Zapata - Obtención de Extracto de Antocianinas A Partir de Arándanos para Ser Utilizado Como Anti...
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Zapata - Obtención de Extracto de Antocianinas A Partir de Arándanos para Ser Utilizado Como Anti...
Alimentación
TESIS DOCTORAL
Presentada por:
Luz Marina Zapata
Dirigida por:
Dr. Juan A. Cárcel Carrión
Dra. Gabriela Clemente Polo
Abril de 2014
Quiero dedicar el esfuerzo invertido en este trabajo:
A Dios,
que con su amor infinito me regala tanto en esta vida.
A mi esposo Omar,
por su amor y por hacer que este largo camino sea más fácil.
A mis amigas Cristina y Liliana, por compartir la vida y por estar siempre.
A las Dras. Maria del Carmen Schvab y María Mercedes Ferreyra, que
me introdujeron en el mundo de la investigación científica.
A Dios por las personas que puso en mi camino y por haberme dado
tanto.
Las antocianinas son flavonoides responsables del color de los frutos del
arándano. Estos compuestos son interesantes por su impacto sobre las
características sensoriales de los alimentos, ya que se pueden utilizar como
colorantes alimentarios naturales. Además, debido a su elevada actividad
antioxidante, presentan potenciales beneficios para la salud.
ii
El aumento del RAT con el incremento de la temperatura hasta 36.6 ºC podría
deberse a que la elevación de la temperatura estaría favoreciendo la extracción
al aumentar la solubilidad de los antocianos y el coeficiente de difusión. Sin
embargo, por encima de esa temperatura, las antocianinas extraídas se
degradaron, posiblemente debido a que el efecto del calor produjo la pérdida
del azúcar glicosilante en la posición 3 de la molécula y apertura de anillo, con
la consecuente producción de chalconas incoloras. Se señaló anteriormente
que el mejor RAT se obtuvo para el mínimo tiempo de extracción considerado.
Esto podría deberse a que se alcanzó el equilibrio entre la fase sólida y la fase
líquida. También podría deberse a que a partir de ese mínimo tiempo, el ritmo
de extracción de las antocianinas se vio contrarrestado con una mayor
degradación de las mismas, producido por el ataque nucleofílico del agua al
catión flavilio y la formación de compuestos incoloros.
iv
y las condiciones que favorecen el crecimiento de las levaduras
Saccharomyces cerevisiae. La combinación óptima de dichos factores obtenida
en este trabajo fue la señalada anteriormente.
v
de 5°C para que la velocidad de degradación de esto s pigmentos-antioxidantes
fuera lo más baja posible.
vi
impregnado en los cubos de melón, que aumentó con el grado de
desgasificación; mientras que la porosidad efectiva manifestó una alta eficacia
del proceso de IV especialmente a 53 mbar. La concentración de AT en los
cubos de melón impregnado con EA a 210, 130 y 53 mbar, respectivamente,
fue: 3.9, 7.1 y 13.9 mg cianidina-3-glucósido/100g melón. Por lo tanto, la
impregnación de cubos de melón con EA, mediante la técnica de IV, fue mejor
a presión de vacío de 53 mbar.
vii
SUMMARY
The objective of this PhD thesis was to study the extraction process of
anthocyanins from fresh blueberries and to analyze the use of the extracts in
food products formulation.
viii
have caused glycoside sugar loss at position 3 of the molecule and ring opening
with subsequent production of colourless chalcone. The best ATY was obtained
with the minimum time extraction. This may be attributed either to a solid-liquid
phases equilibrium or to the counteractive effect of anthocyanin degradation on
the anthocyanin extraction rate occurrence caused by water nucleuphilic attack
on the flavylium cation forming colourless compounds.
The two series of assays showed that the best conditions for anthocyanin
extraction were: acidified ethanol with citric acid (1 %) as extractant, 1:3 kg/kg
as raw material / extraction solvent rate, temperature 36 ± 1 ºC and extraction
time of 2 h.
x
results showed that anthocyanin degradation rate increased with temperature
rise during heating as well as during storage experiments. In general, all
experimental data fit adequately to first-order kinetics. Although anthocyanins
obtained by solid-liquid extraction were more stable than those extracted by
fermentation during temperature assays, both extracts were temperature
susceptible. Therefore, results suggest that these extracts could be used for
products that require low temperature and short time heat treatments. With
regard to storage conditions of extracts, 5 ºC should be the adequate
temperature to keep degradation rate of the antioxidant pigments as low as
possible
xi
volume during the atmospheric pressure stage. Consequently, pore volume
increased compared to the initial value and a significant impregnation of melon
cubes with AE was observed. These values were higher as the vacuum in the
impregnation chamber increased during stage 1. Regarding to the global
process, a large amount of AE impregnating melon cubes was observed, and
increased with the degree of degasification. In addition, effective porosity
demonstrated the IV process efficacy particularly at 53 mbar. The AT
concentration in AE impregnated melon cubes at 210, 130 and 53 mbar, was
3.9, 7.1 and 13.9 mg cianidyn-3-glucoside/100g melon, respectively. Therefore,
AE melon cubes impregnation using IV methodology showed the best response
to vacuum pressure at 53 mbar.
