ANTIESTREPTOLISINAS.

PRESENTACIÓN.
La estreptolisina O es una proteína antigénica que solo se activa en forma reducida (de
donde deriva su designación “O” por ser lábil frente al oxigeno); es una citotóxica general, que lisa
los leucocitos, las células hísticas y las plaquetas, y no parece tener actividad enzimática, sino que
se inserta directamente la membrana de las células huésped, formando poros circulares a través
de la membrana en la superficie celular. Dicha estreptolisina es producida en la mayoría de las
cepas Lancefield de estreptococos del grupo A, así como por algunas cepas de los grupos C y G.
A menudo se forman anticuerpos contra estreptolisinas O como consecuencia de la infección
y la inhibición de la hemólisis por esos anticuerpos constituye la base para la prueba de
antiestretolisina O.
Se han diseñado varias pruebas serológicas para facilitar el diagnóstico de las secuelas
post-estreptocócicas. Entre ellas incluyen las pruebas antiestreptolisinas (ASO), anti-DNAasa B,
antiestreptocinasa y antihialuronidasa. Puesto que en el suero de los pacientes con fiebre
reumática suelen encontrarse títulos altos de ASO, esta prueba es la que se emplea con mayor
frecuencia.
Para la identificación definitiva de una especie del grupo A, se requiere la demostración del
antígeno específico mediante procedimientos de precipitación, inmunofluorescencia o aglutinación.
El tipo de prueba que se utiliza más frecuentemente es la de neutralización, denominada a
menudo prueba hemolítica. Se basa en la capacidad de la estreptolisina O reducida de actuar
como una hemolisina y lisar eritrocitos. De este modo, los eritrocitos sirven como un indicador de sí
la propiedad hemolítica del antígeno estreptolisina O ha sido neutralizada por el anticuerpo ASO, o
está libre para lisar los eritrocitos en ausencia de ASO.
Un título elevado ASO es de gran ayuda en el diagnóstico de las infecciones estreptocócicas
recientes del grupo A, en fiebre reumática aguda y glomérulonefritis aguda. El título ASO es normal
en artritis reumatoide.

OBJETIVO DEL MANUAL.

Conocer y aplicar el procedimiento de la determinación de antiestreptolisinas por el método
de neutralización, para garantizar un resultado de calidad emitido por el laboratorio clínico.

PROPOSITO DEL EXAMEN O ANÁLISIS.

Método hemolítico para la determinación del titulo de antiestreptolisinas.

RESPONSABILIDADES.
El analista debe ser químico o técnico clínico, estudiante de 9º semestre con un
entrenamiento supervisado durante cinco reproducciones por lo menos.

DEFINICIONES.
ASO. Antiestreptolisinas. Anticuerpo inducido por la estreptolisina estreptocócica. Su
determinación se utiliza como prueba de actividad de procesos estreptocócicos.
PRINCIPIO DEL MÉTODO Y PROCEDIMIENTO EMPLEADO PARA
EL ANÁLISIS.
La estreptolisinas O, producida por el estreptococo ß-hemolítico de grupo A, tiene la
propiedad de producir hemólisis cuando se pone en contacto con glóbulos rojos. Al colocar
distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis
constantes de estreptolisina O, se produce una reacción antígeno-anticuerpo que neutraliza la
capacidad hemolítica de la misma. Este fenómeno se evidencia por una inhibición de la hemólisis
al agregar suspensión de glóbulos rojos del 3 al 5%. El título de antiestreptolisina será la recíproca
de la máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina.

ESPECIFICACIONES DE EJECUCIÓN.
Límites de detección.
Tiene un límite de detección de 200U/mL. Cuando la concentración de ASO en suero es
igual o superior a 200Ul/mL se obtiene un resultado positivo y cuando es inferior el resultado es
negativo.

Sensibilidad analítica.
En el método de aglutinación directa en placa, las serolipoproteínas, los productos de
desarrollo bacteriano, o la estreptolisina “O” oxidasa, no causan falsos títulos como en la prueba
de neutralización.
En pacientes con fiebre reumática, las pruebas de anticuerpo estreptocócico son, en
general, un indicador más fidedigno de infección estreptocócica reciente que los cultivos de
exudado faríngeo.
La tipificación serológica es realizada cuando se requiere una clasificación definitiva y por
razones epidemiológicas, por ser más rápidas que los cultivos.

