Biologia Celular

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

ESTUDIANTE :

-------------
CATEDRATICO:
-----------------
INTRODUCCION

Las células eucariontes tienen orgánelos celulares delimitados por una sola membrana. Todos
ellos pueden ser separados utilizando métodos de centrifugación diferencial y por gradientes
de densidad. Dado que la mayoría de los orgánelos tienen diferente peso molecular,
viscosidad o densidad. Existen diversos tipos de purificación de orgánelos, uno de ellos es la
ultra centrifugación, que consiste en separar las células u orgánelos presentes en una mezcla
celular sometiéndola a una fuerza centrífuga. Mediante una ultracentrífuga se alcanzan
velocidades de más de 100 000 rpm, para generar una fuerza centrífuga de 500 000 G; con lo
cual se logra separar a la mezcla en dos porciones.

¨Una célula es la unidad mínima de la vida que puede sobrevivir y reproducirse por sus
propios medios gracias a la información contenida en su ADN y al aprovechamiento de
energía y materias primas. Algunas células viven y se reproducen de manera independiente.

Tipos de células

“La existencia de dos clases distintas de células, sin intermediarios conocidos, constituye una
de las divisiones de evolución más fundamentales en el mundo de la biología. Las células
procariotas, que en su estructura son más simples, incluyen a las bacterias, mientras que las
células eucariotas tienen una estructura más compleja e incluyen a los protistas, hongos,
plantas y animales.”

Métodos de estudio celular

✓ Microscopia

En casi totalidad de los microscopios el material biológico debe ser examinado por
transparencia, la luz debe atravesar los tejidos para formar imágenes, por lo cual es necesario
estudiar células aplanadas sobre la superficie de un vidrio, o finos cortes de tejidos lo
suficientemente delgados como para ser atravesados por la radiación luminosa.

- Resolución de cada microscopio: El límite de resolución del microscopio indica su

capacidad para resolver estructuras. El poder de resolución es la capacidad del
instrumento para dar imágenes individuales de puntos situados uno muy cerca del otro.
- Tinciones: emplea colorantes que tiñen selectivamente los distintos componentes
celulares. Las técnicas de coloración tienen el inconveniente de que la mayoría de los
casos no se pueden utilizar en las células vivas.
 - Contraste de fases: La microscopia de contraste de fases se usa en la actualidad como
método de rutina para la observación de células y tejidos vivos, y es particularmente
valiosa en el estudio in vivo de células cultivadas.
- Fluorescencia: La aplicación más importante del microscopio de fluorescencia reside
en la posibilidad de unir colorantes fluorescentes, como algunas de las
inmunoglobulinas u otras moléculas utilizadas en los métodos inmunohistoquímicos.
- Microscopia de fondo oscuro: En la práctica de laboratorio se lo utiliza a veces para la
identificación en fresco de algunos organismos de forma característica
- Microscopia confocal: Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener
imágenes tridimensionales de la célula. Para observar preparaciones con este
microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o marcarlas con
sustancias conjugadas con fluorocromos, como los anticuerpos.
- Microscopia electrónica: El microscopio electrónico es el único instrumento que
permite reconocer directamente la ultraestructura biológica, puesto que posee un poder
resolutivo mucho mayor que el del microscopio óptico. El material biológico para el
microscopio electrónico de transmisión (MET) debe ser extremadamente fino
✓ Centrifugación diferencial
Este método consiste en la separación y aislamiento de diversos componentes celulares,
para posterior estudio mediante técnicas bioquímicas o de biología molecular. Se basa en
la homogeneización de los tejidos y la destrucción de los limites celulares por medio de
diferentes procedimientos mecánicos, químicos o biológicos con separación de las
fracciones subcelulares de acuerdo a su masa, superficie y peso específico.

✓ Cultivo celular se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento de las células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Las células que pueden crecer y mantenerse en
suspensión o en monocapa por más de 24 horas en condiciones controladas.

✓ Métodos citoquímicos
El propósito de la citoquímica consiste en la identificación y localización de los diferentes
compuestos químicos dentro de la célula. La histoquímica hace lo propio de nivel tisular.
CUIDADOS DE LA CENTRIFUGA

PRINCIPIO
Partículas pequeñas que difieren en tamaño y densidad pueden separarse por centrifugación.

Estas partículas están suspendidas en un líquido y luego de ser sometidas a una intensa fuerza
gravitacional se moverán a través del fluido a distintas velocidades, las más grandes y densas
sedimentarán rápidamente.

