PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGICAS EN EL LABORATORIO

CLÍNICO. ¿SE REALIZAN BIEN?

QFB. Oscar Aguilar Sierra

1. Determinación del sistema ABO. 3. Prueba de Coombs directa.

2. Determinación del sistema RhD. 4. Prueba de Coombs indirecta.

La inmunohematología es una rama de la hematología que estudia los procesos

inmunitarios relacionados con los elementos sanguíneos, esta dividida en
inmunohematología eritrocitaria que se encarga de determinar grupos sanguíneos y estudiar
anticuerpos antieritrocitarios utilizando técnicas serológicas y moleculares; e
inmunohematología leucoplaquetaria que estudia los anticuerpos antiplaquetarios,
antineutrófilos y tipifica la HLA utilizando métodos de adherencia en fase sólida,
citofluorometría, enzimoinmunoanálisis y técnicas moleculares.
La determinación del sistema ABO es la prueba más comúnmente realizada en
laboratorios clínicos y su objetivo es comprobar la presencia o ausencia de antígenos en la
membrana eritrocitaria del paciente. De manera general los eritrocitos tienen en su
estructura lo que se conoce como sustancia precursora (grupo R, galactosa y acetil
glucosamina), además de contar con genes específicos que codifican de manera natural la
síntesis de transferasas que agregan un carbohidrato adicional a la sustancia precursora (SP)
dando como resultado los diferentes grupos sanguíneos.
Todos los eritrocitos (excepto los de fenotipo Bombay) presentan el gen H que incorpora
una fucosa a la SP; en pacientes grupo O se encuentra presente un gen que codifica una
transferasa tipo O sin capacidad enzimática; en pacientes grupo A encontramos uno o dos
genes que codifica una transferasa tipo A, la cual incorpora un acetil galactosamina a la SP;
en pacientes grupo B encontramos uno o dos genes que codifica una transferasa tipo B, la
cual incorpora una galactosa a la SP; por último, en pacientes grupo AB los genes y
transferasas de los grupos A y B se encuentran expresados por lo que habrá incorporación
de un acetil galactosamina y una galactosa a la SP. Por lo anterior es adecuado establecer
que el carbohidrato terminal determinara el grupo sanguíneo del paciente.
Los eritrocitos además de contar genes que codifican la síntesis de antígenos, también son
capaces de estimular al sistema inmunológico para generar anticuerpos libres en el suero
con la capacidad de lisar células sanguíneas pertenecientes a otros tipos de sangre, de esta
manera en pacientes del grupo O se encuentran presentes anticuerpos anti-A y anti-B; en
pacientes del grupo A se encuentran anticuerpos anti-B; en pacientes del grupo B se
encuentran anticuerpos anti-A; y por último, en pacientes con grupo AB no se encuentran
anticuerpos. Los pacientes de fenotipo Bombay no presentan el gen H, por lo que sintetizan
un anticuerpo H, además de sintetizar los anticuerpos anti-A y anti-B lo que les ocasiona
que no puedan recibir transfunciones sanguíneas de otro tipo que no sea fenotipo Bombay.

Para realizar la determinación del grupo ABO en el laboratorio es necesario contar con
antisueros A, B y un control los cuales son preparados en ratones, las técnicas más
utilizadas para realizar esta determinación son la técnica en placa, en tubo, en micro placa y
en columna de gel o perlas de vidrio. Es importante mencionar que la técnica de
aglutinación en placa no es recomendable para dar un resultado determinante sobre el grupo
sanguíneo de algún paciente, ya que esta técnica no tiene trazabilidad, tiene una alta
probabilidad de contaminarse y su sensibilidad es baja, su uso está más enfocado como un
método rápido de comprobación del grupo sanguíneo del paciente.

En general todas las técnicas para realizar la determinación del sistema ABO consisten en
incorporar una gota de los eritrocitos preparados del paciente con una o dos gotas del
antisuero (A, B o control), para posteriormente realizar una centrifugación y finalmente
observar si existe la presencia de aglutinación (resultado positivo). Es necesario realizar la
determinación tanto directa como indirecta, ya que el solo realizar la determinación directa
puede llevar a dar un resultado erróneo, la técnica indirecta es similar a la directa solo que
en esta se utiliza suero del paciente con eritrocitos conocidos (A o B) y se determinan los
anticuerpos presentes en el suero del paciente. Es importante mencionar que siempre se
debe realizar la prueba control y esta debe ser negativa, de lo contrario (si es positiva) la
determinación sería invalida.

La técnica en columna de gel o perlas de vidrio es la más recomendable para realizar la

determinación del sistema ABO, el proceso de esta técnica es el mismo que en todas las
demás, requiere de eritrocitos preparados del paciente, antisueros (A, B y control) y
eritrocitos conocidos (A y B), la columna posee en su interior una capa de gel o perlas de
vidrio que cumplen la función de actuar como un sistema de filtración o película porosa que
mantiene los eritrocitos no aglutinados al fondo de la columna y los aglutinados en la
superficie.