xii
RESUM
Les antocianines són flavonoides responsables del color dels fruits del
nabiu. Aquests compostos són interessants per l’impacte que tenen sobre les
característiques sensorials dels aliments, ja que es poden utilitzar com a
colorants alimentaris naturals. A més, a causa de la seua elevada activitat
antioxidant, presenten beneficis potencials per a la salut.
xiii
L’augment del RAT amb l’increment de la temperatura fins a 36,6 ºC podria ser
causat perquè l’elevació de la temperatura estaria afavorint l’extracció en
augmentar la solubilitat dels antocians i el coeficient de difusió. No obstant això,
per a temperatures superiors, les antocianines extretes es van degradar,
possiblement perquè l’efecte de la calor va produir la pèrdua del sucre glicosilat
en la posició 3 de la molècula i l’obertura d’anell, amb la conseqüent producció
de calcones incolores. Anteriorment, es va assenyalar que el millor RAT es va
obtenir per al mínim temps d’extracció considerat. Això podria ser causat pel fet
que es va aconseguir l’equilibri entre la fase sòlida i la fase líquida. També
podria haver-se degut al fet que a partir d’aquest mínim temps, el ritme
d’extracció de les antocianines es va veure contrarestat amb una major
degradació d’aquestes, produïda per l’atac nucleofílic de l’aigua al catió flavili i
la formació de compostos incolors.
xiv
d’antocianines entre les partícules de nabius i el solvent, i després va disminuir
a causa del deteriorament de les antocianines.
xv
creixement dels llevats Saccharomyces cerevisiae. La combinació òptima
d’aquests factors obtinguda en aquest treball és l’assenyalada anteriorment.
xvi
En conclusió respecte al mètode d’extracció, l’extracció sòlid-líquid va
ser més adequada a causa de la major senzillesa i rapidesa del procés, el
rendiment més elevat i la major estabilitat de les antocianines.
Posteriorment a l’extracte obtingut en les condicions òptimes (extracció sòlid-
líquid, agent extractor etanol acidificat amb àcid cítric a l’1%, proporció matèria
primera/solvent d’extracció 1:3 kg/kg, temperatura de 36±1ºC i temps
d’extracció de 2 h), va ser sotmès a una doble concentració. Aquest concentrat
(EA) es va utilitzar per a la impregnació al buit (IV) de cubs de meló. L’operació
d’IV es va realitzar en 2 etapes: etapa 1 o etapa de buit o pressió reduïda (IV1)
i etapa 2 o etapa a pressió atmosfèrica (IV2). En la primera etapa es van
realitzar 3 experiències diferents utilitzant diferents pressions de buit: 210, 130 i
53 mbar, durant 10 minuts (t1) a 25°C en cada cas, amb el propòsit d’avaluar
l’efecte de la pressió reduïda sobre la concentració d’antocianines totals en els
cubs de meló impregnats; mentre que en la segona etapa, el conjunt cubs de
meló - EA es va sotmetre a pressió atmosfèrica durant 10 minuts (t2) a 25°C. La
resposta de l’IV es va quantificar en termes de: fracció volumètrica (X),
deformació volumètrica (γ), porositat efectiva (εi) i concentració d’antocianines
totals (AT). En l’etapa de buit es va observar una important disminució del
volum dels cubs de meló. Aquesta resposta fou major a 130 i 53 mbar. S’hi van
obtenir valors negatius de fracció volumètrica, que estarien indicant una eixida
de líquid natiu des dels espais intercel·lulars i extracel·lulars produïts durant
l’expansió del gas oclòs. Aquesta transferència de massa va ser major a les
pressions de 130 i 53 mbar. Durant l’etapa a pressió atmosfèrica va haver-hi un
augment del volum de les mostres, per tant el volum dels porus es va
incrementar respecte al seu valor inicial. S’observà una important impregnació
dels cubs de meló amb l’EA, que va ser major a mesura que va augmentar el
buit produït en la cambra d’impregnació durant la primera etapa. Respecte al
procés global, es va observar una elevada quantitat d’EA impregnat en els cubs
de meló, que va augmentar amb el grau de desgasificació; mentre que la
porositat efectiva va manifestar una alta eficàcia del procés d’IV especialment a
53 mbar. La concentració d’AT en els cubs de meló impregnat amb EA a 210,
130 i 53 mbar, respectivament, va ser 3,9, 7,1 i 13,9 mg cianidina-3-glucòsid /
xvii
100 g meló. Per tant, la impregnació de cubs de meló amb EA mitjançant la
tècnica d’IV va ser millor a la pressió de buit de 53 mbar.
