Instituto Tecnológico de Celaya

Practica 3 de laboratorio
Materia: Bioquímica
Docente: Orozco Mosqueda Ma. Del Carmen
Fecha de entrega: 20/10/22

Integrantes:
 Osorio herrera Erik Ivan N°20031314
 Tierrablanca Sánchez Jair N°20031454
 Mata Nieto Emily Ghyslaine N°20031451
 Guerra Mancera María Fernanda N°20031997
Introducción
La fermentación es una vía muy difundida, pero no es la única forma de obtener
energía de combustibles anaeróbicamente (en ausencia de oxígeno). Algunos sistemas
vivos utilizan en su lugar una molécula inorgánica diferente al O2
O, como el sulfato, como aceptor final en una cadena de transporte de electrones. Este
proceso, llamado respiración celular anaerobia, lo realizan algunas bacterias y
archaeas.
En este artículo, veremos con mayor detalle la respiración celular anaerobia y los
diferentes tipos de fermentación.
Para obtener etanol a partir de piruvato, se usan dos pasos. En el primer paso, al
piruvato se le retira un grupo carboxilo y se libera como dióxido de carbono, con lo que
se produce una molécula de dos carbonos llamada acetaldehído. En el segundo paso,
el {NADH}, dona sus electrones al acetaldehído y regenera el NAD a la vez que
genera etanol.
La fermentación alcohólica de las levaduras produce el etanol de bebidas alcohólicas
como la cerveza y el vino. Sin embargo, el alcohol en grandes cantidades es tóxico
para las levaduras (al igual que para los seres humanos), lo que establece un límite
superior en el porcentaje de alcohol en estas bebidas. La tolerancia de las levaduras al
etanol abarca desde el 5 por ciento hasta el 21 por ciento según la cepa de levadura y
las condiciones ambientales.
 Objetivos
• Determinar la presencia de piruvato mediante la fermentación de levadura.
• Observar la producción de piruvato mediante cambios de coloración.
• Observar las reacciones enzimáticas de la glucólisis.
• Demostrar la formación de intermediarios glucolíticos.
 Materiales
 8 tubos de ensayo

 1 pipeta 10ml

 2 pipetas de 5ml

 2 pipetas de 2ml

 4 Tubos para centrífuga

 Termómetro

 2 matraz erlenmeyer

 2 vasos de precipitado 250ml

 Espátula

 Gradilla

 2 vidrios de reloj
 Metodología
A.FORMACIÓN DE PIRUVATO A PARTIR DE GLUCOSA
2 tubos de ensaye como A y B. colocar solución glucosa
Al tubo A agregar 5mL de suspensión de levadura en solución ligeramente alcalina
de Na 2 HPO 4 ; al tubo B, 5mL de suspensión de levadura en solución ácida de
KH 2 PO 4 .

Colocar los tubos en un baño María de temperatura controlada a 37°C durante 1

hora.
Después del tiempo indicado, añadir a cada tubo 2 mL de solución de CCl 3
COOH. Mezclar vigorosamente, y centrifugar durante 10 minutos a 2500 rpm.

Separar los sobrenadantes en un matraz, cada uno; y usarlos para la

determinación de piruvato.

B. DETERMINACIÓN DEL PIRUVATO MEDIANTE NITROPRUSIATO DE SODIO

En 2 tubos de ensaye colocar 1 g de (NH 4 ) 2 SO 4 sólido, en cada uno; y después

agregar 2mL de sobrenadante, A y B, respectivamente, hervido previamente.
Agregar 2 gotas de Na 2 [Fe(CN) 5 NO] y mezclar vigorosamente.
Deslizar cuidadosamente por las paredes de cada tubo (A y B) NH 4 OH
concentrado (unas gotas).La interface de los 2 líquidos revelará un color verde o
azul.

La formación de un anillo rosado transitorio en la interface indica la presencia de

grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloración azul o verdosa,
característica de la reacción de piruvato.
 C. DETERMINACIÓN DE PIRUVATO CON 2,4-DINITROFENILHIDRAZINA
En 2 tubos de ensaye colocar 2 mL de sobrenadante, A y B, respectivamente.
Agregar, a cada tubo, 1 mL de solución saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina.
Mezclar fuertemente.

