Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Facultad de Ciencias Biológicas

Licenciatura en Biotecnología

“CRISPR - Cas 9”

Materia: Química Analítica

Profesora: Fabiola Avelino Flores
NCR: 34302
Sección: 001

Integrantes:
Nidia Michelle Olguin Trejo
Samantha Gigdém Narváez Osorio
INTRODUCCIÓN

La edición genética se ha visto muy marcada en los últimos años y esto

por el gran impacto que ha generado con relación a enfermedades,
mejora de cultivos, área clínica, etc. Es impresionante como la
comunidad científica ha buscado la manera de adentrarse cada vez más
al mundo celular, demostrando la capacidad que se tiene de manipular
células de una manera que antes no se imaginaba. Una de estos
grandes avances es la nueva tecnología CRISPR – Cas9 que consiste
básicamente en un método que corta y pega pedazos de ADN,
dándonos la posibilidad de modificar ADN; logrando corregir grandes
errores genéticos de los cuales parecían no tener remedio. “El
descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas y concretamente del
sistema CRISPR-Cas9 ha supuesto una revolución en el campo de la
ingeniería genómica y la biotecnología, puesto que permite editar
cualquier región del genoma de cualquier organismo de manera
altamente eficaz, precisa y económica. Así, desde su descubrimiento
como un sistema natural de inmunidad adaptativa en organismos
procariotas, sus características estructurales y funcionales han sido
estudiadas y redefinidas hasta obtener variantes de CRISPR-Cas9 que
incrementan la versatilidad de esta maquinaria para su empleo en
investigación e industria” (Piñon, 2017). Todo esto nos abre un mundo
de posibilidades en los cuales el ser humano tiene el poder de realizar
cualquier modificación, aún más cuando el método resulta ser
demasiado eficiente, barato y de fácil realización, algo que antes
resultaba difícil, complejo y aún ineficiente. Esta nos ofrece una edición
que se basa en la proteína Cas9 y el sistema CRISPR, siendo
incorporada a los laboratorios en los que se ha visto la posibilidad de
trabajar con genes de organismos y la generación de nuevas cosas de
una manera más rápida.
En el presente trabajo se tratarán puntos en relación con esta tecnología
CRISPR – Cas9 como son sus antecedentes, técnica, usos y caso
aplicativo para así tener una noción de lo que es este procedimiento y
no pasándolo por alto ya que ha venido a revolucionar la edición
genética siendo una gran herramienta para científicos que ayudarán a
dar respuesta a múltiples problemas en el genoma humano y no solo
eso, sino la búsqueda de mejoras y avances que puedan obtenerse de
igual forma.
OBJETIVOS

● Proporcionar al grupo una aproximación al sistema CRISPR/cas9

realizando una investigación detallada de su estructura y modo de
acción en situaciones naturales, así como los avances que le han
permitido convertirse en la herramienta de edición del genoma
más popular.
● Descripción de las nucleasas CRISPRCas9 y su función natural
en procariotas.
● Desarrollo de tecnología CRISPRCas9 para edición de genes en
eucariotas
● conocer las ventajas y desventajas de esta técnica y sus
perspectivas de futuro.

