Manual de Prácticas Lab Micro Médica

MANUAL DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA MEDICA
PROGRAMA DE MEDICINA
ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA
Y PARASITOLOGIA
DPTO. CIENCIAS BASICAS
ICB, UACJ.
Agosto 2012
1
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMEDICAS
DIRECTOR
M.C. Hugo Staines Orozco
DEP. CIENCIAS DE LA SALUD
M. C. Carlos Cano Vargas
PROGRAMA MEDICINA
Dr. Jorge Camargo Nassar
DEP. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS
Dr. Alejandro Martínez
COORDINADORA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA

M.C. Bertha Alicia Borrego Ponce
PROFESORES
Dra. Evangelina Olivas

M. C. Luis Alarcon Morales
AGRADECIMIENTOS:
A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y

PARASITOLOGIA, POR SUS VALIOSAS SUGERENCIAS EN LA ELABORACION
DE ESTE MANUAl.
2
CONTENIDO: Pag.
Portada……………………………………………………………………………………………………………1
Agradecimientos……………………………………………………………………………………………..2
Contenido………………………………………………………………………………………………………..3
Reglamento de laboratorios……………………………………………………………………………4
Introducción a la Microbiología………………………………………………………………………6
CAPÍTULO I BACTERIOLOGÍA……………………………………………………………………….. 7
Práctica #1 Aislamiento de Bacterias y Tinciones…………………………………………. 9
Práctica # 2 Microflora Normal y Control Microorganismos………………………….17
Práctica #3 Cocos Gram Positívos…………………………………………………………………21
Práctica # 4 Enterobacterias ……………………………………………………………………….25
CAPITULO II VIROLOGIA………………………………………………………………………………..29
Práctica # 1 Diagnostico de Virus Humanos……………………………………………….…31
Práctica # 2 Bacteriófagos…………………………………………………………………………….40
Práctica # 3 Diagnóstico de Hepatitis B…………………………………………………………43
Práctica # 4 Diagnóstico Rubeola…………………………………………………………..……...47
Práctica # 5 Diagnóstico de Rotavirus………………………………………………..……….…50
CAPITULO III PARASITOLOGIA…………………………………………………………………..….52
Práctica # 1 Manejo Muestras y coproparasitoscópico Directo…………………….53
Práctica # 2 Protozoarios Intestinales y Tisulares ………………………………………..62
Práctica # 3 Tinciones Permanentes y Técnica de Flotación……… ……………….65
Práctica # 4 Identificación de Helmintos y Técnica de Richtie………………………69
CAPITULO IV MICOLOGIA……………………………………………………………………………...75
Práctica #1 Eumycetos………………………………………………………………………………....75
Práctica # 2 Micosis Superficiales………………………………………………………………….80
Práctica # 3 Micosis Oportunistas…………………………………………………...…………….84
Práctica # 4 Micosis Subcutáneas y Sistémicas………………………………………….….88
Bibliografía…………………………………………………………………………………………………….94
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REGLAMENTO PARA ESTUDIANTES
INTRODUCCION
Este reglamento regirá la actitud, el comportamiento y el desempeño del

estudiante dentro de los laboratorios de Microbiología y tiene como finalidad evitar
riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el laboratorio es un área
donde se manejan microorganismos patógenos, parásitos y algunos compuestos
químicos peligrosos. Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso como son los
microscopios y el material delicado como la cristalería.
REGLAS
1. Todos los alumnos deberán asistir con bata blanca larga y el cabello recogido.
2. La entrada al laboratorio quedará restringida exclusivamente a los alumnos
inscritos
3. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O
BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminación con microorganismos
patógenos.
4. Está estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio.
5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debiéndose
colocar estas en los lockers de la entrada de
6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se
deberá comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de
contaminación con los microorganismos patógenos o parásitos manejados en
las prácticas.
7. Se nombrará un jefe de mesa quien será el responsable del cuidado del
material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. También
vigilará que todos los integrantes de la mesa se laven las manos con
antiséptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibirá del profesor los
microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo de
las prácticas, y posteriormente los devolverá en las mismas condiciones que
los recibió, a excepción de los materiales especiales indicados por el profesor.
(ejemplo cultivos). En caso de algún daño al material o aparatos, los alumnos
integrantes del equipo estarán obligados a reparar dicho daño en forma que
indique el profesor.
8. Para tener derecho a la evaluación final en la teoría, el alumno deberá tener
el 80 % de asistencia.
9. Para poder tener derecho a la asistencia se dará 10 minutos como retardo
10. La calificación final de la materia de Microbiología quedará constituida por la
puntación obtenida en la práctica y en la teoría, cuya suma se efectuará en la
forma siguiente:
a) La calificación final obtenida en el laboratorio tendrá un valor del 30 % de la
calificación final total.
b) La calificación total de la teoría corresponderá al 70 % de la calificación final.
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c) La suma de ambas calificaciones (teoría y práctica) será igual al 100 %.
d) El alumno no podrá acreditar la materia si obtiene calificación reprobatoria
en el laboratorio o en la teoría. Debe aprobar ambas para promediarse.
11.- El alumno deberá capacitarse con la NOM-087 sobre la Separación,

Tratamiento y Destino de los Residuos Biológico- Infecciosos
Introducción.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestación de servicios

para promoción, prevención, diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de la salud,
regulando los servicios médicos para que respondan a las demandas y necesidades de la
población.
Los servicios médicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos,
independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea público, social o
privado.
Las soluciones tecnológicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta

norma, deben ser el resultado de las demandas de actividades de promoción y prevención
de la salud, así como aquéllas dirigidas al diagnóstico y tratamiento de las diversas
patologías. Se debe indicar qué tecnologías diagnósticas, terapéuticas y de rehabilitación
se utilizarán en los establecimientos médicos para atender correctamente tales demandas,
lo cual integra el programa médico.
La indicación o el uso de las tecnologías para la salud dependen de la motivación, de los

conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una
correcta organización funcional de los establecimientos de atención que asegure realizar
las actividades médicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integración
de la infraestructura y el equipamiento.
En esta norma se presentan los requisitos mínimos de infraestructura y equipamiento para

hospitales y consultorios de atención médica especializada, incluyendo la infraestructura
y el equipamiento para ejercer actividades directivas y de formación de personal de salud,
establecido como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de
prestación de Servicios de Atención Médica.
1. Objetivo
Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mínimos de
infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atención
médica especializada.
2. Campo de Aplicación Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los
hospitales de los sectores público, social y privado, cualquiera que sea su denominación,
que realicen internamiento de enfermos para la ejecución de los procesos de diagnóstico,
tratamiento médico.
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA MÉDICA
INTRODUCCION.
La microbiología es la rama de la biología encargada del estudio de los

microorganismos, seres vivos pequeños (del griego «μικρος» mikros "pequeño", «βιος»
bios, "vida" y «-λογία» -logía, tratado, estudio, ciencia), también conocidos como
microbios. Es la ciencia de la biología dedicada a estudiar los organismos que son sólo
visibles a través del microscopio: organismos procariotas y eucariotas simples. Son
considerados microbios todos los seres vivos microscópicos, estos pueden estar
constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños agregados celulares
formados por células equivalentes (sin diferenciación celular); estos pueden ser
eucariotas (células con núcleo) tales como hongos y protistas, procariotas (células sin
núcleo definido) como las bacterias]. Sin embargo la microbiología tradicional se ha
ocupado especialmente de los microorganismos patógenos entre bacterias, virus y
hongos, dejando a otros microorganismos en manos de la parasitología y otras
categorías de la biología.
Aunque los conocimientos microbiológicos de que se dispone en la actualidad son muy

amplios, todavía es mucho lo que queda por conocer y constantemente se efectúan
nuevos descubrimientos en este campo. Tanto es así que, según las estimaciones más
habituales, sólo un 1% de los microbios existentes en la biosfera han sido estudiados
hasta el momento. Por lo tanto, a pesar de que han pasado más de 300 años desde el
descubrimiento de los microorganismos, la ciencia de la microbiología se halla todavía en
su infancia en comparación con otras disciplinas biológicas tales como la zoología, la
botánica o incluso la entomología.
Al tratar la microbiología sobre todo los microorganismos patógenos para el hombre, se

relaciona con categorías de la medicina como patología, inmunología y epidemiología.
La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata
de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por
debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga
determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los
microorganismos. Con la invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de
una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 años su
progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos microbianos, y a los primeros
intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas naturales" de los
Reinos Animal y Vegetal.
Tras la Edad de Oro de la Bacteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y
Koch, la Microbiología quedó durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y
aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la
Química, que le aportaría varios avances metodológicos fundamentales.
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CAPITULO 1 BACTERIOLOGIA
La Bacteriología es una disciplina de la Microbiología, que ha estado presente a lo largo

de la historia de la humanidad.
Las bacterias son responsables de millones de muertes de personas a nivel mundial.

Entre algunas enfermedades infecciosas bacterianas, causantes de grandes epidemias que
han mermado la población, se encuentran: la difteria, cólera, tuberculosis, sífilis, tétanos,
tos ferina, y fiebre tifoidea. Sin embargo, también existen infecciones bacterianas que
aunque están asociadas en menor frecuencia como causa de muerte, son un problema de
salud pública en países en vías de desarrollo como el nuestro, entre las que podemos
mencionar: diarreas (causadas por Shigella o Escherichia coli), infecciones de vías
urinarias, faringoamigdalitis, gonorrea, tracoma y brucelosis.
CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS
De acuerdo al Árbol de la Vida de Woese, microbiólogo creador de la nueva taxonomía

molecular basada en la comparación entre especies de la fracción 16s del ARN
ribosomal, se proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los que se incluye a
todos los seres vivos, aunque existen controversias.
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Los dominios Archeae y Bacteria corresponden a las células procariotas, una de cuyas
características es la de carecer de membrana nuclear. Con base en el estudio de fósiles y
modelos, se calcula que emergieron hace unos 3.6 - 4 billones de años. Su importancia
radica en el hecho de haber desarrollado una pared celular o membrana externa que les
confirió, desde el principio, de autonomía y protección con respecto a su medio ambiente.
Desde entonces constituyeron la forma de vida más abundante en el planeta en términos
de biomasa y número de especies. A pesar de su menor complejidad en relación a
Eucarya, los integrantes de los dominios Archeae y Bacteria pueden vivir en hábitats
extremos: se les encuentra en las profundidades de la Tierra, sobreviviendo gracias al
lento catabolismo del carbono orgánico depositado en los sedimentos, y en las profundas
fuentes hidrotermales submarinas.Se acepta la aparición del dominio Eukarya, con
membrana nuclear y orgánulos más desarrollados, desde hace unos dos billones de años;
de este dominio derivan todos los organismos eucariontes uni y multicelulares.   Otra
clasificación de los seres vivos muy utilizada es la propuesta por Whitaker y Margulis.
Ellos clasifican a los organismos en cinco reinos, Animalia, Plantae, Fungi, Protista y
Monera, en éste último reino se incluyen todas las bacterias.
MORFOLOGíA BACTERIANA
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PRACTICA #1
TECNICAS DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y MEDIOS DE
CULTIVO
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.
Que los alumnos desarrollen las técnicas de siembra comunes de aislamiento de bacterias y
que conozcan algunos medios de cultivo comunes para bacterias y adquieran el criterio para
seleccionarlos según sus necesidades.
INTRODUCCION.
El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido a su
tamaño tan pequeño, por lo que es necesario recurrir a medios nutritivos artificiales, donde
se puedan desarrollar rápidamente y producir grandes poblaciones. En estas condiciones se
pueden manipular y efectuar las investigaciones deseadas.
Los materiales nutritivos donde se desarrollan y multiplican los microorganismos contienen
los nutrientes necesarios para su crecimiento, y se denominan medios de cultivo, cuyos
componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el propósito del estudio.
Los medios de cultivo pueden ser sintéticos, es decir de composición química conocida, o
pueden ser complejos, en los cuales por lo menos hay un componente de composición
desconocida.
En general, los medios son ricos en proteínas no específicas, con el fin de estimular el
crecimiento de los microorganismos que se desean aislar. La mayor parte de los
microorganismos requieren un medio enriquecido o suplementado por substancias como
sangre, suero, vitaminas, etc.
Los medios líquidos se pueden transformar en sólidos, mediante la adición de agar. Esto
significa que conservan la misma fórmula nutritiva.
Los medios de cultivo además de nutrientes y agua pueden contener sustancias inhibidoras
de ciertos grupos microbianos, sin interferir con otros, convirtiéndose en medios selectivos.
Cuando la muestra procede de una parte del cuerpo que contiene microorganismos de la
flora normal, el desarrollo de éstos es inconveniente y puede inhibir a los microorganismos
patógenos, por lo que el espécimen debe sembrarse en un medio que los inhiba y permita el
desarrollo del patógeno. Estos medios son complejos y altamente selectivos para ciertos
organismos. Por ej.: el de Shigella-Salmonella agar (SS), el citrato-desoxicolato-agar y el
sulfito de bismuto-agar, inhiben el crecimiento de la mayoría de los coliformes y permite el
desarrollo de patógenos entéricos. El agar-sangre-alcohol feniletil, es selectivo para el
aislamiento de cocos grampositivos positivos a partir de especímenes contaminados con
organismos gramnegativos, los cuales crecen en colonias muy pequeñitas. Los medios con
telurito de potasio y con suero o sangre favorecen el aislamiento de Corynebacterium,
mientras que inhiben todos los cocos grampositivos comunes en las muestras. En sal-
manitol-agar las colonias de estafilococos patógenos crecen con un halo amarillo.
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La adición de algunas sustancias indicadoras al medio, los convierte en medios
diferenciales, debido a que permiten el desarrollo de las bacterias con una apariencia
colonial distintiva, según la especie. En virtud de la composición química de estos medios,
se pueden caracterizar ciertos géneros bacterianos por la apariencia colonial distintiva en el
medio, por ej: el medio agar-eosina-azul de metileno (EMB) y el agar-MacConkey
contienen lactosa y un colorante o un indicador de pH. Las colonias fermentadoras de
lactosa y productoras de aldehído, producen colonias de un color especial.
Los medios para identificación de las bacterias, contienen sustratos específicos de prueba,
para diferenciar unas especies de otras, en base a su capacidad enzimática. Cada especie se
presenta un equipo enzimático característico de su especie.
Los medios con antibióticos: son inhibitorios para unos organismos, permitiendo aislar a
otros, a partir de una población mixta. Por ej: agar-Sabouraud con cicloheximida y
cloranfenicol, permite el crecimiento de hongos dermatofitos y de la mayoría de hongos
patógenos, e inhibe a los hongos saprófitos y a las bacterias.
Los medios de mantenimiento contienen los requerimientos necesarios para conservar las
cepas bacterianas puras en el laboratorio, haciendo resiembras periódicas.
Otros medios son muy especiales, para permitir el crecimiento de grupos poco comunes de
bacterias, como los anaerobios, las mycobacterias, los mycoplasmas, etc.
Bactrrias no cultivables que no se pueden cultivar en ninguno de los medios conocidos
hasta ahora, como las Rickettsias y Chlamydias, el Mycobacterium leprae, y el
Treponema palidum.
El material bacteriano que se inocula en el medio de cultivo se denomina inóculo. Una vez
que los microorganismos se desarrollan en el medio, el resultado es un cultivo.
Cuando se inocula un medio solidificado adicionado de agar, contenido en una caja de Petri
(medio en placa ), las bacterias pueden esparcirse en la superficie, mediante una técnica de
rayado (estriado) con el asa , en tal forma que las células queden separadas
individualmente, lejos unas de otras. Durante la incubación, cada célula bacteriana se
reproduce tan rápidamente, que en 18 a 24 hs se producen masas bacterianas visibles a
simple vista, denominadas colonias. Cada colonia presumiblemente procede de una bacteria
progenitora, cuyos individuos son de una sola especie. Una colonia que se desarrolló
separada de las otras, al ser transferida a un medio de cultivo nuevo, dará lugar a un cultivo
puro, es decir con individuos de una sola especie.
MATERIALES Y METODOS.
I. Cultivo y aislamiento de bacterias en placa, por la técnica de estría cruzada

1. Siembre por placas por separado de medio tripticasa-agar-soya o de agar-nutritivo, con
cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
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Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes. Para lograrlo,
desarrolle el método de siembra de la estría cruzada en placa, girando la caja al ir
rayando hasta formar un pentágono, siguiendo las indicaciones del profesor, con el fin
de ir diluyendo el inóculo. Al final de la siembra las bacterias quedarán bien separadas
unas de otras.
2. Siembre una mezcla de todas las bacterias en una placa del mismo medio y con la
misma técnica, a partir de una suspensión en caldo nutritivo o en agua destilada.
3. Invierta todas las placas, con la tapa hacia abajo y métalas a la incubadora a 37°C,
durante 24 hs.
4. Saque las placas de la incubadora y observe el crecimiento bacteriano.
5. Determine y anote los errores efectuados en la siembra, cuando no se obtuvo la
separación de las colonias.
6. Note las diferencias entre las colonias, según la especie bacteriana. Haga una tabla de
características morfológicas con los datos observados, para cada bacteria, tomando en
cuenta diámetro aproximado, color, transparencia, brillo, elevación pigmentos
Esterilización del asa