xviii
ÍNDICE
Índice
ÍNDICE DE CONTENIDOS
I. INTRODUCCIÓN 1
I.1. El arándano 2
I.1.1. Taxonomía 2
I.1.2. El fruto 3
I.2.2.1. pH 15
I.2.2.2. Temperatura 17
I.2.2.3. Agua 19
I.2.2.4. Copigmentación 19
I.2.2.5. Oxígeno 23
I.2.2.6. Luz 24
II
Índice
II. OBJETIVOS 46
III
Índice
III.6.2 pH 90
IV
Índice
V
Índice
V. CONCLUSIONES 184
VI
Índice
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura I.1. Cultivo de arándano de la provincia de Entre Ríos,
3
Argentina
VII
Índice
VIII
Índice
IX
Índice
X
Índice
XI
Índice
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I.1. Composición del arándano 5
XII
Índice
XIII
Índice
XIV
NOMENCLATURA
Nomenclatura
AT Antocianinas totales
mg cyn-3-
ATarándanos Concentración de antocianinas totales en los
gluc./100g
ó ATa arándanos
arándano
mg cyn-3-
ATEDA Antocianinas totales presentes en el EDA
gluc./100gEDA
mg cyn-3-
C Concentración de antocianinas al tiempo t
gluc./100mL
mg cyn-3-
C0 Concentración inicial de antocianinas
gluc./100 mL
XVI
Nomenclatura
DW Durbin-Watson
XVII
Nomenclatura
metodología de extracción.
FD Factor de dilución
IV Impregnación a vacío
LI Líquido de impregnación
XVIII
Nomenclatura
Ma Masa de arándanos g
pH Potencial de hidrógeno
XIX
Nomenclatura
r Relación de compresión
r Coeficiente de correlación
R2 Coeficiente de determinación
T Temperatura °C ó K
XX
Nomenclatura
TM Toma de muestra
x Variable independiente
XXI
Nomenclatura
β0 Ordenada en el origen
β1 Pendiente
ΔA Cambio en la absorbancia
XXII
Nomenclatura
εa Error aleatorio
XXIII
I. INTRODUCCIÓN
I. Introducción
I.1. El arándano
I.1.1. Taxonomía
2
I. Introducción
I.1.2. El fruto
El fruto del arándano es una baya casi esférica, que según la especie y
cultivar, puede variar en tamaño, de 0.7 a 1.5 centímetros de diámetro, y en
color, desde azul claro hasta negro (Figura I.2).
La epidermis del fruto está cubierta por secreciones cerosas, que le dan
una terminación muy atractiva, lo que tiene gran importancia a la hora de su
comercialización.
3
I. Introducción
Los arándanos maduros tienen una vida poscosecha muy corta. Para
prolongarla se requiere controlar la temperatura y la humedad de
almacenamiento. Así, para la comercialización en fresco no deben ser
expuestos a temperaturas superiores a 10°C y, prefe riblemente, deben
almacenarse entre -0.5 y 0°C con una humedad relati va de 90-95% (Nunes,
2008; Kader 2002). En estas condiciones tienen una vida útil de
aproximadamente 1 mes.
4
I. Introducción
Tabla I.1. Composición del arándano (Nunes, 2008; Pritts y Hancock, 1992).
5
I. Introducción
NEA: 1150 ha
NOA: 1250 ha
Buenos Aires: 600 ha
Otras: 100 ha
7
I. Introducción
8
I. Introducción
9
I. Introducción
10
I. Introducción
11
I. Introducción
12
I. Introducción
14
I. Introducción
I.2.2.1. pH
-H
HO O O O HO O
OR2 OR2 OR
2
Figura I.8. Estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH. Dónde R1= H o glúcido, R2 y R3= H o metilo
(Castañeda-Ovando et al., 2009a).
16
I. Introducción
I.2.2.2. Temperatura
18
I. Introducción
I.2.2.3. Agua
I.2.2.4. Copigmentación
existen en las células de las flores, frutas y berries (Rein, 2005). Los
copigmentos pueden ser flavonoides, polifenoles, alcaloides, aminoácidos,
ácidos orgánicos y grupos acilo aromáticos, entre otros (Sari et al., 2012; Lewis
y Walker, 1995).
21
I. Introducción
22
I. Introducción
I.2.2.5. Oxígeno
23
I. Introducción
I.2.2.6. Luz
24
I. Introducción
26
I. Introducción
sus potenciales beneficios a la salud (Aguilera Ortíz et al., 2011; Bridgers et al.,
2010; Castañeda-Ovando et al., 2009a). De hecho, el empleo de antocianinas
como colorantes se encuentra contemplada en el Código Alimentario Argentino
(2012), como así también en la lista de colorantes alimentarios autorizados en
la Unión Europea (Astiasarán et al., 2003).
27
I. Introducción
29
I. Introducción
30
I. Introducción
31
I. Introducción
dC (I.1)
Nୗ D
dz
Dónde:
NS - A dt k L (Ci - Cd )
dM (I.2)
Dónde:
t: Tiempo en s.
