Universidad Autónoma de Baja California

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

LICENCIATURA
EN CIRUJANO DENTISTA

LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA

PRÁCTICA 1
GRUPO: 221
SUBGRUPO: 2 I
NTEGRANTES DE
EQUIPO:
Carmona Ibañez Meilin - 2209559
Gavia Guillen Mariana Nicole -
2212204Hernandez López Yarelin -
2213449
Hernandez Villalpando Xavier Alexandro -
220870

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PRÁCTICA 3. VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA DE
BACTERIAS

Objetivo

1. Comprender y emplear la técnica de tinción de Gram para la identificación y

clasificación de bacterias en Gram positivas y Gram negativas a partir de
muestras de placa dental (biofilm).

Introducción

La tinción de microorganismos es una técnica fundamental en microbiología que

permite realzar la visualización de diferentes tipos de microorganismos bajo el
microscopio. A través de la tinción se brinda valiosa información sobre la estructura,
morfología y características de estos diminutos seres vivos.

La observación microscópica de microorganismos es esencial para el

diagnóstico de enfermedades infecciosas, la investigación científica, la identificación
de patógenos y la clasificación taxonómica de microorganismos. Sin embargo,
muchos microorganismos son prácticamente invisibles, incluso al microscopio,
debido a su tamaño diminuto y a la transparencia de sus estructuras celulares. Aquí
es donde las tinciones adquieren relevancia, al permitir visualizar estos organismos
mediante el uso de colorantes específicos.

Existen diferentes tipos de tinciones en microbiología, cada una con un

propósito específico y brindando información valiosa sobre los microorganismos
estudiados. Algunas de las tinciones más comunes son:

1. Tinción de Gram: Esta tinción es una de las más utilizadas en microbiología.

Permite clasificar bacterias en dos grupos principales: grampositivas y
gramnegativas. Las bacterias grampositivas adquieren un color violeta oscuro
debido a la retención del cristal violeta, mientras que las bacterias gramnegativas
se tiñen de rojo debido al efecto del contraste con la safranina.

2. Tinciones ácido-alcohol resistentes (Tinciones de Ziehl-Neelsen y

Kinyoun): Estas tinciones se utilizan para identificar bacterias acidorresistentes,
como Mycobacterium tuberculosis, causante de la tuberculosis. Estas bacterias
retienen el colorante carbol fucsina incluso después de ser sometidas a la
decoloración con ácido-alcohol, lo que las diferencia de otros microorganismos.

3. Tinción de esporas (Tinción de Schaeffer-Fulton): Esta tinción se emplea

para identificar la presencia de esporas bacterianas. Las esporas son
estructuras de resistencia formadas por algunas bacterias en condiciones
desfavorables. La tinción de Schaeffer-Fulton utiliza colorantes específicos para
resaltar la presencia de esporas en bacterias como Bacillus y Clostridium.

19
4. Tinciones de Hifas y Levaduras: Estas tinciones permiten diferenciar entre
hifas (estructuras filamentosas) y levaduras (células redondeadas) en hongos.
Utilizando colorantes como la tinta china y la tinta india, se pueden revelar las
características morfológicas de diferentes tipos de hongos.

Las tinciones se clasifican en función de cómo interactúan los colorantes con las
estructuras celulares de los microorganismos. En general, se pueden dividir en dos
categorías principales:

1. Tinciones simples: En este tipo de tinciones, se utiliza un solo colorante para

revelar características generales de los microorganismos, como su morfología y
tamaño. Por ejemplo, la tinción con azul de metileno es una tinción simple
comúnmente utilizada en microbiología para visualizar bacterias.

2. Tinciones diferenciales: Las tinciones diferenciales utilizan más de un

colorante para distinguir diferentes tipos de microorganismos o estructuras
celulares. Un ejemplo destacado es la tinción de Gram, que diferencia bacterias
grampositivas de gramnegativas basándose en las propiedades de su pared
celular.

La tinción de Gram es una de las técnicas más importantes en microbiología,

desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884. Su
fundamento se basa en la capacidad de diferenciación de las bacterias en dos
grupos principales: grampositivas y gramnegativas, según la estructura y
composición de su pared celular.

El proceso de tinción de Gram comienza con la fijación de la muestra

bacteriana en un portaobjetos, seguido de la aplicación del cristal violeta, un
colorante primario. Luego, se realiza una fijación con yodo, formando un complejo
de cristal violeta-iodo en las células bacterianas. A continuación, se realiza una
decoloración con alcohol o acetona para eliminar el colorante de las células.

