MANUAL DE HISTOLOGÍA.

TEJIDOS FUNDAMENTALES
Juan Fernando Cediel, María Helena Cárdenas, Ananías García, Lilian Chuaire,
César Payán, Victoria Villegas, Carolina Sánchez

CAPITULO II
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

1.- OBJETIVOS

1.1.- GENERAL

Comprender la importancia de las preparaciones histológicas como herramientas que

permiten correlacionar la estructura de los tejidos con su función biológica.

1.2.- ESPECÍFICOS

.- Identificar las distintas etapas requeridas en la preparación de una muestra

histológica, que será observada en el microscopio óptico compuesto.

.- Reconocer las principales tinciones de uso histológico, su aplicación e importancia en

el diagnóstico, enfatizando en la coloración de hematoxilina eosina.

.- Conocer la importancia del diagnóstico histopatológico, en las ciencias de la salud.

.- Establecer las principales diferencias entre la técnica histológica de las preparaciones

para microscopía de luz y electrónica.

2.- INTRODUCCIÓN

En histología (histo: tejidos; logos: estudio de), para realizar una adecuado análisis de
los diferentes tejidos, es necesario partir de un correcto procesamiento de los diferentes
tipos de muestra. Los procesos involucrados en la preparación de dicho tejidos en
conjunto se denominan técnicas histológicas, las cuales son realizadas por personal
experto en el campo de las histotecnología.

En el área médica es trascendental el análisis histológico; en primer lugar porque

permite correlacionar la estructura de las diferentes células, tejidos, órganos y sistemas
con las funciones realizadas por cada uno de ellos. Asimismo, partiendo del
conocimiento histológico de las estructuras normales, podemos analizar su
comportamiento desde la perspectiva de la enfermedad. Es evidente entonces que una
buena calidad histotecnológica repercutirá en la adecuada interpretación histopatológica
de los especímenes.

3.-FUNDAMENTOS DE HISTOTECNOLOGÍA

La histotecnología es la parte de la histología encargada de la obtención de cortes de

muestras histológicas, bien sea de tejidos vivos o de tejidos inertes.
Estas técnicas tiene como fin conservar la relación estructural entre los diferentes tipos
celulares y su medio, y al mismo tiempo realizar cortes muy finos de los tejidos, que
permitan su análisis microscópico. Estos cortes deben permitir el paso de luz, y evitar la
superposición visual de sus componentes.

Dado que el grosor de un corte a veces es menor que el diámetro de muchas células, lo
que vuelve al tejido extraordinariamente frágil, es necesario adherirlo a una lámina de
vidrio para manipularlo con facilidad.

El producto final –es decir, la preparación montada- se conoce como corte histológico, y
suele prepararse mediante la técnica con parafina que se describirá detalladamente en
este capítulo. Sin embargo, es importante tener en cuenta que existen otros tipos de
técnicas para preparar los diferentes tipos de cortes.

Las diversas técnicas para preparar los tejidos buscan que estos se asemejen a su
estado viviente natural. Con este fin se ha desarrollado una serie de etapas consecutivas
para el manejo de los tejidos: obtención de la muestra; fijación; deshidratación,
aclaración e infiltración; corte; montaje, y tinción.

3.- OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

El primer paso consiste en obtener el material biológico de estudio; con este fin existen
diferentes tipos de procedimientos más o menos invasivo, que oscilan desde el raspado
de las capas más superficiales del tejido –como el realizado en la citología cérvico-
vaginal- hasta la extracción completa del órgano, efectuada por métodos quirúrgicos.
Otra fuente de tejidos consiste en su obtención de un cadáver, mediante el
procedimiento de la autopsia.

Cuando se obtienen de diferentes órganos o parte de ellos, es necesario obtener

pequeños fragmentos llamados bloques. Es esencial procesar la muestra lo más
rápidamente posible, con el fin de evitar la degeneración que ocurre luego de la
extracción. Asimismo, es necesario disecar con cuidado el tejido, por medio de
instrumentos cortantes adecuados, y de esa manera no deformar su imagen
microscópica.

Para poder continuar con el procesamiento de la muestra, el bloque no debe exceder de

un centímetro en cualquier dimensión, y tan pronto se le ha extraído, debe estar en
contacto dentro de una solución fijadora.

3.2.- FIJACIÓN DEL TEJIDO

El proceso de fijación tiene como objetivo preservar los tejidos deteniendo la autolisis, y
además permitir que los tejidos permanezcan sin cambios, luego de subsecuentes
tratamientos.
De modo ideal los tejidos se endurecen ligeramente, pero no se fragmentan,
permitiendo que las estructuras tisulares no se encojan, y permanezcan en una
disposición muy similar al estado in vivo.

