Chagatest

C ELISA lisado
Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección de
anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi

SIGNIFICACION CLINICA
Control Negativo: suero humano no reactivo inactivado. Color
La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria pro-
amarillo.
ducida por el Trypanosoma cruzi. El diagnóstico de labora-
torio depende del estadio en el cual se encuentre la enfer- medad.
REACTIVOS NO PROVISTOS
Durante la fase aguda, se efectúa directamente mediante la
Agua destilada o desionizada
comprobación de los parásitos en sangre o por métodos
inmunológicos que detecten IgM. Durante la fase crónica, se
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
pueden usar métodos inmunológicos como: hemaglutinación,
- Micropipetas para medir los volúmenes indicados
inmunofluorescencia, ensayo in- munoenzimático o Western
blot. - Tips descartables
- Material volumétrico para preparar las diluciones indicadas
- Estufa a 37oC
FUNDAMENTOS DEL METODO
- Papel absorbente
Chagatest ELISA lisado es un ensayo inmunoenzimático "in
vitro" para la detección cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi - Guantes descartables
en muestras de suero o plasma humano. - Reloj alarma o cronómetro
La muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se - Hipoclorito de sodio
encuentran sensibilizados con antígenos de T. cruzi, co- - Sistema de lavado de policubetas (manual o automático)
rrespondientes a zonas altamente conservadas entre dis- tintas - Espectrofotómetro para lectura de policubetas
cepas. Si la muestra contiene anticuerpos específi- cos, éstos
formarán un complejo con los antígenos y per- manecerán PRECAUCIONES
unidos a la fase sólida. La fracción no unida se elimina por - Los reactivos son para uso diagnóstico “in vitro”.
lavado y luego se agrega el conjugado (anti- cuerpo monoclonal - Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si
anti-IgG humana conjugado con peroxi- dasa), el cual reacciona fueran capaces de transmitir infección.
específicamente con los anticuer- pos anti-T. cruzi - Los sueros controles han sido examinados para antígeno de
inmunocapturados. El conjugado no unido se elimina por lavado. superficie de hepatitis B (HBsAg) y anticuerpos contra el virus
La presencia de peroxidasa unida al complejo se revela mediante de inmunodeficiencia humana (HIV) y hepatitis C (HCV),
el agregado del sustrato cromogénico, tetrametilbencidina. Las encontrándose no reactivos. Sin embargo, se re- comienda
muestras reactivas desarrollan color celeste. La reacción manipularlos con las precauciones requeridas para muestras
enzimática se detie- ne mediante el agregado de ácido sulfúrico, potencialmente infecciosas.
produciendo un viraje del color celeste al amarillo. La densidad - Al descartar los materiales empleados en el ensayo se deben
óptica se mide en forma bicromática a 450/620-650 nm o a 450 tratar a fin de asegurar la inactivación de agentes patógenos. El
nm. método recomendado para este procedi- miento es autoclavar
durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de desecho pueden ser
REACTIVOS PROVISTOS desinfectados con hipoclorito de sodio (concentración final
Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles, con 5%) durante por lo menos 60 minutos.
96 pocillos recubiertos con antígenos de T. cruzi. - No intercambiar reactivos de distintos lotes.
Diluyente de Muestra: buffer salino con tensioactivo. Color - No emplear reactivos de otro origen.
violeta. - Evitar tocar las paredes de los pocillos con los tips.
Conjugado Concentrado: anticuerpo monoclonal anti-IgG - No utilizar elementos metálicos que puedan entrar en con- tacto
humana conjugado con peroxidasa (10x). Color rojo. con los reactivos.
Diluyente de Conjugado: buffer salino con proteínas. - Las policubetas deben incubarse en estufa. Debe evitarse abrir
Revelador: solución de tetrametilbencidina y peróxido de la estufa durante este proceso. No usar baño de agua.
hidrógeno. - Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los
Stopper: ácido sulfúrico 2 N. recipientes para desechos biológicos u otras fuentes en- tren en
Buffer de Lavado Concentrado: buffer salino con tensioac- contacto con los reactivos, ya que el hipoclorito afecta la
tivo (25x). Color verde. reacción.
Control Positivo: suero humano inactivado conteniendo an- - Evitar contacto del ácido sulfúrico (Stopper) con piel y mu-
ticuerpos anti-T. cruzi. Color naranja. cosas. Si esto ocurre enjuagar con abundante agua. R36/

38: irrita los ojos y la piel. R34: provoca queimaduras. S24/ 25: contacto con los ojos, lávense inmediata y abundante- mente con
evítese el contacto con los ojos y la piel. S26: en caso de agua y acúdase a un médico. S28: en caso de contacto con la