Las causas por las que en una determinación de grupo ABO se encuentran discrepancias
son ser errores técnicos y problemas relacionados con los antígenos o con los anticuerpos
(adquiridos o heredados) y toda discrepancia debe ser aclarada antes de liberar resultados
finales.
La determinación del sistema ABO para la realización de transfusiones sanguíneas es de
suma importancia, ya que mediante la determinación del grupo sanguíneo (entro otros
factores) se podrán transfundir los diferentes componentes sanguíneos, aunque esta
determinación no siempre es posible de realizar en urgencias transfuncionales porque los
pacientes necesitan recibir los componentes sanguíneos lo antes posible, en estos casos se
debe proceder de acuerdo a la norma vigente, en México la NOM-253-SSA1-2012 en sus
puntos 11, 12 y 13 hace mención de la metodología a seguir, en ella menciona que las
determinaciones del sistema ABO, RhD y pruebas cruzadas se deben realizar para evitar
reacciones postransfuncionales, aunque existe la posibilidad de poder transfundir
concentrado eritrocitario tipo O RhD+ siempre y cuando el paciente sea indudablemente
RhD+ (ABO desconocido); o transfundir concentrado eritrocitario O RhD- si el paciente es
RhD- o se tiene duda sobre su RhD.
En recién nacidos (menores a 6 meses) no es recomendable realizar la determinación del
grupo ABO, los antígenos de membrana aún no se expresan totalmente (técnica directa) y
los anticuerpos en su suero provienen de la madre (técnica indirecta) por lo que resulta
poco relevante determinar el grupo ABO, a menos que requiera de algún procedimiento
transfuncional. Es importante mencionar que la determinación del sistema ABO no es una
prueba de paternidad y los resultados antes de los 6 meses de edad de un recién nacido
pueden ser confusos e incluso erróneos.

El sistema RH, es el más importante después del sistema ABO en medicina transfuncional,
es un sistema complejo y bastante polimórfico que cuenta con 55 antígenos diferentes entre
los cuales D, C, c, E, y e son los más importantes, a diferencia del sistema ABO estos
antígenos no se generan de manera natural, ya que requieren de un estímulo para ser
expresados. En este sistema la presencia del gen RHD (30 epitopes) en la membrana
eritrocitaria lleva a la producción del antígeno D: mientras que la presencia del gen RHCE
en la membrana eritrocitaria lleva a la producción de los antígenos C, c, E y e, los
individuos (D-) que se exponen de manera consciente a eritrocitos D+ tienen de un 80 –
90% de probabilidades para generar anticuerpos anti-D, en condiciones hospitalarias por
una transfusión incompatible la probabilidades de los pacientes de generar anticuerpos anti-
D es del 35%. Es importante realizar la tipificación del antígeno D para evitar la
sensibilización de pacientes y gestantes, además de identificar correctamente a donantes y
los fetos.

La determinación del antígeno D se puede realizar mediante una identificación directa

(salina rápida) y una identificación en fase Coombs, en ambas se debe contar con al menos
un suero anti-D tipo blend (IgM + IgG) y en el caso de la identificación en fase Coombs un
anti-D (IgG). La identificación directa consiste en hacer reaccionar una gota de suero anti-
D con una o dos gotas de eritrocitos preparados del paciente, centrifugar y posteriormente
observar si existe presencia de aglutinación (IgM se une a los eritrocitos), lo que nos
indicaría que el paciente es D+. La identificación en fase de Coombs se realiza cuando se
considera que en el paciente la expresión del antígeno D es débil, la identificación consiste
en tomar los eritrocitos anteriores (D-), añadir anti-D (IgG) y un potenciador para llevar
incubar a 37 °C (el tiempo cambia respecto al potenciador), posteriormente realizar 3
lavados y, por último, añadir suero de Coombs para analizar si existe presencia de
aglutinación (IgG se una a los eritrocitos).
Al igual que en la determinación del grupo ABO es de suma importancia realizar una
prueba control, ya que esta nos indicara que el paciente esta reaccionado efectivamente a
los anticuerpos D y descartará que sus eritrocitos vengan previamente unidos a un
anticuerpo desconocido, la prueba de control siempre deberá ser negativa para poder
validar los resultados. Cuando la prueba control en fase de Coombs es positiva, se deduce
que los eritrocitos del paciente ya vienen con un anticuerpo unido a su membrana y por
tanto es necesario realizar una prueba de Coombs directa para determinar el tipo de
anticuerpo o complemento unido a su membrana, posterior a ello se puede realizar un
lavado de los eritrocitos para eliminar los anticuerpos o el complemento (Cloroquina para
IgG y ZZAP para complemento) y de esta manera poder efectuar nuevamente la
determinación del RHD en fase de Coombs sin la interferencia de otros anticuerpos, aunque
todo este proceso final no se realiza de manera frecuente en México. En general solo en
bancos de sangre se realizan tanto las pruebas de identificación directa y de identificación
en fase de Coombs, en los laboratorios clínicos es suficiente con realizar solo la
identificación directa (salina rápida) y siempre se debe mencionar en los resultados que
solo se realiza la determinación directa.

