Hongos Comestibles Medicinales Cepas

Proyecto: “Adaptación e implementación de cinco cepas de hongos
comestibles en diferentes subproductos agrícolas para mejorar la

productividad y competitividad de ASOFUNGICOL en el Huila”
MANTENIMIENTO DE
CEPAS DE HONGOS
COMESTIBLES Y
MEDICINALES
Mantenimiento de cepas de
hongos comestibles y
medicinales
Fotografía
Archivo Cenicafé
Archivo Proyecto
Diseño PROTOCOLOS
Martha Liliana Araque Fonseca
• Aislamiento de carpóforos
Cenicafé
• Mantenimiento de cepario
Versión preliminar
Copyright © FNC –Cenicafé 2006

Realizado por: Nelson Rodríguez Valencia
CON EL APOYO DE: Investigador Científico I. Cenicafé.
Servicios Profesionales. Cenicafé.
Francenid Perdomo Perdomo.
PÁGINA 2 MANTENIMIENTO DE CEPAS DE HONGOS COMESTIBLES Y MEDICINALES MANTENIMIENTO DE CEPAS DE HONGOS COMESTIBLES Y MEDICINALES PÁGINA 15
PRESENTACIÓN
LITERATURA CONSULTADA
RODRÍGUEZ V., N. Cultivo de hongos comestibles. Apuntes del trabajo en la-
El proyecto empresarial de innovación y desarrollo tecnológico boratorio. Chinchiná, Cenicafé. Disciplina Química Industrial. 2001. 152 p.
“Adaptación e implementación de 5 cepas de hongos comesti-
bles en diferentes subproductos agrícolas para mejorar la pro- RODRÍGUEZ V., N; JARAMILLO L., C. Cultivo de hongos comestibles del géne-
ductividad y competitividad de la Asociación de productores de ro Pleurotus. Boletín Técnico Cenicafé N° 27: 1-56. 2005.
hongos comestibles de Colombia ASOFUNGICOL”, tuvo como
propósito encontrar las mejores formulaciones de sustrato, elabo-
rados a partir de los subproductos agrícolas más abundantes en
el departamento del Huila e identificar las cepas de hongos de
mayor rendimiento, facilitadas por el Centro Nacional de Investi-
gaciones de Café (Cenicafé), de forma que se mejore el proceso
de cultivo de setas de los asociados.
De igual manera busca transferir a la Asociación todos los cono-

cimientos relacionados con el manejo del material biológico y la
producción de semilla comercial, por ser éste uno de los mayores
obstáculos que han tenido los cultivadores.
El proyecto se realizó con la financiación del SENA, la Goberna-

ción del Huila y la CAM, bajo la dirección técnica de Cenicafé.
En su desarrollo se utilizaron los laboratorios del Centro Agrope-

cuario la Angostura perteneciente al SENA, Regional Huila, para
la obtención de la semilla de los hongos y para el manejo postco-
secha del cultivo.
La fase de campo se realizó en los cultivos de los Asociados en

los Municipios de Rivera, Garzón, Tesalia y Teruel, en el Depar-
tamento del Huila.
PROBLEMAS, CAUSAS Y SOLUCIONES TABLA DE CONTENIDO

Página
PROBLEMAS CAUSAS SOLUCIONES
Contaminación microbia- Acumulación de polvo y • Limpieza constante
na en los procesos de desinfestación deficiente • Rotación de desinfes- Metodologías básicas de laboratorio 4
crecimiento micelial en el laboratorio tantes
Deficiencia en la esterili- • Lavar y desinfestar co- Aislamiento de carpóforos 8
zación del material rrectamente el material.
• Verificar temperaturas y Mantenimiento de cepario 10
tiempos de esteriliza-
ción descritos en los
protocolos Problemas, causas y soluciones 14
Manejo inadecuado de la Revisar el protocolo
técnica
Mala preparación de los Preparar los medios de
medios de cultivo cultivo de acuerdo con las
recomendaciones del
fabricante
Mutación o disminución Cepas aisladas hace más Mantener las cepas por
de vigor de la cepa de dos años un tiempo no mayor a un
año y medio
Mala conservación Conservar en refrigeración
y crioconservación
Agotamiento de los ele- Hacer repiques del cepa-

mentos nutricionales rio cada tres meses
para el hongo
Utilización de un solo Realizar la transferencia
medio para el repique seriada en diferentes me-
dios de cultivo
Cepas de bajo rendimien- Cuerpos fructíferos débi- Seleccionar cuidadosa-

to les mente los cuerpos fructí-
feros que tengan las me-
jores características feno-
típicas
METODOLOGÍAS BÁSICAS DE LABORATORIO
El diseño del laboratorio, el manejo