PARTES DE UNA CENTRIFUGA

• Tapa
• Rotor
• Tacómetro
• Control de velocidad
• Botones de abrir y cerrar
• Interruptor

CUIDADOS EN EL EQUIPO

• El equipo se debe encontrar en una superficie firme y nivelada

• Debemos elegir el rotor idóneo según la cantidad de muestra
• Siempre equiparar las muestras
• Una vez encendido el equipo se debe tomar una distancia, en caso de accidentes
apretar el botón de emergencia y el equipo se detendrá
• El rotor debe detenerse completamente antes de abrir la tapa y sacar las muestras
• Si hubo derrames al final del proceso se debe limpiar y desinfectar el equipo • Realizar
un mantenimiento frecuente

RECOMENDACIONES EN EL USO
• Revisar los tubos falcón deben estar en buenas condiciones para evitar derrames
• Revisar que estos tubos este bien tapados con cierre hermético para evitar la
contaminación
• Se debe limpiar y desinfectar el tubo y poner su respectivo rotulo
• Realizamos el contrapeso con agua destilada para evitar la descalibración del equipo
• colocar los tubos en dirección opuesta uno del otro, en caso de tener muestras impares
la disposición de los tubos tendrá que ser triangular
• una vez retirados los tubos se debe verificar que no existan derrames
• descartar el material rayado o roto
• debemos consultar los PNO (procedimientos normalizados estándar) realizar la
conversión de G a rpm para esto es necesario el conocimiento del tamaño del radio
 RCF= Fuerza centrífuga relativa

RPM= revoluciones por minuto

R= radio de la centrifuga en mm

OBJETIVOS

✓ Identificar los organelos celulares animales mediante el método de estudio celular

centrifugación diferencial
✓ Mencionar otros métodos de análisis celular empleados en laboratorio
✓ Analizar los organelos y sus coloraciones luego de emplear la técnica de
fraccionamiento
✓ Explicar el manejo de la centrifuga y sus cuidados al ser un equipo de laboratorio
sensible
✓ Describir como aislar organelos de una muestra como un tejido.

MATERIALES

Insumos de laboratorio

- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Goteros
- Pinzas
- tubos de ensayo de 13 x 100 - pipetas graduadas.
- Vasos de precipitado 250 ml, mortero
- pipetas Pasteur
Equipos:

- Microscopio compuesto
- centrifuga
- licuadora

Material biologico

- Hígado de pollo fresco

Reactivos:

- Buffer de separación (buffer de fosfatos 10mM y de cloruro de sodio0.15 M, KCl 3.3

mM y MgCl 2.6 mM a pH
- Gradiente de sacarosa 25 Verde Janus y Azul de bromotimol

DESCRIPCION DE LA PRACTICA

Estructuras de una célula eucariota animal:

✓ Núcleo
✓ Membrana celular
✓ Citoplasma
✓ Citoesqueleto
✓ Mitocondria
✓ Aparato de Golgi
✓ Retículo endoplasmático, liso
✓ Lisosomas
FRACCIONAMIENTO CELULAR: El objetivo del fraccionamiento celular es aislar y
separar los principales organelos de las células, el instrumento utilizado para fraccionar las
células es la centrífuga que puede hacer girar los tubos de ensayo a diferentes velocidades la
fuerza centrífuga separa los componentes celulares por tamaño y densidad las más potentes
son denominadas Ultra centrífugas pueden alcanzar 130,000 revoluciones por minuto y
ejercer fuerza sobre las partículas de un millón de veces la fuerza de la gravedad (7)

Tiene como objetivo estudiar las estructuras subcelulares, la centrifugación es una técnica que
se basa en que cada estructura intracitoplasmática tendrá una densidad diferente debido a esto
será posible poder observarlas, utiliza tubos con fondo cónico que facilita la separación.

Pasos para el uso:

1. Partimos de una muestra

2. Agregamos una cantidad de agua equivalente

la muestra, en algunos casos se pesan los tubos

3. colocamos los tubos uno en frente del otro

4. programamos las revoluciones por minuto y el

tiempo

5. sacamos de la centrifuga los tubos y

observamos dos fases en la muestra
ETAPAS PARA EL FRACCIONAMIENTO CELULAR

Pasos previos a la centrifugación:

