UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela profesional de Biología

ASIGNATURA: BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 6 “EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE DNA”

Grupo: Jueves (2:50 – 6:30 p.m.)

Alumno: Cárdenas Condori, Gerardo Sebastián

Docentes: Navarro Oviedo, Ronald Demetrio

Fecha de entrega: 20/10/2022

Arequipa – Perú
2022
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos,
poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-
evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN
con o sin función conocida que proporcionan información sobre la variación
alélica y permiten distinguir individuos. Estos marcadores se obtienen con
técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain
Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la
molécula del ADN con un detalle sin precedentes Los datos moleculares han
permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y
su distribución; el comportamiento; la selección natural; las interacciones
biológicas; la composición, funcionamiento y dinámica de comunidades
microbianas; las relaciones filogenéticas, entre otros. (Velázquez, L.,
Martínez, M., & Romero, A; 2014)
Está más que claro la importancia de esta molécula para la ciencia moderna,
pero nada de esto sería posible sin antes un previo estudio del ADN, como
extraerlo y como purificarlo, sus componentes, como identificarlos y sus
propiedades. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con
la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como
garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el
tratamiento posterior de la molécula, pero los que predominan comparten el
mismo principio, es decir, empiezan con una lisis celular, seguido por una
remoción de proteínas y por último la obtención del DNA de alta pureza por
precipitación etanólica.

2. OBJETIVOS
General
• Purificar DNA de células vegetales
Específicos
• Identificar las bases nitrogenadas del ADN
• Identificar los azucares en el ADN (desoxirribosa y ribosa)
• Identificación del grupo fosfato
3. MATERIALES Y MÉTODOS
EXPERIMENTO N° 1. EXTRACCION DE DNA A PARTIR DE BULBO DE
CEBOLLA
MATERIALES
Solución de lisis
Rallador
Alcohol etílico 95%
Reactivo de difenilamina
Cebolla
Embudo
Filtro
Varilla de metal
MÉTODOS
1. Descascaramos un cebolla de tamaño
medio
2. Rallamos la cebolla con un rallador
común. Es importante que no haya
grandes pedazos de cebolla.
3. Pesamos unos 50 g de cebolla rallada
y adicionamos 100 ml de la solución de
lisis.
4. Dejamos la mezcla a temperatura ambiente por 10 a 20 minutos.
5. Filtramos la suspensión a través de un embudo que contiene algodón, y
recoger el filtrado en una probeta. Anotar el volumen.
6. En un tubo de ensayo colocamos 4 ml del
filtrado. Adicionamos 2 volúmenes de
etanol al 95%, procurando no mezclar las
dos soluciones. Observar en la interface,
la formación de un precipitado
blanquecino. Con la ayuda de una varilla
de vidrio enrollar el material blanquecino.
7. Transferimos el material de la varilla de
vidrio a otro tubo de ensayo y disolverlo en
 0.5 ml deagua. A esta solución, adicionamos 1.5 ml de reactivo de
difenilamina.
8. El filtrado restante (ítem 5) debe
ser transferido a un beaker y a esta
solución se le añade 2 volúmenes
de etanol al 95%. El material
blanquecino formado en la
interface de las dossoluciones
debe ser enrollado en una varilla
de vidrio y transferido a otro tubo
de ensayo.
9. Disolvimos el precipitado en 5 ml de agua con el auxilio de la varilla de
vidrio. Dividir estasolución en dos tubos para observar cambios de
viscosidad en diferentes condiciones.
EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACION DE BASES NITROGENADAS
Método 1) Tomamos 2 ml del extracto de DNA y leeimo su absorbancia en el
espectrofotómetro a 260 nm. Si estaba muy concentrado diluimos en etanol.
Método 2) Agregamos gotas de Hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado
hasta obtener un medio básico y algunas gotas de Nitrato de Plata 0.1 M a una
pequeña cantidad del precipitado obtenido que ha sido colocado en un tubo de
ensayo.