Estría cruzada
II. Cultivo en medio líquido.
1. Siembre las mismas bacterias, en tubos con caldo-tripticasa-soya inoculando una
asada de la bacteria. Deje un tubo testigo sin inocular.
2. Incube todos los tubos sembrados a 37 C por 24 hs.
3. Saque de la incubadora sin agitar los tubos. Note una turbidez, un sedimento, una
película superficial, o combinados.
4. Deduzca la causa por la que no se forman colonias en medio líquido y por qué no se
aíslan las bacterias. Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos.
Compare sus resultados personales con los de los otros equipos.
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Siembra en agar inclinado Siembra en caldo
ESTUDIO MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Desarrollar las técnicas microscópicas comunes para observar, teñir y medir a las
bacterias y sus estructuras.
INTRODUCCION
El tamaño tan pequeño de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su
promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrómetros (µm) de diámetro. En cuanto a su forma, las
bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos o helicoidales. Los
extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos y pueden ser móviles o
inmóviles. Las bacterias esféricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares, en tetradas,
en cadenas o en racimos. Los bacilos también pueden agruparse en dos o en cadenas.
Las características morfológicas de las bacterias se pueden apreciar mediante técnicas
microscópicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del estudio directo al
microscopio de células vivas en referencia a su forma, disposición y tamaños naturales,
han sido antagonizadas por el hecho de que, el índice de refracción del protoplasma de
los microbios se acerca al del agua y por ello, las células y sus estructuras no pueden
diferenciarse en forma neta entre sí, ni del líquido en que están incluídas. El estudio
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microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes,
apreciándose su forma y tamaño.
Preparación en fresco:
Permite observar en los microorganismos la movilidad, el color, el tamaño, la forma y la
agrupación en su forma natural viva y sin alteraciones. Sin embargo, la observación es
difícil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el índice de refracción del
medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve utilizando el microscopio de
campo oscuro y el de contraste de fases.
- Una forma de preparación en fresco es la Preparación en portaobjetos normal
con cubreobjetos
- Otra forma es la Preparación en gota suspendida. Se utiliza un portaobjetos
excavado y un cubreobjetos.
Técnicas de tinción:
Tinción simple o directa:

Tiñen homogéneamente la célula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul de
metileno, safranina, cristal violeta, etc.
Tinción compuesta o diferencial:

Requieren combinaciones de dos o más colorantes, como en la técnica de Gram, la de
Ziehl Neelsen, tinción de esporas, etc.
Algunas de estas técnicas permiten la demostración de estructuras específicas como
cápsula, flagelos, esporas, etc. Otras tiñen selectivamente bacterias de un grupo
específico.
Tinciones negativas:
En realidad no colorean los microorganismos, se limitan a depositarse en el campo del
rededor, delimitando las células.
MATERIALES Y METODOS
I. Preparación en fresco.
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En este tipo de preparación se perderán varios detalles de las bacterias.
1. Para el montaje en gota suspendida, unte un poco de vaselina con un palillo,
alrededor de la concavidad de un portaobjetos excavados.
2. A continuación, coloque en el centro de un cubreobjetos una gota de suspensión
bacteriana en agua y coloque encima el portaobjetos excavado, haciendo
coincidir la excavación con la gota.
3. Permita la adhesión del porta con el cubre.
4. Invierta el portaobjetos con el cubreobjetos arriba y observe al microscopio a 10
X y posteriormente a 40 X.
5. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma, agrupación, color, movilidad, etc.
6. Al terminar, haga una preparación en fresco entre porta y cubre, substituyendo el
portaobjetos excavados por uno normal y anote sus observaciones y los detalles
en las células, sobre todo la movilidad, comparando en las dos preparaciones en
donde se observó mejor. Diga si pudo observar la forma de las células y su
agrupación.
II. Técnica de elaboración de frotis bacterianos (antes de la tinción)

1. Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y déjela enfriar en el área de
esterilidad
2. Destape un cultivo bacteriano líquido junto a la flama del mechero y tome con el asa
una gotita del cultivo, depositándola en el centro de un portaobjetos limpio; extienda con
el asa para hacer un frote.
3. Si el cultivo no es líquido, coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el centro
de un portaobjetos. Queme el asa y déjela enfriar, tomando a continuación una poca de
la masa bacteriana de la superficie del medio, para hacer una suspensión de bacterias en
la gotita del porta. Enseguida extienda con el asa para hacer un frote.
4. Deje secar el frote al aire libre.
5. Fije la preparación con calor, pasándola tres veces sobre la flama del mechero en
forma rápida.
III. Tinciones Diferenciales

Tinción de Gram.
Esta tinción separa las bacterias en dos grandes grupos, las gram positivas que retienen el
primer colorante usado (cristal violeta) y las gram negativas que se tiñen con el segundo
colorante (safranina). Estas diferencias están basadas en la estructura y composición
química de la pared celular. Las gram positivas tienen una pared gruesa de péptidoglicano
y además, muchas de estas especies presentan ácidos teicoicos en la pared.
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Las gram negativas contienen menos péptidoglicano y su capa es mucho más delgada,
pero que está rodeada de una bicapa más externa de lípidos, llamada membrana externa.
Los mejores resultados se obtienen utilizando cultivos jóvenes de bacterias, no mayores
de 24-48 hs, pues de lo contrario los resultados son ambiguos. La pared celular es dañada
en las células viejas.
1. Prepare un frote de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus,

Escherichia coli y Bacillus subtilis, en cultivos de 24-48 hs.
2. Después de fijar los frotes, cúbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague
con agua.
3. Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua.
4. Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.
5. Cubra con safranina medio minuto y lave con agua.
6. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y después a100 X con aceite
de inmersión.
7. Las bacterias teñidas de rojo se consideran gramnegativas; las de morado,
grampositivas.
8. Note las diferencias en la observación de bacterias teñidas con las no-teñidas.
Observación de cápsula.
La cápsula es una capa gruesa de polisacárido (ocasionalmente de polipéptido), más
externa a la pared celular, que rodea a la bacteria y está adherida a ella. Sus dos funciones
principales son favorecer su adhesión a las superficies y protegerla de los predadores. Por
ejemplo el Streptococcus mutans productor de una gran cápsula, es uno de los
iniciadores de la caries dental, debido a su capacidad para adherirse a los dientes y sus
ácidos que degradan el esmalte dental. El Streptococcus pneumoniae ataca el pulmón,
causando pneumonía cuando es capsulado y no causa enfermedad cuando pierde la
cápsula, debido a que es fácilmente fagocitado por los macrófagos. La cápsula es difícil
de teñir con los colorantes, por lo que se recurre a tinciones negativas. El campo del
rededor se tiñe con un colorante ácido, mientras que la célula se tiñe con un colorante
básico de otro color. En estas condiciones se observa como un área brillante translúcida
alrededor de la célula.
1. En el extremo de un portaobjetos coloque una gota de suspensión bacteriana de
Klebsiella pneumoniae (cultivo de 24-48 hs) en agua.
2. Adicione una gota de tinta china y mezcle con el asa.
3. Con otro portaobjetos extienda la preparación, como para realizar un frote. Deje secar
al aire libre. No se requiere fijar con calor.
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4. Cubra la preparación con safranina por un minuto y lave con agua rápidamente y
con cuidado, para no despegar la preparación.
5. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y después a
100 X
PARED GRAM NEGATIVA PARED GRAM POSITIVA
Anote detalladamente los resultados en cada experimento e interprete los resulta
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Practica # 2
MICROFLORA NORMAL HUMANA y CONTROL DE

MICROORGANISMOS
I.-MICROFLORA NORMAL HUMANA.-
OBJETIVO
Conocer la microflora normal de las diferentes partes del cuerpo y comprobar su presencia
en piel y cavidad bucal mediante técnicas de laboratorio.
INTRODUCCION.
Los microorganismos normalmente existen en diversas regiones del cuerpo y estas
poblaciones representan lo que se conoce como microflora nativa, pero su simple presencia
no debe interpretarse como indicación de enfermedad.
La contaminación microbiana del cuerpo se inicia durante el nacimiento y continúa al
respirar y al alimentarse. Abarca superficies de partes anatómicas, tales como el tracto
digestivo, el tracto respiratorio, el tracto genitourinario, la piel y oído externo. Sin embargo,
los microorganismos en todos estos lugares sólo están superficialmente y nunca en el
interior de los tejidos.
La flora normal se encuentra constantemente en un sitio dado, a una edad dada y está
compuesta por grupos relativamente fijos, permaneciendo sin alterarse. Si se le trastorna,
vuelve a restablecerse. Si la microflora normal sufre alteraciones o es eliminada, los
microorganismos patógenos pueden responder aprovechando la situación y entonces
proliferar, llegando a causar enfermedad.
Las poblaciones de esta microflora de varias regiones del cuerpo, pueden contribuir en
varias funciones útiles. Por ejemplo la flora intestinal sintetiza varias vitaminas y también
ayuda en la digestión de alimentos. Normalmente, ella tiende a desalojar formas que puedan
ser patógenas. En cualquier situación ecológica se puede lograr un equilibrio entre la flora
normal y los parásitos, sin evidencia de enfermedad.
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I. Estudio de la flora normal bucal.

1. Con ayuda de un palillo estéril extraiga una pequeña cantidad del sarro existente entre los
dientes y con cuidado deposítela en el extremo de una placa con tripticasa-agar-soya;
enseguida proceda a extender el inóculo en la superficie con un asa bacteriológica, por estría
cruzada.
2. Con otro palillo tome otra muestra de sarro y extiéndalo en un portaobjetos para hacer un
frote. Deje secar y fije con calor. Tiña con Gram. Observe a 100 X. Haga dibujos.
3. Acerque a la boca una placa abierta de agar nutritivo y pronuncie cinco veces cada una de
las siguientes palabras: fantástico, pústula, satisfecho, chichimecas, pusilánime, ferrocarril.
II. Estudio de la flora normal de la piel.

1. Con un hisopo estéril humedecido en s.s.f. estéril, frote la palma de la mano y deposite el
inóculo en una placa de tripticasa-agar-soya, extendiendo después con el asa por estría
cruzada.
2. Lave con agua la misma mano y sin secar, nuevamente frótela con otro hisopo estéril,
depositando el inóculo en otra placa de agar nutritivo y extendiendo con el asa por estría
cruzada.
3. Incube todas las placas sembradas a 37 C por 24 hs. y compare la abundancia del
crecimiento bacteriano, en los diferentes experimentos. Compare también los diferentes
tipos de crecimiento bacteriano, y determine si hay variaciones en las diferentes cajas. Haga
deducciones.
II.- CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS
OBJETIVO
Desarrollo de técnicas de laboratorio para comprender la diferencia entre esterilización y
desinfección y determinar la sensibilidad microbiana a diferentes agentes físicos y
químicos.
INTRODUCCION
Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes físicos,
procesos físicos o agentes químicos.
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En los métodos de esterilización queda implícita la destrucción total de todas las formas de
vida.
En la desinfección no se logra la destrucción total.
Un agente físico es una condición física o propiedad física que causa un cambio. La
temperatura, la presión y la radiación son ejemplos de agentes físicos que actúan sobre los
microorganismos. Los filtros los retienen. Mediante los procesos físicos se causan
cambios en los microorganismos, por ejemplo la esterilización y la incineración que los
conducen a la muerte. En la higienización, por ejemplo el lavado, los desprende de los
materiales.
Un agente químico es una sustancia (sólido, líquido o gas) que se caracteriza por una
composición molecular definida y que causa una reacción en los microorganismos, por
ejemplo los compuestos fenólicos, los alcoholes, el cloro, el yodo y el óxido de etileno.
Dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición, los daña o los mata
3. Incube a 37 C por 24 hs. mida el radio de inhibición alrededor de cada círculo de papel
para cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas. Determine si hay
diferencias en el efecto del mismo compuesto para las dos bacterias.
4. Forme una tabla con los datos del MATERIALES Y METODOS.
I. Factores Físicos:
A: Efecto del calor sobre la viabilidad bacteriana.

1. Para iniciar el experimento se contará con un cultivo líquido de E. coli y uno de Bacillus
subtilis. Enseguida siembre con una bacteria la mitad de una placa de agar nutritivo por
estría contínua cerrada. En otra caja siembre la mitad con la segunda segunda bacteria.
2. A continuación coloque los frascos de los cultivos líquidos en un baño María a 70 C por
10 min. y después sáquelos.
3. Ahora, con cada uno de los cultivos calentados siembre la otra mitad de cada placa.
4. Incube las placas sembradas a 37 C por 24 hs. Compare la abundancia del crecimiento en
las cajas sembradas, antes y después de calentar.
II. Actividad bacteriostática o bactericida de algunos compuestos:

1. Siembre la superficie de una placa totalmente por medio de un hisopo impregnado de
una suspensión bacteriana de S.aureus. Haga lo mismo en otra caja con E. coli.
19
2. Distribuya varios círculos de papel (5 círculos por caja) impregnados con antisépticos,
limpiadores comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes, jabones, antibióticos, etc.
Deben ser los mismos para las dos bacterias.
halo de inhibición medido en mm. para hacer las comparaciones.
Anote detalladamente los resultados en cada experimento e interprete los resultados.
20
PRACTICA # 3
COCOS GRAMPOSITIVOS
Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.
INTRODUCCION
El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal, incluyendo
estreptococos, estafilococos, neisserias, difteroides, levaduras y bacilos entéricos
Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos se aíslan en agar enriquecido y
suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemolítica,
parcial (alfa hemólisis) o total (beta hemólisis)
El género Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades
microscópicas, morfológicas coloniales y bioquímicas. S. aureus es el único coagulasa
positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentación amarilla si
se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es muy resistente a la acción del
calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes químicos, sobrevive semanas o
meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales,
sobreviviendo en alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de
3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de
aquél, S. epidermidis es coagulasa negativo, no-hemolítico.
El género Estrerptococcus antigénicamente, presenta 13 grupos (clasificación de

Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denominados de la A a la O.
Los estreptococos del grupo A, también denominados Streptococcus pyogenes forman
colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolíticas y son los más
virulentos. La proteína M es el principal antígeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la
Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus.
Los estreptococos del grupo B incluyen a S. agalactia y dan la prueba de CAMP positiva:
una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unión de su crecimiento
con S. aureus.
El Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB.
21
El Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y
desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y
beta hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que
presentan una gran cápsula, lo que constituye su factor de virulencia.
Es difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la Optoquina.
1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo estéril en la forma
tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar sangre. Extienda el
inóculo con un asa por estría cruzada. Incube a 37 C por 24 hs.
2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo en un portaobjetos y haga un
frotis. Tiña con gram.
3. Simultáneamente, Haga un Gram de cepas puras de Staphylococcus aureus,
Staphylococcus sp, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae. Observe al
microscopio.
4. Siembre las cepas puras en agar sangre. Incube a 37 C por 24 hs.
5. Haga una tinción de Gram con las cepas puras.
6. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias produjeron hemólisis y de
qué tipo.
7. Haga un gram de las colonias del exudado.
8. Para la cepa pura de S. aureus y las colonias semejantes a S. aureus o a Staphylococcus
sp., desarrolladas del exudado faringeo, haga la siguientes pruebas:
- Prueba de la catalasa (tome una colonia bien aislada con el asa estéril y sumérjala
en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por desprendimiento del
O2).
- Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica
bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el
resultado. Si hay coagulación del plasma, es coagulasa positivo.
- Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el asa estéril una colonia bien aislada,
beta hemolítica y siémbrela en una placa de sal-manitol-agar por estría cruzada. Incube
a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y el cambio
de color del medio a amarillo. Esto, debido a la fermentación del manitol y
acidificación.
9. Para S. pyogenes (estreptococos del grupo A) y en las colonias semejantes del exudado,
determine su sensibilidad a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en
la mitad de una placa de agar-sangre y coloque un círculo de papel filtro impregnado
con Bacitracina
10. En el otro sector de la caja , coloque un círculo impregnado con Trimetroprim para
determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine el diámetro del halo de
22
inhibición alrededor de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.
11. Para la identificación del estreptococo beta hemolítico del grupo B (Streptococcus
agalactiae), realice la prueba de CAMP:
- Tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola línea
perpendicular a otra línea previamente sembrada con S. aureus. Incube a 37
C por 24 hs.
- Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, en el lugar donde

se unen las dos bacterias.
12. Para identificar S. pneumoniae y en las colonias semejantes determine su

susceptibilidad a la optoquina, colocando un círculo de papel impregnado con el
antibiótico en un medio con agar-sangre donde se sembró la bacteria. Incube a 37 C por
24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la sensibilidad.
Prueba de Camp Prueba de Bacitracina, Optoquina y camp
23
Diagnóstico
Anote detalladamente y analice los resultado
24
PRACTICA # 4
ENTEROBACTERIAS
Objetivo.- Desarrollar las técnicas de aislamiento e identificación de

enterobacterias, comprendiendo el significado de las pruebas bioquímicas.
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, anaerobios
facultativos que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo oxidasa negativos;
reducen los nitratos a nitritos. Cuando son móviles son flagelados peritricos. Son
llamadas enterobacterias porque con frecuencia residen en el aparato digestivo de
animales y humanos, pero algunas especies también viven en la tierra y en el agua.
Incluye los géneros Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter,
Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Morganella, Proteus, Providencia, Yersinia,
Erwinia y Pantoea. La mayoría forman parte de la flora normal o son bacterias
ambientales, a excepción de los géneros Salmonella, Shigella y Yersinia, quienes son
causantes de infecciones gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces,
es muy probable que estén causando daño.
Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estéril, producen
enfermedades como neumonía, infecciones de vías urinarias, septicemia, infecciones
neonatales, infecciones de heridas y de cirugías. Se comportan como patógenos
oportunistas sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.
A semejanza de las enterobacterias, los géneros Campylobacter y Helicobacter causan
enfermedades gastrointestinales. Campylobacter es un bacilo curvo gramnegativo,
microaerofílico, con un solo flagelo polar. Causa enteritis aguda.
Helicobacter es un bacilo un poco curvo, microaerofílico, con flagelos polares múltiples.
Requiere medios específicos para cultivarse. Causa gastritis crónicas y úlceras gástricas y
duodenales.
Aislamiento en medios selectivos:

