PRÁCTICA N° 5 CLONACIÓN MOLECULAR (metodología virtual)

PRESENTADO POR:

Maria Paula Osorio

Maria Jose Torres

Juan Carlos Rengifo

Santiago Vargas

I. Fundamento teórico

La transformación es un proceso por el cual las células captan ADN libre presente en el medio.
Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia con que
ocurre varía enormemente de unas especies a otras. Para que ocurra la transformación, la
bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en
determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su
pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. Este
proceso puede ser realizado en condiciones in vitro en otro tipo de células como levaduras y
plantas.

La transformación celular se puede ejecutar con un vector de clonación o de expresión, por lo

tanto, antes de iniciar un proceso de clonación molecular es importante tener claro los
resultados esperados y la aplicación de los mismos.

II. Objetivo de la práctica

● Analizar in silico secuencias ligadas, clonadas y expresadas en una célula hospedera
eucariota.

III. Procedimiento
1. Se desea realizar el proceso de transformación de la levadura Pichia pastoris con el vector
de expresión pPICz-αA, que presenta la secuencia del gen X, para escalar la producción de
la proteína a escala industrial.
a. Antes de realizar el proceso en la levadura, fue indispensable realizar el proceso de
ligación del gen al vector de expresión y posteriormente introducirlo por
transformación en células de E. coli, esto con el fin de garantizar que la secuencia se
encuentre de forma correcta en el vector para su producción en las células de
levadura.
b. Una vez realizada la transformación de E. coli se seleccionaron las colonias que
crecieron en medio con antibiótico, se extrajo el ADN plasmídico y se envió a
secuenciar.
c. Una vez obtenida la secuencia se verificaron los resultados.
A continuación, se presenta el protocolo a seguir para el análisis de la secuencia.

2. Ingrese al link https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?

set=yeast_plasmids&plasmid=pPICZ(alpha)_A
3. ¿Cuál es el tamaño en pb del vector?
3593 bp
4. Identifique las secuencias básicas de un vector plasmídico de expresión: OriC,
polilnker(MCS), Gen de resistencia antibiótico, promotor del gen (AOX1) y la secuencia
terminadora del gen (AOX1)
a. ¿Cuál es la longitud en pb de cada una de estas secuencias?

OriC: 589 pb
Plilnker (MCS): 69 pb
Gen de resistencia antibiótico: 375 pb
promotor del gen (AOX1): 939 pb
la secuencia terminadora del gen (AOX1): 247 pb

b. ¿Cuántas enzimas de restricción se ubican en el MCS? ¿Cuáles son?

EcoRI

BsaAI 
SfiI 
BsmBI 
Acc65I 
KpnI 
PspXI 
SacII 
NotI
XbaI 
5. Se realizó una PCR de colonia para verificar los vectores que tuvieran el inserto (333 pb),
posteriormente se corrió un gel de agarosa. Se obtuvo el siguiente resultado:
 6. ¿Cuál o cuáles plásmidos poseen el inserto? ¿Por qué?

El plásmido número 1 es el que posee el inserto, porque posee las pares de bases del
control negativo más las pb del inserto.

7. Con base en este resultado se envió a secuenciar y se obtuvo la siguiente información

(Ver anexo secuencia)

8. El gen se encuentra entre el sitio de restricción para EcoRI y XbaI. Por lo tanto:

a. Identifique y resalte la secuencia de EcoRI y XbaI del resultado de secuenciación.

¿Por qué están presentes estos sitios de restricción en la secuencia?

El sitio donde se encuentra EcoRI es el sitio de origen de replicación. Este provee el sitio
único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación.

La secuencia XbaI está presente en el sitio de clonación múltiple, este sitio debe tener una
secuencia específica reconocida por diversas enzimas de restricción (en este caso XbaI) para
poder introducir el ADN del gen que queremos insertar y así generar el ARN producto de la
transcripción o bien producir la proteína codificada en la secuencia génica que se introdujo
(proteína recombinante).

>Secuencia
GTAACGGACTTTTACGACACTTGAGAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGATGAGA
TTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAA
CACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGA
TTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTA
TTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGA
AAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCG
CTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGG
CTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACC
CAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGG
CCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGC
ATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC
TAGTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAAGCGCCGTCGACCATCATCAT
CATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACG
AGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAG
ATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTC
ATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAACTGATGAATATCT
TGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGCATTTCCCACTCCT
CTTCAAAGTACAAAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCCCCCACCCTAA
CTTTCAAAAGGTTTCTACTCCCTTTTTTACCCTTCCCAAATTTTCCCGGACTCCCCCCCTCC
CCCTTTCAATTTCAAAAAACCCAAGGCCAGGAATATTAAATTTCCCCCCCTTTTTTCCCCG
GAGGGGGGGGTTATTTCCCCCGCCCTAAAGGGTTGGGAAAAAAAAAAAAAAACCCCCTTT
TTTCTTTTTTTTTCCCAAAAAGGCATAAA

b. En la secuencia del gen identifique y resalte el codón de inicio (ATG) y el de paro

(TAG).