Colocar de 5 a 8 gotas de la mezclas anteriores, A y B, a un tubo de ensaye,

respectivamente. A cada tubo, agregar 1 mL de NaOH, y diluir con 4 mL de agua
destilada; en dónde la formación de un color rojo indica la presencia de piruvato.
 Metodología

A. Formación de piruvato a partir de glucosa.

1.-Primeramente, rotulamos dos tubos de ensayo con las letras A y B.

2.- Añadimos 5ml de solución de glucosa a cada tubo.

3.- Después, al tubo A le adicionamos 5ml de suspensión de levadura en solución

levemente alcalina de Na2HPO4, mientras que al tubo B le agregamos 5ml de
suspensión de levadura en solución ácida de KH2PO4 .
4.- Calentamos a baño maría a 37°C por 1hr.

5.-Por consiguiente, agregamos a cada tubo 2ml de solución de CCl3COOH,

mezclamos y centrifugamos por 10min. a 2500 rpm.

6.- Separamos los sobrenadantes en un matraz diferente y los utilizamos para la

determinación B.

B. Determinación del piruvato mediante nitroprusiato de sodio.

1.- Hervimos los sobrenadantes A y B, obtenidos en la parte A.

2.- Agregamos a dos tubos, 1gr de (NH4)2SO4 y añadimos 2ml en tubos
independientes sobrenadante A y B(hervido).

3.- Luego, adicionamos 2 gotas de Na2 [Fe(CN)5NO] y mezclamos enérgicamente.

4.- Por último, añadimos gotas NH4OH conc. por paredes a cada tubo.

C. Determinación de piruvato con 2,4-dinitrofenilhidrazina.

1.- Adicionamos 2ml de sobrenadante A y B, en tubos distintos.

2.- Enseguida, añadimos 1 ml de solución saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina a
cada tubo y mezclamos vigorosamente.

3.- A tubos distintos agregamos las mezclas anteriores, A y B. Después, agregamos

a cada tubo 1 ml de NaOH, y disolver con 4 ml de H2O dest.
 Resultados
Observaciones:
A. Formación de piruvato a partir de glucosa.
La glucosa es asimilada por la levadura mediante la ruta metabólica de la glucolisis
y el O2 ingresa al metabolismo energético como aceptor final de electrones en la
cadena respiratoria.
El producto final de la glucolisis es el piruvato, este compuesto puede ser
incorporada a dos metabolismos diferentes:

Metabolismo óxido-reductor
El piruvato es descarboxilado para producir C₂H₆O y CO2. La biomasa microbiana se
incrementa sólo levemente.

Metabolismo oxidativo
Por otra parte, la formación del acetil coenzima A es la primera etapa de
incorporación del piruvato a las rutas del metabolismo respiratorio, a saber:
el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. La activación de este metabolismo
conlleva al consumo de oxígeno. La producción de biomasa aumenta
significativamente respecto al metabolismo oxidativo-reductor, pero se produce
poco C₂H₆O.

Lo antes mencionado, indica que el comportamiento cinético y el estado de la

levadura dependen de la concentración de glucosa (0 fructosa) en el medio de
cultivo, y de la cantidad (por unidad de volumen) de oxígeno disuelto en el medio
líquido que se aporta al cultivo.
Las condiciones de cultivo pueden manipularse con el fin de orientar un cultivo
celular de Saccharomyces cerevisiae hacia la producción de biomasa o hacia la
producción de etanol.
B. Determinación del piruvato mediante nitroprusiato de sodio.

La primera imagen, fue tomada en cuanto se le agrego NH 4OH por paredes. Los
tubos mostraron una tonalidad blanquizca con un anillo entre café-anaranjado y un
precipitado blanco.
La segunda imagen, ya no nos muestra el anillo, por lo que la reacción fue
momentánea y la parte del sobrenadante se tornó besh, al igual que el precipitado.
En esta determinación, no obtuvimos los resultados deseados, pues, teníamos que
haber obtenido una coloración ya sea azul o verdosa y la formación de un anillo
rosado.