33
I. Introducción
34
I. Introducción
7:1) y tamaño de partícula (<0.5 mm, entre 0.5 y 0.75 mm y >0.75 mm) en la
extracción de aceite a partir de semillas de una planta nativa de América
Central denominada Jatropha (Jatropha curcas l). La cantidad de aceite
extraído aumentó con el incremento de la temperatura hasta los 68°C debido a
que aumentó el coeficiente de difusión y la solubilidad del aceite en el solvente
de extracción. Sin embargo, por encima de esta temperatura disminuyó la
cantidad de aceite extraído, lo que fue atribuido a la evaporación del solvente
utilizado, que fue hexano. También hubo una mayor cantidad de aceite extraído
a medida que aumentó el tiempo de extracción hasta aproximadamente un
tiempo de 8 h. A tiempos mayores no observaron un aumento significativo en la
extracción. Esta última se vio favorecida con el aumento de la proporción
solvente/sólido hasta la relación 6:1. El gradiente de concentración entre el
sólido y la fase líquida favoreció la transferencia de masa en ese sentido. Sin
embargo, una mayor proporción solvente/sólido no mejoró de forma
significativa el rendimiento de la extracción. En cuanto al tamaño de partícula,
la mayor extracción se observó cuando éste estuvo comprendido entre 0.5 y
0.75 mm. Partículas más grandes tienen menor área superficial de contacto por
lo que ofrecen mayor resistencia a la entrada de solvente y a la difusión del
aceite. Esto hizo que fuera menor la cantidad de aceite transferido desde el
interior de las partículas al seno del solvente. Por su parte, para las partículas
demasiado pequeñas (<0.5 mm), si bien ofrecieron una mayor área de
transferencia, no se observó un aumento en la extracción, lo que fue atribuido a
la aglomeración de partículas finas, provocando una reducción del área
superficial efectiva disponible para el libre flujo del solvente al sólido.
35
I. Introducción
36
I. Introducción
37
I. Introducción
38
I. Introducción
39
I. Introducción
40
I. Introducción
° ° ° (I.3)
Y = β + β x + β x x
41
I. Introducción
(Cortés et al., 2007). Varios investigadores han utilizado esta técnica para
obtener diferentes productos, por ejemplo batatas enriquecidas con ácido
ascórbico (Hironaka et al., 2011), hongos enriquecidos con calcio, selenio y
vitamina C (Cortés et al., 2007); cáscaras de naranja enriquecidos con potasio,
sodio y vitaminas B1, B6 y B9 (Restrepo Duque et al., 2012); apio fortificado
con vitamina E (Martelo Castaño et al., 2011) o mango fortificado con calcio
(Ostos et al., 2012).
42
I. Introducción
43
I. Introducción
44
I. Introducción
45
II. OBJETIVOS
II. Objetivos
47
II. Objetivos
48
III. MATERIALES Y MÉTODOS
III. Materiales y Métodos
50
III. Materiales y Métodos
51
III. Materiales y Métodos
52
III. Materiales y Métodos
Lavado
Escurrido
Pesado
Extracción sólido-
Extracción de
líquido de
antocianinas por
antocianinas
fermentación (EAF)
(ESLA)
TM TM Antocianinas totales, AT EDA
Antocianinas totales, AT EDA
Extracto diluído de Extracto diluído de Rendimiento de extracción
Rendimiento de extracción de
antocianinas (EDA) antocianinas (EDA) de antocianinas totales, RAT
antocianinas totales, RAT
Determinación de Determinación de
las mejores las mejores
condiciones de condiciones de
extracción extracción
EDA obtenido en las mejores condiciones de extracción EDA obtenido en las mejores condiciones de extracción
Concentración Concentración
Extracto de
Antocianinas totales, C0 Extracto de Antocianinas totales, C0
antocianinas
Fenoles totales TM antocianinas TM Fenoles totales
obtenido por
Actividad antioxidante obtenido por Actividad antioxidante
extracción sólido-
pH fermentación (EF) pH
líquido (ESL)
Comparación de
las dos
metodologías de
extracción
Extracto de
antocianinas
(EA)
53
III. Materiales y Métodos
54
III. Materiales y Métodos
55
III. Materiales y Métodos
56
III. Materiales y Métodos
57
III. Materiales y Métodos
Extracción de
antocianinas
Factores:
Primera serie de experiencias
Temperatura: 16-44°C
pH: 2.4-6.6
Factores:
Temperatura: 3-87°C Determinación de las mejores
pH: 1.8-5.2 condiciones de temperatura y
Tiempo de extracción: 1.0-6.0 h pH que posibilitaron maximizar
el RAT por medio de la MRS
Factores:
58
III. Materiales y Métodos
59
III. Materiales y Métodos
Temperatura Tiempo
Bloque pH
(°C) (h)
1 45 3.5 1.0
1 87 3.5 3.5
1 70 2.5 2.0
1 20 2.5 5.0
1 45 3.5 3.5
1 45 3.5 6.0
1 45 3.5 3.5
1 3 3.5 3.5
1 20 4.5 2.0
1 70 4.5 2.0
1 45 1.8 3.5
1 45 3.5 3.5
1 45 5.2 3.5
1 20 2.5 2.0
1 70 4.5 5.0
1 20 4.5 5.0
1 70 2.5 5.0
2 45 3.5 1.0
2 87 3.5 3.5
2 70 2.5 2.0
2 20 2.5 5.0
2 45 3.5 3.5
2 45 3.5 6.0
2 45 3.5 3.5
2 3 3.5 3.5
2 20 4.5 2.0
2 70 4.5 2.0
2 45 1.8 3.5
2 45 3.5 3.5
2 45 5.2 3.5
2 20 2.5 2.0
2 70 4.5 5.0
2 20 4.5 5.0
2 70 2.5 5.0
60
III. Materiales y Métodos
61
III. Materiales y Métodos
62
III. Materiales y Métodos
63
III. Materiales y Métodos
Proporción
Tiempo
Bloque materia prima /
(h)
solvente
1 3.5 1:0.4
1 2.0 1:2.5
1 2.0 1:0.4
1 0.5 1:2.5
1 0.5 1:0.4
1 3.5 1:4.6
1 2.0 1:4.6
1 0.5 1:4.6
1 3.5 1:2.5
1 2.0 1:2.5
1 2.0 1:2.5
2 3.5 1:0.4
2 2.0 1:2.5
2 2.0 1:0.4
2 0.5 1:2.5
2 0.5 1:0.4
2 3.5 1:4.6
2 2.0 1:4.6
2 0.5 1:4.6
2 3.5 1:2.5
2 2.0 1:2.5
2 2.0 1:2.5
Temperatura
Bloque pH
(ºC)
1 30 4.5
1 30 4.5
1 40 3.0
1 30 4.5
1 44 4.5
1 20 3.0
1 16 4.5
1 40 6.0
1 30 2.4
1 20 6.0
1 30 6.6
2 30 4.5
2 30 4.5
2 40 3.0
2 30 4.5
2 44 4.5
2 20 3.0
2 16 4.5
2 40 6.0
2 30 2.4
2 20 6.0
2 30 6.6
65
III. Materiales y Métodos
25 y 30°C y dejan de crecer entre los 35-47°C; mien tras que el pH que favorece
su desarrollo es 4.0-4.5 y tienen escaso desarrollo en medio alcalino (Pitt y
Hocking, 2009).