c. ¿Cuántos pares de bases posee el gen? 333 pb

9. Ingrese al link: https://web.expasy.org/translate/, esta página permite realizar la

traducción de la proteína e identificar los posibles marco de lectura abierta (ORF por su
sigla en inglés)
10. Copie y pegue la secuencia del gen en el espacio correspondiente, y seleccione los
parámetros de acuerdo a la siguiente imagen.
11. Para identificar a que proteína corresponde la secuencia dar click en blast, se abrirá
una ventana emergente en la cual deberá dar click en run blast

12. ¿Cuál es el nombre de la proteína que expresa el gen? Insulina

13. Posteriormente identificar las características químicas de la proteína, desplegando la

pestaña sequence analysis tolos y seleccionando Protparam. Se abrirá una ventana
emergente con toda la información.
 a. ¿Cuántos aminoácidos constituyen la proteína? 110

b. ¿Cuál es el peso molecular de la proteína? 11980.91

c. ¿Cuántos aminoácidos posee con carga positiva y con carga negativa?

Carga negativa (Asp + Glu): 10

Carga Positiva (Arg + Lys): 7

d. ¿Cuál es la vida media de la proteína?

30 horas (reticulocitos de mamíferos, in vitro).

> 20 horas (levadura, in vivo).

> 10 horas (Escherichia coli, in vivo).

14. Escriba la conclusión más importante de este trabajo.

Con este trabajo entendemos cuáles son los componentes (entre ellos las enzimas de restricción,
los elementos que forman un vector de expresión, la finalidad de un vector de expresión que es
generar el ARN producto de la transcripción o bien producir la proteína codificada en la secuencia
génica que portan) y los pasos que se deben realizar para realizar una transformación celular, que
generará que el material genético se incorpore de manera extracromosómica y se replique,
transcriba y traduzca empleando la maquinaria enzimática de la célula huésped.
GTTCCGGACTTTTACGACACTTGAGAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG
CTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGC
TGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACG
GGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTG
AAGCTGAATTCTCTCCGCGAGATTGCGTTATTGTCTACTGACTATATAGAGAGTGTGTGTGCTGTGTTTTCTCTTTTGTG
TCGTAGAATTGAGTCGAGTCATGGACAAATCTGAATCAACCAGTGCTGGTCGTAACCGTCGACGTCGTCCGCGTCGTG
GTTCCCGCTCCGCTTCCTCCTCGGATGCTAACTTTAGAGTCTTGTCGCAGCAGCTTTCGCGACTTAACAAGACGTTAGCA
GCTGGTCGACCAACTATAAACCACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAACGCTGTAAACCTGGGTACACGTTCACATCTATTA
CCCTAAAGCCACCAAAAATAGACCGTGGGTCTTATTACGGTAAAAGGTTGTTATTACCTGATTCAGTCACGGAATATGA
TAAGAAGCTTGTTTCGCGCATTCAAATTCGAGTTAATCCTTTGCCGAAATTTGATTCTACCGTGTGGGTGACAGTTCGTA
AAGTTCCTGCCTCCTCGGACTTATCCGTTGCCGCCATCTCTGCTATGTTCGCGGACGGAGCCTCACCGGTACTGGTTTAT
CAGTATGCTGCATCTGGAGTCCAAGCTAACAACAAATTGTTGTATGATCCTTCGGCGATGCGCGCTGATATAGGTGACA
TGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGTATTCAAAAGACGATGCGCTCGAGACGGACGAGCTAGTACTTCATGTTGACATCG
AGCACCAACGCATTCCCACGTCTGGGGTGCTCCCAGTCTGATTCCGTGTTCCCAGAACCCTCCCTCCGATTTCTGTGGCG
GGAGCTGAGTTGGCAGTTCTGCTATAAACTGTCTGAAGTCACTAAACGTTTATTACGGTGAACGGGTTGTCCATCCAGC
TTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGC
CTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGT
CAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGGATAGGATTTTTTT
TGTCATTTTGTTTCTTCTCGAACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAACTGATGAATATCTTGAGGGAGGGGTTT
GGGAAAATCATTCGAGATTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCCCTTCAAAGAACAAAAAATTAAGGGATACCTTCG
TTTGGGGCGGATCCCCCCCCCCCCCTACCTTTCAAAATGTTTCCCCTCCTTTTTTTACCCTTCCAAAATTTTTTCGGAATCC
CCCCCCTTGCCCGTTCCCTTTTAAAAACCCCAGGCAAACAAAAATTAATTTTCCCTCCTTTTTTCCCCCGGGGGGGGGGT
TAATTACCCCCCACCCAAAGGGTTGGGAAAGAAAAAAAAAAACCGCCTCTTTTTTTTTTTTTTCTTTAAAAAAGGGGAAA
AAAAATAATTTACCCCCTTCCTTTTTCTGGAAAAATTTTTTTTTTTATTTTTTTCCCTTCCCAGCACCCCCCCTGTAATTTTA
AAAAAAAAAAGGGGCCTCAATTTCCCAAGTAAAAAATTATTTTTTTTGGGTTTAAAAAAAATTTTTTTAATCTTTTCCTTT
TAAAAAAAAGAAAAAAAATAA