Este documento describe varios métodos indirectos para cuantificar microorganismos viables y totales, como el número más probable (NMP), la medición de ATP, la incorporación de precursores radiactivos y la determinación de CO2. También describe métodos para cuantificar microorganismos totales, como el método de turbidez, la determinación del peso seco y húmedo en las células, y métodos bioquímicos y cinéticos basados en la determinación de proteínas u otras biomoléculas. El documento proporciona detalles sobre cómo
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Este documento describe varios métodos indirectos para cuantificar microorganismos viables y totales, como el número más probable (NMP), la medición de ATP, la incorporación de precursores radiactivos y la determinación de CO2. También describe métodos para cuantificar microorganismos totales, como el método de turbidez, la determinación del peso seco y húmedo en las células, y métodos bioquímicos y cinéticos basados en la determinación de proteínas u otras biomoléculas. El documento proporciona detalles sobre cómo
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Este documento describe varios métodos indirectos para cuantificar microorganismos viables y totales, como el número más probable (NMP), la medición de ATP, la incorporación de precursores radiactivos y la determinación de CO2. También describe métodos para cuantificar microorganismos totales, como el método de turbidez, la determinación del peso seco y húmedo en las células, y métodos bioquímicos y cinéticos basados en la determinación de proteínas u otras biomoléculas. El documento proporciona detalles sobre cómo
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ESCUELA: CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE
SERVICIOS No. 85 “DR JOSE MARÍA LICEAGA”
LUGAR: COATZACOALCOS, VER. SUBMÓDULO: 3CMICRO “CUANTIFICA MICROORGANISMOS” PROFESOR: Q.F.B. JESÚS MELESIO ORNELAS MIJANGOS NOMBRES: 1. CABRERA ARREDONDO LITZI GERALDINE 2. CRUZ CUEVAS KARLA BERENICE 3. GARCÍA ALFONSO LESLY ALONDRA 4. GARCIA PERALTA LUIS FELIPE 5. MONTALVO MERCHANT DIANA DE LOS ÁNGELES 6. TEJEDA DE LA PAZ DULCE MARÍA 7. WONG HERNÁNDEZ LUIS FERNANDO EQUIPO: 7 GRADO Y GRUPO: 4ALM ESPECIALIDAD: TÉCNICO LABORATORISTA QUÍMICO COMPETENCIA PROFESIONAL: COMPETENCIA PROFESIONAL 7. “CUANTIFICA MICROORGANISMOS VIABLES Y TOTALES POR MÉTODOS INDIRECTOS PREPARANDO MUESTRAS E INSUMOS EN DIFERENTES PRODUCTOS SIGUIENDO INSTRUCCIONES Y PROCEDIMIENTOS Y APLICANDO BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO” TEMA: TRABAJO DE INVESTIGACIÓN DE “MÉTODOS INDIRECTOS PARA CUANTIFICAR MICROORGANISMOS VIABLES Y TOTALES” PERIODO SEMESTRAL: FEBRERO 2020-JULIO 2020 FECHA DE ENTREGA: 30/04/2020 MÉTODOS INDIRECTOS DE CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS VIABLES. NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) El método del Número más probable, también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística. La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan; cinco tubos por dilución se consideran como una relación adecuada entre precisión y economía. Este método se usa para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias Escherichia coli que pueden crecer en un medio con lactosa. La presencia de E. coli en el agua potable es una prueba de contaminación. En microbiología, el método se emplea habitualmente realizando diluciones en serie de un cultivo de bacterias en un medio de crecimiento, y luego divisiones adicionales en serie hasta obtener partes alícuotas. Los cultivos son incubados y evaluados a ojo, eludiendo el tedioso recuento de colonias, o el caro y tedioso recuento microscópico. En biología molecular, una aplicación habitual se da en las plantillas de ADN diluidas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). MEDIDA DEL ATP Por medio de la bioluminiscencia se puede detectar la cantidad de ATP presente en una superficie. Esto se relaciona directamente con la suciedad biológica, entendiéndose por tal a la constituida por sustancias orgánicas de origen vegetal o animal, incluyéndose a los microorganismos. Es opinión generalizada que el ATP es rápidamente destruido luego de la muerte celular por acción de la ATPasa. En la presente comunicación se publican resultados que ponen en discusión esta afirmación. Se concluye que, en las condiciones de trabajo descriptas, la bioluminiscencia es muy sensible para determinar materia orgánica de origen animado, pero es poco sensible para los microorganismos en particular. INCORPORACIÓN DE PRECURSORES RADIACTIVOS Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la población. DETERMINACION DE CO2 La actividad metabólica que realizan los microorganismos en cualquier proceso de descomposición puede ser cuantificada por medición de la producción de CO2 o por el consumo de O2 (Alef 1995). El presente estudio tuvo como objetivo determinar la evolución del CO2 producido por los microorganismos en un suelo patagónico enmendado con distintas cantidades de lodos de piscicultura y de salmonicultura lacustre y su relación con la estabilidad de la materia orgánica.
