Determinacion de Bilirrubina

DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA
OBJETIVO
 
Al finalizar la practica el alumno:
1. Conocerá la técnica para cuantificar la concentración de bilirrubina total
y directa en suero.
2. Relacionará los valores de concentración de bilirrubinas obtenido con la
función hepática.
 
INTRODUCCIÓN
Tradicionalmente se determina la bilirrubina total y fraccionada. La bilirrubina
total es la suma de la bilirrubina directa (conjugada) y la bilirrubina
indirecta (no conjugada)
La bilirrubina se origina por degradación del grupo hemo de la hemoglobina, que a
su vez aparece en el plasma como consecuencia de la destrucción de los glóbulos
rojos en el sistema retículo endotelial. La hemoglobina, una vez liberada en el
interior del eritrocito, se combina con las haptoglobinas, proteínas plasmáticas
específicas para su transporte. En una primera etapa y tras su liberación de la
haptoglobina, se forma, por acción de una oxigenasa, un grupo formilo, con lo que
se rompe el anillo tetrapirrólico del hem, formándose el compuesto denominado
biliverdina, que en una etapa posterior y por acción de una reductasa se
transforma en bilirrubina.
FUNDAMENTO 
La mayoría de los métodos químicos para la determinación de bilirrubina total se
basa en la reacción entre ácido sulfanil diazótico y bilirrubina para producir
azobilirrubina que absorbe a 560 nm en solución acuosa. La intensidad del color
producido es directamente proporcional a la cantidad de la concentración de
bilirrubina directa presente en la muestra. Tales pruebas se realizan en presencia
o ausencia de solvente orgánico por ejemplo, metanol para distinguir la bilirrubina
libre de la bilirrubina conjugada en base a un diferencial de solubilidad.
 
 
MATERIAL Y REACTIVOS
 
2 tubos sin • Reactivo de Bilirrubina total: Ácido sulfanílico 32
anticoagulante mmol/L en ácido clorhídrico diluído, adicionado de
1 jeringa  un  acelerador y estabilizador.
Torundas con alcohol • Reactivo Bilirrubina Directa: Ácido sulfanílico
Ligadura látex 32mmol/L en ácido clorhídrico diluido, adicionado de
1 gradilla un estabilizador.
Micropipeta 100μl • Oxidante: Nitrito de Sodio 20mmol/L acuoso
Puntillas para • Calibrador para Bilirrubina: Sal de Dicloruro de N-1-
micropipeta metiletilendiamina
1 Pipeta de 5 ml
1 Pipeta de 1 ml
4 tubos de 13 x 100
Centrífuga
Espectrofotómetro
Cubetas para
espectrofotómetro
Cronómetro
Vaso de precipitados
de 100 ml
Perilla
Pizeta con agua
destilada
Gasas
Marcador
 
 
PROCECIDIMIENTO
BILIRRUBINA TOTAL
Bilirrubina total
  BLANCO CONTROL BLANCO MUESTRA
MUESTRA
Reactivo de bilirrubina   0,03      
total( ml)
Oxidante (1gota= 50 μl)        
Calibrador ( ml)        
Muestra (ml)        
Agua destilada (ml)        
 
1. Colocar todos los tubos en la gradilla por cinco minutos a Temperatura
ambiente.
2. Calibrar el espectrofotómetro a ceros con el reactivo blanco a 540 nm
3. Leer y registrar la absorción de los tubos calibrador y muestra en el transcurso
de 30 minutos.
 
BILIRRUBINA DIRECTA 
Bilirrubina directa
  BLANCO CONTROL BLANCO MUESTRA
MUESTRA
Reactivo de bilirrubina   0,06      
total( ml)
Oxidante (1gota= 50 μl)        
Calibrador ( ml)        
Muestra (ml)        
Agua destilada (ml)        
 
1. Colocar todos los tubos en la gradilla por tres minutos a Temperatura ambiente.
2. Calibrar el espectrofotómetro a cero con el reactivo blanco a 540 nm
3. Leer y registrar la absorción de los tubos inmediatamente.
 
NOTA: El tiempo para las muestras de Bilirrubina Directa después de la adición
del suero es importante, ya que las lecturas de absorbancia se incrementan
lentamente debido a la presencia de la fracción INDIRECTA.
 