La prueba de Coombs busca investigar de manera in vivo la adherencia de anticuerpos o

complemento a la membrana de los eritrocitos del paciente. Es una prueba especialmente
útil en anemias como la enfermedad hemolítica peri-natal, la enfermedad hemolítica auto-
inmune, la hemolisis inducida por drogas y las reacciones hemolíticas inmunes
postransfuncionales, ya que permite comprobar si los eritrocitos del paciente están siendo
atacados por anticuerpos o complemento, es importante mencionar que la prueba de
Coombs no es un diagnóstico y esto se debe a que se requieren de otros factores y estudios
clínicos para realizar un diagnóstico adecuado.
La prueba consiste en tomar eritrocitos preparados del paciente, añadirles suero de Coombs,
incubarlos y finalmente observar la presencia o ausencia de aglutinación. La presencia de
aglutinación solo es un indicador de que en los eritrocitos existe un anticuerpo tipo IgG o
complemento unido (no define de cual se trata). Cuando se observa un resultado negativo
se debe realizar una comprobación, en la que se demuestra que no existe unión a los
eritrocitos y se evidencia que el suero de Coombs no se encuentra inactivo, la prueba
consiste en añadir a la muestra negativa eritrocitos sensibilizados y centrifugar, en este caso
si el suero no está inactivo se debe observar aglutinación, de lo contrario toda la prueba es
invalida. Es importante que en la preparación de los eritrocitos del paciente se realice
correctamente el lavado de los mismo para evitar la inactivación del suero de Coombs.

La inactivación del suero de Coombs se produce cuando los eritrocitos del paciente no se
preparan adecuadamente (deben ser preparados de acuerdo a las indicaciones del inserto),
cuando estos eritrocitos mal preparados interactúan con el suero de Coombs (AHG), este se
inactiva por la posible presencia de anticuerpos restantes en el suero del paciente, la AGH
es suero anticuerpo anti anticuerpo humano capaz de reaccionar o interactuar todas las
globulinas humanas, es por esto que se deben preparar adecuadamente los eritrocitos, para
observar si estos traen un anticuerpo unido a su membrana. El lavado del material a utilizar
también es importante, ya que los limpiadores utilizados también pueden inactivar el suero
de Coombs y llevar a un resultado erróneo en la prueba.

La prueba de rastreo de anticuerpos irregulares (Coombs indirecta) se usa

específicamente para determinar la incompatibilidad materno-fetal en la que el feto genera
antígenos que se liberan por sangrado trasplacentario, lo que ocasiona que el organismo de
madre genere anticuerpos que ataquen y ponga en riesgo la vida del feto; y para evitar las
reacciones transfuncionales hemolíticas. La causa más común de incompatibilidad materno
fetal y reacciones transfuncionales hemolíticas es el antígeno D, aunque en general son muy
variados los antígenos que pueden causar incompatibilidad, la ISBT reconoce más 370
antígenos pertenecientes a 43 sistemas de grupos sanguíneos de alta y baja frecuencia, cabe
mencionar que no todos tienen capacidad inmunogénica (inducir anticuerpos), y aquellos de
que inducen la síntesis de anticuerpos solo son significativos aquellos anticuerpos con la
capacidad de producir hemolisis.

En relación con la incompatibilidad materno-fetal en madres con un primer embarazo

incompatible tienen bajas probabilidades de presentar complicaciones, pero si llegan a tener
un segundo embarazo es seguro que habrá una reacción de incompatibilidad porque ya
habrán estado sensibilizadas durante su primer embarazo, los anticuerpos IgG son aquellos
que se buscan en esta determinación, ya que tienen la capacidad de atravesar la placenta.

Es importante identificar que se está buscando (antígenos o anticuerpos), si se desea

identificar los antígenos en la membrana eritrocitaria del paciente se debe utilizar un suero
comercial con anticuerpos; mientras que si el objetivo es determinar los anticuerpos en el
suero del paciente se utilizaran eritrocitos conocidos (comprados) para la prueba. Las
células de eritrocitos conocidos deben estar estandarizadas para poder ser utilizadas, deben
contar con un panel de control que indica todos los antígenos presentes con el fin de poder
establecer el tipo de antígeno que está causando la incompatibilidad.