66
III. Materiales y Métodos
pH: 1.8, 2.5, 3.5, 4.5 y 5.2. El ajuste de dichos valores se realizó
con ácido cítrico o hidróxido de sodio utilizando pH-metro Crison
Instruments S.A. modelo GLP 21-22 (España)
67
III. Materiales y Métodos
Arándano triturado
Saccharomyces
Inoculación
cerevisiae
Incubación
Inóculo
69
III. Materiales y Métodos
Arándano triturado
Acondicionamiento del
Sacarosa
sustrato
Inóculo Inoculación
Fermentación
Centrifugación Residuo
Extracto diluído de
antocianinas (EDA)
70
III. Materiales y Métodos
Energía de activación, Ea
72
III. Materiales y Métodos
C = C − k t (III.1)
C = C e ⇒ ln C = ln C − k t (III.2)
Dónde:
73
III. Materiales y Métodos
C
t/ = (III.3)
2 k
74
III. Materiales y Métodos
C
ln C − ln 2 ln 2 0.693
t/ = = = (III.4)
k k k
k
Q =
k (III.5)
75
III. Materiales y Métodos
Dónde:
k
: constante de velocidad a una temperatura 10°C may or, (h-1).
k = k e
(III.6)
Donde:
76
III. Materiales y Métodos
Ea
ln k = ln k − (III.7)
R T
77
III. Materiales y Métodos
Dónde:
78
III. Materiales y Métodos
+
ా ∗
en el origen ([ln ) se obtuvo ΔS∗ .
79
III. Materiales y Métodos
Dónde:
T: Temperatura (K)
80
III. Materiales y Métodos
Para el estudio se utilizaron melones del tipo Rocío de Miel obtenidos del
mercado local, que se cortaron en cubos de 2 cm de lado.
81
III. Materiales y Métodos
esperar que se produzca un arrastre de parte del líquido extracelular. Una vez
equilibradas las presiones (interior de los poros y exterior a la muestra) se
produciría una entrada parcial del EA en el interior de los poros como
consecuencia de la presión capilar (Fito et al., 1996).
Mi, Vi
Dónde:
Mi, Vi
Dónde:
84
III. Materiales y Métodos
85
III. Materiales y Métodos
(III.13)
X = X − X
Dónde:
86
III. Materiales y Métodos
87
III. Materiales y Métodos
ΔV V − V
γ = = (III.14)
V V
ΔV V − V
γ = = (III.15)
V V
γ = γ − (III.16)
Dónde:
88
III. Materiales y Métodos
X
ε = (III.17)
1
1−
r
Dónde:
r: Relación de compresión
89
III. Materiales y Métodos
III.6.2. pH
90
III. Materiales y Métodos
0.4 M ajustado con ácido acético. A una alícuota (entre 50 y 300 µL) de EDA se
le agregaron 5 mL de solución tampón de cloruro de potasio (pH 1.0) y se midió
la absorbancia a 510 nm (longitud de onda de máxima absorción de
antocianinas) con un espectrofotómetro Shimadzu, UV-VISIBLE, modelo UV-
1603 (Japón). Para la realización de la medida, la muestra se diluyó de forma
tal que a pH 1.0 tuviera una absorbancia comprendida en el rango de 0.1 a 1.0.
mg ΔA PM FD 1000
AT = (III.20)
L ε l
Dónde:
91
III. Materiales y Métodos
92
III. Materiales y Métodos
93
III. Materiales y Métodos
Como fenol de referencia se utilizó ácido gálico, por lo que se realizó una
curva de calibrado de cinco puntos a las concentraciones de 2.5, 10, 20, 30 y
50 mg ácido gálico/100 mL. Para medir la absorbancia de la curva de calibrado,
se mezcló 50 µL de cada solución patrón con el reactivo de Folin-Ciocalteu, la
solución de carbonato de sodio al 20% y el agua ultra pura en las cantidades y
de acuerdo al procedimiento señalado anteriormente para los extractos. Cada
punto de la curva de calibrado se realizó por triplicado.