ANTECEDENTES GENERALES
La era de la ingeniería genética inicia en 1973, con los primeros
experimentos cuando Stanley Cohen, Herbert Boyer y Paul Berg
(Premio Nobel de Química 1980). Demostraron que el gen para el ARN
ribosomal de la rana podía ser transferido y expresado en una célula
bacteriana. Este puede considerarse como el primer ejemplo de edición
genética. Años más tarde con la mutagénesis dirigida, utilizando ADN
sintético como agente para modificar genes, desarrollándose en 1978
por Michael Smith (Premio Nobel de Química 1993). Produciendo
mutaciones puntuales basadas en la noción de que se pueden inducir
mutaciones específicas en sitios específicos de un genoma. Usando
oligonucleótidos sintéticos producidos, desarrollando y perfeccionando
un método para modificar selectivamente mutaciones en genes. Con el
paso del tiempo la ciencia ha logrado avances aún más grandes
resultado de ello nuevas técnicas de mayor precisión y factibilidad. Entre
ellas podemos encontrar las nucleasas con dedos de zinc en el año
2000 y la tecnología de TALENs (transcription activator-like effector
nucleases) en el año 2010. Las nucleasas unidas a dedos de zinc (ZFN)
son una clase de proteínas de unión al ADN diseñadas que nos facilitan
la edición en una zona específica en nuestro genoma mediante la
creación de rupturas de doble cadena en el ADN, parte de la proteína
reconoce una secuencia de ADN específica y otra parte corta el ADN.
Desarrollada uniendo una serie de dominios de unión al ADN más
pequeños para reconocer una secuencia de ADN más larga. Este
dominio (dominio Cys2His2, que reconoce un triplete específicoo según
los residuos de la α hélice que se hayan elegido) de unión al ADN se
fusiona con una nucleasa que cortará el ADN cercano.
Por otro lado la tecnología TALENs (Transcription activator-like effector
nuclease) son un tipo de enzimas de restricción diseñadas
artificialmente para cortar una secuencia específica de ADN.
Constituidas al fusionar un efector tipo TAL y un dominio cortador del
ADN (una nucleasa que corta hebras de ADN). Los efectores TAL
—TALEs— pueden ser diseñados para cumplir la misión de unirse a
prácticamente cualquier secuencia de ADN, por lo que al unirse a una
nuclaeasa, el ADN se puede cortar en lugares específicos. Las enzimas
de restricción pueden introducirse en células, pueden utilizarse en la
edición génica y del genoma in situ, técnica conocida como edición
genómica mediada por nucleasas.Diseñarla es mucho más fácil en
comparación con dedos de Zinc , sin embargo por ser de gran tamaño
suele ser complicado trabajar con ellas
“Mientras la tecnología TALENs utiliza motivos de unión de ADN para
dirigir a una nucleasa. Las nucleasas unidas a dedos de zinc reconocen
tripletes de ADN, cada dominio de TALEN reconoce un solo nucleótido.
Estas herramientas actualmente son de las más confiables y
empleadas. Aunque ambas herramientas presentan ventajas
considerables (facilidad de localizar secuencias, diseño rápido y
precisión al escindir), también son métodos costosos y, en ocasiones, su
construcción resulta complicada. Por ello, el sistema CRISPR surge
como una alternativa factible para lograr la edición del genoma: es de
fácil diseño e introducción, más económico, rápido y eficiente al
momento de localizar y modificar una secuencia. Por estos factores,
CRISPR se ha convertido en uno de los sistemas con mayor potencial
en la edición genómica y actualmente se estudian sus posibles
aplicaciones en diversos ámbitos” (Lammoglia-Cobo, 2016)
En 1987, un grupo de investigación de la Universidad de Osaka observó
secuencias repetidas de 29 nucleótidos altamente conservadas en el
genoma de Escherichia coli. quienes accidentalmente clonaron una
serie inusual de estas secuencias intercaladas con secuencias
espaciadoras mientras analizaban un gen responsable de la conversión
de la fosfatasa alcalina. Sin embargo, debido a la falta de suficientes
datos de secuencias de ADN, la función de estas matrices seguía
siendo un misterio.Se había pensado que estas secuencias eran ADN
basura; sin embargo, tras análisis bioinformáticos se revelo que las
secuencias entre estos repetidos, llamadas espaciadoras, eran
complementarias con secuencias de algunos fagos y virus que atacan a
las bacterias. Esto confirmo que las bacterias poseían algo similar a un
sistema inmune con memoria. Posteriormente, Koonin y Makarova
propusieron que algunos organismos (principalmente las bacterias y
arqueas) integran fragmentos del ADN de los fagos en su propio
genoma y que, al transcribirse, reconocen las del nuevo virus y forman
un complejo de doble cadena que detiene el proceso infectivo. Es así
como fueron llamadas CRISPR, con el silenciamiento génico por ARN
interferente en eucariontes. Tiempo después, en 2007, otro equipo
demostró que Streptococcus thermophilus podía adquirir resistencia a
un fago, ya que al ser expuesto a éste incorporaba un fragmento de la
secuencia del intruso. Una vez asentadas las bases de CRISPR, las
investigaciones se centraron en establecer las moléculas involucradas
en el procesamiento del ARN con la secuencia complementaria (ARNcr)
y la formación del complejo CRISPR/Cas. Así también se descubrió su
actividad endonucleasa y la presencia de dos sitios de corte, además de
la alta especificidad del ARNcr, se comenzó a plantear la posibilidad de
utilizar a CRISPR/Cas como un sistema de edición genómica.
Es así como en 2012 surge una nueva técnica basada en un sistema
que tienen las bacterias para defenderse del ataque de los
bacteriófagos. Está técnica de edición genética conocida como
CRISPR-Cas9, por sus siglas en inglés, que quieren decir Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats o Repeticiones
Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente utiliza a la enzima Cas9
para introducir cortes de doble cadena en la hebra del DNA;activando el
sistema de reparación endógeno de la célula. Algo a resaltar de este
sistema es que la enzima Cas9 puede ser dirigida al sitio de corte por un
RNA guía (RNAg), el cual se diseña en base a la secuencia del gen que
se desee modificar.

