Practica 3. Titulación de Aminoácidos

UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA
TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS
Identificación:
GL-AA-F-1
Guías de Prácticas de Número de
Revisión No.:
Páginas:
Laboratorio 2
12
Fecha Emisión:
2018/01/31
Laboratorio de:
BIOQUÍMICA
Título de la Práctica de Laboratorio:

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:
María Claudia Sandoval Dr. Laura Cerón Rincón, M.Sc. Comité Asesor de
Sc. Departamento de Química
Docentes Departamento de Directora Departamento de

Química Química
El uso no autorizado de su contenido, así como reproducción total o parcial por cualquier persona o entidad, estará en
contra de los derechos de autor
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Control de Cambios
Fecha de
Descripción del Cambio Justificación del Cambio Elaboración /
Actualización
La práctica se modifica para
incluir algunos temas nuevos y
Edición del marco teórico 25/06/18
retirar otros que ya no se
consideran pertinentes
Se aumentó la concentración
Cambio concentración HCl 1/12/19
para añadir un menor volumen
Cambio en el marco teórico,
aclarando cómo es la titulación de Para aclarar algunos aspectos
11/12/19
aminoácidos con tres valores de teóricos.
pKa.
Con el fin de reforzar los
Adición de una muestra desconocida cálculos, se incluyó un 11/12/19
aminoácido desconocido
Se añadió la sección de Para mejor comprensión del
06/07/20
estandarización procedimiento se separó el texto
Se disminuyó la concentración
Cambio concentración HCl 06/07/20
para mejorar la titulación
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1. FACULTAD O UNIDAD ACADÉMICA: : Facultad de Ciencias Básicas y

Aplicadas
2. PROGRAMA: Ingeniería Ambiental
3. ASIGNATURA: Bioquímica
4. SEMESTRE: Cuarto
5. OBJETIVOS:
 Repasar conocimientos en preparación de disoluciones y unidades

 Titular y comparar los valores de pKa de tres aminoácidos diferentes.
 Aprender el manejo y los usos del pH metro en el laboratorio
5.1. MARCO TEORICO
5.1.1. DISOLUCIONES BUFFER
Las reacciones químicas de los seres vivos requieren unas condiciones de concentración de
especies químicas determinadas y precisas, es así como la relación entre los iones H + y OH-
deben permanecer en intervalos útiles para que se lleven a cabo las reacciones mediadas por
enzimas. Algunas enzimas necesitan medios ácidos (pH < 7) y otras alcalinos (pH > 7). Para
mantener estas condiciones el medio celular cuenta con disoluciones amortiguadoras o buffer
que evitan los cambios bruscos de pH. Para medir el pH se utiliza el pH metro, un instrumento
que permite determinar la concentración de hidrogeniones de una solución a través del paso de
corriente por una solución saturada de cloruro de potasio en un electrodo. Con la concentración
de iones H+ se puede determinar el pH de la siguiente forma:
pH= -log[H+] pOH = -log[OH-] 14 = pH+pOH
La relación entre el pH y el pKa se describe por medio de la ecuación de Henderson Hasselbalch

Esta ecuación es una reorganización de la expresión de la constante de ionización de un ácido
débil:
[ A -1 ] [ base ]
pH= pk a +log o pH= pk a +log
[ HA ] [ ácido ]
A partir de esta expresión se pueden calcular las concentraciones de las especies ácidas y
básicas de un equilibrio ácido base. La titulación es un experimento en el cual cantidades
medidas de base se añaden a una cantidad desconocida de un ácido. La reacción se sigue por
medio de medidas con el pH metro. El punto en la titulación en el cual un ácido está
exactamente neutralizado es el punto de equivalencia.
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En la gráfica de abajo se muestra la curva de titulación de la glicina. Los dos grupos ionizables,
el amino y el carboxilo se titulan con una base fuerte como lo es el NaOH, y se observan las dos
fases, una por cada disociación:
Al inicio, la especie predominante es la especie completamente protonada +H3N-CH2-COOH, por

lo que su carga neta es +1. A medida que se añade el NaOH, el grupo -COOH se desprotona, y
empieza a aparecer la segunda especie, +H3N-CH2-COO-. Cuando existen las mismas cantidades
de ambas especies, se llega a la zona media de la zona buffer, y en este punto el pH es igual al
pKa del grupo titulado, en este caso del grupo carboxilo, 2,34; debido a que una de las especies
tiene carga neta +1 y la otra 0, la carga neta en este punto sería el promedio de las dos, +0,5.
En la gráfica puede verse que es un punto de inflexión en donde la especie completamente

