Determinacion Del Aminoacido N Terminal

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE

SANGER.
ALUMNO: BERNAL CARREÓN FRANCISCO permanecía intacta, por lo que la secuencia-
ANTONIO GRUPO: 3IM1 SECCIÓN: 4 ción se facilita.
INTRODUCCIÓN. OBJETIVOS.
La determinación de la estructura primaria Identificar el aminoácido alfa-amino terminal

de una proteína suele denominarse secuen- de las cadenas de la molécula de hemoglobi-
ciación. Existen varias maneras de determi- na mediante el método de Sanger.
nar la secuencia de aminoácidos. El primero
DESARROLLO.
en lograr esto fue Frederick Sanger, quién di-
seño un método, el cual consiste en el mar- Se colocaron 30 mg de hemoglobina en un
caje del amino terminal a través del uso de tubo y se disolvió con bicarbonato de sodio
DNFB. Este compuesto químico color amari- al 4.2%, esto debido a que la reacción con el
llo reacciona con los grupos amino libres en DNFB se lleva a cabo en condiciones ligera-
condiciones ligeramente básicas formando mente básicas. Después de esto se agregó al
los dinitrofenil derivados (DNP-aa), también tubo DNFB al 1% y se agitó, procurando man-
reaccionará con los grupos imidazol, fenóli- tener el pH entre 8 y 9. Se agregó HCL 3N,
cos y epsilonamino, por lo que se dará una con la finalidad de detener la reacción de di-
dinitrofenilación en la cadena lateral de la ti- nitrofenilacion, después se realizaron 3 ex-
rosina, histidina y lisina. Al hidrolizar el pépti- tracciones con éter y solución acuosa de Fe-
do o la proteína ya dinitrofenilada, se da una SO4, posteriormente se evaporaron los resi-
ruptura total de los enlaces peptídicos lo que duos de éter. Se centrifugó a 3000 rpm du-
nos da como resultado un hidrolizado que rante 15 minutos, se elimina el sobrenadante
contendrá aminoácidos libres y DNP deriva- y posteriormente se agrega HCL 6N y se colo-
dos que se conservan intactos, ya que su en- ca el tubo en la autoclave a 15lb/in^2 duran-
lace es más difícil de romper. Los DNP de te 3 horas, con esto se logra la ruptura de los
aminoácidos terminales, a diferencia de los enlaces peptídicos de la hemoglobina, obte-
demás DNP y de los aa’s libres, son no pola- niéndose un “caldo” de aminoácidos que
res por lo que se pueden extraer muy fácil- contiene al amino ácido n-terminal, mismo
mente con un disolvente no polar. Estos DNP que se extrae con éter, se pasa a una parrilla
son sometidos a cromatografía, y se determi- y se evapora casi a sequedad , el residuo se
na al aminoácido amino terminal de la pro- disuelve en 5 ml de etanol y se aplica en una
teína en comparación con otros DNP deriva- tira de papel Whatman junto con otros DNP
dos. Edman utilizó una técnica similar a la de derivados.
Sanger, utilizando el fenilisotiocianato para
marcar al grupo amino del aa terminal, a di- Posteriormente se coloca el cromatograma
ferencia de Sanger, al hidrolizar la proteína en una cámara previamente saturada con
únicamente rompía el enlace entre el aa ter- solvente de ácido cítrico y citrato de sodio,
minal y el resto de la de la cadena, la cual saturar durante dos horas y desarrollar la
cromatografía en forma ascendente durante
4 o 5 horas. Medir las distancias correspon-
dientes y calcular los valores de RF.
portado en la bibliografía. Las otras dos mar-
cas obtenidas en la muestra problema pre-
RESULTADOS.
sentan un valor de Rf similares a los de las
muestras de DNFB (Similar a P1) y DNP-Ala
(Similar a P2), esto puede deberse a que exis-
tió contaminación de ambas muestras a la
hora de extraer el aminoácido N-terminal.
CONCLUSIÓN.
El aminoácido N-terminal de la hemoglobina

es la Valina. La técnica de Sanger permitió
extraer dicho aa.
BIBLIOGRAFÍA.
Fonaguera J. y G. Gómez (2004), “BIOQUIMI-

CA: LACIENCIA DE LA VIDA”, Editorial de la
Universidad Estatal a Distancia (2004).
Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger

“Principios de Bioquímica” 4ª Edición. Ed.
Omega.
Imagen 1. Cromatograma. Se colocaron

DNP-Ala, DNP-Val, DNP-Phe, DNFB y mi PREGUNTAS EXTRA.
muestra problema de izquierda a derecha.
¿Cuál es la fase estacionaria en la cromato-
grafía en papel?
MUESTRA dm (cm) dsoluto(cm) Rf La tira de papel actúa como fase estaciona-
DNP-Ala 24.2 39.8 .608 ria.
DNP-Val 27 39.7 .6801
DNP-Phe 22.5 39.7 .5667 ¿Por qué utilizamos bicarbonato de sodio en
DNFB 17.5 39.5 .4430 lugar de hidróxido de sodio para alcalinizar
P1 15.5 39.1 .3964 la muestra de hemoglobina?
P2 24.3 39.1 .6214 Porque lo que se requería eran condiciones
P3 27.8 39.1 .7109
ligeramente alcalinas, para evitar que el gru-
TABLA 1. Cromatografía en papel. Valores de
po amino del aminoácido N-terminal no se
Rf.
desprotonara y se pudiera llevar a cabo la
DISCUSIÓN. reacción de dinitrofenilación, el hidróxido de
sodio hubiera provocado condiciones más
Después de obtener los valores de Rf corres- extremas de alcalinidad.
pondientes, se observa similitud entre la
marca 3 de la muestra problema con el valor
de la muestra de DNP-Val, por lo que se pue-
de decir que la Valina es el aminoácido N-ter-
minal de la hemoglobina, mismo que es re-

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La determinación de la estructura primaria Identificar el aminoácido alfa-amino terminal

El aminoácido N-terminal de la hemoglobina

Fonaguera J. y G. Gómez (2004), “BIOQUIMI-

Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger

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