UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS
Coordinación Académica

MANUAL DE TÉCNICAS BÁSICAS

DEL CULTIVO CELULAR
MANUAL DE TÉCNICAS BÁSICAS
ELIZABETH MERENTES

CARACAS, 2016
 Sello Editorial Ediciencias-UCV
Universidad Central de Venezuela
Facultad de Ciencias
Coordinación Académica

Editor Jefe:
Héctor Finol
Editores del Área:
Blas Dorta; Guillermina Alonso
Coordinación Editorial:
Carmen Marrero
Editado por:
Fundación Amigos de la Facultad de Ciencias
Fondo Editorial de la Facultad de Ciencias
Diseño, ilustración, edición electrónica y diagramación:
Carlos Raúl Pérez
© 2016, Elizabeth Merentes
Manual de técnicas Básicas del Cultivo Celular
Depósito Legal: DC2017000405
ISBN: 978-980-00-2848-3
CAPITULO 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE
CULTIVO

1.1 Introducción………………………………………………………………..1
1.2 Procedimiento……………………………………………………………...3
a) Preparación PBS……………………………………………………..3
b) Preparación DMEM…………………………………………….……4
c) Medios condicionados……………………………………………….6
1.3 Pruebas de esterilidad……………………………………………………..7
a)
b) Tioglicolato de sodio……………………………………….…….....8
1.4 Otras soluciones…………………………………………...…….…………9
1.5 Bibliografía del capítulo……………...………………………………..11

CAPITULO 2
ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS
POR EXPLANTES Y DISGREGACIÓN ENZIMÁTICA
A PARTIR DE FETOS DE RATÓN.SUBCULTIVOS
DE LINEAS CELULARES

2.1 Introducción……………………………………………………………...11
2.2 Materiales………………………………………………………………...13
2.3 Soluciones y medio de cultivo …………………………………………..14
2.4 Procedimiento……………………………………………….………...…14
a) Disección del ratón y aislamiento de los fetos
de los cuernos del útero ………………………………….………….14

b) Obtención y establecimiento de cultivos primarios

a partir de ex plantes………………………………..………………...16

c) Obtencion y establecimientos de cultivos

primarios a partir de disgregación enzimática…………………….…..17

2.5 Subcultivos de líneas celulares……………………………………………..19

2.5.1 Materiales………………………………………………………………...19

2.5.2 Soluciones y medios de cultivo…………………………………………..20

2.5.3 Procedimiento…………………………………………………………….20

2.6 Bibliografía del capítulo……………………………………………………21

CAPITULO 3

CAPITULO 4
CARACTERI ZACIÓN M ORFO LÓ GICA E INM UNOH ISTO-
QUÍMICA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO

4.1 Introducción……………………………………………………………..31
4.2 Materiales………………………………………………………………..32
4.3 Soluciones y medios de cultivos………………………………………..32
4.4 Coloración histológica de rutina MAY-GRÜNWALD-GIEMSA……..33
4.5 Coloración Sudan III……………………………………….. ………….34
4.6 Rojo de alizarina………………………………………………………...34
4.7 Caracterización inmunohistoquímica………...…………..………..….35
4.8 Bibliografía del capítulo…………………………………………..…..39

CAPITULO 5
MÉTODOS DE CRIOPRESERVACIÓN CELULAR Y DES-
CONGELACIÓN

5.1 Introducción…………………………………………………..………..40
5.2 Congelación Tradicional………………………………………..……..41
5.2.1 Procedimiento………………………………………………..………41
5.3 Vitrificación de Células…………………………………………..…...42
5.3.1 Procedimiento………………………………………………………..42
5.4 Vitrificación de Tejidos………………………………………………..43
5.5 Bibliografía del capítulo……………………………………………….43

CAPITULO 6
UTILIZACIÓN DE

CAPITULO 7
CULTIVO DE CÉLULAS MESENQUIMALES DEL TE-
JIDO ADIPOSO HUMANO
7.1 Introducción……………………………………………….50
7.2 Materiales………………………………………………….52
7 .3 P ro ced i mie n to …… …… … …… … … …… … … …… … …… ….5 3
7 .4 B ib l io gra fía d el cap í t ulo …… … … …… … …… …… … …… ..5 4