94
III. Materiales y Métodos
95
III. Materiales y Métodos
96
III. Materiales y Métodos
MEDA ATEDA
RAT (%)
100 (III.21)
Ma ATa
Dónde:
97
III. Materiales y Métodos
C − C
Degradación % = . 100 (III.22)
C
Dónde:
98
III. Materiales y Métodos
99
III. Materiales y Métodos
100
III. Materiales y Métodos
101
III. Materiales y Métodos
Y = β + β x + ε (III.23)
102
III. Materiales y Métodos
Dónde:
ε : Error aleatorio
Para ver con qué bondad el modelo explicó la relación entre x (tiempo) e
Y (C o ln C) se evaluaron una serie de hipótesis y criterios de calidad de ajuste,
según se describe a continuación (Gutiérrez Pulido y Vara Salazar, 2008).
H0: β1= 0
HA: β1≠ 0
103
III. Materiales y Métodos
Los buenos modelos son aquellos que cumplen más criterios de calidad
del ajuste. Siempre existirán circunstancias en las que, al no cumplirse alguno
de los criterios, desde el punto de vista práctico no necesariamente harán
inviable el modelo. Otro aspecto a tomar en cuenta es que bajo calidad similar
en el ajuste de dos modelos, siempre se deberá preferir el más sencillo
(Gutiérrez Pulido y Vara Salazar, 2008). El modelo cinético seleccionado fue el
que mejor cumplió los criterios mencionados.
105
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV. Resultados y Discusión
107
IV. Resultados y Discusión
108
IV. Resultados y Discusión
(IV.1)
Dónde:
T: Temperatura (ºC)
110
IV. Resultados y Discusión
Las Figuras IV.3 y IV.4 muestran las estimaciones del RAT en función
del pH y el tiempo de extracción para una temperatura constante de 36.6°C.
Así, se puede observar que para un pH constante de 2.12, el RAT fue mayor al
menor tiempo de extracción. Esto puede deberse a que, para el mínimo tiempo
de extracción considerado, 1 h, se alcanzó el equilibrio entre la fase sólida y la
fase líquida (Ibarz y Barbosa–Cánovas, 2005). Otra posibilidad es que a partir
de ese mínimo tiempo el ritmo de extracción de las antocianinas se vio
contrarrestado con una mayor degradación de las mismas, probablemente por
el ataque nucleofílico del agua al catión flavilio, formando compuestos incoloros
(Kopjar et al., 2011).
111
IV. Resultados y Discusión
112
IV. Resultados y Discusión
113
IV. Resultados y Discusión
114
IV. Resultados y Discusión
115
IV. Resultados y Discusión
116
IV. Resultados y Discusión
117
IV. Resultados y Discusión
118
IV. Resultados y Discusión
Dónde:
119
IV. Resultados y Discusión
120
IV. Resultados y Discusión
Figura IV.8. Contornos de la superficie del RAT estimado en función del tiempo
de extracción y la proporción de materia prima / solvente en la segunda serie
de experiencias de ESLA.
121
IV. Resultados y Discusión
122
IV. Resultados y Discusión
123
IV. Resultados y Discusión
RAT 124.86
5.62 T
45.12 pH 0.1017 T ଶ 5.37 pH ଶ (IV.3)
Dónde:
T: Temperatura (°C)
124
IV. Resultados y Discusión
125
IV. Resultados y Discusión
126
IV. Resultados y Discusión
127
IV. Resultados y Discusión
ESLA:
Tiempo de extracción: 2 h.
EFA:
Tiempo: 72 h,
Temperatura: 28±1ºC,
pH= 4.2.
128
IV. Resultados y Discusión
En una misma columna, letras diferentes indican que el análisis de varianza (ANOVA) señaló
diferencias significativas entre las medias de los extractos para un p-valor inferior a 0.05.
129
IV. Resultados y Discusión
En una misma columna, letras diferentes indican que el análisis de varianza (ANOVA) señaló
diferencias significativas entre las medias de los extractos para un p-valor inferior a 0.05.