CONSERVACIÓN
de las técnicas y la destreza del
personal para la producción de se-
milla comercial debe apuntar princi-
palmente a evitar errores que oca-
sionen contaminación que deteriore
la calidad de la semilla y con ello la
productividad de los cultivos.
DESINFECCIÓN DEL
LABORATORIO
Uno de los requisitos básicos para el éxito de la técnica de producción de semilla
comercial es mantener los cultivos libres de microorganismos contaminantes. Se
debe, por tanto, iniciar la limpieza del área de cultivo con el retiro de suciedades
de mesones, pisos, paredes y ventanas para luego desinfestar las superficies con
una solución de hipoclorito al 10% y trapear con hipoclorito al 2%. Los contami-
nantes más comunes en estas áreas son bacterias y esporas de hongos que
habitan en el ambiente. Se recomienda realizar una rotación diaria con las si-
guientes soluciones desinfestantes: Timsen (1g timsen/500ml agua), Vanodine
(2.5 ml vanodine/500ml agua), Cloruro de benzalconio (2.5g de cloruro de benzal-
conio/500ml agua), con el fin de evitar que se desarrolle resistencia de los mi-
croorganismos a los desinfestantes.
Termo con nitrógeno líquido para crioconservación de material biológico de
Para garantizar la pureza de los cultivos de los hongos comestibles y medicina- hongos comestibles
les, la etapa de producción de semilla debe realizarse en una cámara de flujo
laminar la cual se desinfesta con la solución de cloruro de benzalconio, horas
antes de iniciar las siembras y durante el procedimiento de inoculación se utiliza
alcohol al 70% para desinfestar constantemente la cabina y las manos del técni- La adecuada conservación de las cepas garantiza la
co.
calidad y continuidad en la producción de la semilla
Periódicamente y durante la siembra debe realizarse un control de ambiente por
precipitación, para establecer el nivel de contaminación del laboratorio y la fre- comercial y además mantiene la viabilidad y el potencial
cuencia de aplicación de los desinfestantes. Esta evaluación consiste en la expo-
sición de una caja de petri que contiene un medio de cultivo, por 15 minutos al
productivo de las especies al cultivarlas.
ambiente y que luego se incuba a una temperatura de 25°C durante 5 días, si se
utiliza EMA para evaluar hongos y levaduras, y a una temperatura de 37°C por 24
horas cuando se utiliza como medio Agar plate count para evaluar bacterias.
8. Con el asa trocear el micelio y adicionar un sólo pedazo de inóculo en LAVADO, SECADO Y ESTERILIZACIÓN
todo el centro del medio nutritivo de los tubos de cultivo. DEL MATERIAL DE LABORATORIO
9. Por cada cepa repicar el micelio en 5 tubos con EMA y en 5 tubos más
con PDA. El material que se va a utilizar en la preparación de la semilla debe sumergirse
10. Rotular el material, anotando la fecha, el tipo de medio, la especie del de un día para otro en una solución jabonosa compuesta por 10 g de detergen-
hongo, la fuente del inóculo y el número del repique. te en polvo y 20 ml de hipoclorito comercial, por cada litro de agua. Se lava con
11. Recoger la basura y limpiar y desinfestar mesones y área de laboratorio abundante agua asegurándose de no dejar restos de jabón que puedan afectar
después de la siembra. Colocar trampas con formol comercial al 5% en el crecimiento micelial. Seguidamente, se seca y esteriliza el material de vidrio y
volumen. de acero inoxidable en la estufa por 3 horas a 160°C y se deja enfriar en un
12. Incubar los tubos de cultivo a 25ºC y evaluar diariamente el crecimiento sitio previamente desinfectado.
micelial. Debe retirarse el material contaminado y disponerlo acorde a lo
establecido en el presente protocolo para el material de desecho. Para la esterilización del material con vapor se utiliza una autoclave a 121°C
durante 30 minutos. La autoclave debe lavarse cada día de por medio, por fue-
ra y por dentro, cambiarsele el agua (utilizar agua destilada) y engrasarse con
vaselina cada dos esterilizaciones.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo utilizados para la conservación y propagación de las ce-
pas son: Papa Dextrosa Agar (PDA), el Agar Extracto de Malta (EMA) y el Agar
Sabouraud Dextrosa (SDA), que son especialmente elaborados para el creci-
miento de hongos e inhiben la contaminación bacteriana gracias a su bajo pH.
Para garantizar la esterilidad en la preparación de los medios de cultivo se re-

quiere agua destilada estéril (el agua debe esterilizarse en una autoclave a
Crecimiento micelial en tubos de cepario 121ºC durante 20 min). Utilizar materiales previamente esterilizados en autocla-
ve y los medios se sirven en la cabina de flujo laminar previamente desinfesta-
da.
13. Cuando la invasión micelial esté entre el 90 y 100%, colocarle vinilpel, a
los tubos, desinfestarlos y conservarlos en refrigeración por un tiempo Los medios de cultivo se preparan de acuerdo con las recomendaciones dadas
de 3 meses. Al cabo de este tiempo se realiza un nuevo repique pasan- por el fabricante, registradas en la etiqueta del empaque. En una probeta se
do el micelio que estuvo conservado en PDA a un tubo con medio nuevo mide el agua destilada estéril necesaria, se transpasa a un erlenmeyer junto
de EMA y los que estuvieron conservados en EMA se transpasan a tu- con la cantidad de medio necesario y se coloca en la estufa agitando constan-
bos de cultivo conteniendo como medio nutritivo PDA. temente con la ayuda de una varilla de vidrio hasta que el medio hierva. Lue-
14. Mantener las cepas así conservadas durante 6 repiques, una vez alcan- go se sirve en tubos, botellas planas o cajas de petri, junto a mecheros, de la
zado este valor, aislar cultivos puros a partir de carpóforos frescos. siguiente manera:
• En la preparación de los tubos, se utilizan 5 ml del medio de cultivo para