CAPITULO 8
CULTIVO DE CÉLULAS DE CARTÍLAGO NASAL
HUMANO

8.1 Introducción……………………………………………………………...56
8.2 Materiales………………………………………………………………...57
8.3 Procedimiento……………………………………………………………57
8.4 Bibliografía del capítulo…………………………………………………60

CAPITULO 9
CULTIVOS DE CÉLULAS DE LA PIEL

9.1 Introducción………………………………………………………………61
9.2 Materiales………………………………………………………………...63
9.3 Procedimiento…………………………………………………………….64
9.3.1 Obtención de las células epidérmicas…………………………………..64
9.3.2 Cultivo de células dérmicas humanas………………………………….67
9.4 Queratinocitos subcultivados sobre equivalentes dérmicos……………...67
9.5 Bibliografía del capítulo………………………………………………….69

CAPITULO 10
ESTABLECIMIENTO DE LÍNEAS C E L U L A R E S
EMBRIONARIAS PLURIPOTENTES

10.1 Introducción………………………………………………………70
10.2 Materiales…………………………………………………………72
10.3 Procedimientos…………………………………………………...73
10.3.1 Obtención de los blastocitos…………………………………………73
10.3.2 Preparación de monocapas de fibroblastos…………………………..74
10.3.3 Cultivo de blastocitos y aislamiento de las líneas celulares
Embrionarias………………………………………………………….74
10.4 Bibliografía del capítulo………………………………………………..77

CAPITULO 11

E S T A B L E C I M I E N T O D E C É L U L A S M A D R E M ESE N-
Q UIM A L ES PR O V E NI EN T E S D EL CO RD Ó N UM B IL IC A L
H UM ANO

1 1 .1 In tro d uc ció n … …… …… … …… … …… … …… …… … …… ..7 8

1 1 .2 Ma teri al es … …… … …… … …… … …… … …… …… … …… .. 80
1 1 .3 P ro ced i mi e n to s … …… … …… … …… … … … …… … …… ….8 1
1 1 .3 .1 Ob te nc ió n y e s ta b lec i mi e nto d el c ul ti vo
p r i mar io a p art ir d e la s cél u la s me se nq u i ma le s
d el co rd ó n u mb i li cal h u ma no … … …… … …… … …… … …… …..8 1
1 1 .3 .2 S ub c ul ti vo s… … …… … …… … …… … …… …… … …… ….8 2
11.4 b ib l io gra fía d el cap ít ulo … …… … … … … … …… … …… ....8 4
 PREFACIO

Las técnicas de cultivo celular son una herramienta esen-

cial en la investigación básica y aplicada. Con la implementación
de esta tecnología se han logrado grandes avances, creando mo-
delos in vitro que han permitido generar un mayor conocimiento
en áreas básicas, tales como la biología del desarrollo. Por ejem-
plo, se tiene una mayor comprensión de los mecanismos de dife-
renciación de las células madre adultas y su aplicabilidad en la
ingeniería de tejidos. Este es un campo emergente que tiene un
enorme potencial médico y se presenta como un método alternati-
vo para la sustitución de tejidos dañados en el humano, ya que se
pueden reconstruir tejidos y órganos in vitro a partir de células
obtenidas del mismo paciente.
En este manual presentamos los trabajos de laboratorio
que se han llevado a cabo a través de los diferentes cursos de la
materia electiva “Cultivo de Tejidos Animales” del Departamen-
to de Zoología de la Escuela de Biología de la Facultad de Cien-
cias de la Universidad Central de Venezuela (UCV). Igual-
mente, describiremos las metodologías que se han estandariza-
do y desarrollado para obtener cultivos primarios y subcultivos
de células de tejidos adultos y embrionarios, realizados en el La-
boratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores del Insti-
tuto de Biología Experimental de la UCV.
La Profesora Mercedes Urbaneja fue la fundadora de este
laboratorio y en el año de 1975, junto con las Profesoras Mireya
Gugig y Rosaura Bello, publicaron un folleto denominado
“Cultivo de Tejidos Animales. Trabajos de Laboratorio”, el cual
permitió tener una guía que contemplaba los aspectos básicos y
generales de este tipo de técnicas y que hasta ahora ha sido de
gran utilidad para estudiantes y profesionales que desean intro-
ducirse en este campo.
Sin embargo, es fundamental la actualización y adecuación
de un manual de cultivo celular, que comprenda, además de las
técnicas básicas, las nuevas metodologías de biotecnología del
cultivo, que tienen una gran relevancia en la bioingeniería de
tejidos y su aplicación terapéutica. He allí el aporte que ofrece la
presente obra.
 CAPITULO 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE

CULT IVO

1.1 Introducción
Las soluciones y medios que se utilizan en cultivo de célu-
las y tejidos son diversas y deben ser seleccionadas dependiendo
del tejido u órgano que se requiere cultivar.
Las soluciones salinas balanceadas están constituidas por
los iones necesarios para el buen funcionamiento de las células in
vitro. Hay una diversidad de soluciones (ver Tabla I) y las más
usadas son la solución tampón fosfato (PBS) de Dulbecco para la
disección de tejidos y/o lavado de células. Otra es la solución de
Hank’s que contiene como fuente de energía, la glucosa, amplia-
mente recomendada para el aislamiento de ciertos tejidos, tales
como el muscular.
En relación con los medios nutritivos, éstos deben ser isotó-
nicos, con capacidad amortiguadora de pH y ser específicos para
el tipo de cultivo que se quiere realizar. Ellos contienen todos los
elementos para el mantenimiento y crecimiento de las células in
vitro.
Inicialmente en cultivo de tejidos se utilizaron medios natu-
rales, tales como coagulo de plasma, sueros sanguíneos y extrac-
tos de embriones. Posteriormente se produjeron los medios sinté-
ticos definidos donde se conoce cuál es la composición de los ele-
mentos que lo conforman. Éstos contienen una serie de aminoá-
cidos que van a variar dependiendo del tipo de medio
(DMEM, F12, RPMI, 199), además tienen un conjunto de sa-
les, las cuales mantienen un balance osmótico, proporcionan-
do los elementos necesarios para la adhesión celular.
Asimismo, pueden actuar como cofactores en muchas reaccio-
nes enzimáticas. Otros constituyentes son las vitaminas prin-
cipalmente del complejo B y una fuente de energía, la gluco-
sa.
El medio es suplementado con suero de origen animal
de diversos tipos: bovino, equino, humano, los cuales se utili-
zan a diferentes concentraciones. Ésta es una mezcla muy
compleja indefinida y que varía dependiendo de los lotes y de
la casa comercial. Suministra factores de crecimiento, hormo-
nas, que estimulan la proliferación celular, así como también
factores de adhesión y de matriz tales como la fibronectina.
Además contiene inhibidores de proteasas (α2macroglobulina)
que se usan para inactivar la tripsina que es una enzima am-
pliamente usada para la disgregación de los tejidos y para
subcultivar, así de esta manera se evita que se dañen las célu-
las una vez que están disociadas.
También se pueden utilizar medios condicionados, don-
de se han cultivado las células en un tiempo dado y donde se
encuentra una serie de factores de crecimiento que pueden
estimular la proliferación, diferenciación y mantener la mor-
fología sin rasgos aparentes de senescencia de otros tipos de
células a cultivar (Rodríguez, 2010).
 Tabla 1. Soluciones Salinas Balanceadas

Composición de las soluciones salinas balanceadas (g/L)

Ringer Tyrode Gey Earle Puck Hanks Dulbecco

(PBS)

NaCl 9,00 8,00 7,00 6,80 8,00 8,00 8,00

KCl 0,42 0,20 0,37 0,40 0,40 0,40 0,20
CaCl2 0,25 0,20 0,17 0,20 0,012 0,14 0,40
MgCl2•6H2O 0,10 0,21 0,10 0,10
MgSO4•7H2O 0,07 0,10 0,154 0,10