130
IV. Resultados y Discusión
ESLA EAF
Complejidad de la
Más sencilla Menos sencilla
metodología
Concentración del EDA Más sencilla Menos sencilla
Tiempo requerido 2h 72 h
Rendimiento de la
57% 49%
extracción
ESL EF
Antocianinas totales 137.2±7.5 mg/100 mL 126.2±8.9 mg/100 mL
1424±67 mgGAE/100 2955±101 mg GAE/100
Fenoles totales
mL mL
131
IV. Resultados y Discusión
132
IV. Resultados y Discusión
133
IV. Resultados y Discusión
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
150
120
90
60
30
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
150
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
120
90
60
30
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
134
IV. Resultados y Discusión
135
IV. Resultados y Discusión
150
90
60
30
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
ESL EF
150
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
120
90
60
30
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
ESL EF
136
IV. Resultados y Discusión
150
90
60
30
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
ESL EF
150
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
120
90
60
30
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
ESL EF
137
IV. Resultados y Discusión
138
IV. Resultados y Discusión
150
120
90
C
60
30
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
VE(55°C) VE(65°C) VE(75°C) VE(85°C)
M(55°C) M(65°C) M(75°C) M(85°C)
140
110
C
80
50
20
-10 0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
VE(55°) VE(65°C) VE(75°C) VE(85°C)
M(55°C) M(65°C) M(75°C) M(85°C)
139
IV. Resultados y Discusión
140
IV. Resultados y Discusión
5,0
4,5
4,0
3,5
ln C
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
VE(55°C) VE(65°C) VE(75°C) VE(85°C)
M(55°C) M(65°C) M(75°C) M(85°C)
5,0
4,5
4,0
3,5
ln C
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
VE(55°) VE(65°C) VE(75°C) VE(85°C)
M(55°C) M(65°C) M(75°C) M(85°C)
141
IV. Resultados y Discusión
142
IV. Resultados y Discusión
Para evaluar cuál de los modelos (orden cero y orden uno) es el que
mejor describió la degradación de antocianinas en función del tiempo de
calentamiento, se realizó un análisis de regresión y se obtuvieron y analizaron
los criterios de calidad del ajuste, según se explicó en el apartado III.7.3.
Tabla IV.10. Ajuste de los modelos de orden cero y uno para el ESL a distintas
temperaturas de calentamiento.
Orden Temp. p-valor
r MEA
modelo (°C) DW
0 55 - 0.98 3.94 0.1439
0 65 - 0.93 6.52 0.0540
0 75 - 0.94 10.04 0.0028
0 85 - 0.94 10.35 0.0084
1 55 - 0.95 0.05 0.1691
1 65 - 0.96 0.06 0.4423
1 75 - 0.99 0.07 0.0177
1 85 - 0.99 0.06 0.1673
143
IV. Resultados y Discusión
Para el modelo de orden cero las MEA fueron elevadas y los p-valor DW
únicamente mostraron independencia de los residuos a 55°C (> 0.05) (Tabla
IV.11), no así a las demás temperaturas ensayadas. Para el modelo de orden
uno las MEA obtenidas fueron bajas, sin embargo los p-valor DW señalaron
independencia de los residuos a 55 y 65°C, no así p ara 75 y 85°C.
144
IV. Resultados y Discusión
Tabla IV.11. Ajuste de los modelos de orden cero y uno para el EF a distintas
temperaturas de calentamiento.
Orden Temp. p-valor
r MEA
modelo (°C) DW
0 55 - 0.76 10.81 0.0528
0 65 - 0.85 9.88 0.0201
0 75 - 0.76 21.24 0.0214
0 85 - 0.73 21.63 0.0300
1 55 - 0.90 0.10 0.0582
1 65 - 0.93 0.14 0.0616
1 75 - 0.95 0.22 0.0255
1 85 - 0.97 0.17 0.0276
145
IV. Resultados y Discusión
146
IV. Resultados y Discusión
147
IV. Resultados y Discusión
148
IV. Resultados y Discusión
Los valores más altos del Q10 en el ESL y en el EF fueron obtenidos para
el intervalo de 65 y 75°C (Tabla IV.14), indicando que en este rango de
temperatura fue cuando más aumentó la cinética de degradación de las
antocianinas al aumentar la temperatura (Pereira Kechinsky et al., 2007). Entre
75 y 85°C el incremento de la velocidad de degradac ión fue menor en los dos
extractos.
149
IV. Resultados y Discusión
150
IV. Resultados y Discusión
1/T (1/K)
-4
2,7 2,8 2,9 3,0 3,1
-6
ln k
-8
-10
EF ESL
Letras diferentes indica que el ANOVA señaló diferencias significativas entre las medias de la
Ea del ESL y el EF para un p-valor inferior a 0.05.
151
IV. Resultados y Discusión
Sin embargo, la Ea fue mayor en el EF, lo que estaría indicando que una vez
que las moléculas de antocianinas, presentes en éste, han logrado alcanzar la
Ea, el deterioro de estos pigmentos-antioxidantes ocurrió más rápido que en el
ESL; es decir que la degradación de antocianinas en el ESL fue menos
sensible a la elevación de la temperatura que las presentes en el EF (Wang y
Xu, 2007; Pereira Kechinski et al., 2010). Quizá el menor deterioro de las
antocianinas presentes en el ESL se debió a su menor valor de pH, ejerciendo
éste un efecto protector sobre la estructura de las antocianinas (Jenshi Roobha
et al., 2011) al disminuir las posibilidades de ataque nucleofíco de agua para
convertirlo en la base carbinol (incolora).
152
IV. Resultados y Discusión
1/T
-10
0,0027 0,00279 0,00288 0,00297 0,00306
-11
ln(k/T)
-12
-13
-14
ESL EF
153
IV. Resultados y Discusión
IV.16), por lo que la energía requerida para que se inicie el deterioro de las
antocianinas, en el ESL y en el EF, fue similar para ambos extractos.
Letras diferentes en una misma columna indican que el análisis de varianza (ANOVA) señaló
diferencias significativas entre las medias de los parámetros para un p-valor inferior a 0.05.