tubos de 15x100 mm, si se utilizan tubos de mayor dimensión se puede
PROTOCOLO
utilizar una relación lineal para el cálculo del volumen del medio que se
debe adicionar. Los tubos se cierran suavemente y luego se esterilizan 1. Cuantificar el número de tubos, botellas de agua destilada estéril, probe-
dentro de beakers y al terminar el proceso, se retiran de la autoclave, se tas, beakers, erlenmeyers y asas necesarias para el repique.
ajustan las tapas y se disponen de forma inclinada hasta que se solidifi- 2. Lavar y esterilizar el material de acuerdo con lo descrito anteriormente
quen, con el fin de incrementar el área de contacto, en una zona previa- en las metodologías básicas de laboratorio.
mente desinfestada. 3. Realizar la limpieza y la desinfestación del laboratorio (Ver metodologías
básicas de laboratorio).
• En la preparación de cajas de petri se coloca a esterilizar el medio de
4. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Mantener una bata limpia,
cultivo en un erlenmeyer con tapón de algodón y se sirve caliente bajo
cofía y tapabocas al interior del laboratorio y una bata a la salida para el
cámara de flujo laminar, adicionando 15 ml de agar por caja de petri, las
cambio.
cuales deben estar estériles y se colocan a enfriar en un área cerrada y
5. Preparar los medios de cultivo utilizando el procedimiento referido ante-
previamente desinfestada. Si las cajas no se van a utilizar de inmediato,
riormente en este documento.
tan pronto el agar solidifique, se sellan con papel vinilpel y se refrigeran,
6. Retirar de la nevera el material de siembra 1 día antes para permitir que
por un tiempo máximo de 15 días.
se aclimate, desinfestarlo con alcohol.
• En la preparación de las botellas planas se utilizan 60 ml del medio de 7. Desinfestar la cabina de flujo laminar o el área de trabajo, encender me-
cultivo, se les coloca un tapón de algodón y se esterilizan, disponiéndo- cheros y mantener alcohol para la desinfección constante durante el
las en forma vertical y luego se enfrian horizontalmente. Es importante proceso de siembra.
esterilizar tapones de algodón dentro de una bolsa de polipropileno ter-
moresistente, en caso de tener que reemplazar algún tapón de las bote-
llas que resulte impregnado de medio y que puede favorecer el asenta-
miento de microorganismos contaminantes.
• Se debe incubar una caja, tubo o botella con medio nutritivo estéril y sin
sembrar para verificar la esterilidad del medio de cultivo, en lo que se
conoce como “control medio”.
DISPOSICIÓN DEL MATERIAL DE DESECHO

Para evitar la contaminación cruzada o afecciones respiratorias en el personal
del laboratorio, es necesario esterilizar el material contaminado antes de su
eliminación. Para ello los tubos, las cajas o las botellas planas con el microor-
ganismo contaminante deben esterilizarse en una autoclave durante 1 hora a Siembra por transferencia seriada
121°C.
MANTENIMIENTO DEL CEPARIO

.
SELECCIÓN
Material biológico de hongos conservado por transferencia
La conservación apropiada de las cepas de hongos es un paso crítico del cual

depende en gran parte la continuidad y la calidad de la semilla comercial. El
método más común empleado para el mantenimiento del cepario es la transfe-
rencia seriada, en la cual se utilizan tubos con agar, en forma de pico de flauta,
que permiten conservar mejor el medio fresco y la cepa libre de contaminantes
por su boca angosta y su cierre con tapa.
Teniendo el área del laboratorio y la cabina de flujo laminar previamente desin-

festada, se realiza el repique de la cepas, utilizando una pequeña cantidad de
micelio de un cultivo madre para inocular tubos de agar fresco. Estos cultivos se
revisan diariamente, después de incubarlos a 25°C por cinco a siete días, para
constatar que no se presenten contaminaciones. Carpóforos de Pleurotus sajor caju, cultivados en desechos agrícolas
El primer paso consiste en la selección de los cultivos madre, que han estado
refrigerados durante tres meses, eligiendo aquellos con un buen crecimiento
micelial para transferir el micelio a tubos con medio fresco, y repetir el ciclo de
conservación. Es importante resaltar que para conservar el vigor de la cepa La selección cuidadosa de los carpóforos, que posean las
debe realizarse un máximo de 6 repiques, rotando el medio de cultivo entre
PDA y EMA y conservando la cepa adecuadamente en refrigeración. mejores cualidades fenotípicas (tamaño, color, forma,
En caso de que se presenten contaminaciones microbianas en los tubos de vigor), para la producción de semilla comercial, redunda
cultivo, éstos deben desecharse de acuerdo a las recomendaciones dadas para
el material de desecho y llevar la cuenta de los tubos contaminados para deter-
en la calidad de la misma y la productividad de nuestros
minar si debe repetirse la siembra. Por lo anterior, la transferencia seriada debe
hacerse bajo un estricto control ambiental y con observaciones frecuentes del
cultivos.
crecimiento del micelio para maximizar la calidad de la semilla.
AISLAMIENTO DE CARPÓFOROS 3. Lavar y esterilizar el material de vidrio y el instrumental de acuerdo a