El proceso de fijación puede lograrse por inmersión o por perfusión. La fijación deber
hacerse inmediatamente, ya que cualquier demora deshidrata el tejido, y acelera la
autolisis.

En la sección del fijador intervienen varios factores tales como las estructuras y
entidades que van a demostrar y los efectos a corto y largo plazo del almacenaje. Hay
numerosos tipos de fijadores, cada uno con sus ventajas y desventajas; sin embargo,
los líquidos más comúnmente usados, ya sean solos o en combinación con otros líquidos
o sólidos, son el alcohol, la acetona, la formalina y el glutaraldehído.

El alcohol absoluto preserva el glucógeno; sin embargo, causa distorsión del detalle
nuclear y comprime el citoplasma.

La acetona es preferida cuando se efectúan ciertos estudios histoquímicos para enzimas

para enzimas, especialmente lipasas y fosfatasas. La acetona no se usa como un fijador
de rutina, porque causa distorsión nuclear y comprensión del citoplasma; además no
preserva el glucógeno.

La formalina o formaldehido no precipita las proteínas, aunque precipita ligeramente

otros componentes celulares. Funciona uniéndose a los grupos aminos de las proteínas,
de las cuales conserva su conformación tridimensional. Es un buen fijador de complejos
lipídicos, pero no tiene ningún efecto en las grasas neutras. Aunque la formalina no es el
fijador de elección para los carbohidratos, sí preserva las proteínas que mantienen el
glucógeno, el cual entonces no se disuelve fácilmente. El formaldehido es un líquido
incoloro o gas con un olor fuerte. Es un irritante instantáneo de los ojos, la nariz, y la
garganta; la piel y el sistema respiratorio son particularmente afectados. Por esto es
necesario manejar una serie de medidas de protección, en el momento de manipular
este fijador, que deben incluir una adecuada ventilación y exteriorización de gases,
períodos de exposición limitados o restringidos y lavado concienzudo, si hay contacto
sobre la piel.

Aunque la fijación con formalina es universalmente aceptada como ideal, sus efectos son
considerados como de fijación suave.

El glutaraldehido actúa más lentamente que el formaldehido, y es muy valioso en

microscopía electrónica y en histoquímica enzimática.

3.3.- DESHIDRATACIÓN, ACLARACIÓN E INFILTRACIÓN DEL TEJIDO

Estos tres pasos secuenciales del procesamiento de tejidos tienen como fin remover toda
el agua que se pueda extraer de los tejidos, y reemplazarla con un medio que se
solidifique, para de esta manera facilitar el corte de dichos tejidos.
Inicialmente se lava la muestra con el fin de remover el exceso de formalina, y se
procede a deshidratar. Durante la deshidratación se prefieren los alcoholes isopropílico y
etílico, con la ventaja de que el alcohol isopropílico es más barato que el etanol, y no se
encuentra en la lista de sustancias controladas.

Estos alcoholes, con el fin de deshidratar el tejido, se utilizan en diferentes

concentraciones que oscilan entre el 70 y el 100 por ciento; de manera que la muestra
se sumerge primero en bajas concentraciones de alcohol y consecutivamente, en
concentraciones crecientes hasta el alcohol absoluto.

Seguidamente, se utiliza el xileno o xilol, que es uno de los muchos agentes aclarantes
que reemplazan el alcohol, siendo además miscible con la parafina. Generalmente se
utiliza el xilol, debido a su compatibilidad con muchos tipos y tamaños de especímenes,
en muestras que serán manejadas en la inclusión rutinaria en parafina. Otros agentes
aclarantes son el tolueno y el benceno.

Por último, con el objeto de distinguir las células sobrepuestas en un tejido y la matriz
extracelular, los tejidos deben embeberse o infiltrarse en un medio apropiado que
permita realizar cortes en rebanadas delgadas. En la microscopía de luz, el agente de
rutina para embeber o infiltrar las muestras es la parafina. La parafina es una mezcla de
hidrocarburos sólidos derivados del petróleo, blanca o incolora, más o menos translúcida
e inodora. Al exponerla inicialmente al tejido se encuentra fundida, y luego por
enfriamiento se endurece. Existen varios tipos de parafina, cada uno con un punto de
fusión distinto; las parafinas más blandas tienen un punto de fusión a los 45° C, y
funcionan mejor con tejidos blandos tales como los tejidos conectivos del feto (véase
capítulo 6); mientras que las parafinas duras se derriten cerca a los 60° C, y son las
mejores para tejidos duros, tales como el tejido conectivo denso o el tejido óseo (Véase
capítulo 7).

Todo este proceso se realiza en unos recipientes denominados cassettes, los que por
medio de unas perforaciones permiten el intercambio de los diferentes fluidos (véase
lámina 2.1).