Tabla 1 Comparación de técnicas de edición genética (ResearchGate, 2016)

ANTECEDENTES ESPECÍFICOS

La edición genética hace referencia a una técnica en la que secuencias

de ADN se modifican o editan directamente en el genoma de las células
vivas. Aunque disponemos de herramientas eficaces para editar genes
en las bacterias desde hace décadas, la capacidad de editar ADN
en células eucariotas, que albergan el genoma en una estructura
separada llamada núcleo, iba muy retrasada hasta el descubrimiento de
CRISPR.

¿Qué es CRISPR?

Se utiliza el acrónimo CRISPR para nombrar a secuencias repetitivas

presentes en el ADN de las bacterias, que funcionan como
autovacunas.
En su interior contienen el material genético de los virus que han
atacado a las bacterias en el pasado, por eso permiten reconocer si se
repite la infección y defenderse ante ella cortando el ADN de los
invasores.
La ciencia ha descifrado la manera de utilizar la herramienta CRISPR
fuera de las bacterias para cortar y pegar trozos de material genético en
cualquier célula. El poder de estas tijeras moleculares ha generado un
gran impacto con respecto a la edición genómica ya que desde que fue
descubierta, científicos han trabajado con ella, por su versátil y facil
procedimiento. Por eso, fue considerado el mayor avance científico del
año 2015.

Después de este hallazgo, correspondía a genetistas y bioquímicos

determinar cómo funcionan los sistemas inmunes CRISPR, en concreto,
qué enzimas participaban y cómo eran capaces de reconocer con
precisión rasgos únicos de ADN viral durante una infección. A partir del
trabajo de innumerables investigadores de todo el mundo, empezó a
surgir una comprensión nueva y unificada: las bacterias y las arqueas
usan moléculas de ácido ribonucleico o RNA para identificar secuencias
coincidentes de ADN en el genoma viral, junto con una o más proteínas
codificadas por genes asociados a CRISPR para fragmentar el ADN
(Klompe y Sternberg, 2018).
CRISPR eran en realidad unas tijeras moleculares de precisión, con la
asombrosa capacidad de actuar sobre secuencias específicas de ADN y
neutralizarlas, cortando ambos filamentos de la doble hélice. Y la
estrella de este proceso era una proteína llamada Cas9.
¿Cómo funciona?

CRISPR utiliza unas guías y una proteína (Cas9) para dirigirse a zonas
elegidas del ADN y cortarlas. A partir de ahí, se pueden pegar los
extremos cortados e inactivar el gen, o introducir moldes de ADN, lo que
permite editar sus ‘letras’ a voluntad del que las utiliza.

Así funciona CRISPR, la revolucionaria herramienta de edición de ADN(Sinc, 2015)

MATERIAL DE UTILIDAD
● Botella de vidrio para verter platos
● Asas de inoculación/esparcidor de placas
● Pipeta ajustable de volumen variable de 10-100 ul (incrementos de
1 ul)
● puntas de pipeta
● 14 placas Petri
● Gradilla para tubos de microcentrífuga
● Guantes de nitrilo
● Tubos de microcentrífuga
● Tubo de 50 ml para medir
● Tampón de transformación bacteriana 25 mM CaCl2, 10 % PEG
8000
● Medios LB para recuperación de transformación
● plásmido Cas9
● plásmido de ARNg
● Plantilla de ADN

EQUIPO DE UTILIDAD

Nucleofector

4D-Nucleofector™(Lonza)
Esta es una tecnología basada en crear pequeños agujeros en la
membrana celular mediante la aplicación de un pulso eléctrico. La forma
más integral en la que se desarrollan los programas Nucleofector™
específicos del tipo de célula y las soluciones permite la entrega de
sustratos de ácido nucleico no solo en el citoplasma, sino también a
través de la membrana nuclear y en el núcleo. Esto permite una alta
eficiencia de conversión de hasta el 99 % y hace que el éxito de la
transfección sea independiente de cualquier proliferación celular.