las metodologías básicas de laboratorio.
Las setas se reproducen 4. Retirar de la nevera los medios para la siembra y desinfestar las cajas
por medio de esporas, las con alcohol. Para permitir que se aclimate antes de utilizarlo debe ser
cuales se alojan en las lamini- retirado aproximadamente 1 día antes.
llas que se ubican debajo 5. Limpiar y desinfestar el laboratorio y la cabina de flujo laminar o área
del píleo o sombrero, tejido de siembra según las metodologías básicas de laboratorio. Encender
que se utiliza para el aisla- mecheros
miento de la cepa. 6. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Mantener una bata limpia,
cofia y tapabocas al interior del laboratorio, y una a la salida para el
Para cultivar los tejidos de los cambio.
cuerpos fructíferos de la cepa 7. Seleccionar un carpóforo con excelentes características fenotípicas y
que se quiera aislar es nece- seccionar un trozo para aislar la cepa, y con la ayuda del bisturí y de
sario realizar una selección las pinzas eliminar los tejidos externos.
cuidadosa de los individuos 8. Desinfestar el trozo de carpóforo en hipoclorito al 25% durante 5 mi-
con mejores cualidades feno- nutos, luego sumergir el trozo en agua destilada estéril durante 5 mi-
típicas como: tamaño, aspecto, Carpóforos de Pleurotus ostreatus nutos más.
color, crecimiento, adaptación, 9. Eliminar el exceso de agua pasando el pedazo de tejido a una caja de
precocidad, etc. petri con servilletas estériles.
10. El fragmento de carpóforo se siembra en una caja de petri con agar
Una vez escogidas las setas, se toma un trozo del sombrero y en una caja de extracto de malta y se incuba a 25º C, de 7 a 10 días.
petri vacía y estéril se hacen cortes del tejido externo del trozo seleccionado y 11. Recoger la basura y limpiar y desinfestar el área de trabajo, después
se desechan. Luego, el tejido resultante se sumerge en una solución desinfes- de realizada la siembra.
tante (hipoclorito al 25%), durante 5 minutos, pasado el tiempo el tejido se su- 12. Para control de hongos y bacterias es recomendable realizar asper-
merge en agua destilada estéril para eliminar el desinfestante y se traslada a siones con formol al 0.3% en volumen, es decir adicionar 3 ml de for-
una caja de petri que contenga servilletas estériles, con las cuales se le elimina mol comercial en un litro de agua.
el exceso de agua y nuevamente se le hacen cortes externos, dejando sola- 13. Evaluar diariamente el crecimiento micelial, retirar el material contami-
mente la parte interna, la cual es transferida a una caja de petri con agar extrac- nado y disponerlo de acuerdo con lo establecido en las metodologías
to de malta y se incuba a 25°C de 7 a 10 días. básicas.
14. Cuando la invasión del hongo sea entre el 95 y 100%, sellar la caja de
La cepa así aislada puede mantenerse vigorosa hasta por año y medio, siempre petri con vinilpel, desinfestarla externamente y guardarla en la nevera
y cuando se almacene a temperaturas de refrigeración y/o crioconservación, entre 4 y 6°C.
realizando repiques en agar cada tres meses. 15. Cuando ocurran contaminaciones lejos del área de crecimiento mice-
lial del hongo, puede realizarse un repique a otras cajas de petri con
PROTOCOLO agar para eliminar el contaminante, y disponer el material contamina-
do conforme a lo expresado en el presente protocolo.
1. Preparar cajas de petri con agar extracto de malta, papa dextrosa agar
y/o agar sabouraud, de acuerdo con la metodología básica de laborato-
rio.
2. Disponer de los siguientes materiales: cajas de petri vacías, cajas de
petri con servilletas, pinzas, pipetas de 10 ml, beakers de 100 ml, bisturí,
botellas con agua estéril.
AISLAMIENTO DE CARPÓFOROS 3. Lavar y esterilizar el material de vidrio y el instrumental de acuerdo a