.
- A partir de una cepa pura siembre por estría cruzada placas de SS, EMB y
agar-verde-brillante, descargando la muestra con el asa en un extremo de la
caja y extendiendo después. Incube 24 hs a 37o C.
25
- En agar-verde brillante todas las salmonellas, excepto S. typhi, forman
colonias rojas o rosas a las 48 hs de incubación. El Proteus mirabilis forma
colonias amarillas o amarillo-verdosas con un halo amarillo verdoso. E. coli
no crece.
- En EMB E. coli forma colonias negruzcas o moradas, usualmente con brillo

verde metálico. Las shigellas producen colonias sin color
- En SS el Enterobacter forma colonias rojas o rosas a las 24 hs. Salmonella

forma colonais sin color con centro negro. E. coli crece poco.
1. Haga un Gram de las colonias obtenidas y compruebe que son de bacterias

gramnegativas.
II. Pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias:

Elija las colonias de enterobacterias a partir del desarrollo en las placas de medio
selectivo sembradas con la cepa. Cada tipo diferente de colonia deberá sembrarse en
todos los medios para pruebas bioquímicas.
A. Medio Doble azúcar Agar Kligler (fermentacion de lactosa y dextrosa) en tubo

inclinado (medio de color naranja):
1. Con una asa normal con anillo, se toma una colonia bien aislada y se siembra por
estría en la superficie de agar del tubo
2. Usando una asa recta sin anillo, tome otra colonia igual a la anterior y siembre por
picadura en el centro del tubo, sin tocar el fondo, cuidando que no le tiemble la mano.
Incube 24 hs a 37o C. Al cabo de este término, la fermentación de la glucosa ocurre
en anaerobiosis hasta ácido, lo cual se manifiesta por un cambio de color del
indicador de pH en el medio, de rojo a amarillo en el fondo del tubo. La
degradación de la lactosa en aerobiosis es indicada por un color amarillo en la
superficie del agar.
B. Medio de SIM en tubo (color beige):

A partir de una colonia siembre un tubo por picadura en el centro, sin tocar el fondo,
cuidando que no le tiemble la mano e incube 24 hs a 37o C.
- La producción de sulfuros toma lugar a partir r de aminoácidos con azufre y
es indicada por la aparición de un color negro
- La movilidad positiva es demostrada al crecer la bacteria homogéneamente
en todo el medio, observándose una turbidez
26
- La producción del metabolito indol es indicada por un anillo de color rojo
que se forma después de adicionar unas 2 o 3 gotas del reactivo de Kovacs.
C. Medio MIO en tubo (color café):

Siembre una colonia por picadura en el centro e incube igual. El indicador de pH en el
medio cambia de color, de café a color violeta al alcalinizarse, lo que indica la
descarboxilación de la ornitina por la enzima ornitína descarboxilasa
D. Citrato como única fuente de carbono (color verde) en tubo inclinado:
Siembre una colonia por estría en la superficie del agar e incube igual. El crecimiento y
el cambio de color del indicador de pH a azul en condiciones alcalinas, indica la
utilización del citrato positiva.
E. Urea (color beige) en tubo inclinado.
Se siembra por estría y se incuba igual. La aparición de un color fucsia(rosa mexicano)
en el medio, indica la acción de la ureasa y alcalinización del medio. El indicador de pH
se torna rosa en condiciones alcalinas.
F. Fenil alanina
Se siembra en la superficie y por picadura, se agrega después de la incubación cloruro
férrico, interpretándose como positivo si da una coloración verdosa. O desanimación de
la fenil alanina
G. Lisina Iron Agar (LIA)

Se siembra por estría en la superficie y por picadura Alcalino toma color violeta, acido,
color amarillo. Se utiliza para conocer la acción de la Lisina descarboxilasa
H. Voges proskawer
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar
la glucosa con producción de acido por la vía acido-mixta o con producción de acetoína
por la via butanodiólica.
Haga una tabla de resultados y compare con los datos de la literatura. La identificación de
las bacterias encontradas puede efectuarse hasta género o hasta especie, según el número
de datos. Una vez identificada la bacteria, investigue las enfermedades que ocasiona.
27
28
II.- VIROLOGIA.
INTRODUCCION.-Los virus varían en tamaño en un rango desde menos de 100

nanómetros en diámetro a varios cientos de nanómetros en longitud en el caso de los
filoviridae
Todos los virus contienen un genoma de ácido nucleico (ARN o ADN) y una capa
proteínica protectora (llamada cápside). Al conjunto del genoma y cápside se le llama
nucleocápside y la misma puede tener forma icosaédrica, helicoide o compleja. Los virus
pueden o no tener envoltura. Los virus envueltos obtienen sus envolturas por gemación a
través de las membranas de las células huésped. En algunos casos, los virus atraviesan la
membrana plasmática pero en otros casos, la envoltura puede provenir de otras
membranas como del aparato de Golgi o el núcleo. Algunos virus, geman a través de
porciones especializadas de la membrana plasmática de la célula huésped.
Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden
clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del
virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de
anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.
Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas
29
serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas.
Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten
precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).
En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear

nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de
ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo
de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la
identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad.
30
PRACTICA #1
DIAGNOSTICO DE VIRUS HUMANOS.

Que el alumno conozca teóricamente los principales métodos de diagnóstico de virus
humanos.
INTRODUCCION.
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los
filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la
composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una
envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO:
Las muestras deben tomarse precozmente en la fase aguda de la infección. Deben trasladarse
al laboratorio a la mayor brevedad posible, en medio de transporte. Las muestras más
comunes son:
- Torundas nasofaríngeas:
Adecuados para el diagnóstico de enterovirus, adenovirus, y herpes simplex. Las
nasofaríngeas se prefieren para el virus respiratorio sincitial y la mayoría de los otros
respiratorios. Las nasales son las mejores para los rinovirus.
- Aspirados faríngeos:
son mejores que los hisopos (torundas) nasofaríngeos, pero estos últimos son más prácticos.
- Torundas rectales y muestras de heces: en virus no cultivables, como rotavirus, o
adenovirus, que se detectan por microscopía electrónica o con técnicas de detección de
antígenos.
- Secreciones, Sangre o Líquido cefalorraquídeo. Como en los virus VIH, Hep. B y C
- En algunas virosis excepcionalmente el diagnóstico solo puede efectuarse en Biopsia de
cerebro, como en la encefalitis por herpes simplex; en Huéspedes inmunodeprimidos y con
citomegalovirus, el virus solo puede identificarse en el órgano afectado.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus.
31
La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente
causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal,
amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se
utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de
experimentación es excepcional en el diagnóstico.
- Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus,
paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
- Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un
amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus,
picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
- Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar
el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
- Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen
estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA) de la inmunodeficiencia, el
coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa

del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la
morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincitios y existen cuerpos de
inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son
cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por
variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales
familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento
viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de
importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en
los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas,
como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej. los picornavirus no pueden
replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina
interferencia heteróloga).
32
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus
que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una
hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de
desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra
antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
1.4. Inmunofluorescencia directa, Es una de las técnicas más antiguas y de uso más
difundido en el laboratorio clínico. Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y
colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan
anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a
través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior
de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de
fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.
Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente
sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado
nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático
observado en cultivos celulares...
1.5. Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales
permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
1.6. Microscopía electrónica.
Cuando algunos virus comunes no se aíslan con los métodos de cultivo habituales, ni
pueden diagnosticarse por técnicas serológicas, pueden estudiarse con otras técnicas,
como la microscopía electrónica. Tal es el caso de los calcivirus, los minirrotavirus, los
astrovirus y los parvovirus del cerebro. Sin embargo, hay tres grandes dificultades
para su uso: el instrumento es caro y es difícil su mantenimiento. Por otro lado, deben
estar presentes grandes cantidades de particulas virales en la muestra para poder
detectarse. Finalmente, la morfología no es suficientemente diferencial para un
diagnóstico preciso.
2. Métodos para detectar anticuerpos específicos virales.

La mera presencia de anticuerpos específicos en contra de un determinado virus, no permite
el diagnóstico de dicha infección. Debe tomarse en cuenta el cambio en los títulos en un
33
lapso corto de tiempo, o ver si hay seroconversión. En muchas virosis la presencia de IgM
sugiere infección reciente.
2.1. Fijación de complemento:

Es una técnica estándar, pero de difícil ejecución. La muestra se procesa con el antígeno o el
anticuerpo y el complemento; el complemento residual se determina mediante la lisis de
eritrocitos cubiertos de anticuerpos que actúan como indicadores. Los anticuerpos medidos
por este método se suelen desarrollar tardíamente en el desarrollo de la enfermedad. Los
miembros de algunos grupos como adenovirus, influenza A y B, poseen antígenos comunes
que se detectan por este método. Los demás grupos deben analizarse individualmente.
2.2. Neutralización:
Cuando se incuba un virus con anticuerpos homólogos específicos de tipo, el virus no es
capaz de producir la infección en un sistema de cultivos celulares indicadores. La respuesta
de anticuerpos neutralizantes es específica del tipo de virus y se desarrolla al comienzo de
los síntomas, elevándose los títulos rápidamente durando mucho tiempo.
2.3. Inhibición de la hemaglutinación:

Se puede realizar con diversos virus que aglutinan selectivamente los eritrocitos de varias
especies animales (por ej: pollo, cobaya y humanos). La capacidad de hemaglutinación del
suero se inhibe por el suero humano específico. Los anticuerpos inhibidores de la
hemaglutinación se desarrollan tras el comienzo de los síntomas, posteriormente se elevan y
al final disminuyen. Esta prueba es útil para detectar virus de rubeola y para determinar el
estado inmunitario.
2.4. Ensayo inmunoenzimatico ( prueba de elisa)
Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del

antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el pocillo
de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la
muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno
viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una
enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato
para esas enzimas varía. En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido
capaz de oxidar un compuesto químico incoloro que en su forma oxidada tiene un
color característico.
En el caso de la fosfatasa la desfosforilización es la responsable directa de la

aparición del color. Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en
forma rápida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para
34
leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotómetros
especialmente diseñados, siendo entonces una técnica más objetiva. Fig. 2.
2.5. Método de Aglutinación
El test de aglutinación es un método simple, de un solo paso, que a veces se usa para
la detección de antígenos virales en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación,
dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre
eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica
en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno
adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se
confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones
inespecíficas.
El test de aglutinación ha sido usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces

(el más importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el
EIA para Rotavirus. Además es una técnica rápida y barata. También se la ha usado
para detectar antígenos de Adenovirus.
En las reacciones de aglutinación el antígeno es una célula o una partícula. la adición del
anticuerpo homólogo provocará la aglutinación o la agregación, dando como resultado la
formación de agregados visibles de células o partículas. Pueden llevarse a cabo en
portaobjetos o en tubos de ensayo. La mayoría de estas pruebas se efectúan en tubo, con
diluciones seriadas del suero conteniendo el anticuerpo (antisuero), añadiendo una cantidad
fija del antígeno (la célula o la bacteria). Después de la incubación se observa la formación
de agregados, determinándose el título.
El título es un valor relativo representado por el recíproco de la máxima dilución que
provoca aglutinación. Por ejemplo, si un antisuero aglutina a una dilución 1:256, pero no a
1:512, su título es 256.
Ejemplo de esta técnica es la Prueba de Vidal para diagnóstico de Salmonella, la Prueba de
Weill-Felix para Rickettsias, etc.:
Prueba de Reacciones febriles:
Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuencia de ciertas
infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinación entre
los antígenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antígenos
presentes en el suero del paciente.
Esta técnica comprende:
- Reacción de Widal para diagnóstico de la fiebre tifoidea, entérica y ondulante. La
reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensión de
antígenos conocidos de Salmonella typi , S. paratyphi A y S. paratyphi B.
35
- Reacción de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis).
- Reacción de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen
componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OX-K). En esta
prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo.
Antígenos comerciales:
Brucella (B. abortus) Paratífico B (flagelar)
Tífico O (somático) Tífico H (flagelar)
Paratífico A (flagelar) Proteus OX-19
Obtención de la muestra sanguínea:

1. Se revisan ambos brazos del paciente para localizar una vena adecuada.
2. En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule látex, aproximadamente a 6 cm por
encima de la vena.
3. Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje secar antes de
sangrar, para evitar posibles reacciones alérgicas y que no arda.
4. Introduzca la aguja del vacutainer paralelamente a la vena para no perforarla, cuidando
que el en el bisel de la aguja, el orificio quede hacia arriba.
5. Se introduce el tubo para recolección de muestra, en el soporte del vacutainer y
automáticamente se obtendrán 3 ml.
6. Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga más sangre del
paciente.
7. Deje coagular la sangre y centrifugue.
8. Separe el suero con una pipeta pasteur y deposítelo en un tubo limpio, para las pruebas
serológicas.
PRUEBA CUANTITATIVA
Pozo # ml Suero Antígeno Aglutinación Título
problema
ml
1……………..0.08………………….1 gota……….. 4+……………1:20
2……………..0.04………………….1 gota……….. 4+……………1:40
3 …………….0.02………………….1 gota………...3+……………1:80
4 …………….0.01………………….1 gota………...2+……………1:160
36
5 …………….0.005 ………………..1 gota ………..1+……………1:320
6……………..suero…………………1 gota………...3+……………1:80
control(+)
0.02
7……………. Suero…………………1 gota……….no debe mostrar aglutinación
control(-)
0.02
Interpretación de los resultados: Se observa la aglutinacion macroscópica y se valoran los

resultados en la siguiente forma:
4+ 100% aglutinación
3+ 75 % "
2+ 50 % "
1+ 25 % "
0 -
Los enfermos de brucelosis aguda mostrarán un título de aglutininas 1:80 o mayor. Pueden
persistir por meses o años.
Un título tífico somático (O) significativo es 1:80, pero mayor es importante.
Para el tifo, el menor título significativo es 1:80. Un aumento cuádruple se considera
importante.
Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete días. Si en la
segunda muestra se encuentra un título más elevado que en la primera, indicará una
infección activa. Si por el contrario en la segunda muestra se encuentra un título menor que
en la primera, indica que el paciente está en recuperación y los anticuerpos detectados son
de memoria.
Anote el resultado de las pruebas febriles, por ejemplo tífico “O” positivo 1:80, Proteus
negativo, etc.
Discuta los resultados, indicando en las reacciones positivas, cómo se puede saber
en base al título obtenido, si el resultado de una titulación alta es a consecuencia de
una enfermedad activa o de inmunoglobulina (IgG) de memoria.
37
En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir entre
células o sustancias de su propio organismo y las que tienen otro origen. Entre los extraños
se incluyen células de otros organismos, virus, bacterias, toxinas, toxoides, vacunas, etc.
Cuando estos materiales penetran en el organismo son reconocidos como sustancias
extrañas.
La Inmunología estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del hospedador

frente a enfermedades causadas por microorganismos, es decir, la inmunidad adquirida
específica. Las células germinales de la médula ósea que participan en las respuestas
inmunitarias, se diferencian en una de dos posibles poblaciones de linfocitos:
1.- Linfocitos B, o Células B. Reciben ese nombre, porque las células precursoras
maduran en un pequeño órgano linfoide llamado Bolsa de Fabricio en las aves (en los
mamíferos hay tejidos linfoides equivalentes, como las placas de Peyer del tracto digestivo)
y se transforman en linfocitos B. Sólo el 20 % de los linfocitos circulantes son Células B; el
resto de las células están en el tejido linfoide. Viven días o semanas. Las Células B son las
responsables de la respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el
antígeno, originan células plasmáticas productoras de anticuerpos. También pueden originar
células con memoria, linfocitos de larga supervivencia que están en reposo después de haber
sido estimulados por un antígeno; cuando se renueva el contacto con un antígeno igual,
producen la llamada "respuesta secundaria" que es más rápida y vigorosa que la "respuesta
primaria", porque hay una mayor y más rápida producción de anticuerpos. El resultado es
que el individuo responda con mayor prontitud e intensidad a una segunda exposición al
antígeno.
2.- Linfocitos T, o Células T, que también se originan a partir de precursores producidos en

médula ósea por las células germinales. Se desarrollan en el Timo, de donde toman su
nombre. Abandonan el timo y se concentran en bazo, ganglios linfáticos y también van a la
sangre. Viven durante varios meses. Como consecuencia de la activación antigénica, los
Linfocitos T dan lugar a las células Efectoras responsables de la respuesta inmunitaria
celular. Los linfocitos T participan en la muerte o eliminación de materiales extraños y
microorganismos invasores, e incluso células cancerosas. Son las principales responsables
del rechazo de trasplantes y de reacciones alérgicas cutáneas. Se encargan de movilizar a los
macrófagos en la destrucción de patógenos y de estimular a las células B para intensificar la
producción de anticuerpos (hay una "cooperación celular").
Aunque más difícil de medir, la inmunidad celular también está reforzada por una segunda
exposición a un antígeno, lo que es representado por una nueva y mayor población de
células T con memoria, capaces de responder a la segunda aparición del antígeno.
En el laboratorio clínico, la Serología permite el estudio de las reacciones antígeno-

anticuerpo que se encuentran en el suero sanguíneo. Las reacciones serológicas son
38
específicas entre un antígeno y un anticuerpo y pueden ser usadas para el trabajo de
diagnóstico. Cuando uno de los componentes es conocido, el desconocido puede ser
detectado con un alto grado de sensibilidad y exactitud. Las pruebas serológicas de reacción
antígeno-anticuerpo, amplían la capacidad diagnóstica del clínico y orientan la terapéutica.
Hay muchas técnicas disponibles.
Anote detalladamente y analice los resultados
39
PRACTICA #2
BACTERIOFAGOS
El alumno aprenderá a manejar los fagos en el laboratorio y conocerá su importancia