*Método de berthelot.
Las técnicas indirectas son llamadas así porque no se cuantifica directamente el
metabolito, sino algún producto de degradación del mismo o el de otra reacción. Las
técnicas indirectas para la urea recurren a la enzima ureasa (urea amidohidrolasa,
E.C. 3.5.1.5.) para descomponer la urea en amonio y CO2. Después de la reacción
se cuantifica cualquiera de los dos productos de reacción, principalmente el amonio.
Fundamento: La ureasa hidroliza la urea en amonio y anhídrido carbónico; el
amonio liberado reacciona con fenol e hipoclorito de sodio para formar p-
quinonacloramina; ésta, con una segunda molécula de fenol, produce un compuesto
indofenólico de color azul, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de urea
presente. La reacción se activa en presencia de nitroprusiato de sodio.
La reacción ha sido modificada para que se pueda introducir a un autoanalizador,
sustituyendo el fenol por salicilato de sodio y activando con nitroprusiato de sodio
para formar el indofenol, por lo que el último paso de la reacción es:
C. Determinación de piruvato con 2,4-dinitrofenilhidrazina.

Al diluir el NaOH con H2O destilada, los tubos resultaron con una coloración rojiza,
la cual nos indica que hay piruvato en esa muestra.

Fundamento: La alanina aminotransferasa (ALT, GPT) cataliza la transferencia del

grupo amino del glutamato al piruvato. Se deja actuar el suero problema en solución
amortiguada sobre -cetoglutarato y alanina, se mide la cantidad producida de
piruvato al reaccionar con 2,4-dinitrofenilhidrazina y formar la hidrazona que se mide
espectrofotométricamente.
 Discusión
La producción de piruvato se realiza por una serie de reacciones enzimáticas que
involucran algunos intermediarios, a este proceso se le conoce como fermentación
o glucólisis, el piruvato se produce por la degradación de la glucosa por la vía
glucolítica. El piruvato descarboxilasa es una enzima homotetramérica que cataliza
en el citoplasma la descarboxilación del ácido pirúvico a acetaldehído y dióxido de
carbono, los metabolitos de piruvato y acetaldehído se encuentran presentes
normalmente en muy bajas concentraciones, por lo que, para demostrar su
existencia como intermediario, es necesario impedir que sean transformados en
otros compuestos. El primer procedimiento de la práctica fue la determinación del
piruvato a partir de glucosa, para la cual ocupamos dos muestras de solución de
glucosa (A y B) a las cuales al tubo A se le agrego 5 mL de suspensión de levadura
en una solución alcalina y al B suspensión de levadura en solución acida, se utiliza
en solución alcalina ya que el piruvato descarboxilasa no es activo en esta, por lo
que se acumula y puede demostrarse su presencia visiblemente por la reacción de
nitroprusiato de sodio que se provoca. Las muestras se sometieron a una
temperatura de 37°C durante 1 hora, pasado el tiempo agregamos solución de ácido
tricloroacético lo mezclamos y centrifugamos durante 10 min, al sacarlos de la
centrifugadora pudimos notar como se asentó la levadura en el fondo y nuestros
sobrenadantes lo separamos aparte en un matraz para utilizarlos en la
determinación del piruvato. Para el procedimiento B que es la segunda
determinación de piruvato mediante la reacción de nitroprusiato de sodio utilizamos
2 muestras de solución de 1 g de sulfato de amonio solido con 2 mL de los
sobrenadantes A y B previamente calentados, agregamos 2 gotas de nitroprusiato
de sodio y mezclamos, nuestras muestras se tornaron en la superficie un color jerez
o café tenue y la solución como tal se veía entre blanco e incoloro por el
asentamiento del sulfato de amonio, después a nuestros tubos A y B añadimos unas
gotas de concentrado de hidróxido de amonio, se revelo un anillo rosado muy tenue
en la coloración lo cual nos indica la presencia de grupos tioles y se observa una
coloración azul o verdosa que representa la reacción del piruvato, nuestras
muestras no cambiaron mucho su coloración después del anillo transitorio. Por
último, en el procedimiento C la determinación de piruvato con 2,4-
dinitrofenilhidrazina utilizamos otras dos muestras a las cuales agregamos
sobrenadante y 1 mL de solución saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina y mezclamos,
el tubo A se presento de un color rojizo oscuro mientras que el tubo B se tornó un
color café aún más oscuro casi negro. A dos muestras nuevas A y B agregamos
unas gotas de las soluciones anteriores, 1 mL de hidróxido de sodio y diluimos con
agua destilada, a estos tubos se formaron coloraciones rojas y anaranjadas que
indican la presencia del piruvato.
 Cuestionario
1. Explicar qué es el metabolismo.
El metabolismo se refiere a todos los procesos físicos y químicos del cuerpo que
convierten o usan energía, tales como:
Respiración
Circulación sanguínea
Regulación de la temperatura corporal
Contracción muscular
Digestión de alimentos y nutrientes
Eliminación de los desechos a través de la orina y de las heces Funcionamiento
del cerebro y los nervios
2. ¿A qué se le conoce como proceso de fermentación?, explique.

