CÓDIGO:

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090

VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
1 DE 11

FACULTAD: CIENCIAS DE LA SAUD

DEPARTAMENTO: BACTERIOLOGÍA
PROGRAMA: BACTERIOLOGÍA
NOMBRE DEL CURSO: INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
GUÍA # 3 - MORFOLOGIA CELULAR
PREPARACIONES EN FRESCO, COLORACION SIMPLE Y COLORACION DE
NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
GRAM

1. OBJETIVOS
• Demostrar la existencia de microorganismos en ambiente naturales.
• Practicar los distintos métodos de observación de las bacterias.
• Identificar al microscopio las diferentes formas de bacterias.
• Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización
• e identificación de las bacterias.
• Conocer el fundamento de la coloración de Gram.
• Aplicar correctamente la técnica de la coloración de Gram.
• Conocer el fundamento de la tinción de Zielh Neelzen
• Aplicar correctamente la técnica de la coloración de Zielh Neelzen
• Identificar las bacterias ácido alcohol resistentes

2. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales, pueden estar localizados en

suelos, agua, aire, alimentos, tracto intestinal, piel, etc. Sólo unos pocos lugares de la naturaleza con
condiciones extremas y tejidos sanos de órganos de hombres y animales están libres de ellos. Cuando
se manifiestan en los ambientes naturales, como causantes de infección, producen determinada
sintomatología, que obliga a tomar muestras para realizar frotis y coloraciones, para tener una rápida
información sobre las características básicas del microorganismo y poder continuar con el proceso
adecuado que permita identificar con exactitud el agente causal. La observación al microscopio de las
bacterias nos permite diferenciar tres formas típicas que son los cocos, bacilos y espirales. Los cocos
son bacterias que se pueden observar al microscopio agrupados, distinguiéndose diplococos, racimos,
cadenas de a cuatro (tétradas), o en cubos (Sarcinas). Los bacilos son células en forma de bastón que
pueden presentarse individualmente, en cadena o en palizada. Los espirales se presentan en forma
helicoidal y generalmente no se agrupan. Todas estas formas pueden observarse por medio de los
siguientes métodos:
• Preparaciones no coloreadas: por medio de este método se observan las bacterias vivas, y se
puede detectar con facilidad la movilidad, en las que la poseen, y su forma.
• Preparaciones coloreadas: como las bacterias son incoloras y tienen el mismo índice de
refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlas visualizar.
Los colorantes son sales compuestas por un ión positivo y un ión negativo, uno de los cuales está
coloreado y se conoce como cromóforo. El color de los colorantes básicos está en el ión positivo y en
los ácidos está en el ión negativo. Bajo condiciones de crecimiento la mayoría de las bacterias tienen
un pH interno de 7 y una superficie celular cargada negativamente; por lo que atrae el ión positivo
coloreado del colorante básico. Los colorantes más utilizados son los básicos, entre los que se
encuentran la violeta de genciana, safranina, verde de malaquita, azul de metileno.
La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre
varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial típicamente consiste de tres pasos
principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en la
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
2 DE 11

tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de
células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas pero no
tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante primario.
Coloración de Gram. Esta tinción fue desarrollada por el médico Danés Christian Gram en 1884, la
cual es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos
bacterianos en menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas.
La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las
paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de
peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona
con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas cristal
violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de las células Gram
positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram positiva que una Gram
negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no
de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol también disuelve mucho de la capa exterior de
lipopolisacáridos de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remoción del
colorante primario cristal violeta de estas células. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se
añade, las células Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas
absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas
serán del color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color de
la safranina que es el colorante de contraste.

3. PROCEDIMIENTO

1-PREPARACIONES NO COLOREADAS (PREPARACIONES EN FRESCO)

1. Realice una infusión para trabajar: tome un escobillón estéril y frótelo sobre cualquier parte de
la superficie del cuerpo o introdúzcalo en la mucosa de la nariz frotándolo suavemente
2. Introduzca el escobillón en un tubo que contiene 1cc de Solución Salina estéril, mezcle y deje
reposar por uno segundos.
3. Coloque una gota de la infusión con el asa sobre el portaobjeto limpio, coloque un cubreobjetos
sobre la gota evitando la formación de burbujas, observe con los objetivos de 10x y 40x
4. Leer rápidamente, para que la muestra no se seque.

2-PREPARACIONES COLOREADAS
COLORACIÓN SIMPLE O DIRECTA: Los colorantes básicos empleados son azul de metileno, Cristal
violeta, Safranina, Fucsina y verde malaquita.
1. Tome un escobillón estéril y frótelo sobre cualquier parte de la superficie del cuerpo o
introdúzcalo en la mucosa de la nariz frotándolo suavemente.
2. Haga una extensión sobre la lámina y déjela secar al aire.
3. Pásela rápidamente sobre la llama de un mechero (2 – 3 veces) para fijarla.
4. Coloque los portaobjetos sobre un puente para tinción.
5. Cubra el extendido con una pequeña cantidad de azul de metileno y déjelo actuar por un
minuto.
6. Lave con agua hasta eliminar el exceso de colorante.
7. Secar al aire libre.
8. Examine las preparaciones teñidas al microscopio con objetivo de inmersión.