en la Microbiología.
INTRODUCCION.
Las bacterias son huéspedes de un grupo especial de virus denominados

bacteriófagos o "fagos". Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la
infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la multiplicación viral y,
estudios de ingeniería genética. Por otro lado, también son muy útiles en la
tipificación de cepas bacterianas.
1. Fagos lisogénicos, también denominados moderados o temperados:
aquí el genoma del fago se replica sincrónicamente con el cromosoma bacteriano,

pasando a la progenie. En este estado lisógeno, los fagos integrados al cromosoma
bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separación. Estos genes
permiten a la bacteria lisógena expresar nuevas actividades y producir nuevas
proteínas.
El genoma del fago lisógeno puede modificar la estructura del polisacárido bacteriano
y su antigenicidad, o puede codificar la producción de toxinas bacterianas que causan
enfermedades como la difteria, la escarlatina, el botulismo.
2. Fagos líticos: se replican dentro de la bacteria huésped y la lisan, liberando nuevos

fagos. Los fagos más estudiados hasta ahora son los de Escherichia coli, mismos que
se han designado con la letra T y diferentes números. Los fagos virulentos al destruir
a las bacterias producen placas de lisis que se tornan evidentes en cultivos de placas
de agar.
40
I. Prueba cualitativa.
1. Siembre una placa de agar-cerebro-corazón, depositando en la superficie 0.2 ml de

una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago.
2. Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con un asa bacteriológica.
3. A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en

cada uno deje caer una gotita de suspensión del fago T7, usando una pipeta Pasteur.
4. Incube a 37 C por 24 hs.
5. Observe las áreas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas de

bacterias lisadas por replicación del fago.
II. Prueba cuantitativa por dilución en placa.
1. Haga diluciones de una suspensión del fago en la forma siguiente: En un tubo

estéril coloque 0.5 ml del fago, más 4.5 ml de caldo cerebro corazón (c.c.c.).
2. De ahí transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina

fisiológica y continúe haciendo diluciones con s.s.f. hasta obtener una dilución de
1:1000 000.
3. De cada dilución del fago, transfiera 0.1 ml a tubos conteniendo 0.l ml de la

bacteria. Mezcle e incube a 37 C por 20 min.
4. Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de a.c.c. blando (0.5%), mezcle y
vacíe en cajas de Petri estériles con a.c.c
5. Deje solidificar e incube a 37 C durante 24 hs. Determine las calvas y cuéntelas.
6. Para calcular el número de partículas virales /ml, cuente el número de placas líticas
en las cajas de cultivo que presenten pocas placas y aplique la siguiente fórmula:
41
UFP / ml = PV x FD
PV = número de placas virales
FD = Factor de dilución de la caja de Petri
UFP / ml = unidades formadoras de placas, por ml de suspensión original del fago.
42
PRACTICA # 3
DIAGNOSTICO SEROLOGICO
DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B
Que el alumno desarrolle una técnica serológica para diagnosticar el VHB en suero humano
y comprenda el fundamento para poder interpretar los resultados.
INTRODUCCION
El virus de la hepatitis B es el miembro más importante de los Hepadnavirus. Infecta el
hígado y posiblemente el páncreas, pero solo de humanos y chimpancés. El virión completo
es una partícula esférica de 42 nm de diámetro. La principal proteína es el antígeno de
superficie (HBsAg). La nucleocápside contiene el ADN circular, parcialmente bicatenario,
una ADNpolimerasa y el antígeno del "core" (HBcAg). En la superficie de este antígeno se
expresa otro, llamado antígeno "e" (HBeAg) y es uno de los principales constituyentes de la
cápside.
El suero de los individuos infectados muestra más partículas virales incompletas, que
viriones; por microscopía electrónica se pueden observar tres tipos de partículas, compuestas
de proteína, lípidos y carbohidratos, pero sin contener ácido nucleico:
1) Partículas completas de 42 nm, 2) partículas esféricas de 22 nm y 3) partículas tubulares
de longitud variable hasta de 200nm.
El antígeno de superficie (HBsAg) se halla en la cubierta y en la superficie de las partículas
esféricas y filamentosas y éste mismo induce la aparición de una inmunidad protectora; está
compuesto por lípidos y por siete o más polipéptidos que contienen los determinantes
específicos de grupo y de tipo del VHB.
Las infecciones agudas y crónicas se diferencian entre sí por la prevalencia del HBsAg en el
suero y por el patrón de anticuerpos frente a los antígenos HBs y HBc. Los linfocitos B no
pueden fabricar anticuerpos hasta que no detectan los antígenos y, por otro lado, los
anticuerpos unidos a los antígenos en forma de complejos no se pueden determinar. Los
antígenos HBsAg y HBeAg pueden detectarse en el laboratorio.
En la mayoría de los casos de hepatitis aguda por virus B, el HBsAg desaparece en pocas
semanas o meses. La persistencia del HBsAg por más de 6 meses sugiere un estado de
portador. Conforme el título de HBsAg declina en la hepatitis aguda, empiezan a aparecer
anticuerpos contra HBsAg (es decir anti-HbsAg). Estos anticuerpos son neutralizantes y su
ausencia correlaciona con estado de portador.
43
El VHB resiste el éter, los pH reducidos, la congelación y temperaturas moderadamente
altas, lo que facilita su transmisión de un individuo a otro mediante sangre, vía percutánea y
contacto personal íntimo.
Prueba serológica de hemaglutinación inversa para la detección del antígeno de
superficie del Virus de la Hepatitis B (antígeno HBs).
En la hemaglutinación inversa, se cubren eritrocitos de pollo con anticuerpos antihepatitis B
de superficie, previamente preparados en cobayos. En esta técnica se buscan antígenos en el
suero, a diferencia de la hemaglutinación directa , donde se buscan anticuerpos en el suero.
Esta prueba se basa en el principio de hemaglutinación inversa de eritrocitos de pollo
sensibilizados con inmunoglobulina (IgG altamente purificada) anti-HBs, obtenida de
cobayos. Esta aglutinación inversa es específica cuando existe antígeno de HBs en el suero
(o plasma) de prueba. Esta técnica ofrece varias ventajas prácticas, en comparación con
otras, ya que detecta al antígeno con mayor sensibilidad. Es sencilla y no requiere mucho
tiempo (aproximadamente una hora) y se puede leer a simple vista.
Reactivos:
B. Reactivo de absorción: Buffer de fosfatos salino que contiene suero normal de
conejo y de cobayo para diluir la muestra de suero, así como para reconstituir las Células
Sensibilizadas y las Células Control.
C. Células Sensibilizadas con Anticuerpos (liofilizadas):
Contiene eritrocitos de pollo, sensibilizados con inmunoglobulina anti-HBs. Para la
reconstitución agregue la cantidad especificada de diluyentes de absorción en el momento
de usarse.
D. Células Control (liofilizadas):
Preparación de eritrocitos de pollo sensibilizados con IgG normal de cobayos. Para la
reconstitución agregue la cantidad especificada de diluyente de absorción en el momento de
usarse.
E. Suero Control (líquido):
Una dilución 1:10 de suero humano positivo inactivado (con título de 1:320) para el
antígeno HBs que contiene alrededor de 20 ng/ml de antígeno HBs.
F. Absorbente (liofilizado):
Debe usarse para la absorción del suero de prueba. En el momento de usarlo agregue la
cantidad especificada de diluyente de absorción.
44
Procedimiento:
1. Preparación del suero problema: 3 ml de sangre del paciente se deja coagular y se
centrifuga. El suero no debe contener eritrocitos ni otros componentes visibles del plasma.
2. Ejecución de la prueba Cualitativa: Realice la prueba en una microplaca, usando dos
pozos para cada muestra:
Pozos
I II III
Dilu 100 µl 25 µl 25µl

yente
Suero 25 µl ------->25 µl ---> 25 µl ---->25 µl descartar

problema
Células - 25ul -
control
Células - - 25ul
sensibi
lizadas
Agite durante 5 min y enseguida cubra la placa para evitar la evaporación. Deje reposar 1
hora a temperatura ambiente.
Interpretación de los resultados: la prueba es positiva, cuando se observa:

a) asentamiento de los eritrocitos en forma de anillo mayor en diámetro y más delgado
que el del control.
45
b) eritrocitos aglutinados dispersos uniformemente en el fondo.
CUESTIONARIO.
1. Haga un esquema del VHA y uno del VHB. (anexe hoja)
2. Investigue la incidencia del virus de la hepatitis A, hepatitis B y hepatitis no-A ni B, en
México.
3. Investigue el riesgo de contraer cáncer hepático en portadores de Virus de la Hepatitis
A, B
46
PRACTICA # 4
DIAGNOSTICO DEL VIRUS
DE LA RUBEOLA
Conocer una técnica serológica común para diagnóstico de rubeola y comprender su
fundamento.
INTRODUCCION
Los virus de la rubeola (sarampión alemán) comparten propiedades estructurales y el modo
de replicación de los togavirus, pero se diferencian en la vía de diseminación y transmisión.
Son partículas esféricas de 60-70nm, con tres tipos de proteínas estructurales asociadas con
la envoltura viral y una proteína que forma parte de la nucleocápside interna. El virión
contiene una densa región central rodeada por una doble capa de lípidos. Son virus con
ARN monocatenario.
La rubeola es un virus respiratorio, que causa una enfermedad exantemática leve en los
niños, pero de serias consecuencias para los neonatos. La rubeola materna causa graves
defectos congénitos.
El aislamiento del virus de la rubeola es difícil y rara vez se lleva a cabo. El diagnóstico
suele confirmarse por la presencia de anticuerpos IgM específicos. Un incremento del 400%
en las tasas de IgG, entre la fase aguda y la convalecencia indica infección reciente. Los
anticuerpos contra el virus se determinan al principio del embarazo para conocer el estado
inmunitario del paciente; esta determinación es obligatoria en algunos países. Cuando es
necesario aislar el virus, puede detectarse en muestras de orina, notándose una interferencia
en la replicación del virus ECHO 11 en cultivos de células primarias de mono verde
africano. Se previene con la vacuna hecha de virus vivos, subcutáneamente. Puede
permanecer indetectable en personas asintomáticas.
Desarrolle un método serológico, haciendo reaccionar suero del paciente con antígenos
específicos, siguiendo las instrucciones del Kit serológico comercial.
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbente Assay) El
La técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada regularmente

para la detección de numerosas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del
47
reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.
El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida, siendo la técnica

de referencia utilizada para la medición de determinadas hormonas, toxinas,
inmunoglobulinas, antígenos y anticuerpos desarrollados en todo tipo de infecciones
tanto bacterianas, como fúngicas parasitarias o víricas.
La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da

resultados confiables. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen más pruebas.
Cuando sale positiva, es preciso practicar la IFA o la Western Blot para confirmar los
resultados.
La confiabilidad de una prueba médica depende de dos factores: el nivel de sensibilidad
de la prueba y el grado de especificidad. La prueba ELISA es sumamente sensible (~
99,5%), lo que significa que puede detectar cantidades muy pequeñas de anticuerpos al
VIH. Gracias a eso se reduce la probabilidad de que dé un resultado "falso negativo"
cuando hay anticuerpos al VIH. Suponiendo que una persona se haga la prueba después
del periodo de ventana, si la ELISA da un resultado negativo, es prácticamente imposible
que haya VIH.La elevada sensibilidad de esta prueba implica que tiene una especificidad
ligeramente baja. Esto significa que en algunas ocasiones puede dar un resultado "falso
positivo". Para contrarrestar esta posibilidad, se administran automáticamente otras
pruebas confirmatorias cuando la ELISA da un resultado positivo.
Mecanismo de acción
Se basa en la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido,
poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo
complementario.
El complejo inmunológico, una vez formado, es reconocido por moléculas capaces de

reconocer a su componente más superficial, marcadas con una enzima al que
posteriormente se agrega un sustrato cromógeno.
Posteriormente este sustrato cromógeno es medido por espectrofotometría la cantidad de

producto enzimático resultante., cuantificando así la cantidad producto enzimático
marcado, y por tanto resultante de la reacción inmunológica, unión antígeno-anticuerpo
de inicio.
CUESTIONARIO.
Investigue cuál es la incidencia de la Rubeola en México.
Investigue con cuáles enfermedades se puede confundir la rubeola.
48
49
PRACTICA #5
DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS.
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocer una técnica común para diagnóstico de rotavirus y comprender su fundamento.
INTRODUCCION.
Los Rotavirus forman un grupo de virus productores de gastroenteritis en mamíferos y
aves. Desde 1973 se conocen como agentes comunes causantes de diarrea infantil.
Pertenecen a la familia de los Reovirus y son icosaédricos, de 65-75 nm de diam. Presentan
una cápside de doble capa, un genoma ARN bicatenario y segmentado que es inactivo
como ARNm. En la primera etapa de replicación, ocurre la transcripción de la cadena
menos, como matriz para fabricar el ARNm. Los Rotavirus se dividen en:
- Grupos. Se basan en la antigenicidad de la proteína VP6 y en la movilidad electroforética
de los segmentos del genoma.
- Subgrupos. Son definidos por la fijación del complemento y dependen de la proteína de la
cápside interna VP6.
- Serotipos. Se determinan por reacciones de neutralización y dependen de la proteína VP7.
Entre las técnicas de diagnóstico se incluyen la detección directa del antígeno, el

aislamiento en cultivos celulares y el diagnóstico serológico. La detección directa del
antígeno viral en heces representa el método diagnóstico de elección. La disponibilidad de
anticuerpos específicos ha permitido el empleo del enzimoinmunoensayoy la aglutinación
con látex. Se prefieren estos métodos por rápidos y sencillos, relativamente baratos y de
efectividad.
Desarrolle una técnica serológica para detectar rotavirus en heces de un paciente, siguiendo
las instrucciones de la etiqueta del Kit.
Anote detalladamente la técnica desarrollada y lo que ocurrió en cada paso. Interprete el
resultado en base a los datos de la literatura y concluya.
50
CUESTIONARIO.
Investigue en la biblioteca la incidencia de rotavirus en México.
Investigue qué enfermedades pueden confundirse con la de rotavirus
51
CAPITULO III PARASITOLOGIA
Las asociaciones biológicas entre los seres vivos se iniciaron con la aparición de la vida
misma sobre el planeta Tierra al competir éstos por el espacio y ponerse en contacto
íntimo. Algunos autores señalan asociaciones parasitarias encontradas en restos fósiles de
foraminíferos (protozoos con concha calcárea) y algas marinas con más de 530,000,000
años.
En la actualidad se sabe que hay más clases de organismo parásitos que no parásitos, ya
que esta modalidad de asociación entre los seres vivos es una de las más exitosas. El
hombre es huésped de cientos de especies de parásitos, sin contar a los virus, bacterias y
hongos que en general las especies de éstos son también parásitos en su mayoría.
La parasitología se inicia con el hallazgo de los parásitos por el hombre, hecho que tiene
su origen en los tiempos más remotos y que se pierde en la bruma del pasado histórico de
la humanidad, pero los descubrimientos a este respecto por los antiguos chinos, griegos,
egipcios, persas, etc., han quedado consignados de tal manera que el estudiante actual es
capaz de reconocerlos por el análisis de los manuscritos que dejaron para la posteridad,
los adelantos que sobre los parásitos y enfermedades parasitarias se realizaron hace
muchísimos años.
Las enfermedades parasitarias han producido a través de los tiempos más muertes y daño
económico a la humanidad que todas las guerras juntas. Generalmente en los países con
poco desarrollo socioeconómico es en donde las enfermedades parasitarias y la
parasitosis se presentan con mayor frecuencia, viéndose favorecido esto por las
condiciones climáticas cálidas o templadas y por la falta de cultura médica en el pueblo
Es importante señalar que alguna parasitosis transmitida por el suelo y por fecalismo
(ascariosis, uncinariosis, tricocefalosis, amibiosis, giardiosis, etc.) no solo se presenta en
climas cálidos sino inclusive en zonas templadas y aún en frías.
La República Mexicana, debido a su diversidad geográfica y al desigual desarrollo

económico, presenta frecuencias variables de enfermedades parasitarias en las diferentes
regiones.
Entre las principales causas de mortalidad en país, se observa que las defunciones por
enfermedades infecciosas y parasitarias asociadas a naciones subdesarrolladas ocupan el
4to lugar. La mortalidad por enfermedades parasitarias es un problema común a los
diferentes grupos etáreos, pero su magnitud destaca en la niñez, evaluándose en términos
de muerte prematura y que repercute en Años de Vida Potencial Perdidos (AVPP) que es
un valioso indicador para países en desarrollo pues otorga mayor importancia a las causas
de defunción que inciden a edades tempranas.
52
PRACTICA #1
MANEJO DE MUESTRAS Y COPROPARASITOSCOPICO
DIRECTO
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.
Aprender el tipo, recolección y manejo de muestras utilizadas para el diagnostico de
parasitosis, así como también desarrollar la técnica del coproparasitoscópico directo y
adquirir el criterio para saber cuándo usarlo.
INTRODUCCION.
Un examen coproparasitoscópico es el estudio de material fecal, para la búsqueda e
identificación de formas parasitarias intestinales. Puede ser cualitativo o cuantitativo. Las
muestras fecales son seriadas con un mínimo de tres y deben colocarse en frascos de boca
ancha, guardados en lugares frescos, mientras se analizan, pues con el calor se aceleran los
fenómenos de fermentación y con el frío se pueden destruir los quistes y trofozoítos de
protozoos. Si son heces formadas, para conservar los parásitos se puede utilizar refrigeración
a 10 C. Los métodos químicos permiten la conservación durante un tiempo más
prolongado, sin correr el riesgo de que los parásitos se deformen o se destruyan, por ejemplo
con soluciones que contienen formol, yodo-mertiolate, etc.
En el manejo de los productos biológicos es donde va a radicar el éxito o el fracaso de un