Error sistemático.
 La fuerza de la reacción positiva puede variar de una aglutinación gruesa a una fina o parcial
aglutinación y esto no tiene correlación con el titulo.
 La ligera granulosidad del látex no debe de ser confundida con un resultado positivo. La
comparación con el control negativo facilita el reconocimiento de una aglutinación significativa.
 La agregación de partículas de látex que semeja una aglutinación puede ocurrir si la lectura no
se realiza inmediatamente y se deja pasar más tiempo de lo establecido.
 La oxidación de la estreptolisina “O” anula su capacidad hemolítica, pero no interfiere en su
combinación con el anticuerpo antiestreptolisina.
 Preferentemente se deben utilizar glóbulos del grupo sanguíneo “O”, para evitar
interferencias con los antígenos de superficie de la membrana eritrocitaria.

Limitaciones del procedimiento.

En caso de conservar la estreptolisina O reconstituida congelada, se recomienda
fraccionarla de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos sucesivos que ocasiona
deterioro.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis.
b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemólisis visibles pueden conducir a una
interpretación errónea de los resultados, por lo que deben descartarse.
 d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero es estable
congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta efectuar el ensayo.

TIPO DE MUESTRA PRIMARIA.

 Suero en tubo con tapón rojo sin aditivos.

EQUIPO Y REACTIVOS REQUERIDOS.

REACTIVOS.
 Estreptolisina – O: estreptolisina liofilizada titulada.
 Buffer concentrado: solución de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0.36 mol/L, para pH final
6.5.
 Agua destilada.
 Eritrocitos frescos humanos de grupo O, de un paciente o de conejo.
 Solución fisiológica.
INSTRUCCIONES PARA SU USO.
Buffer; preparación: diluir el contenido del frasco con el volumen de agua destilada
indicando en el rótulo, mezclando por inversión hasta disolución completa.
Suspensión de eritrocitos: lavar los mismos 3 veces con solución fisiológica. Luego del
último lavado centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos, en el sobrenadante no debe aparecer
hemólisis; caso contrario desechar. Con eritrocitos lavados, una vez descartando el sobrenadante,
preparar una suspensión del 3 al 5% con buffer pH 6.5.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO.

Reactivos provistos: son estables en refrigerador (2-10 ° C) hasta la fecha de vencimiento.
Estreptolisina –O: una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente, 5 días en
refrigeración (2-10 ° C) o dos meses congelada (-20 ° C) y fraccionada.
Buffer: establece 1 año en refrigerador (2-10 ° C).
Suspensión de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas después de
preparada la suspensión, si previamente se lavan una vez con Buffer y no se observa hemolisina.

MATERIAL REQUERIDO.
 Tubos de ensayo 13 X 100.
 Material volumétrico apropiado.
 Centrífuga.
 Baño de agua a 37 ° C.
 Pipetas serológicas.

TEMPERATURA.
 Temperatura de reacción: 37 ° C.
 Tiempo de incubación: 60 minutos.

PASOS DEL PROCEDIMIENTO.

METODO EN PLACA.
Las partículas de látex del reactivo, están recubiertas con estreptolisina O purificada y
estabilizada. Cuando mezclamos la suspensión de partículas de látex y un suero con una elevada
concentración de ASO, se produce una aglutinación visible a los dos minutos.
METODO EN TUBO.
La prueba se realiza preparando varias diluciones del suero del paciente, añadiendo un
volumen constante de estreptolisina O a cada dilución, incubando luego la mezcla para permitir la
combinación del antígeno y el anticuerpo. Esto es seguido de la adición de un volumen constante
de eritrocitos a la mezcla. Si el ASO está presente en el suero en cantidad suficiente, se combina
con la estreptolisina O, impidiendo la lisis de los eritrocitos. El punto final de la prueba de Todd, es
la mayor dilución de suero que no presenta hemólisis.

PROCEDIMIENTO
Preparar diluciones de la siguiente forma: 1:10(0.2 mL de suero + 1.8 mL de Buffer), 1:100 (0.5mL)
de dilución 1:10 + 4.5mL de Buffer), 1:500 (1mL de dilución 1:100 + 4mL Buffer). Luego proceder
de la siguiente forma.

