Guía #2 Cinética Enzimática 2020

VICERRECTORÍA ACADÉMICA
INSTITUTO DE CIENIAS NATURALES

CURSO DE BIOQUÍMICA
GUÍA LABORATORIO N°2
CINÉTICA ENZIMÁTICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
CQU 310
2020
RESULTADOS DE APRENDIZAJE
• Identificar la clasificación, función y regulación de las enzimas analizando factores físicos y químicos
del medio.
• Analizar resultados experimentales de laboratorio mediante la aplicación de principios fisicoquímicos

y fisiológicos, con el uso de herramientas computacionales.
LABORATORIO VIRTUAL
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA EN REACCION ENZIMATICA
INTRODUCCION
La enorme variedad de reacciones bioquímicas que comprende la vida son mediadas, casi todas
ellas, por una serie de catalizadores biológicos conocidos como enzimas.
Las enzimas son proteínas con actividad catalítica, es decir aumentan la velocidad de una reacción
química, permitiendo así que el sustrato se transforme en producto de manera más rápida. La
enzima se une al sustrato formando el complejo Enzima – Sustrato, una vez que se ha formado
el nuevo producto, la enzima se separa de éste quedando libre para recibir a otra molécula de
sustrato.
La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentración del

producto o a la disminución de la concentración del sustrato de la reacción en el tiempo.
Existen diferentes métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o productos. Entre
los métodos físico-analíticos destacan los ópticos, que se basan en la absorción de radiación
electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de extinción de un
compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia a un
tiempo dado. (Espectrofotometría, véase guía de laboratorio 1, CQU-310 UDLA)
Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más importantes son:
concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y
activadores), pH, fuerza iónica y temperatura. (Véase clase 8, enzimas ll, Cátedra Bioquímica CQU-
310)
La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, los
catalizadores biológicos son sólo activos en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría
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de los casos una zona de pH óptimo y una disminución de la actividad enzimática a ambos lados del
pH “óptimo”. El efecto del pH en la actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios en el
estado de ionización de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el
complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH óptimo, predomina la forma iónica activa, a valores
extremos de pH su proporción disminuye, aumentando la proporción de formas iónicas no activas; a
causa de lo anteriormente mencionado, la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la
forma de una campana. El pH no sólo afecta la actividad de las enzimas, sino que también la
estabilidad, lo que contribuye a la disminución de la actividad generalmente a valores extremos de
pH.
Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores
determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reacción y el efecto
de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Al igual que sucede con los catalizadores químicos,
un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre cierta
temperatura hay inactivación de la enzima, lo que conlleva a una disminución en la velocidad de
reacción. La zona de temperatura en la cual se observa la mayor actividad enzimática se conoce
como “temperatura óptima”, ésta tiene sólo valor operativo, ya que depende de una serie de factores,
como el pH y el tiempo de reacción.
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En este práctico, se observará el efecto que producen los cambios de pH y temperatura en la

actividad de la enzima -glucosidasa de almendra dulce. Se determinará la velocidad de la
hidrólisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-glucopiranósido (pNPG), midiendo la formación
de un producto de la reacción, el p-nitrofenolato, que en un medio alcalino es de color amarillo y
presenta un máximo de absorción alrededor de 405 nm
Glucosidasa +
p-NPG p-nitrofenolato
(Amarillo)
Las β-Glucosidasas son un grupo heterogéneo y bien caracterizado dentro de las enzimas
glucosidasas. Estas enzimas, catalizan la reacción de hidrólisis de enlaces O-β-Glicosídicos del
extremo terminal no reductor de oligosacáridos de cadena corta y de disacáridos, liberando β-D-
glucosa.
Las β-glucosidasas están extensamente distribuidas en la naturaleza. Dependiendo del organismo
del que proceden y de la especificidad de sustrato de la enzima, las β-glucosidasas están
implicadas en diferentes funciones fisiológicas. En bacterias y hongos, las β-glucosidasas se
encuentran fundamentalmente formando parte de complejos o sistemas multienzimáticos
denominados celulasas, los cuales se encargan de la degradación de la celulosa.
La β-glucosidasa de almendra, presenta pH óptimo de catálisis, entre pH 4 y pH 5; y el rango de
temperatura óptima abarca desde los 15 ºC hasta los 50ºC, dondela mayor actividad es a 40ºC.
Presenta una alta eficacia catalítica al usar pNPG.
Para la obtención de velocidad de la reacción se considera la concentración de producto formado
(p-Nitrofenol) en función del tiempo.
De la misma manera que determinó concentración en las muestras problemas en los prácticos 1
y 2 usando la ley de Lambert-Beer, se puede calcular la concentración de p-Nitrofenol:
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A – A0
C = ------------
·l
Pero a esta debe agregar el tiempo de reacción para obtener la velocidad. Como se indica en la
siguiente formula:
A  Ao 1
v  
 l t
A = Absorbancia
A o = Intercepto curva de calibrado
·, = pendiente curva de calibrado
t = tiempo (minutos)
El valor de Coeficiente de Extinción a considerar para p-Nitrofenol medido a