EXPERIMENTO N° 3. IDENTIFICACION DE AZUCARES

MATERIALES
Solución ácida de difenilanima
Ribosa 1%
Reactivo de bial
Tubos de ensayo
Pipetas
Baño maría
Hielo
MÉTODOS
a) Identificación de desoxirribosa
 • Utilizando el reactivo de Dische, tomamos en un tubo de ensayo 2
ml del extracto de DNA,
• Añadimos 4 ml de la solución ácida de difenilamina, mezclamos
bien y colocamos por 10 min en baño de agua hirviente.
• Retiramos y enfriamo en hielo y observar la reacción.
EXPERIMENTO N° 4. IDENTIFICACION DEL GRUPO FOSFATO
MATERIALES
Acido perclórico 7.5 N
Molibdato de amonio 2.5%
Acido 1-amino-2,4-naftol sulfónico
Hidróxido de amonio
Acido nítrico
Molibdato de amonio
Tubos de ensayo
Pipetas
Embudo
Perlas de vidrio
Baño maría Hielo
MÉTODOS

Método 1

• Colocamos en un tubo de ensayo 0.5 ml del extracto de DNA y

0.5ml de ácido perclórico 7.5 N
• Colocamos en baño maría hirviente por 30 min.
• Dejamos enfriar y procedimos a identificar el fosfato inorgánico de
la siguiente forma: colocamos en un tubo de ensayo 0.5 ml del
contenido del tubo anterior, añadir 3.5 ml de agua destilada, luego
0.5 ml del reactivo de molibdato de amonio al 2.5% y finalmente 0.5
ml del reactivo reductor (Acido 1-amino-2,4-naftol sulfónico).
• Dejamos reposar por 5 min. El color azul nos indica la presencia de
fosfato inorgánico.

Método 2
 • Agregamos un poco del precipitado en un tubo de ensayo y
añadimos Hidróxido de Amonio (NH4OH) concentrado hasta
obtener un medio básico
• Acidificamos con algunas gotas de HNO3 y agregamos Molibdato
de Amonio (1mL)

4. RESULTADOS
Luego de realizar los experimentos de extracción de ADN, identificación de
bases nitrogenadas
mediante el método del
especto fotómetro y el de
hidróxido de amonio con
nitrato de plata;
identificación de azucares
e identificación del grupo
fosfato. Encontramos en el
tubo 1, el ADN puro,
disuelto en agua

En el tubo 2, encontramos
adn disuelto en agua para
el experimento del especto
fotómetro
En el tubo 3, encontramos
el resultado de la prueba
del hidroxido de amonio
con nitrato de plata,
En el tubo 4,
encontramos el resultado del experimento de la prueba de identificación de
azúcares
En el tubo 5, encontramos el resultado del experimento de la prueba de
identificación del grupo fosfato mediante el uso de ácido perclórico, molibdato
de amonio y el reactivo reductor
 En el tubo 6, encontramos el resultado del experimento de la prueba de
iddentificación del grupo fosfato mediante el uso de hidróxido de amonio y
ácido nítrico con molibdato de amonio

5. DISCUSIÓN

EXPERIMENTO N°1. EXTRACCION DE DNA A PARTIR DE BULBO DE

CEBOLLA

El producto filamentoso conseguido de la extracción no es ADN puro puesto

que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una mejor extracción se
realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden
que se unan al ADN. Primero la pared celular y la membrana plasmática se
rompen a través de una fase de licuado y agregando la lisis para así acceder
al núcleo de la misma. Como consecuencia, la membrana se rompe y los
componentes celulares son liberados. Esto se debe a que los iones salinos
son atraídos hacia las cargas negativas del ADN permitiendo así la disolución
celular. sí mismo, para proteger y obtener el ADN se agrega el etanol frio al
95%, haciendo que el ADN se separe de la parte líquida, quedando una
tela blanca. sí mismo, para proteger y obtener el ADN se agrega el etanol frio
al 95%, haciendo que el ADN se separe de la parte líquida, quedando
una tela blanca. De igual manera, para proteger y obtener ADN se agrega
etanol frio al 95%, causando que el ADN se separe de la parte liquida
quedando un a tela. Posteriormente para la identificación de la cebolla
utilizamos difenilamida (detección de nitratos, cloratos entre otros agentes
oxidantes), que en medio acido toma una coloración azul, la que nos indica
presencia de ADN. Esto es debido al hidrolisis del ADN. Al tratarse del ADN
con difenilamina en condiciones ácidas, un compuesto azul con una
absorción definida máxima a 595 nm es formado. Esta reacción la dan en
general las 2- desoxipentosas y no es específica para el ADN. En solución
ácida, la estructura lineal de una desoxipentosa se convierte a la forma b-
hidroxilevulinoaldehído altamente reactiva y que reacciona con difenilamina
para dar un complejo azul. sí mismo, para proteger y obtener el ADN se
agrega el etanol frio al 95%, haciendo que el ADN se separe de la parte
líquida, quedando una tela blanca.
 EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACION DE BASES NITROGENADAS