diagnóstico en enfermedades parasitarias. Es necesario seguir ciertos lineamientos
preestablecidos para cada producto.
Recolección. La obtención de la materia fecal se puede hacer de diferentes maneras; la

más frecuente es por la expulsión natural. La segunda se puede obtener con purgantes y
la otra es de qué se toma por medio de la cucharilla rectal. La que se utiliza con mayor
frecuencia es la primera, la segunda se utiliza en casos muy especiales como en
amebosis intestinal crónica y en estrongiloidosis; Finalmente, la toma con cucharilla
rectal se utiliza en los lactantes. Las muestras serán seriadas en tres días consecutivos,
salvo otras indicaciones
Manejo. Se deben utilizar frascos limpios de boca ancha, se evitará la contaminación con
tierra, agua u orina. Los frascos se guardarán en lugares frescos, pues el calor acelera los
fenómenos de fermentación y con frío se pueden destruir los quistes y trofozoítos de
protozoos (Goldman y Johnson, 1950; Chang, 1955); deberán etiquetarse con el nombre de
53
la persona, edad, sexo, fecha, de preferencia, hora de expulsión de las heces.
Conservación. Los conservadores pueden ser físicos o químicos. Los medios físicos, son
las temperaturas bajas, de 10º C que es la temperatura del refrigerador; se utilizan sobre
todo para heces formadas, las cuales incluso pueden llegar a examinarse 24 y hasta 48 horas
después de evacuadas, lo que no sucede con las heces diarreicas, que deben examinarse en
un plazo no mayor de una hora y no deberán refrigerarse.
Los medios químicos permiten la conservación de las muestras durante un tiempo
mayor, sin correr el riesgo de que las formas parasitarias se deformen o destruyan.
Conservadores y preservadores
 Solución de formalina* al 10 %.
 Solución de formalina al 5%.
 Solución de merthiolate-yodo-formaldehído (MIF).
 Fijador de fenol alcohol y formol (PAF)
CARACTERES MACROSCÓPICOS A ANALIZAR
- CANTIDAD.- Depende fundamentalmente de los residuos alimenticios procedentes de

la dieta, según su contenido en verduras y frutas, es decir, en celulosa. Y de la presencia
de estreñimiento o diarrea en el enfermo.
- CONSISTENCIA.- Puede ser acuosa ó líquida, blanda, pastosa o semiformada,
formada y dura. Normalmente y con dieta mixta, la deposición debe ser sólida y formada,
es decir cilíndrica y consistente para mantener esta forma después de ser excretada. (Ver
anexo)
- COLOR.- Normalmente y con dieta mixta, la deposición es de color pardo o café
marrón más o menos oscuro en el adulto, en niños debido a la dieta Láctea es amarillenta,
con dieta carnea se hace marrón oscuro. Una alimentación rica en verduras, tiñe las heces
de color verdoso, mientras que si preponderan papas o pan las
heces se aclaran a marrón amarillento.
- OLOR.- El olor fecal característico, se hace fétido en todos los procesos que cursan con
putrefacción de las proteínas ingeridas o endógenas, dado por productos aromáticos
originados por la acción de microorganismos de fermentación o de putrefacción que
actúan sobre carbohidratos y proteínas como el indol y el escatol.
- MOCO.- Su aparición en las deposiciones suele ser reconocible macroscópicamente. Si
se encuentra finamente dividido y mezclado en las heces, dándole un color brillante ,
entonces procede del intestino delgado a diferencia del moco en copos visibles tiene un
origen mas bajo y sobre todo el que se observa en tira tiene un origen en el colon distal.
54
SANGRE.- Su presencia es anormal debida a una acción traumática por algún agente
infeccioso. se puede encontrar fresca dándole una coloración rojo brillante cuando los
daños son en el colon o bien encontrarse metabolizada, proporcionándole a las heces un
color rojo oscuro o negrusco cuando los daños son a nivel de intestino delgado.
- PRESENCIA DE PARÁSITOS MACROSCÓPICOS.- Algunos parásitos como
Ascaris lumbricoides pueden ser observados a simple vista, los oxiuros pueden hallarse
en la superficie inicial de las heces, algunos otros parásitos pueden salir como fragmentos
como las tenias y es necesario buscarlos en la totalidad de la muestra.
EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO.

En este estudio, el material fecal más utilizado es el recién obtenido por expulsión natural
del paciente, ya sean heces bien formadas o evacuaciones disminuidas de consistencia, con
moco y/o sangre. Este método es de gran utilidad para la detección en fresco de trofozoítos
de Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli, Trichomonas hominis y
Blastocytis hominis. En la suspensión teñida con lugol se pueden identificar con facilidad
quistes de protozoos.
Este examen en fresco es sencillo, rápido y económico, pues requiere poco material.
-Es excelente para la búsqueda de trofozoítos y protozoos.
-Es eficaz en la búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas.
-Sin embargo, la muestra utilizada es muy pequeña y poco representativa.
Los montajes en solución salina tienen la ventaja de que retienen la movilidad de los
trofozoitos, sin embargo, es difícil la observación de las estructuras internas, pues con
frecuencia son poco definidas. El Yodo se emplea para destacar las estructuras internas de
los parásitos presentes, pero inmoviliza trofozoítos.
Existen otras tinciones para observación de estructuras de protozoarios como tinción de rojo
de metilo (para vacuolas digestivas), tinción con tinta china (observación de inclusiones) y
solución de Noland (observación de flagelos). Ver anexo.
Cada alumno debe trabajar por lo menos con dos especímenes diferentes, además de la
muestra testigo que proporcione el profesor. Una muestra debe ser propia del alumno y una
segunda puede ser de otra persona.
La muestra debe ser recolectada de manera correcta como se menciono anteriormente.
*Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo
el procedimiento.
55
COPROPARASITOSCOPICO DIRECTO.
1. Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La
muestra debe ser reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al
laboratorio.
2. Observar cuidadosamente las características macroscópicas de la muestra a analizar
con la finalidad de determinar su consistencia, color, olor, presencia de moco, sangre o
parásitos macroscópicos.
3. Con un aplicador se toma una muestra de heces (lo que se embarre solo en la punta), de
preferencia que contenga moco y sangre y se deposita en la gota de sol. salina, haciendo una
suspensión (no se hace frote). Se monta con un cubreobjetos.
4. Se repite la operación en la gota de lugol, con una gota de rojo de metilo, una gota de tinta
china y finalmente en una gota de solución de Noland (Hacer en total 5 laminillas)
5. Hacer una suspensión uniforme y retirar los detritos macroscópicos
6. Observe al microscopio, a 10 X y después a 40 X.
7. Con ayuda de la bibliografia, se aprecian los diferentes tipos de residuos fecales, así como
los posibles parásitos.
8. Realice dibujos detallados de los protozoarios encontrados en las heces estudiadas. Hay
posibilidad de que encuentre Giardia, E. histolytica, Balantitdium y Cryptosporidium
principalmente.
9. Con el lugol se observaran estructuras internas de los parásitos

Con el rojo de metilo se observaran vacuolas ácidas:coloración roja y Vacuolas
alcalinas: coloración amarilla
Con tinta china diluida se observaran partículas incluidas por pinocitosis
Con la solución de Noland observara presencia de flagelos
RESULTADOS
Se informará detalladamente aquellas características macroscópicas observadas

durante el análisis coproparasitoscopico
56
CARACTERISTICAS OBSERVACIONES
MACROSCOPICAS
CONSISTENCIA
COLOR
OLOR
MOCO
SANGRE
PRESENCIA DE PARASITOS
MACROSCOPICOS
Resultados de la observación Microscópica
a) Género y especie del parásito:

b) Estadio desarrollado:
c) Aumento utilizado:
d) Estructuras observadas:


DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Con los resultados observados durante el desarrollo de la práctica realice su discusión y

conclusión
57
BIBLIOGRAFIA
Consultada por el alumno
ANEXOS
Regularmente en el área de Parasitología , las muestras más analizadas para demostrar la

presencia de parásitos intestinales del hombre son las heces fecales; sin embargo , existen
otros parásitos cuya presencia se puede evidenciar en muestras biológicas como : bilis,
jugo duodenal, esputo, secreción , biopsia o frotis perianal , no obstante estas pruebas se
harán tomando en cuenta los antecedentes clínicos específicos del paciente y tienen
utilidad en la integración del expediente cuando se sospecha de enfermedades
parasitarias.
Tipos de muestra parasitológica
58
SIGNIFICADO CLINICO DEL COLOR DE LAS HECES:
El color de las heces proporciona una significativa información al químico clínico, ya que
con solo realizar un detallado análisis macroscópico de estas , le puede orientar en gran
parte para detectar alguna patología, disfunción orgánica, hemorragia, o bien hacer de su
conocimiento el tipo de alimentación o ingestión de algún medicamento que este
presentando el paciente en ese momento . El color anormal ayuda al médico a
seleccionar las pruebas tanto químicas como microbiológicas necesarias para llegar
finalmente a extender un buen diagnostico, pronostico y plan de tratamiento adecuados
para el paciente.
A continuación se hará referencia a los colores más comunes que pueden presentar las
heces fecales ya sea por alguna patología o bien por algún otro factor externo:
MEDICAMENTOS QUE PROVOCAN CAMBIOS EN LA COLORACIÓN DE

LAS HECES:
· Negro: Sales de hierro, Sales de bismuto, carbón.
· Verde: cloruro de mercurio, indiometicina, calomel.
59
· Verde a azul: ditiazanina.
· Marrón: antraquinonas.
· Rojo: fenolftaleína, pamoato de pirivino, tetraciclinas em jarabe,
bromosulfaleína.
· Amarillo: santonina, antibióticos.
· Claro a blancuzco: bário, antiácidos.
· Naranja rojizo: fenazopiridina.
· Rosa a rojo a negro: anticoagulantes dosis excesivas, salicilatos.
Tipos de materia fecal de acuerdo a la escala de Bristol
Los tipos 1 y 2 indican estreñimiento; los 3 y 4 son heces ideales, especialmente el 4, ya que son los más
fáciles de defecar; los tipos 5, 6 y 7 tienden hacia diarrea o cólera.
60
PREPARACIÓN DE COLORANTES PARA TINCIONES DE PROTOZOARIOS
Solución Noland:
Fenol saturado en agua ……………………..80 ml
Formol 40%....................................................20 ml
Glicerina…………………………………….4 ml
Violeta de genciana…………………………20 mg
Mezclar todos los componentes y guardar en frasco ambar.
Rojo Neutro:
Solución madre
Rojo neutro…………………………………. 0.5 g
Alcohol 70%: ……………………………….100 ml
Disolver el colorante en el alcohol. Para la solución de trabajo , diluir 1 parte de la solución madre en 10
partes de agua destilada. Guardar en frasco ambar por 6 meses
Tinta china diluida:
Tinta china……………………………………1-2 gotas
Agua destilada………………………………...1 ml
61
PRACTICA #2
Protozoarios intestinales y tisulares
Identificar los protozoarios intestinales y tisulares de importancia medica
mediante la observación de laminillas
INTRODUCCION.
Los Protozoarios son organismos unicelulares que se consideraron durante mucho tiempo
como un solo phylum, pero recientemente se han dividido en una serie de grupos con
carácter de phylum. Los phyla que incluyen especies parásitas humanas son
Sarcomastigophora, Ciliophora, Apicomplexa y raras veces Microspora.
Los protozoarios parásitos incluyen animales unicelulares que muestran modificaciones
fisiológicas parásitas fuertes en aquellos grupos que son completamente parásitos, en
relación a aquéllos que incluyen especies de vida libre y especies parásitas. Con frecuencia
los órganos que no son necesarios para una existencia parásita se han perdido. El único
grupo de protozoos que sólo incluye especies parásitas es el phylum Apicomplexa. Los
miembros de este phylum carecen de órganos locomotores, mientras que estas estructuras de
uno u otro tipo existen en los phyla restantes de protozoos.
PHYLUM SARCOMASTIGOPHORA.
Subphylum Mastigophora: se mueven mediante estructuras especializadas denominadas
flagelos, que son extensiones citoplásmicas largas como hilos. Los flagelos se originan en
estructuras citoplásmicas denominadas blefaroplastos. Su número varía en cada especie.
Algunos son parásitos hemáticos o tisulares y otros son intestinales. Se reproducen
generalmente en forma asexual. Los principales géneros patógenos son Giardia lamblia,
Trichomonas vaginalis, Dientamoeba fragilis, Leishmania y Trypanosoma.
Subphylum Sarcodina: incluye a protozoos que se mueven por medio de extensiones

citoplásmicas denominadas pseudópodos. La especie patógena importante es Entamoeba
histolytica, una amiba intestinal. El grupo incluye también los géneros Naegleria y
Acanthamoeba que aunque son amibas de vida libre, su potencial invasivo ya se ha
demostrado al causar meningoencefalitis y otros daños serios como queratitis.
62
PHYLUM APICOMPLEXA.
Los miembros de este phylum (antes denominado Sporozoa), son parásitos estrictos,
tisulares. Presentan un ciclo de vida complejo con una alternancia de generaciones sexuales
y asexuales. Los géneros patógenos más importantes son Plasmodium, Toxoplasma,
Isospora, Cryptosporium, Pneumocystis y Sarcocystis.
PHYLUM CILIOPHORA.
En estos organismos la locomoción se lleva a cabo por medio de cilios, que son
proyecciones citoplásmicas relativamente cortas, que se originan en pequeños gránulos
basales.
Son más cortos y más numerosos que los flagelos. El único género parásito es Balantidium,
en el intestino.
Observe al microscopio Protozoarios parásitos intestinales, montados en laminillas fijas.
Observe al microscopio Protozoarios parásitos tisulares, montados en laminillas fijas.
Note las diferencias morfológicas fundamentales entre los protozoarios observados, así
como sus estructuras mostradas en cada caso y haga dibujos. (ver anexo)
RESULTADOS
Estudie detalladamente y dibuje, guardando proporción al campo, los estadios de desarrollo
de los protozoarios provenientes de laminillas.
Realizar un análisis de cada protozoario y su estadio observado contestando los siguientes
rubros:
a) Género y especie del parásito

_________________________________________________
b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________
c) Estadío desarrollado ________________________________________________
d) A que órgano (s) o sitio (s) invade o parásita ______________________________
e) Especificando si fue en fresco ó que tinción se utilizo
___________________________________________________________
f) Describe las características y /o criterios morfológicos.
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
63
Realice los dibujos observados:
DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Con los resultados observados durante el desarrollo de la práctica realice su discusión
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA POR EL ESTUDIANTE
64
PRACTICA #3
TECNICAS DE TINCIONES PERMANENTES Y CONCENTRACION DE
PARÁSITOS POR FLOTACION
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Que el alumno se familiarice con diferentes técnicas de tinción de parásitos para poder
distinguirlos al microscopio y utilizarlas en diagnóstico. Se desarrollará y comprenderá el
fundamento de la técnica de concentración para diagnostico de parásitos intestinales.
INTRODUCCION.
En la mayoría de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar bien con
tinciones temporales, como es el caso de los exámenes directos con lugol, solución salina o
Sudán, efectuados en prácticas anteriores. En algunas ocasiones es necesario teñir los
parásitos en forma definitiva, para obtener preparaciones permanentes; otras veces estas
tinciones son necesarias porque se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares,
usando tinciones especiales permanentes. Algunos parásitos requieren tinciones especiales,
para poder observarse. Igualmente, el inmunodiagnóstico puede realizarse recurriendo a la
tinción con anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes, facilitando la identificación.
Las preparaciones fecales permanentes son hechas por diferentes razones:
- Proporcionan información sobre el material estudiado: tinción de Romanowsky)
- Utiles en la identificación exacta de flagelados: tinción de Romanowsky, tinción de Fierro-
hematoxilina
- Cuando el parásito no puede ser detectado en preparaciones en fresco o por técnicas de
concentración, la tinción permanente de material fecal fresco puede revelar la presencia de
parásitos intestinales: tinción de Romanowsky, tinción Tricromo, Tinción de Ziehl Neelsen
modificada
- Son útiles en la demostración de patrones nucleares de quistes, facilitando la
identificación: tinción de fierro-hematoxilina, tinción Tricromo
La mayoría de los Nematodos puede fijarse en alcohol 70° caliente o en alcohol acético (1
parte de ácido acético y 3 partes de alcohol 95°). Los Nematodos se almacenan en alcohol
70°. Se agregan unas pocas gotas de glicerina a fin de impedir la desecación en caso de
evaporarse el alcohol durante ese tiempo.
La concentración de parásitos por flotación en muestras fecales permite comprobar la

existencia de quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos, aún cuando estén presentes
en pequeñas cantidades. Esta técnica se basa en la propiedad que tienen las soluciones de
densidad mayor, para hacer flotar objetos menos densos, como los huevos y quistes de
parásitos, los cuales son colectados en la superficie del líquido y observados al microscopio.
La técnica de concentración con sulfato de zinc proporciona una suspensión de parásitos
muy limpia y es útil para la recuperación de quistes de protozoarios y de la mayoría de los
huevos de helmintos. Aunque no es muy usada en forma rutinaria, por su sencillez se puede
utilizarse en encuestas.
El método de Faust, con ZnSO4, es uno de los más utilizados, aunque es poco eficaz para
huevos pesados como los de Tremátodos o como los huevos no fértiles de Ascaris. Tampoco
es muy efectivo para muestras de heces ricas en grasas. Este método puede realizarse en
muestras recientes, refrigeradas o fijadas con formol (5% ó 10%).
65
1. Tinción de Romanowsky
a). Tinción de Giemsa