Na2HPO4•12H2O 3,00 0,39 0,12 2,9

NaH2PO4•H2O 0,05 0,125

KH2PO4 0,03 0,15 0,06 0,20
NaHCO3 1,00 2,27 2,20 0,35
Glucosa 1,00 1,00 1,00 1,10 1,00
Rojo fenol 0,05 0,005 0,02
95% 95%
Atmósfera aire aire aire/ aire/ aire aire aire
5% CO2 5%CO2

Esterilización autoclave filtración filtración filtración filtración filtración autoclave

1.2 Procedimiento
a) Preparación de las solución PBS libre de calcio y mag-
nesio
1. Pesar las sales en una balanza analítica y se añaden a una fiola.
2. Añadir el 80% del volumen final de agua destilada en relación
con el volumen final a preparar. Es importante usar agua destila-
da de alta calidad, bidestilada y deionizada (H2Od).
3. Disolver las sales con magneto usando el agitador magnético.
4. Ajustar el pH a 7.4 con 1 M HCl o 1 M NaOH (según sea nece-
sario).
5. Aforar la solución con H2Od al volumen final requerido.
6. Esterilizar en autoclave.
 b) Preparación del medio de cultivo DMEM base (ver
composición en la Tabla 2)
1. Pesar 3,7 g de bicarbonato de sodio y añadirlo en una fiola que
contiene un volumen de 100 mL de agua bidestilada desionizada y
disolver con un magneto usando el agitador magnético.
2. El medio en polvo se disuelve en 500 mL de H2Od.
3. Añadir los 100 mL de la solución de bicarbonato de sodio.
4. Ajustar con 400 mL de H20d hasta completar el volumen final
de 1 litro.
5. Esterilizar por filtración en un filtro Millipore estéril que con-
tiene una membrana de 0,20 µm (Figura 1).
6. El medio estéril se coloca en frascos de 500 mL y se realizan
pruebas de esterilidad (ver más adelante).
7. Suplementar el medio con Suero Fetal de Bovino. Generalmen-
te se usa a la proporción de 10%, añadiendo los antibióticos-
antimicóticos al 1% (100.000 unidades de penicilina, 100.000 µg
estreptomicina y 2000 µg anfotericina B) para prevenir la conta-
minación (Tabla 3) y la glutamina a 2 mM (ésta es inestable en el
medio y debe ser añadida al medio base)

Figura 1. Equipo de Filtración

 Tabla 2. Medio de cultivo Eagle Modificado por
Dulbecco´s (DMEM) (Referencia del catálogo GIBCO).

Catálogo 2004
Código 31053 31600
Componentes 1X líquido mg/mL Polvo mg/mL
SALES INORGÁNICAS
CaCl2 (anhidro) 200 200
Fe(NO3)3•9H20 0,1 0,1
KCl 400 400
MgS04 (anhidro) 97,67 97,67
NaCl 6,400 6,400
NaHC03 3,700 -
NaH2P04·H20 125 125
OTROS COMPONENTES
D-Glucosa 4,500 1000
Rojo fenol - 15
Piruvato de sodio - 110
AMINOÁCIDOS
L-Arginina · HCl 84 84
L-Cistina · 2HCl 63 63
L-Glutamina 584
Glicina 30 30
L-Histidina •HCl •H20 42 42
L-Isoleucina 105 105
L-Leucina 105 105
L-Lisina 146 146
L-Metionina 30 30
LFenilalanina 66 66
L-Serina 42 42
L-Treonina 95 95
L-Triptofano 16 16
L-Tirosina •2Na •H20 104 104
L-Valina 94 94
VITAMINAS
D·Ca pantotenato 4 4
Cloruro Colina 4 4
Ácido Fólico 4 4
Inositol 4 4
Niacinamida 7.2 7.2
Riboflavina 0.4 0.4
Tiamina • HCl 4 4
Piridoxina • HCl 4 4
 Tabla 3. Antibióticos y antimicóticos utilizados en cultivo