La fermentación es un proceso por el cual los microorganismos obtienen energía a

partir de compuestos orgánicos, como son los azúcares, y pueden transformarlos en
compuestos químicos más simples como el dióxido de carbono, ácidos, alcoholes,
entre otros.
Existen diferentes tipos de fermentaciones como la alcohólica, láctica y acética, según
el organismo que participe del proceso y las sustancias que se encuentren en el medio
de cultivo.
3. ¿Por qué la fermentación alcohólica sólo sucede en levaduras?
La fermentación alcohólica de las levaduras produce el etanol de bebidas alcohólicas
como la cerveza y el vino. Sin embargo, el alcohol en grandes cantidades es tóxico
para las levaduras (al igual que para los seres humanos), lo que establece un límite
superior en el porcentaje de alcohol en estas bebidas. La tolerancia de las levaduras al
etanol abarca desde el 555 por ciento hasta el 212121 por ciento según la cepa de
levadura y las condiciones ambientales.
4. ¿Qué son los procesos aerobio y anaerobio?
Se denominan organismos aerobios o aeróbicos a los organismos que pueden vivir o
desarrollarse en presencia de oxígeno diatómico.1 El concepto se aplica no solo a
organismos sino también a los procesos implicados ("metabolismo aerobio") y a los
ambientes donde se llevan a cabo. Un "ambiente aerobio" es aquel rico en oxígeno, a
diferencia del anaerobio, donde el oxígeno está ausente, o uno microaerófilo, donde el
oxígeno se encuentra en muy bajos niveles.
La palabra anaerobio significa "sin oxígeno". El término tiene muchos usos en
medicina.
Las bacterias anaerobias son microorganismos que son capaces de sobrevivir y
multiplicarse en ambientes que no tienen oxígeno. Por ejemplo, pueden proliferar en
tejido humano lesionado que no esté recibiendo un flujo de sangre rica en oxígeno.
Este tipo de bacterias causan infecciones como el tétanos y la gangrena. Las
infecciones anaerobias normalmente causan abscesos (acumulación de pus), y la
muerte del tejido. Muchas bacterias anaerobias producen enzimas que destruyen el
tejido, y a veces libera toxinas poderosas.
Además de las bacterias, algunos protozoarios y gusanos también son anaerobios.
5. Menciona 5 diferentes materias primas que puedan ser utilizadas en la
fermentación alcohólica.
Fermentación a partir de materias primas ricas en carbohidratos (azúcar, almidón,
celulosa, etcétera). Por tal razón, es común designar al etanol obtenido por esta vía
"bioetanol". Entre estas materias primas se encuentran las frutas y vegetales como la
caña de azúcar y la remolacha, los cereales (trigo, maíz, sorgo), los tubérculos (papas,
yuca) y en general, materias provenientes de ligno–celulosas o de residuos orgánicos.
 Conclusión
La producción de piruvato durante la fermentación se realiza por una serie de reacciones
enzimáticas que involucran algunos intermediarios. Este proceso se conoce como
fermentación o glucólisis. La reacción total podría considerarse como la transferencia de
dos pares de átomos de hidrógeno de la glucosa al NAD+. Los metabolitos de piruvato y
acetaldehído se encuentran normalmente en bajas concentraciones, por lo tanto, para
comprobar su existencia es necesario impedir su transformación. El piruvato
descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula
 Literatura
Completo, N. (s/f). Cómo citar el artículo. Redalyc.org. Recuperado el 20 de octubre de
2022, de https://www.redalyc.org/pdf/1805/180532151005.pdf
Domingo, M., & Teórico, M. (s/f). Edu.co. Recuperado el 20 de octubre de 2022, de
https://www.unipamplona.edu.co/unipamplona/portalIG/home_191/recursos/general/070
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M, E., C, R., Espinosa, G., & C, P. H. V. (s/f). Teoría: # 3 Práctica: #3. Www.uv.mx.
Recuperado el 20 de octubre de 2022, de http://www.uv.mx/nutri-
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¿Qué es la fermentación alcohólica? (2021, 17 diciembre). Kenshô. Recuperado 20 de
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