COLORACIÓN DE GRAM:
PROCEDIMIENTO: TECNICA DE LA COLORACION DE GRAM:
1. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua destilada y una pequeña porción del cultivo
bacteriano con el asa de siembra estéril.
2. Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.
3. Fijar el material al porta objeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tinción,
pasando el porta objeto 3 o 4 veces por la llama de un mechero de Bunsen.
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
3 DE 11

4. Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de cristal
violeta por un (1) minuto.
5. Pasado el minuto, lavar con agua destilada.
6. Cubrir el preparado con lugol Gram por un (1) minuto. Lavar nuevamente con agua destilada.
7. Sostener el porta objeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con gotas del
decolorante alcohol acetona hasta arrastrar más colorante violeta. Esto, requiere
habitualmente unos 10 a 30 segundos.
8. Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el porta objeto sobre el soporte. Cubrir la
superficie con Safranina (contra color), durante 1 minuto. Lavar con agua.
9. Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical, dejando que escurra el
exceso de agua y que seque el extendido.
10. Examinar el extendido al microscopio con objetivos de inmersión (100X)

CONTROL DE CALIDAD DE LA COLORACIÓN DE GRAM

El objetivo principal del control de calidad de la coloración de Gram es evaluar en primer lugar la
realización adecuada del proceso de coloración, teniendo en cuenta el protocolo, los tiempos de
tinción, la calidad y el estado de los colorantes y la organización al momento de realizar el
procedimiento.
Se utilizan dos microorganismos cuyas características tintoriales han sido previamente establecidas,
con el fin de que el resultado de nuestra coloración concuerde con dichas características.

PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjeto limpio agregue una gota de solución salina estéril o agua destilada estéril
2. Con un asa previamente esterilizada tome una porción de cultivo de S. aureus (coco gram
positivo) y deposítela sobre la gota de Solución salina
3. Esterilice el asa y tome una porción de cultivo de E. coli o Salmonella spp (bacilos gram
negativos) y deposítela sobre la gota de solución salina
4. Mezcle los dos microorganismos suavemente, sin tocar los bordes de la placa
5. Deje secar a temperatura ambiente
6. Una vez seco fije el frotis 3 a 4 veces sobre la llama del mechero
7. Realice la coloración de gram
8. Deje secar la placa y observe al microscopio con objetivo de 100x
9. Debe observarse claramente los cocos gram positivos (violeta) y los bacilos gram negativos
(rosados –fucsias)

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

INTRODUCCIÓN
Las micobacterias están cubiertas por un material grueso, ceroso, que resiste la tinción (ácido
micólico), no obstante una vez se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten a la decoloración por
solventes orgánicos fuertes, como el alcohol ácido. Consecuentemente dichas bacterias son conocidas
como ácido alcohol resistentes, un fenómeno descubierto en 1881 por Ziehl Neelsen.
Se requiere un tratamiento especial para que el colorante primario, la carbolfuscina, penetre en el
material ceroso de los bacilos resistentes al ácido. En esta técnica se utiliza calor. Una vez que la
carbolfuscina se deposita en la superficie del extendido, se pasa por debajo del porta objeto, hacia
atrás y hacia delante sobre la llama de un mechero. También se puede utilizar un componente que
permite la penetración de la tinción en la cápsula llamado TERGITOL. Las bacterias resistentes al ácido,
resisten a la decoloración con alcohol ácido y las no resistentes se colorean con colorantes de
contraste como el azul de metileno o verde de malaquita.
COMPONENTES
CARBOLFUSCINA: es un colorante primario, las bacterias que retienen este colorante luego de
decolorarse con alcohol ácido son denominadas ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE y se observan al
microscopio de color rojo o rosado.
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
4 DE 11

ALCOHOL ÁCIDO: Decolorante.

AZUL DE METILENO: Colorante de contraste, tiñe las bacterias que no resisten la decoloración con
alcohol ácido. También se puede utilizar verde de malaquita.

PROCEDIMIENTO
• Hacer un extendido en la lámina porta objetos y dejar secar a temperatura ambiente
• Cubra el extendido con papel filtro y agregue carbolfuscina
• Calentar la lámina pasando la llama de un mechero por debajo hasta el desprendimiento de
vapores. Si el colorante se empieza a secar, agregue más colorante. Este procedimiento se hace
por 5 – 10 minutos.
• Con una pinza descarte el papel y lave la lámina con agua
• Cubra el extendido con el decolorante Alcohol ácido por 3 minutos (hasta decolorar) y lave la
lámina con agua
• Cubra el extendido con azul de Metileno o verde de malaquita por 1 minuto
• Lave con agua y deje secar a temperatura ambiente
• Observe al microscopio con objetivo de inmersión (100x)
NOTA: Las bacterias ácido alcohol resistente se ven rojas o rosadas y las otras de color azul o verde
dependiendo del colorante de contraste utilizado.

4. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS COLORACIÓN DE GRAM

•Portaobjetos y cubreobjetos.
•Asa bacteriológica
•Coloración de Gram
•Coloración de Zielh Neelzen
•Azul de metileno
•Puentes de coloración.
•Aceite de inmersión.
•Microscopios.
•Tubos con 1 CC de solución salina
•Hisopos estériles y baja lenguas
•Papel kraft
•Guantes, tapabocas y gorros
•Cepas de 24 horas de S. aureus, E. coli, Bacillus spp., K. pneumoniae, Pseudomonas spp.
•Agua destilada en goteros (4/laboratorio) o 1 ml de agua destilada en tubos y pipetas Pasteur (1/grupo)
•Mechero
5. MATERIALES EQUIPOS, REACTIVOS COLORACIÓN DE Ziehl Neelsen

• Laminas portaobjetos
• Mecheros
• Microscopios
• Colorantes de Ziehl Neelsen
• Estiércol de vaca
• Aceite de inmersión

6. EQUIPOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y/O COLECTIVA.

Gorro
Guantes desechables
Tapabocas
Bata manga larga

7. MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS.

 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
5 DE 11
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
6 DE 11
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
7 DE 11
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
8 DE 11

8. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.

PRE- LABORATORIO
1. Define los siguientes términos:
Colorante
• Mordiente
• Tinción diferencial
• Tinción simple
• Tinción negativa
• Peptidoglucano
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
9 DE 11

• Ácido teicoico
• Espacio periplásmico
• Porinas
• Membrana celular
• Lipopolisacárido
Preparación o montaje en fresco

2. Qué precaución debe tenerse al colorear la muestra?

3. Cite ejemplos de colorantes ácidos
4. En qué consiste el procedimiento de fijación de una muestra?
5. Por qué las bacterias y otros microorganismos se observan incoloros al microscopio óptico?
6. Señale 2 razones por lo cual es importante clasificar las bacterias con la coloración de Gram.
7. De ejemplo de 3 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas y mencione las enfermedades que
causan.
8. ¿Se pueden clasificar todas las bacterias con la coloración de Gram?
9. Mencione 2 bacterias ácido alcohol resistente y las enfermedades que causan
10. De ejemplos de bacterias capsuladas
11. Mencione por lo menos 2 enfermedades causadas por bacterias formadoras de esporas

POSTLABORATORIO

1. Complete este diagrama de flujo sobre el proceso de la tinción de Gram, y la coloración simple
indicando la función de cada sustancia empleada y la coloración que adquieren las bacterias en
cada paso de la tinción.

Coloración simple
Positiva
Gram Positiva Gram negativa

Fijación Fijación

Azul de metileno
Violeta de Genciana
Función:

Lugol
Función:

Alcohol Acetona
Función:

Safranina o Fucsina
de Gram
Función:
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
1 DE 11

2. Dibuje la pared celular de una bacteria Gram positiva y una Gram negativa señalando las
principales estructuras en ellas.

9. BIBLIOGRAFÍA

ASUALDO,Juan Angel; COTO,Celia E. y DE TORRES,Ramon Alberto. Microbiologia Biomedica:

Bacteriologia, Micologia, Virologia, Parasitologia, Inmunologia. Editorial Atlante, 1996.

Koneman y cols. Diagnostico Microbiológico, Texto y Atlas Color. Editorial Médica Panamericana. 3ª.
Edición.
Murray P. Microbiología Médica. España 1997

Espinal, G. (2005). Manual de prácticas de microbiología I INTEC.

CAREY, Roberta B.; SCHUSTER, Mindy G. y MCGOWAN, Karin L. Medical Microbiology for the New
Curriculum: A Case-Based Approach (1). Hoboken, US: Wiley-Liss, 2007.

Evolutionary Biology of Bacterial and Fungal Pathogens. Washington, DC, USA: ASM Press, 2008.

SEQUEIRA, María Delfina, Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis, Organización

Panamericana de la Salud. 2008

Ryan, K. J., Ray, C. G., Champoux, J., Neidhardt, F., Drew, W., & Plorde, J. S Microbiología médica
McGraw-Hill. 2010

López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S., Cerón-González, G., &

Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Obtenido

De Http://www.Medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.Pdf

10. RECOMENDACIONES

Por una universidad con calidad, moderna e incluyente

Carrera 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 - 7860920
www.unicordoba.edu.co
 CÓDIGO:
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090
VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
2 DE 11

Leer la guía con anterioridad a la clase.

Por una universidad con calidad, moderna e incluyente

Carrera 6ª. No. 77-305 Montería NIT. 891080031-3 - Teléfono: 7860300 - 7860920
www.unicordoba.edu.co