Características a resaltar:

voltaje de corriente alterna (Vca o Vac en inglés)

hz ciclos por segundo

Dimensiones (ancho × profundidad × altura) 30 × 23 × 11 cm (11,81 ×

9,06 × 4,33 pulgadas)
Peso 2,8 kg (6,2 libras)
Fuente de alimentación 100 – 110 VCA o 230 VCA
50 – 60 Hz, autorregulable
Entre otros
Consumo de energía 50 VA/fusible T630mA L250V
Protección IP 20, EN 61010-1, UL 61010A-1
para su manipulación es necesario un previo entrenamiento

LIMPIEZA

Para su limpieza y desinfección es necesario

Desconectar lafuente de alimentación

Utilizar un paño húmedo para limpiar el exterior del

(agua o etanol al 70-80 %), evitando mojar el compartimento interior del
recipiente del transportador.

PARA SU MANTENIMIENTO
No se requiere mucho para garantizar un funcionamiento fiable del
instrumento Nucleofector ha sido diseñado para su uso en una campana
de extracción estéril con o sin una fuente de radiación UV. La exposición
prolongada del exterior de la carcasa a la luz ultravioleta causará
decoloración sin afectar la funcionalidad del dispositivo Nucleofector.
Cuando los flujos laminares regulares se desinfectan en el sustrato
mediante la radiación UV durante la noche, el dispositivo debe
protegerse con protectores adecuados o retirarse durante períodos
prolongados de exposición a los rayos UV.
El dispositivo Nucleofector está protegido por dos fusibles principales,
ambos ubicados dentro del enchufe integrado en la toma eléctrica
interna. En caso de que se funda el fusible, puede reemplazarlo
fácilmente. Desconecte el dispositivo Nucleofector de la fuente de
alimentación e inserte un destornillador plano pequeño en la ranura del
lado derecho del receptáculo para abrirlo. La parte superior e inferior del
receptáculo deben tener fusibles activos en sus ubicaciones internas
para que funcionen. El fusible fundido generalmente se puede identificar
al observar el cable dentro del tubo de vidrio. Use sólo fusibles T630mA
o L250V para reemplazar los fusibles.
EN CASO DE ACCIDENTE
Generalmente los equios no presentan ningún riesgo de accidente. Pero
si existe peligro de sobrecalentamiento:
Entonces sera necesrio
1. Avisar al personal que pueda estar presente en el laboratorio y
evacuar inmediatamente este en caso de peligro de incendio.
2. Notifique al encargado del mantenimiento del equipo, ya que será
responsable del mal funcionamiento o falla actual del dispositivo.
En caso de descarga eléctrica (muy improbable ya que está protegido
de que suceda)

BENEFICIOS DE LA NUCLEOFECCIÓN
● Alta eficiencia de conversión hasta 90% para ADN plasmídico y
99% para oligonucleótidos (tipo de siRNA).
● Excelente conservación del estado fisiológico y viabilidad de las
células transfectadas
● Análisis de los resultados del transgén a las pocas horas de la
transferencia del gen.
 ● Tecnología fácil de usar, con más de 650 protocolos específicos
de células que se han probado con éxito anteriormente.
Escalabilidad flexible de diferentes módulos y plataformas
NucleofectorTM, incluidas opciones de transporte de bajo, medio y
alto rendimiento y fácil cambio entre estos dispositivos.
● Transforma una amplia gama de sustratos, incluidos: ADN, ARNm,
miARN, siARN, péptido o proteína.
● Indicado para una variedad de aplicaciones, como la eliminación
de genes terapéuticos RNAi o CRISPR y la inducción de células
madre pluripotentes inducidas o CART, entre otras. La tecnología
NucleofectorTM se utiliza actualmente en muchas áreas de
investigación, incluida la genómica funcional y estructural, el
descubrimiento de fármacos y la terapia celular y génica
● La administración de células difíciles de transmitir, incluidas:
células primarias, células madre, organoides, neuronas, células o
células de adhesión .
● Minimice el riesgo de contaminación cruzada mediante el manejo
de cubetas (NucleocuvetteTM), estériles y desechables.
● Excelente soporte técnico y de aplicaciones de un equipo
científico altamente calificado y experimentado.
● Escalabilidad flexible de diferentes módulos y plataformas
NucleofectorTM, incluidas opciones de transmisión de bajo, medio
y alto rendimiento y fácil cambio entre estos dispositivos.