MÉTODOS INDIRECTOS DE CUANTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS TOTALES. MÉTODO DE TURBIDEZ Para algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de monitorizar el crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto nublado por las células. El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro). En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un detector sensible a la luz. Mientras incremente el número de bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado. Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para que la primera señal de turbidez sea visible. Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer una suspensión suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es útil para medir contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias. MÉTODO DETERMINACIÓN DEL PESO SECO EN LAS CÉLULAS Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavadas muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado para remover material extraño, drenado en un secador y después es pesado. El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. MÉTODO DETERMINACIÓN DEL PESO HÚMEDO Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. MÉTODOS INDIRECTOS DE DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA Estos métodos se basan funda-mentalmente en la determinación de algún componente celular específico, en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos bioquímicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formación de algún producto (métodos cinéticos). También se incluyen en este apartado algunos métodos fisicoquímicos. Los métodos bioquímicos y cinéticos determinan, más que la viabilidad de las bacterias la actividad ya que dependen más del estado metabólico de los microorganismos que del número de individuos. PROTEÍNAS Existen varias técnicas para el análisis de proteínas totales de una muestra biológica. Algunos están muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad. Es el caso de las técnicas de Lowry et al. (1951) y Bradford (1976). La principal desventaja de la de-terminación de proteínas es que su cantidad en las células está sujeta a fuertes variaciones debido, funda- mentalmente, a cambios en las condiciones fisicoquímicas y al estado fisiológico celular. LÍPIDOS Los lípidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su determinación para la estimación de la biomasa de una población bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros métodos. La principal ventaja es su alto contenido específico y que se encuentran en cantidades relativamente constantes. Otra ventaja muy importante es que los lípidos no forman parte de las reservas celulares y se degradan rápidamente durante la lisis bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98% de los lípidos de las membranas celulares está en forma de fosfolípidos (Lazarova y Manem,1995). Las técnicas de análisis se basan, fundamentalmente, en la extracción celular de los fosfolípidos con un di- solvente orgánico, su posterior hidrólisis ácida para liberar el fosfato y, por último, la determinación colorimétrica de éste. Son técnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato; Findlay et al., 1989). POLISACÁRIDOS La mayoría de las células procariotas contienen ácido murámico (un peptidoglicano) como componente de la pared celular. Existen varias técnicas para la determinación del ácido murámico en mues-tras que contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la con-versión del ácido murámico a lactato, seguida del análisis enzimático o químico de la concentración de lactato. El ácido murámico se extrae de las células mediante una hidrólisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromatografía de intercambio iónico. Otros aumentar las de ADP y AMP (Uh-linder y White, 1983). BIBLIOGRAFÍAS CABRERA ARREDONDO LITZI GERALDINE
1. Anónimo. (23 de enero del 2013). Medición del crecimiento Microbiano.
29/04/2020, de Google.pdf Sitio web: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_1983 7.pdf CRUZ CUEVAS KARLA BERENICE
2. Camacho A... (28 de mayo del 2009). Cuenta en placa de bacterias.
29/04/2020, de Microsoft Word Sitio web: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en- placa_6527.pdf GARCÍA ALFONSO LESLY ALONDRA
3. Betty A. Forbes. (2009). Microorganismos Viables. En Diagnostico
4. Paco Camarasa Menor. (2014). Métodos en microbiología. 29/04/2020, de
SlideShare Sitio web: https://www.slideshare.net/gathycat/mtodos-en- microbiologa GARCÍA PERALTA LUIS FELIPE
5. ENRIQUE IAÑEZ PAREJA. (17 de agosto de 1998). CRECIMIENTO A
NIVEL DE POBLACIONES. 29/04/2020, de Hipertextos del área de biología Sitio web: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro- ianez/14_micro.htm MONTALVO MERCHANT DIANA DE LOS ÁNGELES
6. Ramírez S. (2017). Análisis de técnicas de recuento de Microorganismos.
29/04/2020, de GOOGLE PDF Sitio web: file:///C:/Users/Rub %C3%AD/Downloads/3665-Texto%20del%20art%C3%ADculo-6051-1-10- 20181029%20(1).pdf TEJEDA DE LA PAZ DULCE MARÍA
CELULAR Y TASA DE CRECIMIENTO. 29/04/2020, de ResearchGate Sitio web: https://www.researchgate.net/publication/253237563_CONCENTRACION_ RECUENTO_CELULAR_Y_TASA_DE_CRECIMIENTO
WONG HERNÁNDEZ LUIS FERNANDO
8. Anónimo. (2008). RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES. 29/04/2020, de