protonada ha prácticamente desaparecido, la gran mayoría está como la especie que ha perdido
su primer protón y la especie completamente desprotonada está empezando a formarse. La
segunda fase corresponde a la titulación del protón del grupo amino y cuyo punto medio
corresponde al segundo pKa, que en el caso de la glicina corresponde a 9,6. En este punto, la
mitad de la glicina se encuentran como la especie H2N-CH2-COO-, por lo que su carga neta es
-0,5. La titulación se completa cuando se llega a un pH aproximado de 13.
A partir de los datos experimentales se puede construir la misma gráfica, pH vs.Moles de OH -. De

esta gráfica puede obtenerse la concentración del aminoácido, al calcular el punto de inflexión,
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ya sea por el método gráfico, el de la primera derivada o el de la segunda derivada. Como puede
verse en la gráfica, para llegar al punto final de la titulación, se necesitan dos moles de OH -, es
decir que el punto de inflexión corresponde a un mol del aminoácido. En el caso de la glicina,
este punto corresponde con el punto isoeléctrico de la glicina, es decir, el punto de corte en el
eje y. Teniendo este punto se pueden hallar los dos valores de pK a; el pK1 corresponde al punto
de pH que se corta en la gráfica cuando se han añadido 0,5 moles de OH - y el pK2 será el punto
de pH cuando se corta en la gráfica con 1,5 moles de OH-.
A partir de la curva de titulación también se obtiene la información acerca de la relación entre la

carga neta del aminoácido y el pH de la disolución. En el caso de la glicina, a pH 5,97, el punto
de inflexión entre las dos partes de la curva, la glicina está predominantemente en su forma
dipolar, es decir ionizada pero sin carga eléctrica neta. El pH característico al cual la carga
eléctrica neta es cero se le conoce como punto isoeléctrico (pI). Considerando que la glicina no
tiene grupos ionizables en la cadena lateral, el pI es el promedio entre los dos valores de pKa:
pK a1 + pK a2 2,34+9,60
pI= = =5,97
2 2
Por encima de ese valor, la glicina tiene una carga neta de valor negativo y en un campo
eléctrico se desplazará hacia el ánodo, el electrodo positivo. Asimismo, a cualquier valor de pH
menor al pI, la glicina tendrá carga positiva y en un campo eléctrico se desplazara hacia el
electrodo negativo (cátodo).
Todos los aminoácidos que no tienen grupos ionizables en la cadena lateral tienen curvas de
titulación muy similares, pero con valores de pK a diferentes. Por su parte, los aminoácidos que
tienen grupos ionizables en su cadena lateral y que por ende tienen un valor de pK a adicional, el
pKR, resultando en una curva de titulación más compleja, en donde se distinguen tres regiones.
La región de adicional estará ubicada dependiendo del tipo de grupo ionizable, y se fusionará
con la zona del grupo carboxilo o la del grupo amino, dependiendo de su valor pK R. El punto
isoeléctrico de este tipo de aminoácidos depende de la naturaleza del grupo ionizable. Por
ejemplo, el glutamato tiene un punto isoeléctrico de 3,22, considerablemente menor que el de la
glicina, debido a que tiene dos grupos carboxilo. Por esta razón, en estos aminoácidos el punto
isoeléctrico no siempre coincide con la adición de 1 mol de OH -, y requiere la adición de 3 moles
de OH- para su titulación completa. Es necesario dibujar la estructura de cada aminoácido y
determinar cuál es su disociación en cada punto de la curva.
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O O
O O O O - -
O O
- - -
HO O = O O
NH2
+ +
NH3 NH3
Carga neta: -2
pH = pK2
9,67
10 Carga neta: -1,5
O O O O
-
HO OH = HO O
+
NH3
+
NH3 8
O O
-
HO O O O O O
pH 6 +
NH3 - - = - -
O O O O
+
NH3 NH2
pH = pKR
4,25
O O 4 Carga neta: -0,5
pH = pI
3,22
Carga neta: 0
HO OH pH = pK1
2 2,19
+ Carga neta: +0,5
NH3
Carga neta: +1 0 1,0 2,0 3,0
0 Moles OH -
a mita
6. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O
EQUIPOS DEL LABORATORIO:
DESCRIPCIÓN (Material,
UNIDAD DE
reactivo, instrumento, software, CANTIDAD
MEDIDA
hardware, equipo)
Balanza analítica 1 unidad
Potenciómetro o pH-metro 1 unidad
Vidrios de reloj 2 unidades
Goteros o pipetas Pasteur 2 unidades
Beakers de 50 mL 2 unidades
Beakers de 100 mL 3 unidades
Tubos de 12 mL 10 unidades
Pipetas aforadas de 5,00 mL 3 unidades
Micropipeta 100-1000 μL 1 unidad
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UNIDAD DE
MEDIDA
hardware, equipo)
Frasco lavador con agua destilada 1 unidad
Lisina 0,2 M 10 mL
Alanina 0,2 M 10 mL
Cisteína 0,2 M 10 mL
Aminoácido desconocido 0,2M 10 mL
Solución de fenolftaleína 1 mL
HCl 0,5 M 50 mL
NaOH 0,1M 100 mL
Biftalato de potasio 1 g
7. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O