El colorante de Giemsa puede ser usado para frotes de heces no-formadas, exudados fecales
y aspirados duodenales.
Una tinción permanente de Romanowsky como la tinción Giemsa o tinción rápida de Field
debe ser usada para diarrea sanguinolenta y para heces semi-formadas con sangre y/o moco.
Proporciona información sobre el exudado presente, presencia de trofozoítos de flagelados
como Giardia lamblia. Permite determinar la presencia de protozoarios que son difíciles de
detectar o no son detectados en preparaciones en fresco, como Blastocystis hominis.
Materiales
Colorante de Giemsa: 1 g de polvo de Giemsa + 66 mL de glicerina calentado a 50
grados durante 2 horas, añadir 66 mL de actohol metílico absoluto, dejar a temperatura
ambiente 7-14 días (maduración). Filtrar antes de su empleo.
Método
Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La
laboratorio.
1. Haga un frote delgado de exudado fecal. Deje secar al aire libre.
2. Fije en metanol por 1 minuto. Escurra y deje secar.
3. Cubra el frote con colorante Giemsa diluido 1:10 con agua destilada. Cada vez debe
prepararse el colorante.
4. Deje colorear por 20-25 minutos.
5. Lave con agua de la llave y no deje precipitar el colorante en el frote. Deje secar al aire
libre.
6. Examine el frote a 100 X.
7. Los Flagelos, cilios y núcleos se tiñen de rojo y el citoplasma azul.
b) Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-resistente) Modificada

Esta técnica es útil en la identificación de ooquistes de coccidios como Cryptosporidium,
Isospora, y Cyclospora, que son difíciles de detectar con colorantes rutinarios. Esta tinción
de Ziehl-Neelsen Modificada no requiere el calentamiento de los reactivos al teñir.
Espécimen: Puede utilizarse el sedimento concentrado, de heces frescas o preservadas en
formalina.
Materiales
Reactivos para la tinción: Se efectúan cuatro pasos en el proceso, con diferentes reactivos:
Metanol Absoluto
Alcohol Acido: 10 ml de acido Sulfúrico + 90 ml de etanol Absoluto. Almacene a
temperatura ambiente.
Carbol fucsina
Verde de Malaquita al 3%: disuelva 3 g de verde de malaquita en 100 ml de agua destilada.
66
Almacene a temperatura ambiente.
Método
1. Preparar un frote con 1 a 2 gotas del espécimen fecal sobre un portaobjetos y secar en
una platina caliente a 60°C. Los frotes no deben quedar demasiado gruesos.
2. Fijar con metanol absoluto durante 30 segundos.
3. Teñir con carbol Fucsina por un minuto.
4. Lavar con agua destilada brevemente y escurrir.
5. Decolorar con alcohol- ácido durante 2 minutos. Enjuagar con agua destilada y escurrir.
6. Teñir con el colorante de contraste verde de malaquita durante 2 minutos.
7. Lavar brevemente con agua destilada y escurra.
Secar el portaobjetos sobre una platina caliente a 60 °C durante 5 minutos. Montar la
preparación con un cubreobjetos usando un medio de montaje.
Examinar 200 a 300 campos usando el objetivo seco fuerte 40×.
Para confirmar la morfología interna, use el objetivo de aceite de inmersión 100x.
2. Concentración por flotacion
Método de Faust, con ZnSO4

laboratorio. Además de su muestra, se examinará una muestra positiva proporcionada por el
profesor.
Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo
el procedimiento.
1. Con un abatelenguas se toma aproximadamente 1 g de heces (el tamaño de un cacahuate)
y se deposita en un vasito que contenga de 10 a 15 ml de agua de la llave y se mezclan con
un aplicador de madera.
2. La suspensión se filtra a través de una coladera o malla y se recibe el filtrado en un tubo
de centrífuga de 14 ml. Se le adicionan 1-2 ml de éter. Se tapa con un tapón de hule y se
agita vigorosamente. Se adiciona agua hasta que la muestra quede a 1cm por debajo del
bordo superior del tubo.
3. Se centrifuga por 45 segundos a 2500 rpm. Debe romperse cualquier acúmulo que
pudiera haberse formado en la parte superior y se decanta el sobrenadante.
4. Se Añaden 2 a 3 ml de agua de la llave y se agita para resuspender el sedimento. Se
resuspende nuevamente el sedimento, adicionando agua de la llave poco a poco, hasta que
quede la muestra a 1 cm del borde superior del tubo. Se centrifuga de nuevo.
5. Se decanta el sobrenadante y se agregan al sedimento 2 a 3 ml de sulfato de zinc (dens.
1.180. Lo cual equivale a 330 g de sulfato de zinc en 1 litro de agua), moviendo con un
aplicador para resuspender. Se agrega más sulfato de zinc hasta que llegue a unos 0.5 cm del
borde superior del tubo.
6. Se centrifuga a 2300 rpm durante 2 min. y no debe sacarse el tubo de la centrífuga.
7. Sin sacar el tubo de la centrífuga, se recogen algunas gotas del material que flota en la
superficie con una asa de platino (se debe cuidar que el asa no penetre demasiado bajo la
superficie) o con una pipeta Pasteur.
8. Se depositan las gotas en un portaobjetos y se agrega una gota de lugol. Enseguida se
67
completa la preparación con un cubreobjetos.
9. Se observa al microscopio, a 10X y 40X. Es posible el hallazgo de protozoarios y
helmintos.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Describa sus observaciones y resultados. Dibuje los organismos observados, compare con la
literatura para identificar los parásitos

68
PRACTICA #4
IDENTIFICACION DE HELMINTOS Y CONCENTRACION DE PARASITOS
POR SEDIMENTACION.
Aprender a diferenciar morfológicamente Helmintos parásitos comunes, mediante
observación de ejemplares en diferentes etapas adultos, larvas y huevos con el fin de
identificarlos, comprendiendo sus ciclos biológicos.
Desarrollo y comprensión de la técnica para aprender a concentrar por sedimentación e
identificar parásitos intestinales en heces. Asimismo analizará la utilidad de los recursos
para el diagnóstico.
INTRODUCCION.
Los Helmintos incluyen los phylum de los Platyhelminthes y de los Aschelminthes.
El phylum de los Platyhelminthes o gusanos planos incluye animales pluricelulares que se
caracterizan por tener el cuerpo aplanado con simetría bilateral. La mayoría son
hermafroditas.
La mayoría de los miembros son simbiontes que viven sobre o dentro de sus
hospedadores. Las clases Trematoda y Cestoda incluyen solo organismos parásitos.
Los miembros de la clase Cestoda tienen cuerpo alargado en forma de cinta segmentada,
que lleva en el extremo anterior un órgano especial de fijación: el escólex. No poseen
aparato digestivo. Los céstodos adultos o tenias, viven en el intestino delgado. Un ejemplo
común es Echinococcus granulosus cuyo adulto parasita el intestino de canidos. Por otro
lado, en su etapa larvaria parasita las vísceras de humanos y herbívoros, causando el quiste
hidatídico (hidátide) al ingerir alimentos o agua contaminados con heces caninas
conteniendo los huevos del parásito adulto.
En el caso de Taenia solium sus larvas afectan músculos y sistema nervioso central de
humanos y cerdos, causando cisticercosis; los huevos de T. solium al ser ingeridos por
humanos o cerdos (en alimentos contaminados con heces humanas conteniendo huevos del
adulto) dan lugar a larvas que se dirigen a los órganos o tejidos del cuerpo, donde
desarrollan los cisticercos. La presencia de unos pocos cisticercos en áreas no vitales (tejido
subcutáneo) puede ser asintomática, pero puede producirse una enfermedad grave cuando se
fijan en áreas de importancia vital. Localización: a) mucosas, b) tejido celular subcutáneo, c)
muscular, d) ocular, e) sistema nervioso central, f) otros.
El diagnóstico de estos parásitos puede ser: a) clínico, b) de laboratorio, c) de gabinete. El
diagnóstico debe hacerse mediante la correlación de todos los datos obtenidos.
Tanto el cisticerco como la larva hidatídica, pueden recuperarse completo o demostrarse
histológicamente, en los tejidos separados por cirugía.
El phylum de los Platyhelminthes o gusanos planos incluye animales pluricelulares que se
caracterizan por tener el cuerpo aplanado con simetría bilateral. La mayoría son
hermafroditas. Los adultos pueden tener menos de 1 mm de longitud o alcanzar una longitud
de varios metros.
La clase Trematoda o "duelas" presenta organismos con forma de hoja alargada, delgados,
con órganos de fijación consistentes en ganchos o en depresiones musculares en forma de
copa terminada en ventosas. Su aparato digestivo es muy simple. De los tres órdenes de
Trematoda, el Orden Digenea incluye todas las especies parásitas humanas. Los miembros
69
tienen ciclos de vida complejos, por lo menos con un huésped intermediario, un molusco.
Hay especies hepáticas, hemáticas y pulmonares en humanos. Las especies más comunes
son Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Paragonimus westermani.
En patología se observan muchos parásitos tisulares, uno de los más comunes e importantes
es el caso de la Trichinella spiralis. Las larvas del parásito se observan en los músculos y es
importante distinguirlos en su dimensión y morfología.
Los aschelmintos parásitos humanos quedan incluidos en la Clase Nematoda. Los
nemátodos o gusanos redondos son animales cilíndricos, alargados, generalmente con los
extremos adelgazados. Poseen una cutícula gruesa que puede ser lisa, o puede extenderse
formando
una serie de estructuras, sobre todo en los extremos anterior y posterior. Los sexos están
separados, siendo el macho generalmente más pequeño que la hembra. Tienen un aparato
digestivo bien desarrollado. Las especies humanas tisulares humanas importantes son
Trichinella, Strongyloides, Toxocara, Gnathostoma, Wuchereria, Onchocerca, Mansonella,
Brugia, Loa Loa, Dipetalonema, Dracunculus.
Aunque los adultos de algunas especies son intestinales en humanos, las fases larvarias son
tisulares, como en los casos de Ascaris, Necator, Strongyloides y Ancylostoma.
La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por

gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios,
huevos y larvas, especialmente huevos de tremátodos. Concentra bien estas formas y
elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los
protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo aún en heces con
cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayoría de los quistes de
protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con
opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma .
La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en
los métodos de flotación. .
Las modificaciones al método de Ritchie utilizar acetato de etilo
La técnica de sedimentación concentra los parásitos presentes en la muestra fecal. La técnica
incluye tamizar primeramente las heces para separar los residuos grandes, tratar con formol
para matar y preservar los organismos, y adicionar un solvente como éter o acetato de etilo
para disolver las grasas. Sin embargo, durante la sedimentación, aparte de concentrarse los
parásitos, se quedan reunidos también algunos otros materiales, abundando los artefactos
durante la observación. Debido a que se usan varios reactivos resulta antieconómico, no
obstante su eficacia.
1. Observación de Helmintos
1. Observe al microscopio o macroscópicamente, según el tamaño del ejemplar, ya sean
huevos,larvas o adultos de Platelmintos, por ejemplo Taenia solium, Taenia saginata,
Fasciola hepática
2. Igualmente observe huevos, larvas y adultos de nemátodos, como Ascaris
lumbricoides,
uncinarias, Trichuris, Enterobius, Trichinella, Onchocerca.
70
3. Note las diferencias morfológicas para su identificación. Haga dibujos detallados con
el
nombre de sus estructuras y el nombre científico correspondiente de cada parásito.
4. Haga dibujos detallados de los diferentes estadíos observados en cada parásito Haga un
esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los parásitos observados.
2. Técnica de sedimientación
laboratorio. Además de su muestra, se examinará una muestra positiva proporcionada por el
profesor.
Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo
el procedimiento.
Método del Formol-éter (Método de Ritchie)

1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate) mediante la
ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solución salina fisiológica. Mezcle
con un aplicador de madera y homogenice.
2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de
centrífuga de vidrio de 14 ml
3. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en solución
salina.
4. Repita el paso anterior, dos o tres veces para lavar, resuspendiendo el sedimento en
solución salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un sedimento más
limpio.
5. Agregue al sedimento 10 ml de formol al 10% en solución salina, mezcle y deje en
reposo durante 5 min.
6. Añada 3 ml de éter y agite vigorosamente 30 segundos.
7. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m.
8. Después de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente.
1) éter y lípidos en la superficie
2) un tapón de restos fecales
3) formaldehido
4) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parásitos.
9. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Se le adiciona unas gotitas de lugol
y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur y se monta entre porta y
cubre. Se observa a 10 y a 40 X.
10. Fuentes comunes de error: una suspensión fecal demasiado cargada, suspensión fecal
pobre, centrifuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de centrifugación inadecuados.
TÉCNICA PARA MUESTRAS FRESCAS

1. En un tubo de centrifuga, desmenuce una porción de heces de unos 2 cms. De diámetro
en suero fisiológico para conseguir que 10 ml, de suspensión contengan cerca de 1 ml.
Del sedimento centrifugado.
71
2. Colar 10 ml de suspensión a través de dos capas de gasa en un embudo. Recolecte en
tubo de centrifuga de 15 ml.
3. Centrifugue durante 1 a 2 min. a 1,500 rpm o 600g.
4. Decante el sobrenadante .El sedimento ocupara entre 1 a 1,5 ml de sedimento. Si la
cantidad es mayor o menor ajuste a la cantidad adecuada. Si el sedimento es mayor
resuspender en solución salina y eliminar la cantidad necesaria. Si es menor añada una
segunda porción tratada de la misma manera que la primera.
5. Resuspenda el sedimento en sol. salina, centrifúguese y vuélvase a decantar.
6. Añadir 9 ml. De formalina al 10%, mezclar bien y dejar reposar por 5 min. o más.
7. Añadir 3.0 ml. De éter o acetato de etilo. Cierre el tubo con tapón y agite
vigorosamente en posición invertida por lo menos 30 seg. Retirar el tapón con cuidado.
8. Centrifugue por 1 min. a 450 - 500 g.
9. Retire el tubo y observe la formación de 4 capas como sigue:
• Capa de Éter.
• Tapón de restos fecales.
• Sol. De Formalina
• Sedimento que contiene parásitos.
10. Marcar cuidadosamente con un aplicador de madera un anillo alrededor de la capa de

restos fecales para liberarlo de los lados del tubo, volcar el líquido sobrenadante en un
recipiente. Arrastrar el sedimento, añadir una cantidad similar de colorante de Yodo
(Lugol) y colocarlo sobre un portaobjetos. Agregar un cubreobjetos y observar.
11. Fuentes comunes de error: Una suspensión fecal demasiado cargada,
Suspensión fecal pobre, Centrifuga mal equilibrada, Tiempo y velocidad de
centrifugación inadecuados.
12. Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos mediante la
comparación de su morfología con los manuales y libros.

1. Discuta el fundamento de las técnicas serológicas utilizadas en el inmunodiagnóstico
para cisticercos de Taenia solium ofrecidas en el mercado
2. Investigue como se diagnostica la cisticercosis en cerdos en el rastro.
3. Haga un esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los parásitos
observados. Anote los nombres de las etapas de desarrollo correspondientes en cada uno.
4. Consulta la literatura y diga cuales son los animales que actúan como huéspedes
intermediarios de Fasciola hepatica. Haga dibujos
5.Discuta las dificultades y las facilidades de la técnica de Ritchie, con respecto a las
anteriores.