TÉCNICA CRISPR-CAS9

Busca cambiar o editar partes del código genético de una célula. esta
técnica utiliza una molécula de ARN con una secuencia especial para
guiar a la enzima cas9 hacia una secuencia deseada del ADN para
después cortar la líneas de ADN en esa área y quitarlas para después
colocar nuevo y diferente ADN.

¿Qué es el sistema CRISPR Cas9?

Es un sistema inmunitario adaptativo procariótico, presente en una gran

parte de las bacterias y en una gran porción de las arqueas, lo que
representa un ejemplo de la memoria celular heredada. Funciona
recopilando y archivando información, fragmentos de material genético
de bacterias y plásmidos invasores que se transcriben como CRNA. son
estos los que actúan como instrucciones para las enzimas llamadas
endonucleasas cas de la célula huésped, que en infecciones posteriores
degradan el ARN o el ADN foráneo siempre que presente
consecuencias complementarias para el ARNc un ejemplo de de la
estructura del locus CRISPER es que este tiene dos componentes
distintos: el operón cas, que contiene las regiones codificantes para las
endonucleasas y otras proteínas de unión a crisper en el ADN y la
región CRISPR que contenga repeticiones intercaladas con pequeñas
secuencias espaciadoras, de origen exógeno.

Sistema CRISPRCas9 (RAO, 2020)

Clasificación del sistema CRISPR

Existen diversos sistemas que en la actualidad se encuentran en 2
clases, 5 tipos y 16 subtipos, siguiendo un criterio basado en la
arquitectura de sus componentes y mecanismos de acción.
Según quien lleve a cabo la escisión de los ácidos nucleicos invasores,
se distinguen sistemas CRISPER de la clase 1 y clase 2. En la clase 1
se encuentran todos aquellos sistemas que requieren de un gran
complejo de proteínas afectadas guiado por ARN para llevar a cabo la
escisión del ADN o ARN foráneo.
Los sistemas CRISPR de la clase 2, precisan de una proteína
endonucleasa afectada, que guiada por ARN lleve a cabo la
neutralización del genoma invasivo, como es el caso cas9 y cpf1.
dentro de estas dos clase, se agruparán los distintos tipos de sistemas
CRISPR:
clase 1: tipos I, II y IV
clase 2: tipos II, V y IV
TIPO I La proteína enzimática se une a la secuencia PAM y forma un
complejo defecto con el ARN precursor de Cas3. La nucleasa Cas3 no
solo corta el ADN, sino que también funciona como una exonucleasa
3'5', por lo que es capaz de destruir grandes fragmentos de ADN
Tipo II. Esta clase utiliza Cas9 como proteína efectora para cortar el
ADN, es la mejor estudiada y más utilizada en la edición del genoma
Tipo III. Utiliza Cas10 como nucleasa. Se parece al tipo I cuando se
forma el complejo multiproteico. Su peculiaridad radica en que también
es capaz de actuar sobre el RNA
Tipo IV. Aún no se ha caracterizado experimentalmente, pero se sabe
que utiliza múltiples complejos de proteínas para su actividad
Tipo V. Utiliza únicamente la proteína Cpf1 para romper la doble cadena
de ADN dejando extremos unidos, por lo que es de gran importancia en
la introducción de segmentos de ADN en eucariotas
Los subtipos hacen referencia a distintos mecanismos de generación o
biogénesis de crRNAs.
 Clasificación del sistema CRISPR Cas9

Estructura
Consta de dos elementos: un ARN de la secuencia CRISPR,
denominado "crRNA", y la endonucleasa Cas. La secuencia CRISPR
consta de la secuencia líder o secuencia promotora y varias secuencias
espaciadoras (25 a 50 nucleótidos) rodeadas de elementos repetidos,
generalmente palindrómicos (aproximadamente 32 nucleótidos). El
crRNA es responsable de dirigir Cas a su secuencia complementaria,
donde Cas corta la secuencia patógena. tenemos la secuencia conocida
como adyacente al proto espaciador PAM que incorpora nucleótidos
adyacentes al PAM como elemento espaciador junto al promotor en
CRISPR, creando así una memoria inmunológica