EQUIPOS DEL ESTUDIANTE:
UNIDAD DE
MEDIDA
hardware, equipo)
Bata de poliéster blanca. 1 unidad
Gafas de seguridad. 1 par
Guantes de nitrilo 2 pares
Bayetilla 1 unidad
Toallas de papel Scott 10 unidades
Marcador tipo Sharpie 1 unidad
Cinta de enmascarar 1 rollo
Cuaderno de laboratorio 1 unidad
8. PRECAUCIONES CON LOS MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS Y

EQUIPOS A UTILIZAR:
 Antes de entrar al laboratorio lea la guía de trabajo.

 Debe tener las precauciones mencionadas en el acta de capacitación para la realización de
todas las prácticas.
 Escuche las explicaciones del profesor al inicio de la práctica y tome atenta nota sobre los
componentes del espectrofotómetro y del pH metro, sus usos y los cuidados que se deben
tener para el correcto uso de este equipo.
 Debe leer y tener consignado en su cuaderno las fichas de seguridad de cada uno de los
reactivos, y debe tener conocimiento de dónde deben desecharse los residuos de los
mismos.
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9. PROCEDIMIENTO, MÉTODO O ACTIVIDADES:
9.1. ESTANDARIZACIÓN DE TITULANTE
Primero, debe estandarizar la solución de NaOH que va a emplear en la titulación de los aminoácidos.
Para ello debe purgar 2 veces la bureta con la solución de NaOH 0,1 M, y llenarla hasta enrasarla en
0,00mL. Pese alrededor de 0,2 g de biftalato de potasio en un vaso de precipitados, disuelva en agua,
añada 2 gotas de fenolftaleína y realice la titulación por triplicado. Anote los volúmenes obtenidos en
su cuaderno de laboratorio y luego calcule la concentración del NaOH.
Determine en compañía del docente la concentración del NaOH utilizado teniendo en cuenta los
siguientes datos experimentales:
Masa biftalato V NaOH gastado [NaOH]*

0,2019 10,90
0,2021 10,40
0,2103 10,55
[NaOH] promedio* =
* Tenga en cuenta el uso de cifras significativas
9.2. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS
Mida el pH inicial de cada uno de los aminoácidos asignados. Rotule un vaso de precipitados de 100
mL, por cada aminoácido a titular. Purgue las pipetas aforadas, mida 5,00 mL del aminoácido y
transfiéralo al respectivo vaso de precipitados. Mida el pH inicial de cada una de las disoluciones y
añada 5 mL de HCl 0,5 M para que el pH sea de aproximadamente de 1,3. Luego adicione NaOH
desde la bureta hasta llegar a un pH de 13, iniciando con adiciones de 1,00 mL; cuando el pH sea 3,
empiece a añadir 0,50 mL cada vez y una vez el pH haya llegado a 8,5, vuelva a añadir 1,00 mL entre
cada medida de pH hasta que la titulación esté completa en pH 13. Registre los valores de pH y
volumen de NaOH en su cuaderno de laboratorio. Luego repita el procedimiento con la disolución de
aminoácido desconocido.
Utilice un set de datos asignado por el docente y analice la curva de titulación.
10. RESULTADOS ESPERADOS:
Posteriormente realice las gráficas de titulación de pH vs. Volumen de NaOH y halle los valores de
pKa de los aminoácidos de estudio, recopilando la información obtenida por sus compañeros.
También se espera que el estudiante pueda hallar un estimado de los valores de pKa de los
diferentes aminoácidos empleados y que pueda comparar los resultados obtenidos con los valores
encontrados en literatura. Adicionalmente debe identificar el aminoácido desconocido de acuerdo a
los valores de pKa calculados.
Preguntas para el informe:

 ¿Cuántas regiones buffer observa en su curva?
Pagina 8 de 12
 ¿Cuántas regiones buffer esperaba encontrar?