72
ANEXO
Morfología diferencial de Cestodos
TENIOSIS TENIOSIS
Parasitosis DIFILOBOTRIOSIS HIMENOLEPIOSIS
SAGINATA SOLIUM
Parásito Taenia saginata Taenia solium Diphyllobothrium latum Hymenolepis nana
Clasificación Helminto / cestodo Helminto /cestodo Helminto / cestodo Helminto /cestodo
Medidas de los ejemplares adultos 5-8m 3-5m 4 - 25 m 2 - 4 cm
Piriforme
Romboidal
Cuadrangular 0,5 - 1 mm
Forma de espátula 0,3 mm
1 - 2 mm 4 ventosas
Características del escólex 4 - 10 mm 4 ventosas acetabulares
4 ventosas acetabulares
2 botrias Rostelo retráctil con corona
acetabulares Rostelo con doble
de ganchos simple
corona de ganchos
Rectangulares Cuadrangulares
1,5 - 2,2 cm x 1 cm 0,7 x 0,5 cm
Trapezoidales
Útero recorre toda la Útero recorre toda la
Trapezoidales 0,1 - 0,3 mm x 0,8 - 1 mm
proglótida y tiene proglótida y tiene
10 - 15 mm x 2 - 5 mm Ovario bilobulado con 3
Características de las proglótidas más de 12 menos de 12
Útero central en roseta masas testiculares
ramificaciones ramificaciones
Poro genital central Poro genital lateral, al
primarias primarias
mismo lado
Poro genital lateral, al Poro genital lateral,
azar al azar
Cisticercus
cellulosae
Cisticercus bovis o
Procercoide
o cisticerco de Taenia
Nombre (s) estadio (s) larval (es) y Cisticercoide
cisticerco de Taenia solium
Plerocercoide
saginata (ver ciclo
Cisticercosis
humana)
Medida huevo 30 - 45 um 30 - 45 um 50 - 75um 30 - 50 um
Esférico u ovoide Esférico o elíptico
Esférico u ovoide
Gruesa corteza Gruesa corteza
Gruesa corteza
radiada Ovalado Interior: oncósfera o
Características del huevo radiada
Interior con Opérculo en un extremo embrión hexacanto,
Interior: oncósfera o
oncósfera o embrión filamentos polares y
embrión hexacanto
hexacanto ganchos en paralelo
Identificación de Identificación de
proglótidas proglótidas Identificación de
Método de diagnóstico EPSD: (Ej. EPSD: (Ej. proglótidas EPSD: (Ej. Telemann)
*Elemento diagnóstico Telemann) Telemann) EPSD: (Ej. Telemann) *Huevo embrionado
*Huevo embrionado *Huevo embrionado *Huevo embrionado
de Taenia sp. de Taenia sp.
Cisticercus
Cisticercus bovis
cellulosae
o Huevo embrionado
Forma infectante o Plerocercoide
cisticerco de Taenia Cisticercoide (artrópodo)
cisticerco de Taenia
saginata
solium
73
ANEXO
Morfología diferencial de tremátodos
Parásito Fasciola hepática Fasciolopsis buski Paragonimus Schistosoma
clasificacion Helminto/tremátodo Helminto/tremátodo Helminto/tremátodo Helminto/tremátodo
Medidas 18-32 mm x 7-14 mm 2 to 7 cm long 7 - 13 x 5.5 - 7.5 mm

adultos
Características cuerpo aplanado, Semejante a fasciola Cutícula espinosa , gusano largo y

adultos intestino lleno de , ausencia de Utero en posición delgado. El macho
sangre contrasta por “hombro” media y lateral, mide 10-12 mm de
tonalidad oscura . arrollado, en forma de longitud y solo 0,11
Parte frontal, roseta, Ventosa oral mm de anchura bordes
proyección cónica de igual tamaño que laterales incurvados,
continúa con ” la ventral, Testiculos considerablemente
hombro” ensanchado lobulados más ancho que la
estrechandose en hembra que mide 12-
sentido posterior 16 x 0,016 mm.1
hasta terminar en
punta; está cubierta de
espinas
Nombres Miracidio,
estadíos Redia,Cercaria
larvales
Tamaño y marrón amarillentos y 120 - 197 micrones, 50-125 micras por son alargados, con
características relativamente grandes semejante a fasciola 35-70 m. cubierta transparente,
del huevo (130-150 x 60-90 1-t) Amarillo-café, de unos 114-180 μm x
Presencia de cutícula ovoides o elongados , 45-73 μm, con un
gruesa exterior uno de los extremos característico espolón
(opérculo) ligeramente achatado. lateral nítido cerca de
Operculo visible la extremidad posterior
y apuntando hacia
atrás. Cada huevo
contiene un miracidio.
74
CAPITULO IV MICOLOGIA
Introducción.- La micología, es la ciencia que se dedica al estudio de los hongos. Mas

allá que estos pertenecen a un reino propio (Reino Fungi), la micología es aún
considerada como un ramo de la botánica (ciencia que se dedica al estudio del reino
Plantae – de las plantas).
El conocimiento de los hongos, ha evolucionado profundamente en gran parte debido a

los desarrollos verificados a nivel de microscopía y de bioquímica, que permitieron una
más amplia caracterización estructural y funcional de los elementos de este reino.
Los hongos presentan una serie de características peculiares que hacen con que ellos
funcionen como eje de enlace de varias cadenas tróficas, presentando características
típicas de diferentes reinos (Animal, Vegetal y Protista): son seres vivos heterotróficos
(absorben sustancias orgánicas en solución), sin clorofila y pueden tener un
comportamiento saprobio, parásito o simbiótico. Se presentan formados por hifas, que se
agrupan en un tejido no verdadero (el micelio), excepción hecha a las levaduras, que son
unicelulares. Siendo delimitados exteriormente por una membrana rígida conteniendo
quitina y hemicelulosa, ellos se reproducen a enorme velocidad mediante una enorme
variedad de procesos sexuales, asexuales y parasexuales.
La micología aplicada es un área de investigación con profundo interés antropológico,

dada la diversidad de características que los elementos del reino Fungi presentan: desde
peligrosos (pudiendo hasta ser mortales), hasta indispensables para el combate de
enfermedades como infecciones bacterianas, ellos son una presencia omnipresente en el
día a día.
En la actualidad, la micología médica ha surgido como una de las ramas más importantes
de la medicina, abarca una gama muy extensa de patologías en el hombre y los animales
que son clasificadas en Alergias, Micotoxicosis, Micetismos, Micosis superficiales,
Micosis subcutáneas, Sistémicas y Oportunistas.
75
PRACTICA # 1
EUMYCETES (HONGOS VERDADEROS)

Aprender a determinar las características macro y microscópicas más sobresalientes

de algunos grupos de Eumicetos (mohos y levaduras), y comprobar su alta
distribución en el ambiente.
INTRODUCCION
Los hongos son organismos eucariotes, unicelulares o pluricelulares y presentan una

pared celular, de composición diferente a la de las plantas. No contienen clorofila ni
sintetizan macromoléculas a partir del CO2 ni de la luz. Todos son heterotróficos. Se
encuentran ampliamente distribuídos en la naturaleza y los de mayor interés son los
ornamentales, los comestibles, los venenosos, los tóxicos, los alucinógenos, los
medicinales, los patógenos (de humanos, animales, plantas), los degradadores de
materia orgánica y los que descomponen los alimentos.
REINO FUNGAE:
Subdivisión Clase
Zygomycotina Zygomycetes
Ascomycotina Ascomycetes
Basidiomycotina Basidiomycetes
Deuteromycotina Deuteromycetes o Fungi Imperfecti (aquí se incluyen la mayoría

de los hongos patógenos humanos.
El cuerpo de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular.
a) Talo unicelular: de forma ovoide o redonda, como las levaduras

b) Talo pluricelular: con aspecto filamentoso. A éstos se les conoce como mohos y
están formados por hifas microscópicas que consisten de filamentos tubulares
ramificados, con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocíticas (sin
divisiones y multinucleadas) o tabicados (divididas en segmentos). La masa de
hifas constituye el micelio. En las hifas se producen diferentes clases de esporas
reproductivas:
esporas asexuales: talosporas, conidios, esporangiosporas.
esporas sexuales: ascosporas, basidiosporas.
- A los macromicetos carnosos se les denomina setas (champiñones).
76
Identificación:
Los hongos presentan requerimientos nutricionales muy simples, pero su desarrollo

es más lento que el de las bacterias, necesitando varios días de incubación. Las
características más empleadas para la identificación de los hongos filamentosos
(mohos) son: el tipo de talo, la morfología macroscópica del micelio, micelio aéreo y
profundo, es decir las características coloniales, tanto de frente como en el reverso.
Las colonias de hifas son macroscópicas, de variados aspectos y colores (algodonoso,
aterciopelado, polvoso. La morfología microscópica del micelio se refiere al tipo de
hifas, estructura y modo de formación del cuerpo reproductivo sexual, tipo de
esporas: forma, tamaño, aspecto externo, agrupacón, número de células, flagelos.
Las levaduras forman colonias semejantes a las bacterianas. Para la identificación de

levaduras se requiere conocer además de la morfología, la determinación de
características fisiológicas y bioquímicas, especialmente su acción sobre azúcares.
I. Aislamiento de hongos del ambiente
1. Abra una caja de Sabouraud-agar-penicilina en el jardín, en alguna habitación, o

en cualquier cualquier otro lugar, durante 15 min. Después de este tiempo tápela e
incúbela a 28 C por una semana, hasta observar el desarrollo de colonias de
hongos.
2. En otra caja espolvoree unas cuantas partículas de polvo del jardín e incube igual
por una
semana.
3. Una vez desarrolladas las colonias de hongos, haga una descripción de las colonias
y compárelas entre sí. Haga dibujos.
4. Guarde en una bolsa de papel una fruta o una verdura, durante una o dos semanas,
a temperatura ambiente. Revise periódicamente, hasta observar el desarrollo de
colonias de hongos.
5. Observaciones Macroscópicas:
Compare las colonias desarrolladas entre sí, tanto en los medios de cultivo como
en los vegetales, notando las diferencias de color al frente y al reverso. Haga dibujos
de las que sean diferentes.
6. Observaciones microscópicas de los hongos de las colonias desarrolladas:

Coloque una gota lo más pequeña posible de lactofenol, en el centro de un
portaobjetos. Enseguida corte un fragmento de cinta adhesiva transparente del
largo de un portaobjetos y ayudándose con un lápiz, doble la cinta a la mitad con la
parte adhesiva hacia afuera sujetando con los dedos los dos extremos. Adhiera la parte
del doblez sobre la colonia del hongo y enseguida coloque la cinta sobre el
portaobjetos, haciendo que coincida la muestra de la colonia del hongo con la gota de
lactofenol, de tal forma que la cinta actúe como cubreobjetos. Observe al microscopio
77
a 10 y a 40 X.
7. Trate de identificar los hongos hasta género, mediante una comparación de las
hifas y
esporas observadas al microscopio, con los dibujos mostrados en los libros. Haga
dibujos detallados, con los nombres de las estructuras del hongo y el nombre del
género
identificado.
II. Levaduras.
A partir de levadura para pan o cerveza, haga observaciones entre porta y cubre
III. Hongos macromycetos.
Colecte hongos macroscópicos (en el mercado y en el campo) y haga

observaciones al microscopio, a partir de un fragmento de unos 3 mm de
diámetro, en una gota de lactofenol entre porta y cubre.
IV. Microcultivo de cepas puras de hongos:
1. Prepare unas cajas de Petri con un círculo de papel filtro en el fondo, una varilla
doblada en V, un portaobjetos y un cubreobjetos. Esterilícelas. Acomode el
portaobjetos y el cubreobjetos sobre la varilla.
2. Con un bisturí estéril, corte cuadros de agar-Sabouraud de aprox. 1 cm2 y
acomode uno en el centro de cada portaobjetos, dentro de la caja.
3. Con un asa micológica obtenga fragmentos (aprox. 1 mm de diám.) de una colonia
pura de un hongo y vaya inoculando el centro de cada lado del cuadro.
4. Enseguida cubra el cuadro de agar con el cubreobjetos, humedezca el papel filtro
con agua-glicerinada estéril, y tape la caja. Incube una semana a temperatura
ambiente.
5. Separe cuidadosamente el cubreobjetos y móntelo sobre un cubreobjetos
conteniendo una gota de lactofenol-azul de algodón. Por otro lado, separe el
portaobjetos y en su centro deposite una gota de lactofenol, montando con un
cubreobjetos. Cuide que en ninguna preparación quede reactivo fuera del
cubreobjetos. Selle los bordes de ambas preparaciones con barniz de uñas y deje
secar.
6. Observe a 10 X y a 40 X.
78
l
Aspergillus Penicillium
PENICILLIUM
79
PRACTICA # 2
MICOSIS SUPERFICIALES
Que el alumno observe al microscopio las diferencias macro y microscópicas de los hongos
causantes de infecciones superficiales y que conozca las técnicas de diagnóstico.
INTRODUCCION
Las dermatofitosis o tiñas (Tinea) son micosis superficiales causadas por un grupo
de hongos queratinofílicos estrechamente relacionados, denominados dermatofitos.
Estos afectan la capa córnea de la piel, pelos y uñas.   Los dermatofitos se dividen en
tres géneros que se distinguen por las características morfológicas de sus
macroconidios: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton. el género
Trichophyton tiene macroconidios alargados cuya porción distal es redondeada, de
pared delgada y lisa, miden de 8 a 50 µm, el número de septos va de 4 a 6. Los
macroconidios del género Microsporum miden de 8 a 15 µm, son en forma de huso,
de pared gruesa, rugosa, con hoyuelos o prominencias que semejan tubérculos
denominados equínulas, multiseptados (5 a 15 septos). Finalmente, los
macroconidios del género Epidermophyton son numerosos, miden de 7 a 12 µm, en
forma de mazo o basto, redondeados en su polo distal, de pared gruesa y lisa, con 4
septos transversos.  En la actualidad se consideran 40 las especies causantes de
enfermedad, de las cuales cinco son las más frecuentes: T. rubrum, T.
mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, E. floccosum. El dermatofito que causa el 80-
90% de esta micosis es T. rubrum. La mayoría de los dermatofitos tienen una
amplia distribución mundial, aunque algunos están geográficamente restringidos,
como T. concentricum.
Las dermatofitos se clasifican en tres grupos ecológicos en base a su hábitat natural

y su preferencia por el hospedero.
  • Antropofílicos, grupo de dermatofitos que parasitan el tejido humano. Se ha

descrito que estas especies evolucionaron de los hongos zoofílicos y que
gradualmente perdieron su afinidad por la queratina del animal. Las especies más
importantes son: T. rubrum, T. tonsurans, T. violaceum, T. schoenleinii, T.
mentagrophytes var interdigitale, M. audouinii y E. floccosum. En casos excepcionales
M. audouinii y T. rubrum han sido aislados de escamas y pelos de animales.
  • Zoofílico, son dermatofitos que afectan a una gran variedad de aves y mamíferos
que actúan como hospedero. Los principales son M. canis, T. equinum y T. gallinae.
  • Geofílico, grupo de dermatofitos que viven en el suelo. La mayoría de las especies
no son patógenas: M. gypseum, M. fulvum, T. terrestre.
80
Técnicas de diagnóstico de laboratorio para hongos Dermatofitos:
1) Toma de muestras:
Piel Cabelluda: se pueden recolectar los pelos cortos de las áreas lesionadas, escamas y/o
pus.
b) Piel: se recolectan escamas raspando con dos portaobjetos en el límite de la lesión.
c) Uñas: con un bisturí se toman fragmentos y polvo.
2) Examen directo de las muestras:

a) en el caso de pelos, éstos se colocan entre porta y cubre con una gota de KOH al 20 % y
la preparación se calienta ligeramente , o se deja 15-20 min sin calentar. Al observar al
microscopio se encuentran abundantes esporas y filamentos dentro del pelo o sobre él.
b) Las escamas de piel o uñas, se montan igual, con KOH entre porta y cubre, calentando
un poco. En el microscopio se encuentranlas células parasitadas por hifas. En las uñas se
pueden observar filamentos más abundantes, mezclados como una red, con muchas
artrosporas en cadenas.
3) Cultivo de las muestras:

Los medios rutinarios para el cultivo de escamas, pelos o uñas, son Sabouraud-dextrosa-
agar con o sin antibióticos y en Mycosel. Las muestras se siembran colocándolas
directamente sobre la superficie del medio y se incuban a 28 C una semana
aproximadamente, hasta observar colonias.
Existen otras clases de micosis superficiales causadas por hongos que se desarrollan
demasiado lejos del tejido vivo, esencialmente no hay patología por la presencia del hongo
y suele haber una falta de respuesta celular del huésped. En estos casos los pacientes pueden
no darse cuenta del trastorno. Aquí se incluyen:
- "Pitiriasis versicolor" causada por la levadura lipolítica Malassezia furfur, es una
infección crónica, asintomática, puede haber caspa en la cabeza o áreas cutáneas que
cambian de color, en tórax, espalda y miembros. En los recién nacidos causa las "costras de
leche" en el cuero cabelludo.
- "Piedra" es causada por Trichosporon beigelii y Piedra hortae. Es una infección

del talo piloso, con la presencia de nódulos firmes como costras arenosas blancas o negras.
- "Tiña negra" es causada por Exophiala wernekii. Es asintomática, con máculas pardas
o negras, no escamosas en la piel.
81
I. Aislamiento de hongos dermatofitos humanos, a partir del suelo.