• Homogenización en frio para evitar la actividad lítica y enzimática

• Filtración: permite remover basura o fragmentos celulares con membrana
completa
• centrifugación propiamente dicha
A) Ruptura de la membrana a través de 3 mecanismos
• Físicos: como la sonicación a partir de ultrasonido, licuadora fuerza mecánica
que nos permite romper la membrana
• Químicas: con reactivos como el hidróxido de sodio, detergentes agentes
tensioactivos, soluciones a diferentes concentraciones, trabajar con una solución
isotónica previene que los organelos sufran de lisis osmótica
• Biológicas; enzimas como la lisozima, glucanasas
B) Separación de componentes Uso de la centrifuga
(calibrado)
• Los organelos mas densos se centrifugan más rápido y estarán en el fono
del tubo como los: Núcleos, mitocondrias, cloroplasto, retículo
endoplasmático, aparato de Golgi
• Los menos densos como los ribosomas en la parte mas superficial
C) Extracción y purificación
Por gradiente de densidad como la sacarosa
El buffer generalmente es una solución isotónica que no altera el Ph

APLICACIÓN

• Investigación
• diagnóstico de enfermedades como el urocultivo y la detección de un patógeno,
también en el hematocrito
OBSERVACION DE ORGANELOS CON BUFFER EN UN HIGADO DE POLLO
• Partimos de una muestra de higado de pollo o de
vaca, cortamos la membrana que recubre la
superficie externa del higado y trabajamos con un
1 pedazo.

• homogenizamos, triturandolo en un mortero o con

un sonicador, permitiendo que la membrana
plasmatica se rompa para poder observar el
2 contenido celular

• para evitar deterioro o daño en el contenido celular,

mezclamos con una solucion buffer de Ph7 o
3 tampon y filtramos.

• procedemos a la primera centrifugacion,

programamos a 1.000 G 20 min al finalizar la
4 centrifufacion observaremos 2 fases.

• sometemos el sobrenadante a la segunda

centrifugación a 1.000 G 20 min nuevamente
observaremos 2 fases de la cual estudiamos el Figura.1
5 concentrado

• tomamos una gota del concentrado y la teñimos

con verde janus para observar mitocodrias y con
6 azul de bromotimol para lisosomas Figura.2

• volvemos a tomar el sobrenadante y la

centrifugamos por tercera vez a 105000 G 120min y
7 observamos el concentrado
Figura. 3

• nuevamente tomamos el sobrenadante y lo

centrifugamos por cuarta vez a 105000 G 20min y
lo sometemos a la presencia de detergentes o
8 agentes tensioactivos como el SDS (Dodecilsulfato
sódico), tween 20-80 y observamos el concentrado
Figura. 4

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

OBSERVACION DE ORGANELOS CON BUFFER EN UN HIGADO DE POLLO CON
DIFERENTES TIEMPOS
1. en un vaso de precipitado colocamos un higado previamente lavado, con
tijeras lo fraccionamos

2.colocamos el contenido del vaso de precipitado en una licuadora

3. pasamos la muestra licuada en tubos de ensayo y realizamos la primera

centrifugacion a 200 rpm 10 min

4. decantamos el sobrenadante y al concentrado agregamos solucion buffer de

Ph 7- 1:4

5. el sobrenadante anterior lo centrifugamos por segunda vez a 5000 rpm 15

min (se observaran mitocondrias en el sedimento)

6. resuspendemos con buffer el sedimento anterior, tomamos 0.1ml de la

resuspension y lo teñimos con 1 ml de verde janus en 10 min observamos
(bastoncillos de color verde) observamos con objetivo en seco y luego con el de
imersion

7. el sobrenadante anterior decantado lo centrifugamos por tercera vez a

7000rpm 30 min, colocamos en un portaobjeto la muestra y una gota de azul
de bromotimol con un objetivo en seco bucamos bastoncillos de color azul y
observamos con el de imersion los lisosomas y reticulo endoplasmatico

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

OBSERVACION DE ORGANELOS UTILIZANDO SACAROSA

4. tomamos una
3. decantamos el
1. ponemos 5 ml de proporcion del
sobrenadante y con
sacarosa 25 M en un 2. centrifugamos el sedimento y los
ayuda de una pipeta
tubo de ensayo y tubo de ensayo a teñimos con los
pasteur trasladamos
añadimos 2 ml de 7000 rpm por 30 min colorantes
el sedimento a tubos
extracto hepatico correspondientes
graduados
para cada organelo.