Existen otros medios de infiltración diferentes de la parafina tales como el parapolast y

asimismo, otros medios plásticos se utilizan cuando es necesario realizar cortes muy
finos.

De igual manera, es posible preparar tejidos con métodos de congelación; cuando se

busca realizar una preparación rápida del tejido, y de esta manera conservar proteínas y
en general estructuras que se degradan por los métodos de preparación ya observados.
En estos métodos no se realizan los procesos de deshidratación, ya que la misma agua
del tejido congelada proporciona la consistencia necesaria para realizar los cortes. Como
métodos de congelación encontramos el nitrógeno líquido con temperaturas hasta de
-190° C.
3.4.- CORTE

Una vez que se elimina el exceso de parafina, se monta el tejido embebido en una
máquina conocida como micrótomo que permite cortarlo finamente. Estos cortes de
meustra en parafina se efectúan con hojas de acero inoxidable.

Se usan dos clases de micrótomos en muestras usadas en microscopia de luz; el

micrótomo rotatorio, el más usado, en el que se mueve el bloque que se está cortando,
y el micrótomo deslizante en el cual la cuchilla se desplaza, es particularmente útil
cuando se está cortado bloques grandes, incluido el montaje de preparaciones enteras.

Durante el corte rutinario de tejidos, lo usual es escoger un grosor de 6 micrometros;

sin embargo, cuando se cortan tejidos altamente celulares, como los ganglios linfáticos,
el grosor apropiado es de 4 micras. Al disminuir el tamaño de la tajada se reduce la
superposición de núcleos.

Por el contrario, los especímenes neurológicos deben cortarse con un espectro de grosor
más amplio, de 6 a 20 micrómetros, ya que elementos tisulares elongados, tales como
nervios mielínicos, se ven mejor cuando los cortes son de mayor grosor.

Se han desarrollado micrótomos que permiten realizar cortes mucho más finos, hasta de
0.1 micras, que se denominan ultramicrotomos.

Cuando los cortes se efectúan en ejemplares congelados en nitrógeno líquido, otra

solución congelante, se cortan a temperaturas por debajo de 0° C, mediante una hoja de
acero enfriada previamente en un aparato denominado criostato. Este tipo de cortes se
emplean cuando se necesita demostrar componentes que se perderían al prepararse de
otra manera, por lo que son especialmente útiles en técnicas histoquímicas,
inmunohistoquímicas, o cuando se pretende observar elementos como los lípidos.

3.5.- MONTAJE

Después de obtener los cortes en forma de cinta, se colocan suavemente en el baño de

flotación para eliminar arrugas y aire atrapado debajo; la temperatura utilizada es de
unos cuantos grados por debajo del punto de fusión de la parafina.

Las muestras son montadas en láminas de vidrio portaobjetos cubiertas con material
adherente, tradicionalmente albúmina. Con el fin de disolver la parafina, se utilizan altas
temperaturas y xilol y luego, concentraciones decrecientes de alcohol que buscan
rehidratar el tejido ya montado véase lámina 2.2).

3.6.- TINCIÓN

Como muchos constituyentes tisulares tienen aproximadamente las mismas densidades

ópticas, deben teñirse para observarse en microscopía de luz, lo cual se efectúa
principalmente con colorantes hidrosolubles.
Después de la tinción, la muestra se lava y se elimina el exceso de colorante, y se
deshidrata una vez más, de modo que pueda fijarse de manera permanente en el
portaobjeto, con un medio de montaje adecuado.

La laminilla cubreobjeto (véase lámina 2.2) que se coloca sobre la muestra no sólo
protege al tejido del daño, sino que además es necesaria para poder ver el corte con el
microscopio.

4.- MÉTODOS DE TINCIÓN

Existen varios tipos de tinción que se han desarrollado para ver muchos componentes
células y tisulares; muchos de ellos se han logrado empíricamente; sin embargo, se
busca evidenciar otras reacciones químicas, que se dan entre los colorantes y las
diferentes moléculas.

Se pueden agrupar en tres clases de tinciones que distinguen entre los componentes
ácidos y básicos de la célula; tinciones especiales que reconocen elementos particulares
intra y extracelulares, y sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman
depósitos metálicos en ellos.

Los colorantes ácidos poseen cargas negativas (aniones) que tienden a teñir las
sustancias cargadas positivamente, consideradas acidófilas (véase lámina 2.3). Por el
contrario un colorante básico cargado positivamente (catión) es afín con las sustancias
con carga negativa, descritas como basófilas (véase lámina 2.3).

La tinción empleada más a menudo en histología es una coloración compuesta por dos
colorantes: la hematoxilina y la eosina (véase lámina 2.3).

