Documento 12
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PROGRAMA DE MEDICINA
PRESENTA:
ASIGNATURA:
BIOLOGIA II GRUPO I
2021
PARTE I
A. Polimorfismos de restricción
Polimorfismos del tipo 1 (RFLPs).- Desde mediados de los setenta, con la
introducción de las endonucleasas de restricción en el análisis genético molecular
por el grupo del premio Nobel Nathans (Nathans and Smith, 1975), cualquier
molécula de ADN puede ser cortada en sitios específicos produciendo unos
fragmentos llamados por ello de restricción. Estas enzimas son un tipo especial de
endonucleasas (tipo II) capaces de reconocer secuencias específicas del ADN
(dianas de restricción) y catalizar la ocurrencia de cortes diplotómicos 11 (en
ambas cadenas). Los fragmentos liberados se pueden caracterizar mediante
electroforesis en geles de agarosa, y si se realiza el mismo tipo de digestiones en
el ADN de diferentes individuos, se pueden comparar los fragmentos equivalentes
mediante hibridación molecular con sondas específicas utilizando la técnica de
Southern (Southern, 1975)
El polimorfismo del tipo 1 (RFLPs) se produce cuando la secuencia de
reconocimiento de una endonucleasa se ve afectada por una mutación puntual, y
se pierde por consiguiente la capacidad de reconocimiento y corte en ese lugar. La
consecuencia inmediata es el cambio en los patrones electroforéticos que
presentan los fragmentos de restricción. En la figura la se esquematiza la
identificación de dos variantes alélicas de un locus RFLP con la sonda S. Con esta
nueva metodología se empezó a comprobar inmediatamente que los genomas
tenían· niveles de variación muy superiores a los estimados mediante análisis de
proteínas. Jeffreys (1979) estimó que 1 de cada 100 nucleótidos de secuencias no
codificantes podía ser polimórfico. Estudios sistemáticos llevados a cabo con
secuencias génicas (globinas y albúmina) y no codificantes, apuntaban igualmente
una diversidad genética mayor que la demostrada con el análisis de proteínas: 1
de cada 250 o 500 nucleótidos acababa presentando alguna variación (Botstein et
al., 1980). La probabilidad de encontrar una variante de un fragmento de
restricción definido por una endonucleasa con una diana de 4 pares de bases es
del 12,3%. Si la diana es de 6 pares de bases esta probabilidad aumenta hasta el
17.7 %
B. Southern blot
Southern blot. Técnica analítica utilizada en biología molecular para detectar o identificar
ADN de interés a partir de una muestra compleja de ADN. Es también conocida como
hibridación Southern o simplemente Southern, debido al nombre de su inventor, Edwin
Southern, destacado biólogo molecular inglés. Como procedimiento de laboratorio, el
Southern blot se puede utilizar para analizar el ADN total de un organismo, también
conocido como su genoma, con el fin de identificar una secuencia específica de interés.
El proceso implica la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a
una membrana portadora que normalmente es nitrocelulosa y la posterior detección del
fragmento de ADN diana mediante la hibridación de la sonda. La hibridación se refiere al
proceso de formación de una molécula de ADN bicatenario entre una sonda de ADN
monocatenario y un ADN diana monocatenario. Dado que la sonda y el ADN diana son
complementarios entre sí, la reacción es específica, lo que ayuda a detectar el fragmento
de ADN específico.
Procedimiento
C. Clonación
D. Secuenciación de ADN
1. Desnaturalización
La incubación a alta temperatura se utiliza para “separar” dsDNA en hebras
simples y aflojar la estructura secundaria en el DNA monocatenario (ssDNA). La
temperatura más alta que puede soportar la DNA polimerasa sin perder fidelidad
suele ser de alrededor de 95 °C.
2. Alineamiento (hibridación)
Durante el alineamiento, las secuencias complementarias tienen la oportunidad de
hibridar, por lo que se usa una temperatura apropiada basada en la temperatura
de fusión (Tm) del iniciador.