las metodologías básicas de laboratorio.
Las setas se reproducen 4. Retirar de la nevera los medios para la siembra y desinfestar las cajas
por medio de esporas, las con alcohol. Para permitir que se aclimate antes de utilizarlo debe ser
cuales se alojan en las lamini- retirado aproximadamente 1 día antes.
llas que se ubican debajo 5. Limpiar y desinfestar el laboratorio y la cabina de flujo laminar o área
del píleo o sombrero, tejido de siembra según las metodologías básicas de laboratorio. Encender
que se utiliza para el aisla- mecheros
miento de la cepa. 6. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Mantener una bata limpia,
cofia y tapabocas al interior del laboratorio, y una a la salida para el
Para cultivar los tejidos de los cambio.
cuerpos fructíferos de la cepa 7. Seleccionar un carpóforo con excelentes características fenotípicas y
que se quiera aislar es nece- seccionar un trozo para aislar la cepa, y con la ayuda del bisturí y de
sario realizar una selección las pinzas eliminar los tejidos externos.
cuidadosa de los individuos 8. Desinfestar el trozo de carpóforo en hipoclorito al 25% durante 5 mi-
con mejores cualidades feno- nutos, luego sumergir el trozo en agua destilada estéril durante 5 mi-
típicas como: tamaño, aspecto, Carpóforos de Pleurotus ostreatus nutos más.
color, crecimiento, adaptación, 9. Eliminar el exceso de agua pasando el pedazo de tejido a una caja de
precocidad, etc. petri con servilletas estériles.
10. El fragmento de carpóforo se siembra en una caja de petri con agar
Una vez escogidas las setas, se toma un trozo del sombrero y en una caja de extracto de malta y se incuba a 25º C, de 7 a 10 días.
petri vacía y estéril se hacen cortes del tejido externo del trozo seleccionado y 11. Recoger la basura y limpiar y desinfestar el área de trabajo, después
se desechan. Luego, el tejido resultante se sumerge en una solución desinfes- de realizada la siembra.
tante (hipoclorito al 25%), durante 5 minutos, pasado el tiempo el tejido se su- 12. Para control de hongos y bacterias es recomendable realizar asper-
merge en agua destilada estéril para eliminar el desinfestante y se traslada a siones con formol al 0.3% en volumen, es decir adicionar 3 ml de for-
una caja de petri que contenga servilletas estériles, con las cuales se le elimina mol comercial en un litro de agua.
el exceso de agua y nuevamente se le hacen cortes externos, dejando sola- 13. Evaluar diariamente el crecimiento micelial, retirar el material contami-
mente la parte interna, la cual es transferida a una caja de petri con agar extrac- nado y disponerlo de acuerdo con lo establecido en las metodologías
to de malta y se incuba a 25°C de 7 a 10 días. básicas.
14. Cuando la invasión del hongo sea entre el 95 y 100%, sellar la caja de
La cepa así aislada puede mantenerse vigorosa hasta por año y medio, siempre petri con vinilpel, desinfestarla externamente y guardarla en la nevera
y cuando se almacene a temperaturas de refrigeración y/o crioconservación, entre 4 y 6°C.
realizando repiques en agar cada tres meses. 15. Cuando ocurran contaminaciones lejos del área de crecimiento mice-
lial del hongo, puede realizarse un repique a otras cajas de petri con
PROTOCOLO agar para eliminar el contaminante, y disponer el material contamina-
do conforme a lo expresado en el presente protocolo.
1. Preparar cajas de petri con agar extracto de malta, papa dextrosa agar
y/o agar sabouraud, de acuerdo con la metodología básica de laborato-
rio.
2. Disponer de los siguientes materiales: cajas de petri vacías, cajas de
petri con servilletas, pinzas, pipetas de 10 ml, beakers de 100 ml, bisturí,
botellas con agua estéril.
MANTENIMIENTO DEL CEPARIO

.
SELECCIÓN
Material biológico de hongos conservado por transferencia
La conservación apropiada de las cepas de hongos es un paso crítico del cual

depende en gran parte la continuidad y la calidad de la semilla comercial. El
método más común empleado para el mantenimiento del cepario es la transfe-
rencia seriada, en la cual se utilizan tubos con agar, en forma de pico de flauta,
que permiten conservar mejor el medio fresco y la cepa libre de contaminantes
por su boca angosta y su cierre con tapa.
Teniendo el área del laboratorio y la cabina de flujo laminar previamente desin-

festada, se realiza el repique de la cepas, utilizando una pequeña cantidad de
micelio de un cultivo madre para inocular tubos de agar fresco. Estos cultivos se
revisan diariamente, después de incubarlos a 25°C por cinco a siete días, para
constatar que no se presenten contaminaciones. Carpóforos de Pleurotus sajor caju, cultivados en desechos agrícolas
El primer paso consiste en la selección de los cultivos madre, que han estado
refrigerados durante tres meses, eligiendo aquellos con un buen crecimiento
micelial para transferir el micelio a tubos con medio fresco, y repetir el ciclo de
conservación. Es importante resaltar que para conservar el vigor de la cepa La selección cuidadosa de los carpóforos, que posean las
debe realizarse un máximo de 6 repiques, rotando el medio de cultivo entre
PDA y EMA y conservando la cepa adecuadamente en refrigeración. mejores cualidades fenotípicas (tamaño, color, forma,
En caso de que se presenten contaminaciones microbianas en los tubos de vigor), para la producción de semilla comercial, redunda
cultivo, éstos deben desecharse de acuerdo a las recomendaciones dadas para
el material de desecho y llevar la cuenta de los tubos contaminados para deter-
en la calidad de la misma y la productividad de nuestros
minar si debe repetirse la siembra. Por lo anterior, la transferencia seriada debe
hacerse bajo un estricto control ambiental y con observaciones frecuentes del
cultivos.
crecimiento del micelio para maximizar la calidad de la semilla.
• En la preparación de los tubos, se utilizan 5 ml del medio de cultivo para