El fundamento clave de esta técnica radica en la estructura de la pared celular

bacteriana. Las bacterias grampositivas tienen una pared celular gruesa compuesta
principalmente por una capa de peptidoglicano, que retiene el complejo cristal
violeta-iodo durante la decoloración. Esto hace que estas bacterias retengan el
colorante y se tiñan de violeta.

Por otro lado, las bacterias gramnegativas tienen una pared celular más
delgada compuesta por una capa de peptidoglicano rodeada por una membrana
externa compuesta por lípidos y proteínas. Durante la decoloración, la membrana
externa se disuelve y la capa de peptidoglicano se daña, lo que permite que el cristal
violeta-iodo se disperse de las células. Luego, se aplica un colorante secundario o
de contraste, la safranina, que tiñe estas bacterias de rojo.

El resultado de la tinción de Gram es que las bacterias grampositivas se

observan de color violeta, mientras que las bacterias gramnegativas se observan de

20
color rojo. Esta diferenciación es crucial en microbiología, ya que proporciona
información importante sobre la estructura de la pared celular de las bacterias y es
un indicador inicial de su respuesta a los antibióticos.

La tinción de Gram es ampliamente utilizada en el diagnóstico clínico, ya que

permite a los médicos y microbiólogos identificar rápidamente la naturaleza de una
infección bacteriana y guiar el tratamiento antibiótico adecuado.

Materiales

• Portaobjetos • Solución de safranina

• Asa bacteriológica o pipeta (colorante secundario)
estéril • Charola para tinción
• Mechero Bunsen • Papel absorbente
• Cultivo bacteriano • Microscopio
• Solución de cristal violeta • Aceite de inmersión
(colorante primario) • Piseta con agua destilada
• Solución de lugol o solución • Cureta estéril o pallilos
yodada (mordiente) picadientes
• Solución decolorante de
alcohol-acetona (decolorante)

Procedimiento

Toma y preparación de la muestra:

1. Colócate los guantes desechables para mantener la asepsia durante el

procedimiento.
2. Posiciona al paciente con la cabeza orientada hacía arriba ligeramente para
facilitar la inspección visual de la cavidad bucal.
3. Identifica la zona de la boca donde se sospeche que hay acumulación de
placa, como la línea de las encías y los dientes.
4. Utilizando una cureta estéril, raspa suavemente la superficie de los dientes,
especialmente en la unión entre los dientes y las encías. Trabaja con
cuidado para evitar causar molestias o daño a los tejidos circundantes.
5. Si no tienes acceso a una cureta estéril, utiliza un palillo picadientes limpio
para recolectar la placa.
6. Extiende ligeramente la muestra de placa sobre un portaobjetos limpio.
7. Agrega una gota de solución salina estéril sobre la muestra y disuélvela
lentamente con movimientos circulares utilizando un asa estéril o un
aplicador limpio.

Visualización en fresco:

8. Agrega un par de gotas de solución de lugol.

9. Coloca un cubreobjetos sobre la gota cuidando de no generar burbujas.
10. Visualiza al microscopio.

21
Visualización en frotis teñido con tinción de Gram:

8. Extiende la suspensión bacteriana sobre el portabojetos, haciendo

movimientos circulares.
9. Espera a que la suspensión sobre el portaobjetos se seque. Para acelarar
el proceso se puede poner dentro de la incubadora a 37°C.
10. Fija la muestra pasando el portaobjetos seco con la muestra por encima de
la llama del mechero Bunsen o la lámpara de alcohol varias veces. Evita
calentar demasiado el portaobjetos para evitar dañar las bacterias o quebrar
el portaobjetos. No utilices guantes durante la fijación con fuego.
11. Posiciona el portaobjetos enfriado sobre las rejillas de la chorola de tinción.
12. Colócate guantes para realizar la tinción.
13. Agrega suficiente cristal violeta para cubrir la muestra sobre el portaobjetos
y espera un minuto.
14. Lava inmediatamente utilizando una piseta con agua destilada. Para evitar
dañar la muestra, realiza los lavados inclinando el portaobjetos y dejando
caer el agua en un ángulo no perperdicular sobre la muestra. Agita
suavemente sobre la charola para retirar la mayor cantidad de agua
restante.
15. Agrega lugol y espera un minuto. Repite el lavado.
16. Agrega decolorante y espera 15 segundos. Es muy importante respetar
este tiempo.
17. Remueve el decolorante inmediatamente con agua destilada.
18. Retira el exceso de agua, agrega safranina y espera un minuto.
19. Realiza el último lavado, retira el exceso de agua y espera a que se seque
el frotis teñido.
20. Visualiza al microscopio con un aumento de 100x (pasando
cuidadosamente por los aumentos previos) y utilizando aceite mineral.