3. Extensión
La actividad de la DNA polimerasa es óptima a 70-72 °C, y la extensión del
iniciador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo. Cuando un
amplicón es pequeño, este paso a menudo se combina con el paso de
alineamiento, aplicando una temperatura de 60 °C.
F. RT-PCR
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, del inglés
Reverse transcription polymerase chain reaction) (también, reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa reversa y reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) es
una variante de la PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología
molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado
amplificación (reacción en cadena de la polimerasa). En la RT-PCR, se retrotranscribe
una hebra o cadena o banda de ARN en ADN complementario (ADNc) usando una
enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica
mediante una PCR tradicional. El término PCR en transcripción reversa no debe
confundirse con la PCR en tiempo real, también denominada PCR cuantitativa (Q-PCR),
que en ocasiones, por una mala traducción del inglés, se abrevia de la misma manera
(RT-PCR, por Real Time-PCR), en vez de ReTi-PCR. La amplificación exponencial
mediante PCR en transcripción reversa supone una técnica altamente sensible, que
puede detectar un número de copias de ARN muy bajo.
Esta técnica es muy precisa, ya que se diseñan primers (también llamados cebadores)
específicos para amplificar una secuencia determinada.1 El uso de grandes bancos de
datos biotecnológicos como el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI)
brinda un exhaustivo ensayo de predicciones para las secuencias franqueantes diseñadas
y otras especificaciones que hacen de esta técnica la más utilizada hoy en día para
identificar la existencia de la secuencia buscada.
Los principales usos de la RT-PCR están relacionados con el campo del diagnóstico
molecular y con la investigación científica. Puede utilizarse como método de detección
molecular de genes, para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (por
ejemplo, el VIH), el virus de la gripe (el virus de la influenza, Orthomyxoviridae)[cita
requerida], o el SARS-CoV-2.
Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de la expresión génica, mediante la
combinación de esta técnica con el análisis de Northern blot.
Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc
generado ya no lleva los intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al
expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente
por exones. Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más importantes:
insertar genes eucariota en organismos procariota.
Cómo funciona el RT-PCR?
Todo inicia con el uso de un cotonete u otro dispositivo para la extracción de
material biológico de la garganta o nariz del sujeto. El material se almacena con un
buffer que rompe las membranas celulares, permitiendo la salida del material
hacia el exterior. Se esperaría que, en la muestra de un contagiado, el material
genético del virus salga de la célula.
El material se introduce después en una máquina especializada para llevar al cabo
el examen. Aquí, las hebras de ácido ribonucleico (ARN) viral son detectadas por
una cadena de ácidos nucleicos, denominada partidor (primer, en inglés), que se
le une a una región específica. Estos primers contienen un marcador fluorescente
adjunto. Posteriormente, una transcriptasa inversa (una proteína con un rol
particular) extiende al primer, creando un ADN complementario y libera el
marcador fluorescente
Esta doble hélice que se crea es separada inmediatamente después para pasar
por el mismo proceso. Esto amplifica la cantidad de material genético viral y es
detectado por la máquina gracias al incremento en marcadores fluorescentes.
No cualquier centro médico tiene el permiso o la capacidad para llevar al cabo la
prueba de RT-PCR. En Estados Unidos se requiere aprobación federal que
compruebe que el centro médico cumple con los estándares de calidad, tiene a los
técnicos entrenados y un alto nivel de esterilidad en el laboratorio, para poder
realizar la prueba.
PARTE II
1. Polimorfismos de restricción: Una de las aplicaciones que pueden
destacarse acerca de esta técnica es la de determinar el estado de
enfermedades genéticas, en el artículo adjunto N°1 podremos encontrar
una investigación acerca de las enfermedades Mycoplasma
genitalium y Ureaplasma urealyticum en pacientes femeninas con
complicaciones genitales por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
2. Southern blot: Esta técnica puede ser utilizada por ejemplo para la
detección del tamaño y cantidad de un fragmento de ADN de interés, en
este caso se presenta el artículo N°2 que utiliza esta técnica para la
validación de alelos obtenidos por recombinación homóloga.