Concentración final
Espectro

Sulfato de Estreptomicina 50-100 µg/ml Bacterias Gram

Positivas y negati-
vas
Penicilina G 50-100U/ml Bacterias Gram
negativas

Neostatina 100 U/ml Hongos y levaduras

Sulfato de Neomicina 50 µg/ml Bacterias Gram

Positivas y negati-
vas
Sulfato de Kanamicina 100 µg/ml Bacterias Gram
Positivas y negati-
vas, Micoplasmas

Sulfato de Gentamicina 5-50 µg/ml Bacterias Gram

Positivas y negati-
vas, Micoplasmas

Anfotericina B 0,5 – 3 µg/ml Hongos y levaduras

c) Medios condicionados
1. Obtener el medio del cultivo donde están creciendo las células.
Debe estar confluente o semiconfluente y colocarlo en un tubo de
centrífuga.
2. Centrifugar a 618 g por 5 minutos y extraer el sobrenadante.
3. Filtrar a través de una membrana de 0,20 µm estéril.
4. El medio condicionado obtenido debe ser guardado en un con-
gelador a -20 oC.
1.3 Pruebas de esterilidad
Después de haber esterilizado una solución o medio de
cultivo, deberán ser sometidos a pruebas de esterilidad para com-
probar que los procedimientos han sido efectuados correctamente.
Para hacer dichas pruebas se usan sustancias utilizadas general-
mente en microbiología, como son: Caldo nutritivo de infusión de
corazón, tioglicolato y otras, que comprueban la presencia de bac-
terias, hongos y levaduras (Urbaneja y col., 1975). Se preparan
las muestras agregando 100 µL de la solución a controlar al me-
dio de cultivo estéril que se han preparado previamente en tubos
de ensayo. Posteriormente se incuban a 37 oC y se dejan por 5 o 7
días. Si el resultado es negativo, esto nos indica que la solución
esta estéril y, por consiguiente, se puede utilizar; pero si es positi-
vo, es conveniente desechar la solución o medio.

a)

Es un medio líquido adecuado para el enriquecimiento y culti-

vo de bacterias aerobias y anaerobias, muy rico en nutrientes,
que proporciona un adecuado desarrollo microbiano.
La mezcla contiene los siguientes componentes (g/L):
 Infusión de corazón de vacuno 500 g
 Bacto-Triptosa 10 g
 Cloruro de sodio 5 g.
Esta prueba de esterilidad se prepara diluyendo 25 g/L de
la mezcla en agua bidestilada desionizada, seguidamente se colo-
ca 1 mL por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121 °C
por 15 minutos, luego se guarda a 4 °C.
La siembra se realiza agregando a los tubos que contienen
el caldo nutritivo aproximadamente 1 mL de la solución a contro-
lar e incubándola a 37 °C. Posteriormente, los tubos son examina-
dos para evaluar el crecimiento de microorganismos por turbidez
(bacterias y levaduras) o por la presencia de hifas (hongos).

b) Tioglicolato de sodio
Es un medio que se utiliza en el cultivo de microorganis-
mos aerobios y anaerobios, y también en las pruebas de esterili-
dad de muestras biológicas y farmacéuticas. Este medio de culti-
vo permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganis-
mos, incluidos los nutricionalmente exigentes y se observa que
las bacterias estrictamente aerobias crecen en la parte superior,
mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas
crecen en la región inferior del medio.

La mezcla contiene los siguientes componentes (en gra-

mos por litro):
 Tioglicolato de sodio 0,5 g
 Extracto de levadura 5 g
 Caseína 15 g
 Cloruro de sodio 2,5 g
 L-Cisteína 0,5 g
 Glucosa 5,5 g
 Resarzurina 0,001 g
 Agar 0,75 g.

Esta prueba se prepara mezclando 29,8 g/L del medio

de cultivo deshidratado en agua destilada y calentando hasta
ebullición. Posteriormente, se distribuye en tubos de ensayo y
se esteriliza a 121°C durante 15 minutos para luego conservar-
los en la nevera a 4 °C protegidos de la luz. Si el medio pre-
senta una coloración rosa nos indica que está oxidado y que se
deben restablecer las condiciones anaerobias colocando los
tubos en el baño de María.