OBSERVACION DE CLOROPLASTOS EN CELULAS VEGETALES

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

 1. trituramos en un
mortero hojas de
espinaca con una
solucion buffer y arena

6. podemos agregar a
2. filtramos la muestra y
otra muestra urea y
la colocamos en un
tritol, para poder
envase frio que contine
observar de mejor
hielo picado
maneja

5. tomamos una
3. realizar lo calculos de G a
alicuota la ponemos
4034rpm y centrifugamos,
sobre un portaobtejos
el sobrenadante volvemos
colocamos el
a centrifugar del cual
cubreobjetos y
obtenemos 2 fases
observamos

4.el sedimento de la 2da

centrifugacion es
resuspendido con un buffer
y lo colocamos en el hielo

La muestra debe ser puesta en frio para evitar

la actividad lítica enzimática

RESULTADOS

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

OBASERVACION DE ORGANELOS CON BUFFER EN UN HIGADO DE POLLO

En el primer
sedimento se podrán
observan núcleos

En el segundo sedimento o Observamos

concentrado se observan Lisosomas de

color azul
mitocondrias gracias al verde
janus: específico para la tinción RE color azul
mitocondrial citocromo c,
El bromotimol es
enzima conjugada que se ve
un indicador ph
azul-verde.

En el tercer sedimento
obtenido se podrán observan
vesículas del retículo
endoplasmático rugoso

En el cuarto sedimento obtenido

se podrán apreciar vesículas del
retículo endoplasmático rugoso
y ribosomas (con microscopio
electrónico)

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

OBSERVACION DE ORGANELOS UTILIZANDO SACAROSA

Figura.1

En el microscopio óptico fue posible observar núcleos, sin embargo, los orgánulos de menor

tamaño se pueden observar con microscopios de mayor resolución como el microscopio

electrónico.

EN EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO LOS ORGANELOS SE OBSERVAN DE LA

SIGUIENTE MANERA:

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

 Se observa con
microscopio
electrónico de
transmisión un
complejo de Golgi con
varios dictiosomas.

Se observa con microscopio electrónico

el retículo endoplásmico rugoso aparece
en muchas células como un conjunto de
cisternas apiladas en paralelo, en otras
ocasiones las cisternas aparecen más
dispersas.

Se observa conmicroscopioLos
lisosomas que son orgánulos esféricos
u ovalados que se localizan en el
citoplasma celular.

En microscopía electrónica son fáciles

de localizar porque es el orgánulo más
oscuro (el más teñido)

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

 En el microscopio electrónico, los ribosomas
se observan adheridos al retículo
endoplasmático y se ven como granos oscuros

Los ribosomas son complejos

ribonucleoproteícos organizados en dos
subunidades: pequeña y grande de 20 nm. de
diámetro

CONCLUSIONES

- Los diferentes tipos de colorantes diferenciales, específicos. ayudan en la observación

de los componentes subcelulares.
- Los métodos de separación celular aportan en la investigación y diagnóstico de
enfermedades, el método más usado para el estudio celular en laboratorio es la
centrifugación diferencial
- Los organelos se pueden observar con mayor especificidad de acuerdo a la resolución
del microscopio empleado
- Para culminar resaltamos la importancia del buen manejo de la centrifuga al ser un
equipo sensible, y peligroso si no se manipula de manera adecuada.

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA

Bibliografía

1. SOLIZ LEU. GUIAS DE PRÁCTICA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD.

2020..

2. STARR C. BIOLOGIA CONCEPTOS Y APLICACIONES. 8th ed. C.V. SAD, editor.

MEXICO: CORPORACION SANTA FE ; 2013.

3. karp g. Biología celular y molecular. 6th ed. mexico: McGraw-Hill Interamericana;

2005.

4. Robertis EDPD, Hib J, Ponzio R. Biología celular y molecular de De Robertis; 2018.

5. Padilla González EA. Modelación en centrifuga para el cálculo de asentamientos

diferenciales en edificaciones. 2016. Universidad de los Andes.

6. Segretín LME. Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de células animales).
2003. INGEBI-CONICET - Dpto. FBMyC, FCEyN-UBA.

7. campell NA. biologia : panamericana; 2007.

8. MURAY R. Murray, R., Bender, D., Botham, K. M., Kennelly, P. J., Rodwell, V., &
Weil, A. P. (2013). HARPER BIOQUIMICA ILUSTRADA (Spanish Edition) (29.a
ed.). McGraw-Hill Interamericana de España S.L.: McGraw-Hill Interamericana de
España S.L.; 2013.

9. Vázquez-Jorge. Caracterización físicoquímica y contenido de proteínas. revista cubana

de quimica. 2014;: p. 74.

CAREN CELESTE CHACOLLA ALANOCA