 ¿Los pKa que puede extrapolar de su gráfica coinciden con los reportados?
 ¿Podrían los aminoácidos titulados ser buffer a pH fisiológico de 7,4?
 Encuentre el pI a partir de cada una de susgráficas, y calcule con la ecuación de Henderson
Hasselbalch cuáles serían las proporciones de cada una de las especies en ese pH. Discuta
si los valores encontrados son los esperados.
 Para los aminoácidos con 3 valores de pKa, ¿es posible ver las 3 zonas buffer en las
gráficas?
 ¿Por qué los valores de pI cambian de un aminoácido a otro? ¿Qué dice esto acerca de la
naturaleza del aminoácido?
11. CRITERIO DE EVALUACIÓN A LA PRESENTE PRÁCTICA:

Presentación del informe grupal, el cual debe entregarse en el formato que se les entregó
previamente, con las características allí mencionadas.
En el cuaderno individual deben registrarse todos los resultados obtenidos, y podrán ser
revisados en la siguiente práctica.
El informe de laboratorio será calificado con la siguiente rúbrica:
NIVELES
Excelente Bueno Aceptable Deficiente No Presentó

4,0 a 5,0 3,0 a 4,0 2,0 a 3,0 1,0 a 2,0 0,0
Asiste Asiste Asiste Asiste

No asiste a la
puntualmente a puntualmente a puntualmente a puntualmente a
práctica
la práctica la práctica la práctica la práctica.
Presenta el No presenta el No presenta el No presenta el

No presenta el
informe en la informe en la informe en la informe en la
informe
fecha indicada fecha indicada fecha indicada fecha indicada
Presenta el Presenta el Presenta el No presenta el

informe en el informe en el informe en el informe en el
formato de formato de formato de formato de
artículo científico artículo científico artículo científico artículo científico
indicado indicado indicado indicado
El resumen El resumen
muestra de muestra de El resumen es El resumen es
forma breve, forma breve, incompleto y no incompleto y no
concisa y concisa y ilustra acerca del ilustra acerca del
concreta todo el concreta todo el contenido del contenido del
contenido del contenido del informe informe
informe informe
La introducción La introducción La introducción La introducción
explica algunos explica algunos explica algunos explica
antecendentes antecendentes antecendentes antecendentes
Pagina 9 de 12
NIVELES

4,0 a 5,0 3,0 a 4,0 2,0 a 3,0 1,0 a 2,0 0,0
no tan
importantes importantes importantes poco pertinentes
relacionados con relacionados con relacionados con y de manera muy
la temática y la temática y la temática pero extensa e
explica el explica el que no ayudan a incoherente, que
objetivo de la objetivo de la explicar el no se relacionan
práctica práctica objetivo de la con la temática
práctica
Describe en
detalle la
Describe en Describe en
metodología
detalle la detalle la No describe en
empleada, pero
metodología metodología detalle la
no incluye las
empleada, empleada, metodología
cantidades
incluyendo las incluyendo las empleada, se
exactas
cantidades cantidades limita a copiar la
utilizadas en la
exactas exactas metodología de
práctica de
utilizadas en la utilizadas en la la guía de
laboratorio ni las
práctica de práctica de laboratorio
modificaciones
laboratorio laboratorio
realizadas a la
misma
Los resultados
Los resultados
Los resultados mostrados están
Los resultados mostrados están
mostrados están incompletos, y
mostrados están completos, pero
completos, así los cálculos y las
completos, así los cálculos y
como los gráficas no
como los gráficas no son
cálculos y las corresponden
cálculos y las correctos, no
gráficas. con los datos o
gráficas pero no están bien
También se están mal
se rotulan realizados y no
rotulan ejecutados y no
correctamente se rotulan
correctamente se rotulan
correctamente
correctamente
La descripción
La descripción La descripción La descripción
de los
de los de los de los
resultados,
resultados, resultados, resultados,
incluyendo tablas
incluyendo tablas incluyendo tablas incluyendo tablas
y gráficas no es
y gráficas se y gráficas se y gráficas no se
clara o se incluye
expresa de expresa de encuentra en el
como análisis de
forma clara, forma clara informe
resultados
Es capaz de Es capaz de No explica todos No Es capaz de
explicar todos los explicar todos los los fenómenos explicar todos los
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NIVELES