VALORES ESPERADOS.    
Bilirrubina Total: Adultos 1-2 mg/dl   
Bilirrubina Directa: adultos e infantes (mayores de 1 mes) 0.5 mg/dl   
 
CALCULOS:
Abs= absorbancia
 
0,105-0,03  x  19,8  = 14,85 mg/dl
Abs calibrador
0,06 – 0,03   x  19,8 = 5,94 mg/dl
Abs calibrador
 
PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE TRABAJO 
El reactivo de trabajo se prepara agregando reactivo de Nitrito de Sodio al reactivo
de Bilirrubina total y directa, los volúmenes dependen de la marca comercial, igual
la estabilidad del reactivo.
 
NOTA: Las proporciones dependen de la técnica y marca comercial del reactivo
CUESTIONARIO
1. En qué casos se encuentra elevada la concentración plasmática de
bilirrubina total y directa.
En un hemograma podemos verificar los niveles de bilirrubina, lo más
común no es que los niveles estén por debajo de lo recomendado, pero no
debemos descuidar esos números. Esto es un anuncio de que el
funcionamiento sanguíneo no está procesando bien las proteínas y
nutrientes.
2. Si existiera un déficit de glucuronil transferasa ¿cuál bilirrubina se
alteraría?
Glucuronil transferasa. Es una enzima hepática que convierte
la bilirrubina en una forma que puede ser eliminada del cuerpo a través de
la bilis.
3. ¿Cuáles son los parámetros que se miden el solicitar las pruebas de
funcionamiento hepático? perfil hepático o Hepatograma, Análisis de
sangre: función hepática
4. ¿Cuál es la concentración plasmática de bilirrubina en la que se puede
presentar el tinte ictérico? se presenta a una concentración de 40 uM (2.4
mg/dl) de bilirrubina (35).
5. ¿Cuáles son los valores de normalidad de las bilirrubinas? Bilirrubina

directa (también llamada conjugada): menos de 0.3 mg/dL (menos de 5.1
µmol/L) Bilirrubina total: de 0.1 a 1.2 mg/dL (de 1.71 a 20.5 µmol/L) Los
rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes
laboratorios.
6. ¿De dónde procede el 80 % de la bilirrubina sérica? de la destrucción

diaria de los glóbulos rojos
7. ¿Cuál bilirrubina se altera en la ictericia hemolítica?
8. ¿Cuál bilirrubina se altera en la ictericia obstructiva?
9. ¿Si existe daño hepático que bilirrubina se altera?
10. ¿En qué forma es transportada la bilirrubina en plasma? es transportada en

un estado ligado a la albúmina. Su conjugación ocurre en el hígado con la
formación de bilirrubina unida soluble en agua.
CONCLUSION
La bilirrubina es un producto del catabolismo del grupo hem. Inicialmente se

produce bilirrubina no conjugada que a nivel hepático es conjugada para ser
eliminada por la bilis.
En el plasma la bilirrubina se encuentra unida en su mayoría a la albúmina y solo

una pequeña fracción se encuentra libre.
La fracción libre de la bilirrubina puede atravesar las membranas biológicas y

acumularse a nivel cerebral. Esta característica la hace potencialmente patógena
a altas concentraciones.
Hay diferentes causas de hiperbilirrubinemia (prehepática, hepática y poshepática)

y algunas de ellas son genéticas. Además, en algunos casos solo hay aumento de
la bilirrubina no conjugada o de la conjugada o de ambas.
La determinación de la bilirrubina se considera tradicionalmente como un

marcador de disfunción hepática, aunque se requiere de otras pruebas para
mejorar el diagnóstico.
En la determinación de la bilirrubina debe considerarse la presencia de algunos
factores interferentes: lipemia y hemólisis. Además, la muestra debe protegerse de
la luz para evitar un valor falsamente disminuido.
A nivel neonatal es de vital importancia estudiar la causa de un aumento

significativo de la bilirrubina total (conjugada o no conjugada).

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DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA

5. ¿Cuáles son los valores de normalidad de las bilirrubinas? Bilirrubina

6. ¿De dónde procede el 80 % de la bilirrubina sérica? de la destrucción

7. ¿Cuál bilirrubina se altera en la ictericia hemolítica?

8. ¿Cuál bilirrubina se altera en la ictericia obstructiva?

9. ¿Si existe daño hepático que bilirrubina se altera?

10. ¿En qué forma es transportada la bilirrubina en plasma? es transportada en

La bilirrubina es un producto del catabolismo del grupo hem. Inicialmente se

En el plasma la bilirrubina se encuentra unida en su mayoría a la albúmina y solo

La fracción libre de la bilirrubina puede atravesar las membranas biológicas y

Hay diferentes causas de hiperbilirrubinemia (prehepática, hepática y poshepática)

La determinación de la bilirrubina se considera tradicionalmente como un

A nivel neonatal es de vital importancia estudiar la causa de un aumento

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