405 nm es 18,45 (mM x cm)-1; por tanto, la unidad de velocidad es mM/min
Una unidad enzimática que suele usarse es la Unidad Internacional (UI) de actividad enzimática y
se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mol de producto por minuto
en condiciones definidas de ensayo.
PARTE EXPERIMENTAL
Ensayo de Actividad Enzimática: Determinación de la Actividad -Glucosidasa (Método

Discontinuo):
0,9 ml de p-nitrofenil--D-glucopiranósido (pNPG) 2 mM disuelto en el tampón apropiado

se pre- incuba durante 3 min., a 40 ºC, o a la temperatura indicada, luego se inicia la reacción al
adicionar 0,1 ml de extracto enzimático. La reacción se detiene después de 5 minutos con 0,2 ml
de Na2CO3 1M. El p-nitrofenolato producido se lee a 405 nm y se determina su concentración en
una curva estándar (calibrado) de p-nitrofenolato.
A) EFECTO TEMPERATURA: Se preparan tres tubos con concentraciones constantes de

enzima y sustrato, a un valor de pH apropiado (pH = 5,0) y se incuban a diferentes
temperaturas un tiempo determinado, de acuerdo con la tabla indicada a continuación.
Nota:
1.- Se pre-incuban los tubos sólo con sustrato por 3 minutos a la temperatura
correspondiente.
2.- Se debe controlar la temperatura del ambiente.

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Transcurrido el tiempo de incubación, se detiene inmediatamente la reacción, agregando

el carbonato de sodio y se mide la absorbancia de cada tubo a 405 nm.
Tubos PnPg Pre- Enzima Incubación Na2CO3

2mM Incubación
Estándar 25°C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
M.P.1 40°C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
M.P.2 100°C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
BLANCO: Se prepara con 0,9 ml de sustrato más 0,2 ml de Na2CO3 y por último 0,1 ml. de
enzima. Se emplea el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
B) EFECTO pH: Se preparan los tubos empleando concentraciones constantes de enzima y

sustrato a diferentes pH; se incuban a la temperatura determinada como óptima por 5 min. Se
detiene la reacción agregando a cada tubo 0,2 ml de carbonato de sodio 1,0 M. Lea la absorbancia
a 405 nm en el espectrofotómetro.
Tubos PnPg 2mM Preincubación Enzima Incubación Na2CO3

pH 3.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
pH 5.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
pH 7.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
BLANCO: Se prepara con 1 ml de sustrato más 0,2 ml de Na2CO3 y por último, 0,1 ml de
enzima. Para cada pH debe preparar un blanco.
CALCULOS:
1. Con los resultados obtenidos y utilizando el coeficiente de extinción milimolar,

calcule la velocidad de la reacción en las diferentes condiciones de Temperatura y
pH.
2. Grafique los resultados obtenidos de velocidad enzimática.
- Grafico 1: “Efecto de la Temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática”
Grafico 2: “Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.
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2.- Se debe controlar la temperatura del ambiente.

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