INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

BIOQUÍMICA GENERAL
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
GRUPO 4QM2
PRÁCTICA 1: DETERMINACIÓN DE desde dipéptidos y tripéptidos en
AMINOÁCIDOS TERMINALES CON adelante por fragmentos de tamaño
GRUPOS ALFA AMINO LIBRE POR EL progresivamente mayor, Sanger logró
MÉTODO DE SANGER. reconstruir la secuencia completa de la
insulina, logro por el cual recibió un
ALUMNOS:
premio Nobel en 1958. Sanger, quien
CRUZ CORTES BLANCA ESTELA recibió un segundo premio Nobel por su
trabajo en el desarrollo de las técnicas de
GONZÁLEZ VARGAS ITZEBEL secuenciación de DNA, murió en 2013 a
MONTSERRAT la edad de 95 años. Pehr Edman
SECCIÓN: 3 introdujo el fenilisotiocianato (reactivo de
Edman) para marcar de manera selectiva
INTRODUCCIÓN el residuo amino terminal de un péptido.
En contraste con el reactivo de Sanger,
La insulina madura consta de la cadena
el derivado feniltiohidantoína (PTH)
A de 21 residuos y la cadena B de 30
puede eliminarse en condiciones leves
residuos unidas mediante enlaces
para generar un nuevo residuo amino
disulfuro. Frederick Sanger redujo los
terminal, Por consiguiente, pueden
enlaces disulfuro, separó las cadenas A y
usarse rondas sucesivas de obtención de
B, y dividió cada cadena hacia péptidos
derivados con reactivo de Edman para
de menor tamaño usando tripsina,
secuenciar muchos residuos de una
quimotripsina y pepsina. Los péptidos
muestra única de péptido. Aun así, la
resultantes después fueron aislados y
determinación de la secuencia completa
tratados con ácido para hidrolizar una
de una proteína mediante métodos
porción de los enlaces peptídicos y
químicos persiste como un proceso que
generar péptidos con apenas 2 o 3
consume tiempo y es laborioso.
aminoácidos. Cada péptido se hizo
reaccionar con 1-fluoro-2,4- OBJETIVOS
dinitrobenceno (reactivo de Sanger), que
deriva los grupos α-amino expuestos de OBJETIVO DE LA PRACTICA
los residuos amino terminal. Después fue  Identificar el aminoácido alfa-
determinado el contenido de amino terminal de las cadenas de
aminoácidos de cada péptido e la hemoglobina mediante el
identificado el aminoácido amino método de Sanger.
terminal. El grupo α-amino de la lisina
también reacciona con el reactivo de OBJETIVOS REDACTADOS POR
Sanger, pero dado que una lisina amino NOSOTROS
terminal reacciona con 2 mol de dicho
 Entender el fundamento del
reactivo, es fácil distinguirla de una lisina
método de Sanger por medio de
en el interior de un péptido. Al trabajar
 la realización de este con ayuda CONCLUSIONES
de una cromatografía.
Gracias a la aplicación del método de
 Realizar la dinitrofenilación del
Sanger se tuvo más facilidad al momento
aminoácido N-terminal de la
de ubicar las alfa-amino terminales de las
hemoglobina para la posterior
distintas cadenas de proteínas, y con
eliminación del reactivo 1-fluoro-
esto, fue posible la detección del
2,4-dinitrobenceno que no
aminoácido alfa-amino terminal de la
reacciono.
hemoglobina.
 Obtener el hidrolisis de la DNP-
proteína para después realizar Bajo nuestra experiencia sobre esta
una cromatografía en papel para práctica, tuvimos la oportunidad de
la identificación del residuo N- comprobar que el método de Sanger es
terminal. un método económico, sobre todo a nivel
escolar, y con respecto al tiempo, es de
Resultados
los más rápidos para la obtención de
Tabla 1. Valores de Rf cromatografía en resultados. Así mismo, el cálculo del Rf
papel. suele ser bastante sencillo de realizar
terminada la cromatografía.
MUESTRA dm dfs Rf
(cm) (cm) (dm/dfs)
DNP-Phe 21.9 38.1 0.5748
BLIBLIOGRAFIA
DNP-Ala 23.2 38.5 0.6025
DNP-Val 26.2 38.9 0.6735 Kennelly P.J., PhD, & Rodwell V.W., PhD
DNFB 17.2 38.8 0.4432 (2016). Proteínas: determinación de la
Pm1 14 38.5 0.3636 estructura primaria. Rodwell V.W., &
Pm2 23.1 38.5 0.6 Bender D.A., & Botham K.M., & Kennelly
P.J., & Weil P(Eds.), Harper. Bioquímica
DISCUSIONES ilustrada, 30e. McGraw Hill.
https://accessmedicina.mhmedical.com/c
El aminoácido N-terminal para la
ontent.aspx?
Hemoglobina, registrado en la literatura,
bookid=1814&sectionid=127361673
se trata de la Valina.
Cromatografía en papel de bolígrafos de
En el cromatograma, la muestra
tinta gel. Recuperado de
problema 2 tiene un valor de Rf muy
https://quimicafacil.net/manual-de-
similar al de DNP-Ala y DNP-Val, sin
laboratorio/cromatografia-en-papel-de-
embargo no es exacta, esto pudiendo ser
boligrafos-de-tinta-gel
por impurezas en la muestra como trazas
de éter que no se hallan separado de Química Biológica I TP 9
forma correcta CROMATOGRAFIA de Partición.
Recuperado de:
Se observaron dos manchas en el mismo
http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabio
carril de nuestra muestra problema esto
logica1/wp-content/uploads/
quiere decir que pudo haber existido una
2010/08/2011-TP-9-CROMATOGRAFIA-
contaminación o que tiene aún restos de
PAPEL.pdf
DNFB.
CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA.
Recuperado de
http://www.qfa.uam.es/qb/practicas/P6- ascendente) o descienda por capilaridad