4,0 a 5,0 3,0 a 4,0 2,0 a 3,0 1,0 a 2,0 0,0
fenómenos
fenómenos fenómenos
moleculares moleculares
moleculares moleculares
ocurridos ocurridos
ocurridos ocurridos
durante la durante la
durante la durante la
práctica, práctica ni
práctica, pero no práctica ni
evidenciando evidencia todas
evidencia todas evidencia todas
todas las las reacciones
las reacciones las reacciones
reacciones químicas
químicas químicas
químicas llevadas a cabo
llevadas a cabo llevadas a cabo
llevadas a cabo en el laboratorio.
en el laboratorio. en el laboratorio.
en el laboratorio
En el análisis de En el análisis de
resultados se resultados se En el análisis de En el análisis de
evidencia que el evidencia que el resultados no se resultados no se
estudiante estudiante evidencia que el evidencia que el
realiza una realiza una estudiante haya estudiante haya
amplia búsqueda amplia búsqueda realizado una realizado una
bibliográfica, que bibliográfica, amplia búsqueda amplia búsqueda
incluye por lo pero no incluye bibliográfica, ni bibliográfica, ni
menos tres por lo menos tres de artículos de artículos
artículos artículos científicos en científicos en
científicos en científicos en inglés inglés.
inglés. inglés.
El estudiante no
analiza sus
El estudiante El estudiante no
resultados
analiza sus analiza sus
basándose en lo
resultados resultados
aprendido en
basándose en lo basándose en lo El estudiante no
clase, ni explica
aprendido en aprendido en incluye análisis
los resultados
clase, explicando clase, ni explica de resultados en
dentro de un
los resultados los resultados su informe
contexto
dentro de un dentro de un
pertinente, se
contexto contexto
limita a describir
pertinente. pertinente.
lo ocurrido en el
laboratorio.
Puede conectar No puede No puede
los resultados conectar los conectar los No menciona el
obtenidos con el resultados resultados trabajo de otros
conocimiento obtenidos con el obtenidos con el autores en su
generado por conocimiento conocimiento análisis de
otros autores en generado por generado por resultados
experimentos otros autores en otros autores en
Pagina 11 de 12
NIVELES

4,0 a 5,0 3,0 a 4,0 2,0 a 3,0 1,0 a 2,0 0,0
experimentos
similares. Se experimentos
limita a similares. Se
similares mencionar el limita a copiar el
trabajo de otros trabajo de otros
autores con sus autores
propias palabras.
No está
Está capacidad Está capacidad capacidad de
No escribe
de resumir en las de resumir en las resumir en las
ninguna
conclusiones los conclusiones los conclusiones los
conclusión
resultados resultados resultados
acerca de la
obtenidos y su obtenidos y su obtenidos y su
práctica o de los
interpretación de interpretación de interpretación, se
resultados
forma clara y forma clara y limita a
obtenidos en ella
concisa. concisa. mencionar
resultados.
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2. PROGRAMA: Ingeniería Ambiental

 Repasar conocimientos en preparación de disoluciones y unidades

5.1. MARCO TEORICO

5.1.1. DISOLUCIONES BUFFER

pH= -log[H+] pOH = -log[OH-] 14 = pH+pOH

La relación entre el pH y el pKa se describe por medio de la ecuación de Henderson Hasselbalch

Al inicio, la especie predominante es la especie completamente protonada +H3N-CH2-COOH, por

En la gráfica puede verse que es un punto de inflexión en donde la especie completamente

A partir de los datos experimentales se puede construir la misma gráfica, pH vs.Moles de OH -. De

A partir de la curva de titulación también se obtiene la información acerca de la relación entre la

7. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O

8. PRECAUCIONES CON LOS MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS Y

 Antes de entrar al laboratorio lea la guía de trabajo.

9. PROCEDIMIENTO, MÉTODO O ACTIVIDADES:

9.1. ESTANDARIZACIÓN DE TITULANTE

Masa biftalato V NaOH gastado [NaOH]*

9.2. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Utilice un set de datos asignado por el docente y analice la curva de titulación.

10. RESULTADOS ESPERADOS:

Preguntas para el informe:

 ¿Cuántas regiones buffer esperaba encontrar?

11. CRITERIO DE EVALUACIÓN A LA PRESENTE PRÁCTICA:

El informe de laboratorio será calificado con la siguiente rúbrica:

Excelente Bueno Aceptable Deficiente No Presentó

Asiste Asiste Asiste Asiste

Presenta el No presenta el No presenta el No presenta el

Presenta el Presenta el Presenta el No presenta el

Excelente Bueno Aceptable Deficiente No Presentó

Excelente Bueno Aceptable Deficiente No Presentó

Excelente Bueno Aceptable Deficiente No Presentó

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