La reacción de Bial es una reacción general para las pentosas y se debe a la

formación de furfural cuando se calienta la pentosa con ácido clorhídrico
concentrado. El orcinol reacciona con furfural en presencia de cloruro férrico
como catalizador, dando una coloración verde. Solamente los nucleótidos de
purina dan una reacción considerable.

EXPERIMENTO N° 3. IDENTIFICACION DE AZUCARES

La pentosa del DNA y RNA puede evidenciarse por la reacción con orcinol.
El ácido uslfurico hidroliza las uniones fosfodiester y N-glicosidicas, liberando
ribosa, bases puricas, pirimidinicas y ácido fosfórico. La pentosa en medio
acido acido, se deshidrata originando furfural que puede reaccionar con el
orcinol brindando un producto de tono verdosos,

EXPERIMENTO N° 4. IDENTIFICACION DEL GRUPO FOSFATO

El ácido molibdico y ácido ascórbico actúan como agentes oxido reductores

en oxidaciones biológicas. En este caso, el grupo fosfato es identificado por
la reacción del fosforo inorgánico en un medio acido, lo cual le otorga una
tonalidad verde azulada. El fosfato reacciona con el molibdato de sodio para
dar fosfomolibdato, el cual es reducido por el ácido ascórbico a azul de
molibdeno.

El arsenito/ citrato se combina con el exceso de molibdato impidiendo su

reacción posterior con el exceso de fosfato liberado de los esteres lábiles.

Esta tonalidad da positiva para grupos fosfato. La presencia del grupo fosfato
se determina indirectamente por la presencia de fósforo inorgánico con
formación de azul de fosfomolibdeno

6. CONCLUSIONES
• La purificación del ADN se da mediante etanol, buffer de lisis y
proteinasas
• La identificación de las bases nitrogenadas del ADN se puede dar
mediante la espectofotometría y el color marrón que dá la reacción con
el hidroxido de amónio y nitrato de plata
 • Los azúcares se identifican mediante el reactivo de Diesche y Bial
• La identificación del grupo fosfato se da mediante la presencia del
color azul en el método del ácido perclórico, molibdato de amonio y el
reactivo reductor
• La identificación del grupo fosfato se da mediante la presencia del
color azul en el método del hidróxido de amonio y el ácido nítrico
7. CUESTIONARIO

1. Cuál es los componentes de la solución de lisis y para que se usan

cada uno de ellos?

Principalmente el reactivo de lisis tiene 3 componentes esenciales.

SDS (sodio dodecil sultafo): Es un detergente

aniónico que solubiliza los lípidos y proteínas, y
desestabiliza la estructura de la membrana celular.
Interactúa con la parte hidrofoba de la bicapa liídica y
el grupo fosfato, por lo que rompe la membrana de la
bicapa fosfolipídica

EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético): Una vez

el ADN es liberado del núcleo, queda expuesto a las
enzimas DNAsas de la célula que degradan el ADN.
Para evitar la degradación se usa el EDTA, agente
quelante que atrapa los iones Mg2+ usados por las
DNAasas como cofactores. Esto se debe a que a pH
fisiológico, el EDTA está cargado negativamente

Tris (hidroximetil amino metano): Es un tampón biológico usado para

estabilizar el pH de la solución (entre 7,0 y 8,0)

2. Si las temperaturas altas desnaturalizan al DNA, porqué en la

extracción de DNAa partir de tejidos vegetales se requiere de
temperatura de 65 °C?