1. Obtenga de sus compañeros fragmentos de uñas y cabellos. Entierre las puntas en la
tierra colocada en una caja de Petri. Riegue con agua la tierra hasta saturarla, es decir,
sin permitir que se encharque.
2. Incube a 30 C durante 1-4 semanas, vigilando que la tierra no se seque. Adicione agua
destilada cuando lo requiera.
3. Observe el desarrollo de hongos algodonoso blancos en las puntas de los pelos y uñas.
Con unas pinzas de disección desentierre los pelos y uñas y colóquelos sobre un
portaobjetos en una gota de agua. Con unas pinzas sujete la muestra y trate de enjuagar
en el agua con mucho cuidado, para eliminar la tierra adherida, permitiendo que
continúe el micelio en la muestra.
4. A continuación transfiera la muestra a un porta conteniendo una gota de KOH al. 20 %.
Deje actuar 2-5 min y monte con un cubreobjetos. Observe a 10 y a 40 X.
5. Identifique los géneros de los dermatofitos aislados, comparando con las claves de la
literatura..
II. Colecte muestras de enfermos con dermatofitos (puede conseguirlas en un hospital

o con personas conocidas, sobre todo uñas de ancianos)
1. Trate las muestras de pelos, escamas de piel o uñas en la misma forma con KOH
y observe al microscopio.
2. Determine si el micelio muestra esporas, y en qué forma se pueden identificar.
3. Siembre algunas muestras en placas de agar Sabouraud-penicilina. Incube a
temperatura ambiente hasta ver desarrollo de colonias fungosas.
III. Observación de cepas puras de hongos Dermatofitos:

6. Haga preparaciones o recíbalas ya hechas, de hongos dermatofitos entre porta y cubre en
una gota de lactofenol. (De preferencia, se recomienda que el alumno reciba del
profesor, preparaciones fijas de los hongos, para evitar el contacto con las esporas).
82
7. Note las diferencias morfológicas al microscopio entre las diferentes especies. Haga
dibujos detallados con sus colores correspondientes. Compare con las claves
taxonómicas para la identificación.
8. Haga una descripción de la morfología colonial de cada hongo, observada en los
medios de cultivo.
9. En base a las observaciones determine cuales fueron las diferencias fundamentales entre
los diferentes hongos dermatofitos observados en cepas puras.
T. rubrum M. canis
CUESTIONARIO
1.Haga un esquema de Malassezia furfur en su fase parásita y en su fase saprófita, y los
nombres de sus estructuras.
83
PRACTICA #3
MICOSIS OPORTUNISTAS
Que el alumno se familiarice con los hongos oportunistas más comunes y con las técnicas de
laboratorio para su diagnóstico.
INTRODUCCION
En las micosis oportunistas no existe una lista precisa de hongos patógenos ni hay
especificidad de ninguno de ellos por lo que respecta a órganos o tejidos. Casi cualquier
hongo saprófito del suelo o de los que constituyen la flora normal de levaduras cutáneas,
puede transformarse en parásito en sujetos inmunocomprometidos total o parcialmente; en
base a ésto, los hongos oportunistas invadirán total o parcialmente.
Por lo tanto, son microorganismos con baja virulencia, y es necesario que las defensas del
huésped estén muy disminuídas antes de que se establezcan como patógenos. Las vías de
entrada también son varias: a través de piel intacta, heridas o inhalación. Antiguamente estas
enfermedades eran raras, pero en años recientes se han vuelto muy comunes y de gran
significación médica, en forma paralela al uso de antibióticos, citotoxinas,
inmunosupresores, esteroides y otros procedimientos que provocan disminución de la
resistencia del huésped. Por lo general estas micosis son insidiosas y no pueden ser
diagnosticadas sino hasta la necropsia.
En las micosis por hongos patógenos verdaderos, con frecuencia son importantes el sexo, la
edad y la raza del paciente, pero estos factores no influyen para nada en las micosis
oportunistas.
Cuatro especies constituyen la mayoría de estas infecciones: Candida albicans, Aspergillus

fumigata, Cryptococcus neoformans y Rhizopus arrhizus, aunque puede esperarse
parasitosis oportunista de cualquier género de hongo normal de vida libre. También pueden
incluirse algunas bacterias Actynomicetales oportunistas más comunes, como Nocardia
asteroides y Actinomyces israeli.
I.- La candidosis o candidiasis es una micosis causada por diversas especies de

levaduras del género Candida. Cualquier tejido puede ser afectado por lo que se
84
presentan diversos cuadros clínicos, cada uno de ellos asociado directamente al
estado inmunológico del paciente. Las candidosis de mucosas y piel son las más
frecuentes, mientras que las sistémicas son de evolución aguda o crónica y
generalmente severas.
Agentes etiológicos.  Los agentes patógenos son levaduras (el estado anamorfo)
del género Candida pertenecientes al Phylum Ascomycotina. Muchas especies se han
aislado de vegetales, suelo, agua, aire, alimentos y algunas de ellas forman parte de
la biota normal de la piel y membranas mucosas (boca, vagina, vías respiratorias
altas, tracto gastrointestinal) de mamíferos. Este género incluye aproximadamente
150 especies identificadas.
Procedimiento:
1. Obtenga una cepa de una levadura, haga un fresco entre portaobjeto y

cubreobjeto, observe a 40X
2. Realice una tincion de Gram y observe a 100X
3. Haga dibujos de sus observaciones
La criptococosis es una micosis sistémica aguda, subaguda o crónica, inicialmente

pulmonar causada principalmente por Cryptococcus neoformans (vars. neoformans y
grubii) y Cryptococcus gattii. La forma pulmonar es generalmente transitoria, leve y
no reconocida. Las lesiones cutáneas, óseas o viscerales pueden presentarse durante
la diseminación de la enfermedad, pero la inclusión del sistema nervioso central con
meningitis subaguda o crónica es la forma más familiar de la micosis. Aunque el
hongo tiene una amplia distribución mundial y se encuentra de manera abundante
en la naturaleza, solamente causa enfermedad grave en personas con resistencia
inmunológica muy baja. En la actualidad, la incidencia de la criptococosis es paralela
a la presentada por el SIDA.
Los criptococos en el suelo o en detritos vegetales son eliminados del ambiente por
acción de la intemperie, especialmente los rayos solares y microorganismos como
bacterias y amibas, pero los criptococos acumulados en cobertizos pueden
permanecer viables durante varios años, permitiendo que estos hábitats actúen
como fuentes importantes para la dispersión de levaduras desecadas, también
infecciosas. C. neoformans var. grubii y C. neoformans var. neoformans se han aislado
a partir de varias fuentes naturales (vegetales, frutas, jugos de frutas, madera,
productos lácteos y suelo), pero es notoria su asociación con deshechos aviarios
(pericos, loros, canarios) y especialmente con excrementos de palomas. Por otro
lado, los aislamientos ambientales de C. gattii (serotipos B y C), han establecido que
esta variedad tiene una asociación ecológica estrecha con algunas especies de
árboles de eucalipto en Australia como Eucalyptus camaldulensis, E. tereticornis, E.
rudis y E. gomphocephala, así como Terminalia catappa en Colombia y Moquilea
tomentosa en Brasil.
85
Se ha apreciado una estrecha relación entre C. neoformans en pacientes con SIDA y
C. gattii en pacientes inmunocompetentes.   La criptococosis tiene una distribución
geográfica amplia. Los casos causados por C. neoformans var. grubii predominan en
lugares de clima templado, principalmente en EUA (excluyendo sur de California y
Hawai) y Japón y C. neoformans var. neoformans (serotipo D) en Europa. Por otra
parte, los casos provocados por C. gattii provienen principalmente de África,
Latinoamérica, Sur de EUA (California), Australia y Canadá.
II.- Metodología para el Aislamiento de Criptococcus
1.- Recolectar muestras de heces secas de palomas
2.- Depositar 20 grs de heces en caldo peptonado
3.- Incubar a 37 ⁰C por 24 horas.
4.- Del sobrenadante se toma .1 ml y se esparce sobre agar saboraud
5.- Se deja incubar a temperatura ambiente por 3 o 4 días
6.- Tomar una muestra de una colonia sospechosa ( mucoide, convexa, de color blanco a
crema) y depositarla en una gota de solución salina sobre un portaobjetos, agregar un
cubreobjeto para su observación al microscopio, en 40X
7.- Si se observa una levadura grande, hacer observación con tinta china
8.- Nuevamente, se toma una muestra de la colonia sospechosa y se suspende en una gota
de tinta china, se cubre con cubreobjeto.
9.- Observar la cápsula refringente característica del criptococo a 40X .
86
Criptococo tinta china cultivo Criptococo
Candida Tincion Gram Cultivo Candida
87
PRACTICA #4
MICOSIS SUBCUTANEAS
Que el alumno compare las diferencias macro y microscópicas de los hongos y bacterias
causantes de micosis subcutáneas.
INTRODUCCION
En las micosis subcutáneas el agente causal penetra por heridas. Las micosis de este tipo
más conocidas en México son los micetomas, la esporotricosis y la cromomicosis.
Cuando el agente etiológico es una bacteria actinomicetal, se le denomina actinomicetoma,

por ejemplo: Nocardia brasiliensis, Nocardia asteroides, Actinomadura madurae,
Actinomadura pelletieri, Streptomyces somaliensis. En México la mayoría de los micetomas
son causados por bacterias, principalmente Nocardia. Cuando esta enfermedad es causada
por hongos, se le denomina eumicetoma, por ejemplo: Madurella mycetomatis, Madurella
grisea, Pyrenochaeta romeroi, Scedosporium apiospermum..
El Micetoma es un síndrome, que se caracteriza por localizarse inicialmente en el

tejido subcutáneo y de evolución crónica. Clínicamente, se observa un aumento de volumen
en la región afectada y la formación de fístulas, por las que drena un material seropurulento,
conteniendo los "granos". Estos, contienen en su interior conglomerados de hifas del
patógeno con aspecto de “bolas de estambre”.
Diagnóstico del micetoma:
- examen directo al microscopio de la secreción de una fístula que esté activa (la que cause
prurito). Si está cerrada se abre con ayuda de una aguja de disección; el exudado se recoge
con el asa para cultivo y para observación en un portaobjetos. Los “granos” fúngicos aunque
son muy pequeños, pueden distinguirse a simple vista, a diferencia de los de actinomycetos
que sólo se observarse bajo el microscopio.
- biopsia de las lesiones e histopatología
- cultivo de las lesiones o de un fragmento de biopsia
La Esporotricosis es producida por el hongo Sporothrix schenckii, un hongo

dimórfico, que afecta primordialmente la piel y los linfáticos, dando lesiones de aspecto
gomoso y que rara vez profundiza.
88
Diagnóstico de la esporotricosis:
El cultivo de la lesión es el mejor método de diagnóstico, aunque la intradermorreacción con
esporotricina es bastante específica.
La Cromomicosis es causada principalmente por hongos "dematiáceos" (negros).

En México son comunes Fonseca pedrosoi, Cladosporium y Phialophora verrucosa,
produciendo nódulos verrucosos localizados preferentemente en miembros inferiores,
expuestos a traumatismos.
Diagnóstico de la Cromomicosis:
- Examen directo al microscopio de escamas de las lesiones, entre porta y cubre con KOH,
dejando reposar 30 min.
- Cultivo de escamas en Sabouraud y micosel-agar, incubando 30-40 días a 28 C, hasta
observar el desarrollo de las colonias.
1. Haga preparaciones entre porta y cubre con una gota de lactofenol, de los hongos
causantes de micosis subcutáneas, utilizando cepas puras. De preferencia, se recomienda
que el alumno reciba del profesor las preparaciones fijas de los hongos, para evitar el riesgo
de la manipulación por los alumnos y contacto con las esporas de los hongos. Haga dibujos
detallados del micelio y sus esporas observados al microscopio y compare con claves
taxonómicas para la identificación. Complemente con la descripción de la morfología
colonial de cada uno en el cultivo.
2. Tiña Actynomadura madurae y Nocardia brasiliensis con Gram y también con Ziehl-
Neelsen . De preferencia, también en estos casos reciba preparaciones fijas. Haga dibujos,
con sus colores correspondientes.
3. Compare la morfología colonial de las bacterias con la de los hongos. Describa las
diferencias. Haga dibujos.
4. Haga observaciones al microscopio, de laminillas conteniendo cortes histológicos de

tejidos infectados con estos hongos.
89
Note las diferencias del micelio entre las bacterias actinomycetales y los hongos.
Qué dificultades tuvo en las observaciones de los patógenos al microscopio, al comparar con
los dibujos y fotografías de los libros de referencia.
CUESTIONARIO
1. Que zonas de México son epidémiológicas de micetoma y de esporotricosis.

2. Que núcleos de la población en México serían los más expuestos a las micosis
subcutáneas.
3. Cómo se caracterizan las células fumagoides en los hongos dematiáceos
90
PRACTICA # 5
MICOSIS SISTEMICAS
Determinar las diferencias macro y microscópicas de los hongos causantes de micosis
profundas y conocer las técnicas de diagnóstico.
INTRODUCCION.
Los hongos más comunes causantes de infecciones generalizadas o sistémicas son
Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis y
Paracoccidioides brasiliensis. Se desarrollan activamente en el suelo, donde producen
abundantes conidios; al madurar se desprenden y quedan libres en el aire. La entrada al
huésped es mediante la inhalación de dichos conidios. Este grupo de hongos muestra una
transición morfológica de la forma miceliar saprófita, a la parásita, que es la de levaduras
en la mayoría de ellos, como una respuesta a la adaptación. Este cambio es acompañado
por modificaciones metabólicas del hongo. Más del 90% de las infecciones son
asintomáticas o de breve duración, acompañadas de una fuerte resistencia específica a la
reinfección. En los pocos casos con infección residual o crónica, el proceso es semejante
a la tuberculosis. En el huésped hay factores individuales predisponentes a la enfermedad.
Presentan una distribución geográfica muy restringida. Estas infecciones han cobrado
nueva importancia en inmunodeprimidos, ya que en ellos la infección progresa
rápidamente con consecuencias fatales.
Histoplasma capsulatum es un hongo dimórfico, que en medio Sabouraud-dextrosa-agar

y a temperatura ambiente desarrolla una fase filamentosa asexual, con colonias
algodonosas, blancas a parduscas. El micelio da lugar a abundantes macroconidios típicos
redondos de doble membrana, espiculados (erizados) como “rondanas de reloj” de 8-18
um de diámetro. Los microconidios miden de 2-5 um. En gelosa sangre a 37C se obtiene
la fase parásita de la levadura. El estado sexual del hongo se forma en medio con extracto
de levadura, originando ascas y cleistotecios con características de los hongos
ascomycetos Gymnoascales. Crece naturalmente en suelos de espacios abiertos cerrados
o recintos como donde hay pájaros o murciélagos. Las epidemias con frecuencia están
asociadas con la presencia de excremento abundante de estos animales. Los
microconidios al ser inhalados, en el pulmón se transforman en levaduras dentro de los
espacios alveolares de e invaden las células del sistema fagocítico mononuclear.
Diagnóstico de laboratorio:
91
Examen directo: de frotis de sangre espesa o del material de punción esternal, para buscar
formas parasitarias.
Cultivo de esputo (menos efectivo que el anterior.)
Inmunología: IDR no tiene valor diagnóstico, sólo denota primocontacto.
Pruebas seriadas de fijación de complemento: son las más efectivas.
Coccidioides immitis es un hongo bifásico que presenta solo reproducción asexual. En

medio sabouraud- dextrosa- agar y a temperatura ambiente, desarrolla colonias blancas
algodonosas, cuyo micelio origina cadenas de artroconidios, que son liberados al
ambiente. En medio de Converse a 37C se produce la fase parásita de esférula. Se
desarrolla en suelos de clima desértico con suelos pobres. Los artroconidios libres son
inhalados y alcanzan los alveolos. En el tejido pulmonar toma lugar una morfogenesis
única entre los hongos sistémicos. El artroconidio se redondea y crece hasta formar un
cenocito llamado esférula de tamaño aproximado al de los neutrófilos. En su interior
ocurre una segmentación, dando lugar a una miriada de endosporas, que son liberadas al
romperse la pared. Cada endospora crece y forma una nueva esférula. Aún no se conoce
su etapa sexual, aunque existen evidencias genéticas de su sexualidad.
Diagnóstico de laboratorio: Examen directo: puede ser a partir de muestras de esputo,

lavados bronquiales, exudados de las lesiones secundarias, escamas, etc. Es posible
observar las esférulas de Coccidioides, o las levaduras correspondientes a la fase parásita
de otros hongos sistémicos.
Cultivo: De las mismas muestras tomadas para examen directo, se siembra una parte en
Sabouraud dextrosa agar, incubando a 28 C mas de una semana. El micelio desarrollara
los conidios correspondientes a cada género. Para Coccidioides no basta la observación
micróscopica, por la similitud de sus conidios con otros hongos, debiendo recurrir a
técnicas más exactas, como pruebas serológicas y estudios de DNA.
Pruebas inmunológicas:
IDR a la histoplasmina: solo tiene valor de primocontacto. Es positiva 4-8 semanas post-
infección.
92
La fijación de complemento, la inmunodifusión en gel y la inmunofluorescencia, son
efectivas en el diagnóstico de Histoplasma y de Coccidioides, dando además información
del avance del padecimiento.
1. Observe al microscopio preparaciones fijas de de hongos causantes de micosis
profundas. Haga dibujos detallados de las estructuras observadas. Diferencie las
formas saprófitas de las parásitas en cada caso.
2. En cada hongo anote la etapa observada de su desarrollo.

Además de la observación de los hongos al microscopio, investigue el ciclo vital
completo, con los nombres de sus estructuras, para cada uno de los hongos observados y
relacione las fases observadas dentro de su ciclo correspondiente.
CUESTIONARIO:
1. En que áreas de México es endémica la coccidioidomicosis.
2. Relacione las condiciones climáticas de Cd. Juárez, con la posiblilidad de
endemicidad de Coccidioides en este lugar.
93
BIBLIOGRAFIA
Zhang,W. Jun Li, and Donald P. McManus. 2003. Concepts in Immunology and Diagnosis of
Hydatid Disease. Clin Microbiol Rev. 16(1): 18–36. .
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94
95

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DEP. CIENCIAS DE LA SALUD

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DEP. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS

Dr. Alejandro Martínez

COORDINADORA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA

Dra. Evangelina Olivas

A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y

Práctica #1 Aislamiento de Bacterias y Tinciones…………………………………………. 9

Práctica # 2 Microflora Normal y Control Microorganismos………………………….17

Práctica #3 Cocos Gram Positívos…………………………………………………………………21

Práctica # 4 Enterobacterias ……………………………………………………………………….25

Práctica # 1 Diagnostico de Virus Humanos……………………………………………….…31

Práctica # 3 Diagnóstico de Hepatitis B…………………………………………………………43

Práctica # 4 Diagnóstico Rubeola…………………………………………………………..……...47

Práctica # 5 Diagnóstico de Rotavirus………………………………………………..……….…50

CAPITULO III PARASITOLOGIA…………………………………………………………………..….52

Práctica # 1 Manejo Muestras y coproparasitoscópico Directo…………………….53

Práctica # 2 Protozoarios Intestinales y Tisulares ………………………………………..62

Práctica # 3 Tinciones Permanentes y Técnica de Flotación……… ……………….65

Práctica # 4 Identificación de Helmintos y Técnica de Richtie………………………69

Práctica # 2 Micosis Superficiales………………………………………………………………….80

Práctica # 3 Micosis Oportunistas…………………………………………………...…………….84

Práctica # 4 Micosis Subcutáneas y Sistémicas………………………………………….….88

Este reglamento regirá la actitud, el comportamiento y el desempeño del

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