Estructura del sistema CRISPR Cas9

Etapas del funcionamiento del sistema

en general la actividad del sistema, para obtener inmunidad adquirida se
divide en tres fases: la fase de adquisición, la fase de expresión y la
fase de confusión, cada uno tiene los tipos diferentes de sistemas
CRISPR con características diferente y propias de la biología del
sistema sin embargo nos centraremos en analizar el sistema CRISPR
cas9.
El objetivo del paso de adquisición es recolectar e incorporar fragmentos
de ADN extraño o plásmido o ADN o ARN como continuación del
genoma de la entidad invasora en el locus CRISPR de la célula
huésped.
Los caracteres cósmicos se instalan entre las secuencias repetidas y en
la posición 5 para la secuencia de relleno justo después de la secuencia
inicial.
En la etapa de expresión, CRISPR se transcribe dando lugar a un largo
transcrito primario denominado pre rRNA que contiene al locus
tracrRNA y los espaciadores adquiridos en la etapa anterior separados
por secuencias repetidas. el prerRNA es tratado con endonucleasa
RNA III, creando secuencias de RNA que consisten en un solo
espaciador rodeado por una repetición corta que servirá como la región
de anclaje cas 9 en la etapa de entrecruzamiento.
La fase de entrecruzamiento ocurre cuando el genoma de un organismo
extraño repetido intenta volver a infectar la célula el cr-RNA maduro se
une a la secuencia del promotor de tracrRNA formando un ARN híbrido
que se requiere para dirigir la endonucleasas cas9 al material de
secuencia de destino mediante el emparejamiento de base del crRNA
con la secuencia objetivo de la entidad infectante entonces cas9
neutraliza el agente invasivo.

Etapas del funcionamiento del sistema

Un ejemplo en laboratorio:
Edición de células humanas mediante la técnica de edición crisper
cas
1. Para comenzar es necesario pasar la proteínas cas 9 por un
proceso de purificación y de esta manera obtener una proteína
limpia de impurezas. un ejemplo de purificacion de proteinas es la
cromatografía la cual busca la separación para la caracterización
 de mezclas complejas cuyo objetivo es separar diferentes
componentes, esto es aplicable en todas las ciencias; Según el
principio de retención selectiva, su objetivo es separar los
diferentes componentes de la mezcla, permitiendo la identificación
y cuantificación de dichos componentes.
2. La proteína será almacenada en el congelador para el
experimento de edición de genes.
3. Se obtendrán cultivos de células humanas a partir del
almacenamiento en nitrógeno líquido el cual alcanza hasta los
-200° C.
4. se levantara las células en placas para electroporar las con cargas
eléctricas y así de esta manera acceder dentro de de la célula y
acceder al núcleo para su edición
5. después se preparan los medios de cultivo los cultivos celulares
para calentarlos a 37° grados
6. las células serán suspendidas en medios para después ser
incubadas y promover el crecimiento

7. los cultivos pasarán por un proceso de centrifugación para

eliminar lo innecesario
8. se combinará la proteína cas9 y el ARN para formar un complejo
RNP que incide el ADN
9. se combinarán los cultivos celulares con el RNP
10. las células pasan por un proceso de electroporación con el
objetivo de aumentar la permeabilidad de la membrana y facilitar
el acceso de RNP
11. se extraerá el ADN para verificar con gel antes de la
secuenciación
12. Para finalizar se analizará la secuenciación para confirmar una
exitosa edición con CRISPR.
Modificación en el genoma humano

APLICACIÓN EN LA BIOTECNOLOGÍA (ARTÍCULO)