Visualización de bacterias a partir de colonias de un cultivo bacteriano:

1. Toma una placa de Petri con el cultivo bacteriano y seleccionar una colonia
fresca y aislada para la tinción. Es importante utilizar una colonia que tenga
menos de 24 horas de crecimiento para obtener mejores resultados.
2. Etiqueta el portaobjetos con el número 1 utilizando un plumón permanente.
Agrega una gota pequeña de agua en el portaobjetos.
3. Esteriliza el asa bacteriológica pasándola por la llama del mechero Bunsen
o la lámpara de alcohol hasta que se ponga al rojo vivo. Deja enfriar el asa
por unos segundos antes de utilizarla.
4. Con el asa bacteriológica esterilizada, toma una pequeña cantidad de la
colonia bacteriana seleccionada. Realiza una punción en el centro de la
colonia y recoger una pequeña cantidad de bacterias. Evita tocar otras
áreas de la placa para evitar contaminación cruzada.

23
 5. Extiende la muestra bacteriana sobre el portabojetos, haciendo
movimientos circulares sobre la gota de agua con el asa hasta disolver la
masa bacteriana.
6. Pasa el portaobjetos por encima de la llama del mechero Bunsen o la
lámpara de alcohol varias veces para fijar las bacterias al portaobjetos.
Evita calentar demasiado el portaobjetos para evitar dañar las bacterias.
7. Repite los pasos 1 al 6 cuatro veces más, etiquetando cada portaobjetos
con los numéros 2, 3, 4 y 5.
8. Aparta el portaobjetos #1 y continua trabajando con los demás.
9. Cubre completamente la muestra en los portaobjetos del 2 al 5 con la
solución de cristal violeta. Dejar actuar durante aproximadamente 1 minuto.
10. Lava los portaobjetos suavemente con agua destilada para eliminar el
exceso de cristal violeta. Es importante no frotar o dañar la muestra.
11. Aparta el portaobjetos #2 y deja secar al aire. Continua trabajando con los
numerados del 3 al 5.
12. Cubre completamente la muestra en los portaobjetos del 3 al 5 con la
solución de lugol o solución yodada. Deja actuar durante aproximadamente
1 minuto. Retira el exceso y lava con agua destilada.
13. Aparta el portaobjetos #3 y deja secar al aire. Continua trabajando con los
portaobjetos 4 y 5.
14. Inclina los portaobjetos 4 y 5 y aplica cuidadosamente el alcohol etílico o
acetona al 95% en la parte superior de la muestra durante 15 segundos,
permitiendo que fluya hacia abajo. Es fundamental tener cuidado con este
paso, ya que la decoloración excesiva puede dar resultados incorrectos.
15. Lava el portaobjetos suavemente con agua destilada para eliminar el
exceso de decolorante.
16. Aparta el portaobjetos #4 y deja secar al aire.
17. Cubre completamente la muestra en el portaobjetos #5 con la solución de
safranina. Deja actuar durante aproximadamente 1 minuto.
18. Lava el portaobjetos suavemente con agua destilada para eliminar el
exceso de safranina. Luego, deja que el portaobjetos se seque
completamente al aire o usando papel absorbente.
19. Coloca uno a uno los portaobjetos preparados en el microscopio óptico y
observa las bacterias bajo diferentes aumentos.
20. Antes de llegar al objetivo de 100x (objetivo de inmersión), agrega unas
gotas de aceite de inmersión para una mejor resolución.
21. Realiza en cada uno de los portaobjetos la observación de 3 campos con el
objetivo 100x, intentando describir cada detalle de la muestra teñida.
22. Anota los resultados y resuelve la actividad siguiente.

Resultados

¿Qué observas en cada uno de los portaobjetos a 100x? Dibujalo en la tabla

siguiente.

24
 Fijado Cristal violeta Lugol Decolorante Safranina
(Portaobjetos 1) (Portaobjetos 2) (Portaobjetos 3) (Portaobjetos 4) (Portaobjetos 5)

Conclusión

En conclusión, la visualización microscópica de bacterias mediante técnicas de tinción

es esencial para obtener información detallada sobre su estructura y morfología. La
diversidad de tinciones disponibles, como la de Gram, ácido-alcohol resistentes, de
esporas, y para hifas y levaduras, permite clasificar y estudiar distintos tipos de
microorganismos.