155
IV. Resultados y Discusión
156
IV. Resultados y Discusión
150
90
60
30
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
5°C 25°C
150
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
120
90
60
30
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
5°C 25°C
157
IV. Resultados y Discusión
150
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
120
90
60
30
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
ESL EF
158
IV. Resultados y Discusión
150
C (mg cianidina-3-glucósido/100mL)
120
90
60
30
0
0 50 100 150 200 250
Tiempo (días)
ESL EF
160
IV. Resultados y Discusión
150
120
90
C
60
30
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
150
120
90
C
60
30
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
162
IV. Resultados y Discusión
5,0
ln C 4,5
4,0
3,5
3,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
5,0
4,5
ln C
4,0
3,5
3,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tiempo (días)
164
IV. Resultados y Discusión
Para evaluar cuál de los modelos (orden cero y orden uno) es el que
mejor describió la degradación de antocianinas en función del tiempo de
almacenamiento se realizó un análisis de regresión y se obtuvieron y
analizaron los criterios de calidad del ajuste, según se explicó en el apartado
III.7.3.
165
IV. Resultados y Discusión
Tabla IV.19. Ajuste de los modelos de orden cero y uno para el ESL a distintas
temperaturas de almacenamiento.
Orden Temp. p-valor
r MEA
modelo (°C) DW
0 5 - 0.97 2.18 0.9328
0 25 - 0.95 4.59 0.5972
1 5 - 0.97 0.02 0.9321
1 25 - 0.94 0.04 0.2013
Tabla IV.20. Ajuste de los modelos de orden cero y uno para el EF a distintas
temperaturas de almacenamiento.
Orden Temp.
r MEA p-valor DW
modelo (°C)
0 5 - 0.81 9.82 0.1305
0 25 - 0.72 13.09 0.0607
1 5 - 0.93 0.09 0.2629
1 25 - 0.73 0.15 0.1255
166
IV. Resultados y Discusión
Temperatura
k ESL k EF
(°C)
5 0.0007 ± 0.0001 a A 0,0019 ± 0.0001 a B
25 0.0018 ± 0.0001 b A 0,0021 ± 0.0001 b B
Letras minúsculas diferentes en una misma columna indican que el análisis de varianza
(ANOVA) señaló diferencias significativas entre las medias de k a 5 y 25°C para un mismo
extracto, mientras que letras mayúsculas distintas en una misma fila señalan diferencias entre
las medias de k de ESL y EF para una misma temperatura (p-valor < 0.05).
167
IV. Resultados y Discusión
En cuanto al análisis del tiempo de vida media, (t1/2), del ESL a las
temperaturas estudiadas, se observó que a 5°C el pr oducto tuvo un deterioro
2.5 veces menor que a 25°C (Tabla IV.22). Resulta i nteresante observar la
marcada diferencia en el tiempo de vida media de los extractos a 5°C, mientras
en el ESL este tiempo fue de 990 días, en el EF fue de 265 días. A 25°C el ESL
tuvo un tiempo de vida media 1.42 veces superior al del EF.
168
IV. Resultados y Discusión
169
IV. Resultados y Discusión
170
IV. Resultados y Discusión
Materia prima
Lavado
Escurrido
Triturado
Pesado
Extracción
(Solvente: etanol 1% ác cítrico,
MP/S= 1:3, pH= 3.5,
T= 36±1°C, t= 2h)
Centrifugación
(4000 rpm - 20 min)
EDA
Concentración
(T= 59±2ºC)
Concentración
(T= 59 ± 2°C)
EA
Almacenamiento
(T= 5°C)
171
IV. Resultados y Discusión
172
IV. Resultados y Discusión
Estos perfiles fueron bastante similares a los encontrados por You et al.
(2011), quienes analizaron las antocianinas presentes en especies nativas de
arándanos Rabbiteye (Vaccinium virgitatum) de las variedades Powderblue y
Climax, ambas del sudeste de EE.UU y provenientes de cultivo orgánico y
convencional. Las antocianinas predominantes fueron cianidina-3-galactósido,
malvinidina-3-galactósido, petunidina-3-glucósido, malvinidina-3-glucósido y
peonidina-3-galactósido. La proporción de cada una de ellas dependió de la
variedad y del tipo de cultivo.
173
IV. Resultados y Discusión
175
IV. Resultados y Discusión
177
IV. Resultados y Discusión
X2 (%) 14 ± 1 a 20 ± 1 b 29 ± 1 c
X (%) 13 ± 1 a 18 ± 2 b 26 ± 3 c
εe (%) 17 ± 1 a 21 ± 1 b 27 ± 1 c
Letras diferentes en una misma fila indican que el análisis de varianza (ANOVA) señaló
diferencias significativas entre las medias de las respuestas para un p-valor inferior a 0.05.
178
IV. Resultados y Discusión
179
IV. Resultados y Discusión
15
Antocianinas totales (mg/100g)
10
2
5
2
1
1
1
0
0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
X (%)
180
IV. Resultados y Discusión
181
IV. Resultados y Discusión
182
IV. Resultados y Discusión
183
V. CONCLUSIONES
V. Conclusiones
185
V. Conclusiones
186
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