Aparte de que el ADN es una molécula que puede renaturalizarse en un

proceso reversible, cuando las temperaturas descienden. Las células, como
mecanismo de defensa natural, contienen enzimas que destruyen al ADN
(ADNasas). Estas enzimas deben ser inactivadas para garantizar la calidad
de las preparaciones de ADN. La inhibición puede realizarse mediante
métodos físicos, tales como desnaturalización por calor (a temperaturas de
65 C°)

3. Para la extracción de DNA se puede utilizar proteinasas?. Si su

respuesta es afirmativa, explique a que componente podría reemplazar
o en que paso sería apropiada utilizarla durante la extracción de DNA.

Las proteinasas pueden usarse para la extracción de ADN, estas pueden ser
usadas en el paso de la purificación del mismo, junto con el buffer de lisis y
antes de la agregación del etanol para su precipitación. Las proteinasas
rompen el enlace peptídico de las proteinas, mediante un proceso de
hidrolisis. Para la purificación del ADN este debe ser separado de las
proteínas en las que este se enrolla (las histonas), las proteinasas se usan
para este proceso

4. ¿Qué condiciones físicas conducen a la desnaturalización del DNA?.

¿Por qué se observa un incremento en la absorción de luz UV (efecto
hipercrómico) al desnaturalizarse el DNA?

La desnaturalización del ADN se puede deber a dos factores, uno de ellos es

la temperatura, que a partir de 94°C produce la separación de las dos
cadenas de la molécula, mediante la ruptura de puentes de hidrógeno más
no los enlaces fosfodiester, otro factor que puede producir la
desnaturalización es el pH.

El efecto hipercrómico del

ADN se caracteriza por el
aumento de la
absorbancia de la
molécula cuando esta
está desnaturalizada.
Esto es debido a que los
anillos heterocíclicos de
los nucleótidos (bases
nitrogenadas como la Adenina, Timina, Guanina, Citocina o Uracilo si fuera
 ARN) absorben fuertemente luz UV (con un máximo cercano a 260nm de
longitud de onda) Si analizamos a fondo molecularmente, se debe a
interacciones entre los sistemas de electrones de las bases, que es posible
gracias a su ordenamiento o apilamiento en una disposición paralela a la
doble hélice y esto tendrá efecto en un aumento en la densidad óptica cuando
las bases están libres. Lo que pasa es que las bases absorben luz ultravioleta
y la máxima absorción se da a los 260nm. Si las bases están sueltas la
absorbancia es máxima, pero si están apiladas en una hebra de ADN, las
moléculas de ribosa y fosfato se interponen al paso de la luz UV y las bases
absorben menos. Por tanto la desnaturalización del ADN se puede seguir por
medio de la hipercromicidad. (Condori,2022)

REFERENCIAS

1. Cadavid, I., & Gómez, G. (2021). Preparación de solución de lisis para

extracción de ADN descrito por Collins et al. (1987). Edu.Co. Recuperado de:
https://dspace.tdea.edu.co/bitstream/handle/tdea/1476/Preparación%20de%
20solución%20de%20lisis%20para%20extracción%20de%20ADN%20descr
ito%20por%20Collins%20et%20al.%20%281987%29.pdf?sequence=1&isAll
owed=y
2. BIO-RAD. (2005). Kit de genes en una botella Módulo de extracción de ADN.
Biotechnology Explore. https://www.bio-
rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4110034ES.pd
3. Velázquez, L., Martínez, M., & Romero, A. (2014). Extracción y purificación
de ADN. Gob.mx
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
4. Condori, E. (2022). Hoy por fin entenderás el Efecto Hipercrómico del ADN.
Bits de Ciencia; Dr. Edwin W. Condori Poma.
https://www.bitsdeciencia.com/revisiones-cientificas/efecto-hipercromico-
adn-arn/