Guía #2 Cinética Enzimática 2020
Guía #2 Cinética Enzimática 2020
Guía #2 Cinética Enzimática 2020
CINÉTICA ENZIMÁTICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
CQU 310
2020
VICERRECTORÍA ACADÉMICA
INSTITUTO DE CIENIAS NATURALES
CURSO DE BIOQUÍMICA
RESULTADOS DE APRENDIZAJE
• Identificar la clasificación, función y regulación de las enzimas analizando factores físicos y químicos
del medio.
LABORATORIO VIRTUAL
CINÉTICA ENZIMÁTICA
INTRODUCCION
La enorme variedad de reacciones bioquímicas que comprende la vida son mediadas, casi todas
ellas, por una serie de catalizadores biológicos conocidos como enzimas.
Las enzimas son proteínas con actividad catalítica, es decir aumentan la velocidad de una reacción
química, permitiendo así que el sustrato se transforme en producto de manera más rápida. La
enzima se une al sustrato formando el complejo Enzima – Sustrato, una vez que se ha formado
el nuevo producto, la enzima se separa de éste quedando libre para recibir a otra molécula de
sustrato.
Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más importantes son:
concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y
activadores), pH, fuerza iónica y temperatura. (Véase clase 8, enzimas ll, Cátedra Bioquímica CQU-
310)
La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, los
catalizadores biológicos son sólo activos en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría
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de los casos una zona de pH óptimo y una disminución de la actividad enzimática a ambos lados del
pH “óptimo”. El efecto del pH en la actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios en el
estado de ionización de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el
complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH óptimo, predomina la forma iónica activa, a valores
extremos de pH su proporción disminuye, aumentando la proporción de formas iónicas no activas; a
causa de lo anteriormente mencionado, la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la
forma de una campana. El pH no sólo afecta la actividad de las enzimas, sino que también la
estabilidad, lo que contribuye a la disminución de la actividad generalmente a valores extremos de
pH.
Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores
determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reacción y el efecto
de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Al igual que sucede con los catalizadores químicos,
un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre cierta
temperatura hay inactivación de la enzima, lo que conlleva a una disminución en la velocidad de
reacción. La zona de temperatura en la cual se observa la mayor actividad enzimática se conoce
como “temperatura óptima”, ésta tiene sólo valor operativo, ya que depende de una serie de factores,
como el pH y el tiempo de reacción.
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Glucosidasa +
p-NPG p-nitrofenolato
(Amarillo)
Las β-Glucosidasas son un grupo heterogéneo y bien caracterizado dentro de las enzimas
glucosidasas. Estas enzimas, catalizan la reacción de hidrólisis de enlaces O-β-Glicosídicos del
extremo terminal no reductor de oligosacáridos de cadena corta y de disacáridos, liberando β-D-
glucosa.
Las β-glucosidasas están extensamente distribuidas en la naturaleza. Dependiendo del organismo
del que proceden y de la especificidad de sustrato de la enzima, las β-glucosidasas están
implicadas en diferentes funciones fisiológicas. En bacterias y hongos, las β-glucosidasas se
encuentran fundamentalmente formando parte de complejos o sistemas multienzimáticos
denominados celulasas, los cuales se encargan de la degradación de la celulosa.
La β-glucosidasa de almendra, presenta pH óptimo de catálisis, entre pH 4 y pH 5; y el rango de
temperatura óptima abarca desde los 15 ºC hasta los 50ºC, dondela mayor actividad es a 40ºC.
Presenta una alta eficacia catalítica al usar pNPG.
Para la obtención de velocidad de la reacción se considera la concentración de producto formado
(p-Nitrofenol) en función del tiempo.
De la misma manera que determinó concentración en las muestras problemas en los prácticos 1
y 2 usando la ley de Lambert-Beer, se puede calcular la concentración de p-Nitrofenol:
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A – A0
C = ------------
·l
Pero a esta debe agregar el tiempo de reacción para obtener la velocidad. Como se indica en la
siguiente formula:
A Ao 1
v
l t
A = Absorbancia
A o = Intercepto curva de calibrado
·, = pendiente curva de calibrado
t = tiempo (minutos)
Una unidad enzimática que suele usarse es la Unidad Internacional (UI) de actividad enzimática y
se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mol de producto por minuto
en condiciones definidas de ensayo.
PARTE EXPERIMENTAL
Nota:
1.- Se pre-incuban los tubos sólo con sustrato por 3 minutos a la temperatura
correspondiente.
BLANCO: Se prepara con 0,9 ml de sustrato más 0,2 ml de Na2CO3 y por último 0,1 ml. de
enzima. Se emplea el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
BLANCO: Se prepara con 1 ml de sustrato más 0,2 ml de Na2CO3 y por último, 0,1 ml de
enzima. Para cada pH debe preparar un blanco.
CALCULOS:
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