864102700 / 02 Pág. 1 de 12
 piel, lávese inmediata y abundantemente con agua. S37/39: estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de los 4 meses
usar guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. posteriores mientras no supere la fecha de venci- miento
- Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles. indicada en la caja.
- No pipetear con la boca. Usar guantes descartables y
protección en los ojos durante la manipulación de las muestras MUESTRA
y reactivos del ensayo. Suero o plasma
- Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de a) Recolección de muestra: obtener de la manera habitual.
acuerdo a la normativa vigente. b) Aditivos: no se requieren para suero. Para las muestras de
plasma se puede emplear heparina, citrato o EDTA como
PREPARACION DE LOS REACTIVOS anticoagulante.
Es importante que todo el material utilizado para la prepa- ración c) Sustancias Interferentes conocidas: no se observa inter-
de los reactivos esté limpio y libre de detergente e hipoclorito. ferencia por bilirrubina hasta 21 mg/dl de bilirrubina, ácido
Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del ascórbico hasta 50 mg/dl, triglicéridos hasta 1500 mg/dl o
reactivo concentrado pueden precipitar. En tal caso, llevar la hemoglobina hasta 300 mg/dl. Las muestras conteniendo
solución a 37oC hasta disolución completa. Para la obtención del
partículas deberán clarificarse mediante centrifugación.
buffer de lavado listo para usar, diluir una parte de Buffer de
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la
Lavado Concentrado (25x) con 24 partes de agua destila- da o
muestra se debe conservar refrigerada (2-10oC). En caso de no
desionizada. Ej.: 20 ml con 480 ml para una policubeta.
realizar el análisis dentro de las 72 horas se debe congelar a
Conjugado: diluir una parte de Conjugado Concentrado (10x)
-20oC. No es recomendable realizar múltiples ciclos de
con 9 partes de Diluyente de Conjugado (ej.: ver tabla si- guiente
congelamiento y descongelamiento, ya que pue- de generar
con volumen requerido de Conjugado Concentra- do y Diluyente
resultados erróneos. En caso de utilizar mues- tras congeladas,
de Conjugado):
éstas deben ser homogeneizadas y cen- trifugadas antes de su
uso.
Conjugado Diluyente de
Nº de pocillos La inactivación por calor puede afectar el resultado. No
Concentrado Conjugado
utilizar muestras con contaminación microbiana.
8 100 ul 0,9 ml Si las muestras deben ser transportadas, embalarlas de acuerdo a
16 200 ul 1,8 ml las especificaciones legales relativas al envío de material
24 300 ul 2,7 ml infeccioso.
32 400 ul 3,6 ml
96 1200 ul 10,8 ml
NTO DEL ENSAYO
Policubeta
ratura ambiente sensibilizada,
los reactivos y las mues- trasDiluyente de la Muestra,
antes de iniciar prueba.
Diluyente
umen necesario de de
de buffer Conjugado,
lavado (1x).Revelador,
3- Colocar enStopper,
el soporteControl
de tiras, el número de pocillos requeridos para la cantidad de determinaciones a reali- za
Positivo y Con- trol Negativo: listos para usar.
l Diluyente de Muestra, luego la muestra
oles según el siguiente esquema:
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE
ALMACENAMIENTO
Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2- 10oC)
hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
Buffer de Lavado Concentrado y Stopper: se pueden con-
servar a temperatura entre 2 y 25oC.
Buffer de lavado: una vez diluido es estable 3 meses a M CP CN
temperatura entre 2 y 25oC.
Conjugado: una vez diluido es estable 6 horas a temperatu- ra Diluyente de Muestra 100 ul 100 ul 100 ul
entre 2 y 25oC. Control Positivo - 20 ul -
Policubeta sensibilizada: no abrir el sobre hasta el mo-
mento de usar, ni antes que haya tomado temperatura am- biente, Control Negativo - - 20 ul
de lo contrario se favorecerá la condensación de humedad sobre Muestra 20 ul - -
la superficie de los pocillos. Las tiras no utilizadas deben
conservarse entreHomogeneizar
2-10oC dentromezclando
del so- bre
2-3con desecante
veces bien
por carga y descar- ga de la micropipeta. Al adicionar la muestra, el Diluyen- te de Muestra vi
cerrado. Las tiras conservadas en

Tipo de Sin Suero o Control Control

muestra muestra plasma Positivo Negativo
Naranja
Color Violeta Celeste Verde
oscuro