tubos de 15x100 mm, si se utilizan tubos de mayor dimensión se puede
PROTOCOLO
utilizar una relación lineal para el cálculo del volumen del medio que se
debe adicionar. Los tubos se cierran suavemente y luego se esterilizan 1. Cuantificar el número de tubos, botellas de agua destilada estéril, probe-
dentro de beakers y al terminar el proceso, se retiran de la autoclave, se tas, beakers, erlenmeyers y asas necesarias para el repique.
ajustan las tapas y se disponen de forma inclinada hasta que se solidifi- 2. Lavar y esterilizar el material de acuerdo con lo descrito anteriormente
quen, con el fin de incrementar el área de contacto, en una zona previa- en las metodologías básicas de laboratorio.
mente desinfestada. 3. Realizar la limpieza y la desinfestación del laboratorio (Ver metodologías
básicas de laboratorio).
• En la preparación de cajas de petri se coloca a esterilizar el medio de
4. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Mantener una bata limpia,
cultivo en un erlenmeyer con tapón de algodón y se sirve caliente bajo
cofía y tapabocas al interior del laboratorio y una bata a la salida para el
cámara de flujo laminar, adicionando 15 ml de agar por caja de petri, las
cambio.
cuales deben estar estériles y se colocan a enfriar en un área cerrada y
5. Preparar los medios de cultivo utilizando el procedimiento referido ante-
previamente desinfestada. Si las cajas no se van a utilizar de inmediato,
riormente en este documento.
tan pronto el agar solidifique, se sellan con papel vinilpel y se refrigeran,
6. Retirar de la nevera el material de siembra 1 día antes para permitir que
por un tiempo máximo de 15 días.
se aclimate, desinfestarlo con alcohol.
• En la preparación de las botellas planas se utilizan 60 ml del medio de 7. Desinfestar la cabina de flujo laminar o el área de trabajo, encender me-
cultivo, se les coloca un tapón de algodón y se esterilizan, disponiéndo- cheros y mantener alcohol para la desinfección constante durante el
las en forma vertical y luego se enfrian horizontalmente. Es importante proceso de siembra.
esterilizar tapones de algodón dentro de una bolsa de polipropileno ter-
moresistente, en caso de tener que reemplazar algún tapón de las bote-
llas que resulte impregnado de medio y que puede favorecer el asenta-
miento de microorganismos contaminantes.
• Se debe incubar una caja, tubo o botella con medio nutritivo estéril y sin
sembrar para verificar la esterilidad del medio de cultivo, en lo que se
conoce como “control medio”.
DISPOSICIÓN DEL MATERIAL DE DESECHO

Para evitar la contaminación cruzada o afecciones respiratorias en el personal
del laboratorio, es necesario esterilizar el material contaminado antes de su
eliminación. Para ello los tubos, las cajas o las botellas planas con el microor-
ganismo contaminante deben esterilizarse en una autoclave durante 1 hora a Siembra por transferencia seriada
121°C.
8. Con el asa trocear el micelio y adicionar un sólo pedazo de inóculo en LAVADO, SECADO Y ESTERILIZACIÓN
todo el centro del medio nutritivo de los tubos de cultivo. DEL MATERIAL DE LABORATORIO
9. Por cada cepa repicar el micelio en 5 tubos con EMA y en 5 tubos más
con PDA. El material que se va a utilizar en la preparación de la semilla debe sumergirse
10. Rotular el material, anotando la fecha, el tipo de medio, la especie del de un día para otro en una solución jabonosa compuesta por 10 g de detergen-
hongo, la fuente del inóculo y el número del repique. te en polvo y 20 ml de hipoclorito comercial, por cada litro de agua. Se lava con
11. Recoger la basura y limpiar y desinfestar mesones y área de laboratorio abundante agua asegurándose de no dejar restos de jabón que puedan afectar
después de la siembra. Colocar trampas con formol comercial al 5% en el crecimiento micelial. Seguidamente, se seca y esteriliza el material de vidrio y
volumen. de acero inoxidable en la estufa por 3 horas a 160°C y se deja enfriar en un
12. Incubar los tubos de cultivo a 25ºC y evaluar diariamente el crecimiento sitio previamente desinfectado.
micelial. Debe retirarse el material contaminado y disponerlo acorde a lo
establecido en el presente protocolo para el material de desecho. Para la esterilización del material con vapor se utiliza una autoclave a 121°C
durante 30 minutos. La autoclave debe lavarse cada día de por medio, por fue-
ra y por dentro, cambiarsele el agua (utilizar agua destilada) y engrasarse con
vaselina cada dos esterilizaciones.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo utilizados para la conservación y propagación de las ce-
pas son: Papa Dextrosa Agar (PDA), el Agar Extracto de Malta (EMA) y el Agar
Sabouraud Dextrosa (SDA), que son especialmente elaborados para el creci-
miento de hongos e inhiben la contaminación bacteriana gracias a su bajo pH.
Para garantizar la esterilidad en la preparación de los medios de cultivo se re-

