UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA

DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

CUAUTITLÁN

BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

Practica 5: Cromatografía en Capa Fina y

Cromatografía en Columna
EQUIPO 2:

Arellano Alvarado Nisandaya

Gloria Chacón Ashley Iveth

Orta Barcenas Carlos Andre

Velázquez Velázquez Emilio Alejandro

1. Objetivo
Los alumnos conocerán y aprenderán qué es la cromatografía y la emplearán como
un método para separar los compuestos presentes en una mezcla; así mismo, la
utilizarán para la purificación y posible identificación de los mismos.
2. Define los siguientes conceptos:
a) Cromatografía:
Cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas utilizadas en la
determinación de la identidad de sustancias, en la separación de componentes de
las mezclas y en la purificación de compuestos. Esta técnica es muy efectiva y
por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigación como a nivel industrial.
b) Fase móvil:
Fase que se está moviendo en una dirección determinada. Puede ser un líquido o
gas. La fase móvil se mueve a través de una columna que lleva la muestra a
separar.
c) Fase estacionaria:
Sustancia que se fija a la columna o en el panel, sobre cuya superficie se separan
las sustancias.
d) Revelador:
Método empleado para la localización de sustancias coloridas e incoloras
(invisibles). Este tipo de metodos puede clasificarse en físicos y químicos. Los
métodos físicos utilizan propiedades particulares de los compuestos, tales como
la fluorescencia y la radioactividad, aunque su aplicación es muy limitada; tal
es el caso de la luz ultravioleta que sólo permite reconocer entidades químicas
que presentan una iluminación característica a longitudes de onda de la luz
emitida larga de (366 nm) o corta de (254 nm). Los métodos químicos hacen
reaccionar a las sustancias por revelar con algún agente químico con el que
forman un compuesto colorido; el revelado con métodos químicos se puede
realizar en uno o varios pasos y en muchas ocasiones es necesario calentar para
completar la reacción.
3. Realiza una tabla que describa las caracteristicas de compuestos que pueden ser
empleados como fase movil y estacionaria, así como ejemplos de sustancias
químicas que pueden utilizarse como fase movil y estacionaria.

Fase Móvil Fase Estacionaria

Sustancias  La fase móvil se elige  Generalmente la fase
tomando en cuenta el estacionaria esta
valor del factor de represnetada por un polvo
retención, el cual debería finamente molido o geles
estar entre .2 y .3 para que demuestran una gran
que se reduzca el tiempo microporosidad, por
y la cantidad del eloyente ejemplo:
utilizado. - Gel de sílice
 Los compuestos deben - Alúmina
ser separados de manera - Polvo de celulosa.
efectiva.
 Se elige a través de
pruebas preeliminares a
escala, normalmente a
través de una
cromatografía en capa
fina.

