
Se debe considerar los cambios durante el proceso de
de color en el pico y el fondo del
producido en el fondo acidifica el
fermentación, en el fondo
tubo y la formación de burbujas. medio en esa zona y se torna de del medio se observan
color amarillo. burbujas o la ruptura del
Cuando el medio es ácido (A) agar.
este se torna de color amarillo y Cuando el microorganismo
cuando es alcalino (ALK) fermenta la lactosa y la sacarosa, Si las bacteria son
permanece de color rojo el ácido producido es suficiente productoras de SH2 este
como para virar el color del medio se evidencia como un
precipitado negro en el
a amarillo.
fondo del tubo.
El medio permanece rojo cuando
no se produce fermentación de
ninguno de los azúcares.
PRUEBA DEL TSI
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
BATERIA BIOQUÍMICA KIT API 20

https://www.youtube.com/watch
?v=tkGpcdBH9N0
MÉTODOS RÁPIDOS DE ANÁLISIS

https://www.youtube.com/watch?v=
J4nusvL8gQE