quiere agua destilada estéril (el agua debe esterilizarse en una autoclave a
Crecimiento micelial en tubos de cepario 121ºC durante 20 min). Utilizar materiales previamente esterilizados en autocla-
ve y los medios se sirven en la cabina de flujo laminar previamente desinfesta-
da.
13. Cuando la invasión micelial esté entre el 90 y 100%, colocarle vinilpel, a
los tubos, desinfestarlos y conservarlos en refrigeración por un tiempo Los medios de cultivo se preparan de acuerdo con las recomendaciones dadas
de 3 meses. Al cabo de este tiempo se realiza un nuevo repique pasan- por el fabricante, registradas en la etiqueta del empaque. En una probeta se
do el micelio que estuvo conservado en PDA a un tubo con medio nuevo mide el agua destilada estéril necesaria, se transpasa a un erlenmeyer junto
de EMA y los que estuvieron conservados en EMA se transpasan a tu- con la cantidad de medio necesario y se coloca en la estufa agitando constan-
bos de cultivo conteniendo como medio nutritivo PDA. temente con la ayuda de una varilla de vidrio hasta que el medio hierva. Lue-
14. Mantener las cepas así conservadas durante 6 repiques, una vez alcan- go se sirve en tubos, botellas planas o cajas de petri, junto a mecheros, de la
zado este valor, aislar cultivos puros a partir de carpóforos frescos. siguiente manera:
METODOLOGÍAS BÁSICAS DE LABORATORIO
El diseño del laboratorio, el manejo

CONSERVACIÓN
de las técnicas y la destreza del
personal para la producción de se-
milla comercial debe apuntar princi-
palmente a evitar errores que oca-
sionen contaminación que deteriore
la calidad de la semilla y con ello la
productividad de los cultivos.
DESINFECCIÓN DEL
LABORATORIO
Uno de los requisitos básicos para el éxito de la técnica de producción de semilla
comercial es mantener los cultivos libres de microorganismos contaminantes. Se
debe, por tanto, iniciar la limpieza del área de cultivo con el retiro de suciedades
de mesones, pisos, paredes y ventanas para luego desinfestar las superficies con
una solución de hipoclorito al 10% y trapear con hipoclorito al 2%. Los contami-
nantes más comunes en estas áreas son bacterias y esporas de hongos que
habitan en el ambiente. Se recomienda realizar una rotación diaria con las si-
guientes soluciones desinfestantes: Timsen (1g timsen/500ml agua), Vanodine
(2.5 ml vanodine/500ml agua), Cloruro de benzalconio (2.5g de cloruro de benzal-
conio/500ml agua), con el fin de evitar que se desarrolle resistencia de los mi-
croorganismos a los desinfestantes.
Termo con nitrógeno líquido para crioconservación de material biológico de
Para garantizar la pureza de los cultivos de los hongos comestibles y medicina- hongos comestibles
les, la etapa de producción de semilla debe realizarse en una cámara de flujo
laminar la cual se desinfesta con la solución de cloruro de benzalconio, horas
antes de iniciar las siembras y durante el procedimiento de inoculación se utiliza
alcohol al 70% para desinfestar constantemente la cabina y las manos del técni- La adecuada conservación de las cepas garantiza la
co.
calidad y continuidad en la producción de la semilla
Periódicamente y durante la siembra debe realizarse un control de ambiente por
precipitación, para establecer el nivel de contaminación del laboratorio y la fre- comercial y además mantiene la viabilidad y el potencial
cuencia de aplicación de los desinfestantes. Esta evaluación consiste en la expo-
sición de una caja de petri que contiene un medio de cultivo, por 15 minutos al
productivo de las especies al cultivarlas.
ambiente y que luego se incuba a una temperatura de 25°C durante 5 días, si se
utiliza EMA para evaluar hongos y levaduras, y a una temperatura de 37°C por 24
horas cuando se utiliza como medio Agar plate count para evaluar bacterias.
PROBLEMAS, CAUSAS Y SOLUCIONES TABLA DE CONTENIDO

Página
PROBLEMAS CAUSAS SOLUCIONES
Contaminación microbia- Acumulación de polvo y • Limpieza constante
na en los procesos de desinfestación deficiente • Rotación de desinfes- Metodologías básicas de laboratorio 4
crecimiento micelial en el laboratorio tantes
Deficiencia en la esterili- • Lavar y desinfestar co- Aislamiento de carpóforos 8
zación del material rrectamente el material.
• Verificar temperaturas y Mantenimiento de cepario 10
tiempos de esteriliza-
ción descritos en los
protocolos Problemas, causas y soluciones 14
Manejo inadecuado de la Revisar el protocolo
técnica
Mala preparación de los Preparar los medios de
medios de cultivo cultivo de acuerdo con las
recomendaciones del
fabricante
Mutación o disminución Cepas aisladas hace más Mantener las cepas por
de vigor de la cepa de dos años un tiempo no mayor a un
año y medio
Mala conservación Conservar en refrigeración
y crioconservación
Agotamiento de los ele- Hacer repiques del cepa-

mentos nutricionales rio cada tres meses
para el hongo
Utilización de un solo Realizar la transferencia
medio para el repique seriada en diferentes me-
dios de cultivo
Cepas de bajo rendimien- Cuerpos fructíferos débi- Seleccionar cuidadosa-