864102700 / 02 Pág. 2 de 12
Se puede verificar la dispensación de controles o mues- tras
a los pocillos visualmente o mediante lectura
espectrofotomética (a 610/650 nm).
Advertencia: las muestras hemolizadas, ictéricas o tur- bias 13- Leer absorbancia en espectrofotómetro en forma bicromática a 45
pueden alterar el color final sin afectar los resulta- dos. El Nota: se recomienda efectuar siempre la lectura en for- ma bicromátic
viraje de color puede depender del volumen de muestra
adicionado y de su composición. Un viraje de color de
menor intensidad puede deberse a que se dis- pensó un
volumen inferior de muestra, a que la muestra no se
encuentra en las condiciones adecuadas, o a que tiene un
bajo nivel de proteínas.
5- Para evitar la evaporación, cubrir la placa con la cinta ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
autoadhesiva provista, e incubar 30  2 minutos a 37  1oC. El color de la reacción es estable durante 10 minutos, por lo que
En forma paralela, preparar el conjugado diluido (ver Tabla los resultados deben leerse dentro de ese lapso.
en PREPARACION DE LOS REACTIVOS).
6- Después de la incubación eliminar el líquido de cada PROCEDIMIENTO DE LAVADO
pocillo por completo. Lavar 5 veces según instrucción de Eliminar el líquido de los pocillos por aspirado o volcado. Los
lavado (ver PROCEDIMIENTO DE LAVADO). pocillos se lavan con 300 ul de buffer de lavado diluido.
7- Agregar el Conjugado: Asegurar que la altura alcanzada al llenar los pocillos no cause
desbordes.
Conjugado diluido 100 ul 100 ul 100 ul La solución de lavado debe estar en contacto con los poci- llos
Para evitar la evaporación cubrir la policubeta con cinta entre 30 y 60 segundos.
autoadhesiva. Garantizar que luego del último lavado no quede líquido
8- Incubar 30  2 minutos a 37  1oC. residual. Realice un doble aspirado para eliminar el exce- dente
9- Lavar 5 veces según instrucción de lavado. de buffer. Si persiste luego de este procedimiento, invertir la
10- Dispensar el Revelador. Para ello, trasvasar a un placa sobre papel absorbente y golpearla varias veces, de lo
recipiente limpio solamente el volumen de Revelador que se contrario podrán obtenerse resultados erróneos.
requiera. No devolver el Revelador restante al frasco Nota: el procedimiento de lavado es crítico para el resulta- do
original. Evitar el contacto del reactivo con agen- tes del ensayo. Si queda buffer de lavado en los pocillos o si los
oxidantes. mismos no están completamente llenos se obtendrán resultados
erróneos. No dejar que los pocillos se sequen durante el
Revelador 100 ul 100 ul 100 ul procedimiento. Los lavadores automáticos de- ben ser
11- Incubar 30  2 minutos a temperatura ambiente (18- enjuagados con agua destilada o desionizada al final del día para
evitar obstrucciones debido a las sales presentes en el buffer de
25oC), protegido de la luz.
lavado.

RESUMEN DEL
PROCEDIMIENTO

ETAPA PROCEDIMIENTO PRECAUCION/OBSERVACIONES

Dilución Preparación de la solución de lavado (1x) Disolución de los cristales de sales
Diluyente de Agregar 100 ul de Diluyente de Muestra en cada
Muestra pocillo
Muestras Agregar 20 ul de M, CP y CN Se observa cambio de color al agregar la muestra y los
controles
Incubación Cubrir los pocillos e incubar durante 30  2 minu- tos En estufa
a 37  1oC
Lavado Lavar cada pocillo con 300 ul de buffer de lavado (5 Tiempo de contacto de la solución de lavado en- tre
veces) 30 y 60 segundos. Eliminar completamente el líquido
residual de los pocillos
Dilución Preparación del conjugado (1x) Durante la incubación con la muestra, diluir Conju-
gado Concentrado (10x)
Conjugado Agregar 100 ul de Conjugado diluido
 Incubación Cubrir los pocillos e incubar durante 30  2 minu- tos a En estufa
37  1oC
Lavado Idem al lavado anterior
Revelado Agregar 100 ul de Revelador Trasvasar el volumen necesario de Revelador a usar.
No pipetear del frasco original. Descartar remanente del
reactivo. Evitar contacto con agentes oxidantes. No
exponer a la luz
Incubación Durante 30  2 minutos entre 18-25oC Mantener los pocillos protegidos de la luz
Detención Agregar 100 ul de Stopper
Lectura Leer en espectrofotómetro Leer dentro de los 10 minutos