El procedimiento detallado proporcionado para la tinción de Gram destaca la

importancia de la preparación cuidadosa de muestras, la aplicación secuencial de
diferentes colorantes y la observación microscópica detallada. Además, se destaca la
necesidad de utilizar materiales estériles y mantener condiciones asépticas durante el
proceso.

Actividad

1. ¿Qué características estructurales de las bacterias son responsables de las

diferencias en la tinción de Gram entre las bacterias Gram positivas y Gram
negativas? Describe la composición de la pared celular en ambos tipos de
bacterias y cómo esto influye en la tinción.

Las bacterias Gram Positivas tienen una capa de peptidoglicano en su pared.

Las bacterias Gram Negativas tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa más
externa de lipopolisacáridos, lipoproteínas y lípidos.

25
 2. ¿Por qué es importante fijar las muestras antes de realizar la tinción de
Gram? Explica el propósito de la fijación y cómo afecta la observación
microscópica.

Para proteger las subestructuras celulares finas y la morfología de los microorganismos más
grandes.

3. ¿Cuál es la relevancia de la tinción de Gram en la clasificación de bacterias

según su susceptibilidad a los antibióticos? Explora cómo la información
obtenida de la tinción de Gram puede influir en la elección del tratamiento
antimicrobiano.

4. ¿Qué es la placa dental?

Película pegajosa y bacteriana que cubre los dientes

5. Investiga 10 especies de bacterias gram positivas y 10 especies gram

negativas de importancia médica y enlístalas a continuación.

Bacteria ¿Gram(+) o Gram(-)? Patología relacionada

Staphylococcus Positiva Endocarditis y osteomielitis.
Estreptococos beta Positiva Bacteria común en el tubo
digestivo, el tracto urinario y
la región genital.
Estreptococcus Positiva Infecciones en la garganta,
como en las amígdalas.
Viridans Positiva Infecciones mayormente en la
cavidad oral, pueden causar
infecciones mas graves si

26
 entran en el torrente
sanguíneo.
Estreptococcus Positiva Se contagian por secreciones
nasales o de la garganta de
personas infectadas con
lesiones cutáneas.

27
Enterococos Positiva intraabdominales, prostatitis,
celulitis e infecciones de las
heridas
Pneumococos Positiva neumonía, meningitis,
sinusitis, otitis e infecciones
en los ojos
Bacilos Positiva infección urinaria, la
tuberculosis, la meningitis, la
gonorrea, la clamidia y la
sífilis
Bacillus anthacis jejuni Positiva Ántrax
Corynebacterium diphtheriae Positiva Lesiones en la vías
respiratorias, orofaringe, el
miocardio, el sistema
nervioso
Neisseria Negativa Gonorrea
Gonorrhoeae Negativa Infecciones atreves de
relaciones sexuales
Neisseria Negativa Gonorrea
Meningitidis Negativa Meningitis
Branhamella Negtaiva Infecciones del oído y las vías
aéreas superiores e inferiores
Catarrhalis Negativa Infección respiratoria baja en
adultos con enfermedad
pulmonar cronica
Acinetobacter sp Negativa Signos y síntomas de
neumonía
También en el sistema
urinario presenta dolor y
ardor
Bordetella pertusis Negativa Causante de tos ferina, tos
convulsa o coqueluche
Brucella sp Negativa Brucelosis, infección del
revestimiento interno del
corazón
Campylobacter Negativa Infecciones, endocarditis,
osteomielitis o artritis séptica

6. Investiga y completa la siguiente tabla.

Tinción Uso Reactivos utilizados

28
 Técnica de tinción diferencial Fucsina fenicada, decolorante
utilizada para identificación deBK Y Azul de metileno.
Tinción de Ziehl-Neelsen microorganismos patógenos.

29
 Se emplea al realizar un Suspensión de líquido
examen de microscopia directacefalorraquideo.
de la capsula de
Tinción con tinta china microorganismos variado.
Facilita la detección del
cryptococos neoformans, un
hongo que puede provocar
complicaciones medicas como
la meningitis.

Es una solución de tinción Glicerol 40 ml, Fenol

lista para usar para la tinción (cristales) 20 g, ácido láctico
de hongos en bacteriología con 20 ml, agua destilada 20 ml.
Tinción de Azul de muestras de origen humano.
Algodón con Lactofenol

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