La hematoxilina –un colorante natural- fue usada por primera vez alrededor de 1863. En
combinación con sales de aluminio, hierro, cromo cobre es una tinción nuclear
excelente. El agente colorante activo, la hemateína, se forma por la oxidación de la
hematoxilina. Existen varios procedimientos para teñir con la hematoxilina, como el
método de Mayer y el de Harris. El método de Harris tiñe todas las estructuras tisulares,
núcleos, citoplasma y matriz extracelular. El método de Mayer es un procedimiento que
solamente tiñe los núcleos. A continuación describimos el método de Harris para teñir
las muestras con hematoxilina y eosina:

.- Previa fijación de las muestras con formalina al 10%, se realizan cortes de 3 a 8

micras.

.- Las muestras desparafinizadas se hidratan hasta llegar al agua destilada.

.- Se tiñe la muestra con hematoxilina de Harris durante 6 a 15 minutos.

.- Se lava la lámina con agua corriente de 2 a 5 minutos.

.- Posteriormente se diferencia en alcohol ácido al 1%, y se lava brevemente en agua
corriente.

.- La lámina se coloca en una solución débil de agua amoniacal o en una solución

saturada de carbonato de litio, hasta que las secciones se vean de color azul brillante, y
se lava concienzudamente en agua corriente por 10 minutos.

.- Luego se coloca la muestra en etanol al 80%, durante uno o dos minutos.

.- Con el fin de contrastar a tinción de hematoxilina, se coloca la lámina en solución de

eosina-floxina, durante dos minutos.

.- Se deshidrata y aclara la muestra a través de dos cambios de etanol al 95% cada uno,
luego etanol absoluto, y luego xileno; dos minutos en cada cambio.

.- Finalmente se monta con medio resinoso.

Con esta tinción se obtendrán los núcleos en la gama de los azules y violetas, debido a
la basofilia que tiene el ácido desoxirribonucleico, asimismo, se teñirán algunos
componentes aniónicos citoplasmáticos como el RNA, algunas proteínas extracelulares y
otros como los glucosaminoglicanos.

Sin embargo, la mayor parte de los componentes citoplasmáticos membranosos y no

membranosos, igual que la mayoría de las moléculas extracelulares, como el colágeno,
al ser cationes se colorearán con la eosina, dando una apariencia rosada (véase lámina
2.4).

Otros colorantes que se basan en la selección de ácidos y bases son: el azul de

toluidina, el azul de metileno, la carmina, la fucsia, el naranja G y el ácido pícrico.

Es importante tener en cuenta que al igual que la tinción con hematoxilina eosina,
existen otras coloraciones compuestas por dos o más de estos reactivos, como por
ejemplo la coloración de Van Gieson, o las coloraciones tricrómica de Mallory, tricrómica
de Masson (véase lámina 2.5) y la tricrómica de Heidenhain.

Con el tiempo se han desarrollado múltiples coloraciones, cada una encaminada al

reconocimiento de estructuras específicas; como ejemplo de estas coloraciones
encontramos, dentro de las más reconocidas: la coloración con ácido peryódico de Schiff
o coloración con PAS (véase lámina 2.6), la tinción con orceína (véase lámina 2.7),
coloración de Weigert (véase lámina 2.8) la técnica de Sudan, la coloración de May-
Grünwald-Giemsa (véase lámina 2.9) y el método de Wrigth (Véase lámina 2.10);
Encontramos también tinciones dirigidas a la identificación de microorganismos, por
ejemplo la coloración de Gram (véase lámina 2.11), la coloración de Ziehl Neelsen
(véase lámina 2.12) o la coloración con tinta china (véase lámina 2.13).

Con el fin de demostrar estructuras finas, como las prolongaciones celulares o las fibras
reticulares, se han desarrollado técnicas con sales metálicas que se precipitan y
evidencian este tipo de estructuras; dentro de estas coloraciones existen algunas con
plata denominadas coloraciones argénticas (véase lámina 2.14), como por ejemplo el
método de Bodian o el método de Bielchowsky, y coloraciones con sales de oro como el
método de Cajal.

De desarrollo más reciente son las técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas (véase

lámina 2.15).

En los métodos histoquímicos, se utilizan agentes visualizadores que evidencian

productos de reacciones enzimáticas con los cuales reaccionan, localizando la presencia
de determinada actividad enzimática. Los métodos inmunohistoquímicos utilizan
anticuerpos o inmunoglobulinas (véanse capítulos 8 y 9), dirigidos contra la proteína
particular que se requiere evidenciar; dichos anticuerpos, para ser observados tienen
asociada una sustancia cromógena visible al microscopio de luz o una sustancia
fluorescente, fluorocromo, visible por microscopía de fluorescencia en el esquema 2.1 se
expone la manera como funcionan la mayoría de las técnicas inmunohistoquímicas.