CRITERIOS DE VALIDACION DEL ENSAYO

mayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, una
El ensayo se considera válido si se cumplen simultánea- mente
muestra netamente amarilla se considera Reactiva.
las siguientes condiciones:
1- El promedio de las absorbanicas de los Controles Ne- Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por
gativos deben ser menor o igual a 0,100. duplicado. Si una o ambas repeticiones dan reactivas, la misma
Ejemplo: debe considerarse reactiva.
Lectura 1 = 0,034; Lectura 2 = 0,028; Lectura 3 = 0,029 Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las
Promedio = (0,034 + 0,028 + 0,029) / 3 = 0,030 dos repeticiones. Esto puede deberse a:
- Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una
2- Eliminar cualquier Control Negativo con D.O. mayor a 0,100. muestra reactiva.
3- Si se ha eliminado algún Control Negativo, volver a calcu- lar - Contaminación de la muestra durante la dispensación,
el promedio de los Controles Negativos. Un ensayo es válido si imprecisión en el dispensado de muestra, Conjugado y/o
se aceptan al menos dos de los Controles Nega- tivos. Revelador en el pocillo.
4- El promedio de las absorbancias de los Controles Posi- tivos - Reutilización de tips.
debe ser mayor o igual a 1,300. - Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes
Ejemplo: oxidantes.
Lectura 1 = 1,697; Lectura 2 = 1,774 En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una
Promedio = (1,697 + 1,774) / 2 = 1,736 reacción falsamente reactiva, tanto en el análisis inicial como en
5- La diferencia entre el promedio de las D.O. de los Con- troles sus repeticiones. Algunas causas de este fenó- meno pueden ser:
Positivos y Controles Negativos debe ser mayor o igual a 1,200. - Contaminación de la muestra durante la extracción, pro-
cesamiento o conservación.
Si una de estas condiciones no se cumple, repetir el ensayo. - Presencia de sustancias interferentes, tales como auto-
Recordar que las lecturas obtenidas dependerán de la sen- anticuerpos, fármacos, etc.
sibilidad del aparato empleado. - Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de
lavado (sistema obstruido).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
a) Con instrumental óptico LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T.cruzi se de- Ver Sustancias Interferentes conocidas en Muestra. No
termina relacionando la absorbancia de la muestra res- pecto al se debe utilizar pool de muestras.
valor del Cut-off. No se deben utilizar otros fluidos corporales como la saliva,
Cut-off = CN + 0,200 líquido cefalorraquídeo u orina.
CN: promedio de las D.O. del Control Negativo Cualquier resultado Reactivo debe ser verificado por otra
técnica. Recordar el criterio recomendado por el Instituto Fatala
Ejemplo: 0,030 + 0,200 = 0,230 Chabén, según el cual el inmunodiagnóstico de la infección
Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con ab- deberá hacerse con un mínimo de 2 de los si- guientes métodos:
sorbancias menores al Cut-off inmunofluorescencia indirecta, hema- glutinación indirecta y
Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absor- ELISA, debidamente validados por el Centro Nacional de
bancias mayores o iguales al Cut-off. Referencia.

b) Interpretación visual CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE PERFORMANCE