guion.pdf y gravedad (técnica descendente). La
fase estacionaria es un complejo
ANEXO
celulosa - agua que tiene un poder
¿Por qué no se utilizó hidróxido de sodio diferente que el del agua pura.
para basificar y por qué se usó
Cromatografía en papel de bolígrafos de
bicarbonato de sodio?
tinta gel. Recuperado de
González Vargas: https://quimicafacil.net/manual-de-
laboratorio/cromatografia-en-papel-de-
Porque el propósito es obtener un pH, boligrafos-de-tinta-gel
alcalino y el NaOH hubiese provocado un
aumento debido a que es base fuerte.
Cruz Cortes: Gracias a que el Cruz Cortes: En la cromatografía en
bicarbonato de sodio es una base débil papel, la sustancia problema es aplicada
este se utiliza para que se obtengan pH a un trozo de papel, bien puede ser papel
alcalinos, como la práctica lo requiere, a especializado para cromatografía, pero
comparación del hidróxido de sodio, que también se puede emplear papel de filtro
hubiera provocado un aumento en el pH. o papel común, mientras sus
constituyentes no interfieran con la
Fundamento de la cromatografía en elución de los componentes o interactúen
papel con el solvente a emplear.
González Vargas: La cromatografía en La composición básica del papel es
papel se utiliza para compuestos muy celulosa, el cual es un polímero de β
polares o polifuncionales. El uso más glucosa, la cual posee varios grupos
común es para azúcares, aminoácidos y hidroxilo en su estructura, dándole la
pigmentos naturales. En esta capacidad de atraer moléculas polares
cromatografía se utiliza el fenómeno de como la del agua. La celulosa es
partición en donde la fase estacionaria se denominada la fase estacionaria en la
halla sobre un soporte activo (el papel) cromatografía en papel.
que en realidad forma parte de la fase
estacionaria que es el agua. Las fases La fase móvil o solvente de la
móvil y estacionaria estarán en contacto cromatografía en papel es menos polar y
en una gran interfase, lo que permite una generalmente consiste en la mezcla de
rápida obtención de una distribución de uno o varios solventes orgánicos y agua.
equilibrio del soluto entre ellas. Si la Los solventes y proporciones a emplear
muestra problema está formada por más dependerán tanto de la fase estacionaria
de un soluto, éstos se separan por sus como de la naturaleza de la muestra a
diferentes coeficientes de partición. La analizar. La cromatografía en papel
realización de la cromatografía en papel consta de tres etapas básicas; 1.
implica la siembra de la muestra Aplicación de la muestra. 2. Desarrollo
problema en un trozo de papel de buena del cromatograma, que consiste en la
calidad, en general Whatman N°1 para elución del solvente junto con la muestra
cromatografía analítica, que luego se través de la fase estacionaria y 3.
introducirá en una cuba de desarrollo de Revelado del cromatograma si es
modo que el solvente (fase móvil) necesario y el cálculo de los índices de
ascienda por capilaridad (técnica
retención para la interpretación de los
resultados.
CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA.
Recuperado de
http://www.qfa.uam.es/qb/practicas/P6-
guion.pdf
González Vargas: Rf es la relación entre
Significado de Rf las distancias recorridas por el soluto y
por el eluyente desde el origen de la
Cruz Cortes: La constante Rf (Factor de
placa, y tiene un valor constante para
retención) es simplemente una manera
cada compuesto en unas condiciones
de expresar la posición deun compuesto
cromatográficas determinadas
sobre una placa como una fracción
(adsorbente, disolvente, tamaño de la
decimal y mide la retención de
cubeta, temperatura, etc.).
uncomponente. Se define como: Rf =
(distancia recorrida por la zona del soluto CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA. (s.
desde el origen) / (distancia recorrida por f.). QFA. UAM. Recuperado 14 de marzo
la fase móvil desde el origen) de 2023, de
http://www.qfa.uam.es/qb/practicas/P6-
La distancia recorrida por el compuesto
guion.pdf
se mide generalmente desde el centro de
la mancha, los cálculos se simplifican si
el denominador es 10. Para que los Rf
sean reproducibles deben ser fijadas una
serie de condiciones (Espesor de la
placa, fase móvil, fase estacionaria,
cantidad de muestra). El máximo valor de
Rf que se puede alcanzar es de 1, lo
ideal es un Rf entre 0.55 y 0.7. Para
averiguar si dos compuestos son iguales,
se colocan ambos sobre la misma placa
y se desarrolla con varios eluyentes. Una
vez desarrollados se calculan los Rf y si
son distintos, puede deducirse con toda
seguridad que no se trataba del mismo
compuesto. Por el contrario, sí los Rf son
iguales, los compuestos pueden ser
iguales o no.
Course hero. Constante Rf La constante
Rf Factor de retención. (2018) Obtenido
de:
https://www.coursehero.com/file/p6vf8ett/
Constante-Rf-La-constante-Rf-Factor-de-
retenci%C3%B3n-es-simplemente-una-
manera-de/
 Fig. 2 Identificación del residuo N-
terminal por cromatografía en papel.

Fig. 1 Identificación del residuo N-terminal

por cromatografía en papel.