4. Métodos cromatograficos:
 Cromatografía líquida:
La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria
un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar, o bien un
líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un
sólido. Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos
experimentales: en columna, en capa delgada o en papel.
 Cromatogarfía de gases:
En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase
 estacionaria es un sólido o un líquido “sostenido” por un sólido inerte. Este
tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de
que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del
sistema.
 Cromatogarfía en papel:
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios
para realizar análisis
cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún
tipo de equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por
una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando
pequeñas gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el
disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La
separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las dos
fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó
la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente
llegarán más lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos
procedimientos físicos o químicos.
En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de
papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada
a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, se
forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los
componentes que se pretenden separar.
 Cromatografía en capa fina:
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio,
un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para
aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las
placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas
preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase
estacionaria consiste en un sólido.
 Cromatografía de permeación en gel:
La cromatografía de permeación en gel, también conocida como
cromatografía de exclusión es una variante de la CLAE que consiste en una
columna cromatográfica empacada de tal manera que las partículas de dicho
empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el
fin de que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en
su forma y tamaño y no en el peso molecular.
Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los
poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son
excluidas y eluyen en el volumen de “cama de vacío” de la fase móvil. Por
el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque
tiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de
difusión hacía los poros que tienen accesibles. Las moléculas de tamaños
intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros
por los que puedan pasar.
 Cromatografía de exclusión de iones:
Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de
exclusión, es cuando se realiza para la exclusión de iones. Mediante esta
modificación, se tienen separaciones que dependen de factores como tamaño
de partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución de isómeros.
Esto permite separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo.
Las separaciones se llevan a cabo en resinas de intercambio con base en
poliestireno de alta capacidad como eluyentes, ácidos minerales diluidos.
Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo
de frutas, etc.) o de muestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos
del ciclo de Krebs están presentes, puede ser hecho fácilmente mediante el
uso de una columna de exclusión aniónica. El uso de las columnas de
exclusión aniónica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la
separación de oligosacáridos usando agua como eluyente a una temperatura
de 90ºC, aplicando también la separación por exclusión estérica.
 Cromatografía de intercambio iónico:
 La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de
columna que tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz
polimérica. Los grupos funcionales enlazados permanentemente y asociados
con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más común es
el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el
grupo cargado de la fase estacionaria.
La cromatografía de intercambio iónico puede efectuarse con alguno de los
varios tipos de empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de
resina, alrededor de 1-2m de espesor, sobre una cuenta de vidrio con
diámetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen
recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de sílice
en el que se impregna o enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos
de empaques la capacidad de intercambio es baja: 0.01- 0.1 meq/g.
 Cromatografía de fluidos supercríticos:
La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la
cual no puede existir en la fase líquida independientemente de la presión. La
presión crítica es la presión de vapor de una sustancia a su temperatura
crítica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su
temperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina fluido
supercrítico.
Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades
que son intermedias entre las características de esa sustancia en estado
gaseoso y en estado líquido.
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la
cromatografía de gases, líquidos y fluidos supercríticos, así como la
extracción de fluidos supercríticos. Una propiedad importante de los fluidos
supercríticos, que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5
g/cm3 ), es su notable capacidad para disolver moléculas grandes no
volátiles.
En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas,
aunque las primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son
 similares a las columnas de sílice fundida con recubrimientos internos de
varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas
tienen una longitud de 10 a 20 m y un diámetro interno de 0,05 a 0.10 mm.
El espesor de la película varía entre 0.05 1 micrómetro.
La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente
par un conjunto de moléculas orgánicas no polares. Además, es una
sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no tóxica, fácilmente
disponible y muy barata cuando se compara con otras fases móviles
cromatográficas.
 Cromatografía de afinidad:
La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su
especificidad de fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son
moléculas poliméricas que sirven de soporte porque están unidas
covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de
tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio
de pH, detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber
específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida. Estos ligandos
se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención
de analitos, esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y
generales (como las lecitinas). Cuando las proteínas no específicas se han
lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución que
contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se
desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteración de los sitios activos
inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en
el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones
modifican las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso
es hacer fluir a la proteína para continuar con la regeneración de la columna
cromatográfica.
 Cromatografía de líquidos de alta resolución:
La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de
separación más ampliamente utilizada. Las razones son la sensibilidad, su
 fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la
separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad
a sustancias que son de interés en la industria. Algunos ejemplos son:
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,
fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies
organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es
un líquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero
inoxidable.
5. ¿Cómo preparar una placa para cromatografía fina?
Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa
delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña
cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la parte inferior de la
placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que
sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o
eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad. 
6. ¿Cómo se prepara una columna?
Para preparar una columna, se introduce un absorbente sólido en un tubo cilíndrico
de vidrio o plástico. El tamaño de este tubo dependerá de la cantidad de compuesto
que se aísla. La base del tubo contiene un filtro, ya sea un tapón de algodón o lana
de vidrio, o frita de vidrio que sujete la fase sólida. Un depósito de solvente puede
fijarse a la parte superior de la columna.
7. Tipos de reveladores y ejemplos.
- Luz UV: Si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F25a ó F366), el
número que aparece como subíndice nos indica Ia longitud de onda de
excitación del indicador utilizado.
- La introducción de la placa en vapores de yodo.
- El rocío con una solución de agualH2SOa 1 :1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases). Después
calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero. hasta carbonizar los
compuestos.
8. Propiedades de reactivos y productos.
Las propiedades de las sustancias químicas dependen fundamentalmente de tres
aspectos:el número y tipo de átomos o elementos que las constituyen, de los enlaces
que los unen y de la disposición espacial de los átomos en el espacio.
En las reacciones químicas se producen roturas y formaciones de los enlaces
químicos, por lo que los átomos de reactivos y productos están unidos de forma
diferente, con enlaces diferentes y con posiciones espaciales diferentes. Por ello las
propiedades físicas y químicas de los reactivos y productos son diferentes.
Las propiedades Químicas son las que exhibe la materia cuando experimenta
cambios en su composición, ya sea transformándose en una sustancia nueva por
descomposición o por reacción con otras especies.
9. Diagrama de flujo del proceso experimental ecológico.

10. Referencias.
• (2021). Retrieved 21 March 2022, from
https://labomersa.com/2020/12/15/que-es-cromatografia-y-para-que-sirve/
• General, Q., Científico, P., Materia, L., Atómica, T., Orgánica, Q., & Bases,
Á. et al. (2015). ¿Qué es la Cromatografía? » TP - Laboratorio Químico. Retrieved
21 March 2022, from
https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/procedimientos-
basicos-de-laboratorio/que-es-la-cromatografia.html
• (2021). Retrieved 21 March 2022, from
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
• Propiedades de las reacciones | Química . (2021). Retrieved 21 March 2022,
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http://contenidosdigitales.ulp.edu.ar/exe/quimica/propiedades_de_las_reacciones.ht
ml