Si se opta por este tipo de interpretación, debe considerarse No a) Sensibilidad
Reactiva toda muestra que no presente una coloración - Sensibilidad clínica en Paneles de Performance: en un
estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales in-
ternacionales, se obtuvieron los siguientes resultados: PMT 201 (Anti-T. cruzi Performance Panel, BBI, USA):se detectaron 14
de las 14 muestras reactivas.
Proceedings of the 5th. National Forum on AIDS, Hepatitis and
PMT 202 (Anti-T. cruzi Performance Panel, BBI, USA): se
Other blood-borne diseases, pág. 89 - Atlanta, Georgia. 29
detectaron 14 de las 14 muestras reactivas.
marzo-1 abril, 1992.
PP 0409 (Panel de Performance para Chagas, Q Panel,
- Lorenzo, L.; Capriotti, G.; Rojkín, F. - Rev. Arg. de Transfu-
Brasil): se detectaron 16 de las 16 muestras reactivas.
sión XVII/1:51 (1991).
PP 0508 (Panel de Performance anti-T. cruzi, Q Panel, Bra- sil):
- Knecher, L.M.; Rojkín, L.F.; Capriotti, G.A.; Lorenzo, L.E.- Int.
se detectaron 16 de las 16 muestras reactivas.
J. Parasitol. 24/2: 207-211 (1994).
- Sensibilidad clínica en Paneles de muestras reactivas anti- - Knecher, L.M.; Capriotti: G.A.; Rojkín, L.F.; Lorenzo, L.E. -
T. cruzi: en un estudio realizado sobre 85 muestras de ni- ños, Rev. Asoc. Bioq. Arg. 58/3:125, 1994.
provenientes de región endémica, con infección por T. cruzi - Schujman, L.; Suita, G.; Acebal, S.; Albrecht, A. - Acta Bioq.
confirmada por diferentes métodos, se encontraron reactivas la Clin. Latinoam. XXIX/4:517, 1995.
totalidad de las muestras con el kit Chagatest ELISA lisado. - Ministerio de Salud y Acción Social, Instituto Nacional de
En un estudio de 89 muestras reactivas provenientes de una Parasitología "Doctor Mario Fatala Chabén" - Normas para el
institución hospitalaria, se detectaron todas las muestras. diagnóstico de la infección chagásica - Resolución mi- nisterial
523/97, 1998.
b) Especificidad - Clinical Evaluation of Immunoassays. Approved Guideline
En un estudio de 739 muestras de sueros y plasmas de dos I/LA21-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory
centros de salud diferentes, se encontró una especifi- cidad de Standards.
99,29%. - Interference testing in Clinical Chemistry. Approved Guideline
En otro estudio realizado sobre 251 muestras de sueros y EP7-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory
plasmas de banco de sangre, la especificidad obtenida fue de Standards.
99,60%. - User Demostration of Performance for Precision and Accuracy
Se estudió la posible aparición de reactividades cruzadas - Approved Guideline EP15-A (2001).
ensayando muestras provenientes de 341 individuos con
diferentes condiciones clínicas que pueden ser causantes de
reacciones inespecíficas para el ensayo Chagatest ELISA lisado.
Estas condiciones incluyen mujeres embarazadas, pacientes
hemodializados y pacientes con enfermedades autoinmunes o
enfermedades infecciosas diferentes a Chagas (HIV, HTLV,
hepatitis C, hepatitis B, sífilis, otras). Para esta población la
especificidad fue de 99,04%.
c) Precisión
Se evaluó la precisión del test siguiendo el protocolo EP15- A
recomendado por la NCCLS. Los ensayos fueron realiza- dos
con muestras de diferentes niveles de reactividad y con los
controles. Se realizó 1 ensayo diario evaluando cada muestra por
cuadruplicado en el transcurso de 5 días.

Media Intra-ensayo Total

(D.O.) D.S. C.V. D.S. C.V.
Muestra 1 0,590 0,021 3,54% 0,041 6,92%
Muestra 2 0,993 0,043 4,34% 0,067 6,72%
Control (+) 2,255 0,062 2,76% 0,087 3,86%
Control (-) 0,025 0,001 4,88% 0,002 7,38%
n = 20

PRESENTACION
- 96 determinaciones (Cód. 1293096).
- 192 determinaciones (Cód. 1293192).

BIBLIOGRAFIA
- Engvall, E. and Perlmann, P. - Immunochem. 8:871-74 (1971).
- Berning, H. - Dtsch. Med. Wscho 108/3:106 (1984).
- Rojkín, L.F.; Knecher, L.M.; Capriotti, G.A.; Lorenzo, L.E. -
EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS
Policubeta Sensib. Diluyente Muestra
Policubeta sensibilizada Diluyente de Muestra

Conjugado Conc. Conjugado Diluy.

Conjugado Concentrado Diluyente de Conjugado

Revelador Buf. Lavado Conc.

Revelador Buffer de Lavado Concentrado

Control + Control -
Control Positivo Control Negativo

Stopper
Stopper
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para
diagnóstico de Wiener lab.
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la

C Directiva Europea 98/79 CE de productos sanita- rios para el

diagnóstico "in vitro"

P Representante autorizado en la Comunidad Europea

V Uso diagnóstico "in vitro"

X Contenido suficiente para <n> ensayos

H Fecha de caducidad

l Límite de temperatura (conservar a) No

❄ congelar

F Riesgo biológico

Volumen después de la reconstitución

Cont Contenido

g Número de lote

M Elaborado por:

Xn
Nocivo

Corrosivo / Caústico

Xi
Irritante

i Consultar instrucciones de uso

Calibr. Calibrador

b Control

b Control Positivo

c Control Negativo h
Número de catálogo

M Wiener Laboratorios S.A.I.C.

Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Autorizado A.N.M.A.T.
Wiener lab.
Cert. Nº: 6655/11

864102700 / 02 Pág. 6 de 12
UR130321
2000 Rosario - Argentina

864102700 / 02 Pág. 7 de 12
UR130321