Dilución del 1:10 1:100 1:500 controles

suero

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Suero diluido 0.2 1 0.8 0.6 0.4 0.3 1 0.8 0.6 0.4 0.2 - -
(mL)
Buffer (mL) 0.8 - 0.2 0.4 0.6 0.7 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1
Estreptolisina- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 - 0.5
O (mL)
Mezclar y mantener a baño María a 37 ° C durante 15 minutos.
Eritrocitos 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
3-5% (mL)
Mezclar agitando ligeramente y mantener en baño María a 37 ° C durante 15 minutos, agitar
nuevamente y continuar en el baño María durante 30 minutos más. Centrifugar 3 minutos a 1500
r.p.m. y leer.
 Unidades
50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 (-) (+)
Todd/mL

DIAGRAMA DE FLUJO 1. PROCEDIMIENTO GENERAL.

Inicio

Revisar la libreta
general

¿Hay pruebas de
antiestreptolisinas No Fin
Anotadas?

Sí

Registrar en la
libreta de
inmunología

Avisar al Avisar al Realizar acciones

¿La muestra
A No responsable responsable de correctivas
es adecuada?
del área laboratorio necesarias

Sí

Habilitar el área
para realizar las
antiestreptolisinas

A: Ver manual de toma de muestra.

B: Ver diagrama de flujo 2.
Determinación de
antiestreptolisinas.
Todos los medios No
están disponibles

Sí

Realizar las
B antiestreptolisinas
registradas

La prueba de No
antiestreptolisinas
fue satisfactoria

Sí

Anotar previa Anotar en la

validación del libreta general el
responsable del resultado
área en la libreta

Fin
DIAGRAMA DE FLUJO 2. DETERMINACIÓN DE
ANTIESTREPTOLISINAS POR AGLUTINACIÓN.
Reactivos
Obtener la
Centrifugar y deben estar a
muestra en tubo
separar el suero. temperatura
sin anticuagulante.
ambiente.

Colocar una gota Añadir una gota

Homogenizar el
de suero de reactivo de
Inicio reactivo antes de
problema, control látex a cada
usarse.
+ y control -. división.

Mezclar las dos

Rotar suavamente
gotas con un
la placa durante
aplicador de
dos minutos.
madera.

Repetir los pasos Observar en un

Realizar
anteriores hasta donde Si la prueba lugar iluminado, si
diluciones 1:2, !:4,
la aglutinación no sea resulta positiva. aparece o no
1:8, !:16, etc.
evidente. aglutinación.

Reportar el resultado
de acuerdo al límite
de detección.

Fin
DIAGRAMA DE FLUJO 3. DETERMINACION DE
ANTIESTREPTOLISINAS POR NEUTRALIZACIÓN.

CONTROL DE CALIDAD.
El control pretende monitorear el procedimiento de la prueba para lograr su
reproductividad, el cual se realiza mediante los controles positivo y negativo que proporciona el
fabricante y comprueban el funcionamiento del reactivo. Además de contar con la bitácora de
control del área, en donde se lleva un registro de las muestras y los análisis efectuados. Los datos
que se contiene están bajo un régimen de confidencialidad estricto, ya que se identifica al paciente
con códigos en lugar del nombre a través de las fases analíticas, lo cual contribuye a la
confidencialidad.

INTERFERENCIAS.
 Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemólisis visibles pueden conducir a una
interpretación errónea de los resultados, por lo que deben descartarse.
 Los sueros lipémicos y contaminados pueden arrojar resultados falsos positivos.
 El plasma obtenido con anticoagulantes no es adecuado para la prueba, debido a que el
fibrinógeno presente puede causar agregación de partículas de látex.
 Otras sustancias distintas del ASO pueden neutralizar la propiedad hemolítica de la
estreptolisina “O” reducida, dando falsos títulos positivos (la betalipoproteína sérica producida
 en enfermedades hepáticas, y en ciertos productos del desarrollo de algunos bacterias como
Bacillus cereus y Pseudomonas).

REFERENCIAS.
1. Folleto: Estreptolisinas “O” Wiener lab.
2. Todd-Sanford-Davidsohn. Diagnostico y tratamiento clínico por el laboratorio. 7 ª ed. Barcelona:
Salvat, 1984:1576-1581
3. Rose NR, friedman H. El laboratorio de inmunología clínica. 2ª ed. Buenos Aires: Médica
Panamericana, 1984:492
4. Bauer JD. Análisis clínicos métodos e interpretación. Barcelona: Reverté, 1986: 927-928
5. Burrows W. Tratado de Microbiología. México: Interamericana, 1983
6. Jawez E, Warren E, Levison. Microbiología inmunología. México: El manual moderno, 1992.