Eliminación mediada por CRISPR-Cas9 compatible con GMP a gran

escala del receptor de glucocorticoides en células T específicas de
multivirus

En el presente artículo se estudia a células T, celulas específicas de

multivirus (VST), estas han expresado tener buenos resultados para el
tratamiento de infecciones graves y refractarias a los medicamentos
después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (TPH). Sin
embargo, su eficacia se ve interrumpida por el uso de glucocorticoides
(fármacos antiinflamatorios, antialérgicos e inmunosupresores derivados
del cortisol o hidrocortisona, hormona producida por la corteza adrenal
esencial para la adaptación al estrés físico o emocional) que en varias
ocasiones se administran a los pacientes para el tratamiento de
complicaciones como la enfermedad de injerto contra huésped.
En el desarrollo de este experimento se lleva a cabo una estategia para
la generación rápida de células T específicas de multivirus (VST)
resistentes a los glucocorticoides (GMP) utilizando repeticiones
palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas con
Crispr - Cas9 .
Por medio de la eliminación del miembro 1 del grupo C de la subfamilia
3 de receptores nucleares ( NR3C1; el gen que codifica el receptor de
glucocorticoides), esto genera que los VST sean resistentes al efecto
linfocitotóxico de los glucocorticoides. Los VST NR3C1 -knockout (KO)
matan a sus objetivos y proliferan con éxito en presencia de altas dosis
de dexametasona tanto in vitro como in vivo. Para concluir los VST
modificados genéticamente nos ofrecen un enfoque novedoso para el
tratamiento de pacientes con infecciones virales potencialmente
mortales después del HSCT en terapia con glucocorticoides.

Procedimiento:
1. Se busca un donante sano seropositivo
2. Se recolecta PBMC
3. Generación de VST específicos de multivirus
4. Expansión de VST específicos de multivirus (NR3C1 CRISPR KO
a gran escala de VST específicos de multivirus)
5. Uso de nucleofactor 4D
6. Expansión de NR3C1 KO de VST específicos
7. Congelación y generación de biobanco de VST específicos de
multivirus NR3C1 KO
8. Descongelación e infusión a paciente inmunosuprimido con
infección viral

Resumen visual de procedimiento (Blood advances, 2020)

DISCUSIÓN
Específicamente el sistema CRISPR Cas9 , tipo II, utilizando la proteína
cas9 como su componente principal. Por su facilidad de acceso, bajo
coste económico y técnico, ha supuesto una revolución casi sin
precedentes en la edición del genoma. Como se explicó anteriormente,
el mecanismo de acción de CRISPR Cas9 en bacterias crea una
especie de "catálogo" de ADN viral después de su primer encuentro
con, generando así secuencias almacenadas, que se denomina ARN
guía, reconoce el ADN invasor. Es en esta etapa que las proteínas
Cas9, funcionan cortándolas y eliminándolas. Por lo tanto, es un sistema
inmunológico adaptativo. El estudio detallado de este mecanismo ha
planteado la posibilidad de que lo use en otros sistemas celulares para
guiar específicamente a la nucleasa Cas9 a otras secuencias. Dado que
la secuencia objetivo escindida por Cas9 está determinada por la
secuencia de ARN guía, es suficiente sintetizar una nueva molécula del
ARN guía para redirigir la nucleasa Cas9 a cualquier secuencia. Esto
convierte al sistema CRISPRCas9 en una técnica de edición del
genoma extremadamente accesible para toda la comunidad científica.

CONCLUSIÓN

La técnica CRISPR-Cas9 a evolucionado el área de la ciencia en

especial los laboratorios alrededor del mundo por sus diferentes
aplicaciones: permitiéndole a la humanidad realizar análisis de sistemas
de genes celulares permitiéndonos alcanzar las ideas de curas a
enfermedades que en un momento se creyó que no tendrán cura sin
embargo gracias a esa técnica lo están investigando.De igual forma el
cambiar rasgos físicos, crear bebés más sanos o corregir mutaciones
hereditarias pero no solo en el área de la salud sino también en el área
de la agricultura se vuelve prometedor al generar alimentos de mejor
calidad y ofrecerlos a la comunidad. Se espera que continúe
evolucionando ya que por el ser una técnica innovadora tiene ciertas
controversias éticas ya que no es una herramienta tan afilada puede
tener ciertas fallas y crear algunos mutaciones no deseadas sin
embargo su bajo coste y su accesibilidad hace que su llegada a clínicas
parezca una posibilidad cada vez más factible sin mencionar que se
están comercializando pequeños kits de CRISPR Cas9 desde casa.
podemos observar lo perfecto de la naturaleza al tener una máquina que
han desarrollado los microbios para contra atacar patógenos extraños
siendo un tesoro biológico para investigadores innovadores.

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