to les mente los cuerpos fructí-
feros que tengan las me-
jores características feno-
típicas
PRESENTACIÓN
LITERATURA CONSULTADA
RODRÍGUEZ V., N. Cultivo de hongos comestibles. Apuntes del trabajo en la-
El proyecto empresarial de innovación y desarrollo tecnológico boratorio. Chinchiná, Cenicafé. Disciplina Química Industrial. 2001. 152 p.
“Adaptación e implementación de 5 cepas de hongos comesti-
bles en diferentes subproductos agrícolas para mejorar la pro- RODRÍGUEZ V., N; JARAMILLO L., C. Cultivo de hongos comestibles del géne-
ductividad y competitividad de la Asociación de productores de ro Pleurotus. Boletín Técnico Cenicafé N° 27: 1-56. 2005.
hongos comestibles de Colombia ASOFUNGICOL”, tuvo como
propósito encontrar las mejores formulaciones de sustrato, elabo-
rados a partir de los subproductos agrícolas más abundantes en
el departamento del Huila e identificar las cepas de hongos de
mayor rendimiento, facilitadas por el Centro Nacional de Investi-
gaciones de Café (Cenicafé), de forma que se mejore el proceso
de cultivo de setas de los asociados.
De igual manera busca transferir a la Asociación todos los cono-

cimientos relacionados con el manejo del material biológico y la
producción de semilla comercial, por ser éste uno de los mayores
obstáculos que han tenido los cultivadores.
El proyecto se realizó con la financiación del SENA, la Goberna-

ción del Huila y la CAM, bajo la dirección técnica de Cenicafé.
En su desarrollo se utilizaron los laboratorios del Centro Agrope-

cuario la Angostura perteneciente al SENA, Regional Huila, para
la obtención de la semilla de los hongos y para el manejo postco-
secha del cultivo.
La fase de campo se realizó en los cultivos de los Asociados en

los Municipios de Rivera, Garzón, Tesalia y Teruel, en el Depar-
tamento del Huila.
Proyecto: “Adaptación e implementación de cinco cepas de hongos
comestibles en diferentes subproductos agrícolas para mejorar la
productividad y competitividad de ASOFUNGICOL en el Huila”
MANTENIMIENTO DE
CEPAS DE HONGOS
COMESTIBLES Y
MEDICINALES
Mantenimiento de cepas de
hongos comestibles y
medicinales
Fotografía
Archivo Cenicafé
Archivo Proyecto
Diseño PROTOCOLOS
• Aislamiento de carpóforos
Cenicafé
• Mantenimiento de cepario
Versión preliminar
Copyright © FNC –Cenicafé 2006

Realizado por: Nelson Rodríguez Valencia
CON EL APOYO DE: Investigador Científico I. Cenicafé.
Francenid Perdomo Perdomo.

Hongos Comestibles Medicinales Cepas

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Proyecto: “Adaptación e implementación de cinco cepas de hongos

comestibles en diferentes subproductos agrícolas para mejorar la

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De igual manera busca transferir a la Asociación todos los cono-

El proyecto se realizó con la financiación del SENA, la Goberna-

En su desarrollo se utilizaron los laboratorios del Centro Agrope-

La fase de campo se realizó en los cultivos de los Asociados en

PROBLEMAS, CAUSAS Y SOLUCIONES TABLA DE CONTENIDO

Agotamiento de los ele- Hacer repiques del cepa-

Cepas de bajo rendimien- Cuerpos fructíferos débi- Seleccionar cuidadosa-

METODOLOGÍAS BÁSICAS DE LABORATORIO

El diseño del laboratorio, el manejo

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Para garantizar la esterilidad en la preparación de los medios de cultivo se re-

• En la preparación de los tubos, se utilizan 5 ml del medio de cultivo para

DISPOSICIÓN DEL MATERIAL DE DESECHO

MANTENIMIENTO DEL CEPARIO

Material biológico de hongos conservado por transferencia

La conservación apropiada de las cepas de hongos es un paso crítico del cual

Teniendo el área del laboratorio y la cabina de flujo laminar previamente desin-

AISLAMIENTO DE CARPÓFOROS 3. Lavar y esterilizar el material de vidrio y el instrumental de acuerdo a

AISLAMIENTO DE CARPÓFOROS 3. Lavar y esterilizar el material de vidrio y el instrumental de acuerdo a

MANTENIMIENTO DEL CEPARIO

Material biológico de hongos conservado por transferencia

La conservación apropiada de las cepas de hongos es un paso crítico del cual

Teniendo el área del laboratorio y la cabina de flujo laminar previamente desin-

• En la preparación de los tubos, se utilizan 5 ml del medio de cultivo para

DISPOSICIÓN DEL MATERIAL DE DESECHO

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Para garantizar la esterilidad en la preparación de los medios de cultivo se re-

METODOLOGÍAS BÁSICAS DE LABORATORIO

El diseño del laboratorio, el manejo

PROBLEMAS, CAUSAS Y SOLUCIONES TABLA DE CONTENIDO

Agotamiento de los ele- Hacer repiques del cepa-

Cepas de bajo rendimien- Cuerpos fructíferos débi- Seleccionar cuidadosa-

De igual manera busca transferir a la Asociación todos los cono-

El proyecto se realizó con la financiación del SENA, la Goberna-

En su desarrollo se utilizaron los laboratorios del Centro Agrope-

La fase de campo se realizó en los cultivos de los Asociados en

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