La siembra se realiza agregando a los tubos aproxima-

damente 1 mL de la solución a controlar e incubándola a 37 °
C.
Finalmente, los tubos son examinados para evaluar el
crecimiento de microorganismos por turbidez.

1.4 Otras soluciones

L-Glutamina 200 mM (100X)

Preparar una solución de concentración final 29,2 mg/
ml en solución de PBS. Disolver y filtrar a través de una mem-
brana de 0,20 µm. Mantener el stock concentrado y congelado
a -20 oC.
Antibióticos y antimicóticos
Concentraciones finales utilizadas en el medio nutritivo:
Penicilina G 100 unidades/mL
Estreptomicina 100 µg/mL
Anfotericina 2 µg/mL.
Preparar la solución de antibióticos-antimicóticos a
100X y almacenar a -20 oC.

Rojo Fenol 0,5%

Disolver 0,5 gr en 100 mL en solución PBS, filtrar y
guardar a 4 oC.

Azul Tripano
Solución A: 0,2 % azul tripano (0,2 g/100 mL H2Od)
Solución B: PBS
Solución de uso: 4A:1B.

Stock de mercaptoetanol 10-4 mM 100X (D: 1.12 g/

mL)
Preparar 100 mL del stock para lo cual se diluye 70 µL
de 2-mercaptoetanol en 100 mL de solución de PBS en
una campana de extracción, almacenar a 4 oC.

Mitomicina C
Preparar una solución stock 50X: Agregar 1 mg mito-
micina en 10 mL de solución salina balanceada (PBS) y
 almacenar a 4 oC en un frasco ámbar.
La concentración recomendada para su uso en las célu-
las es de 2 µg/mL. La solución una vez diluida puede
ser usada por una semana. Para periodos más largos se
debe almacenar a -20 oC.

1.5 Bibliografía del capítulo

Freshney I. (2000). Culture of animal cells. A manual of basic
technique. Editorial Wiley-Liss, Cuarta Edición, Toron-
to, Canadá.
Rodríguez, M. (2010). Estudio comparativo del potencial de
diferenciación hacia el linaje epitelial de las células me-
senquimales provenientes del tejido adiposo de ratón y
humano. Tesis Doctoral. Universidad Central de Vene-
zuela.
Urbaneja, M., De Gugig, M., Bello, R. (1975). Cultivo de Teji-
dos Animales. Caracas, Venezuela.
 CAPÍTULO 2

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS POR EX-

PLANTES Y DISGREGACIÓN ENZIMÁTICA A PARTIR DE
FETOS DE RATÓN.SUBCULTIVOS DE LINEAS CELULA-
RES

2.1 Introducción
El cultivo primario es el cultivo obtenido directamente a
partir de tejidos u órganos. Éstos conservan las características
fisiológicas y fenotípicas similares al tejido de origen y mantie-
nen su cariotipo diploide. Además están formados por una pobla-
ción celular heterogénea de la cual posterior y progresivamente
irán sobreviviendo las células más competentes dando origen a
una población más homogénea. La proliferación es baja hasta que
las células se adapten al microambiente donde han sido sembra-
das o cultivadas. Ellas deben restablecer los componentes de su-
perficie y de matriz, así como el citoesqueleto dañado durante el
proceso de disgregación.
Las células provenientes de cultivos primarios son las que
presentan un mejor patrón de crecimiento en ambientes funciona-
les in vitro, dada su estabilidad genética y su naturaleza diploide
normal original. No presentan transformación, evitando así pro-
blemas de inestabilidad genética producto de aberraciones cromo-
sómicas, mutaciones espontáneas y/o células mutantes no elimi-
nadas.
 Se utilizan dos estrategias para establecer el cultivo prima-
rio por explantes procedentes de una disgregación mecánica, o de
una suspensión celular derivada de una disociación con enzimas o
agentes químicos (Freshney, 2010). Las enzimas se usan para di-
gerir las sustancias intracelulares a nivel de proteínas y específi-
camente a nivel de los enlaces peptídicos adyacentes a la unidad
de arginina y lisina, degradando las proteínas y componentes que
sirven de unión entre las células y el tejido, liberándolas en sus-
pensión (Urbaneja y col., 1975).
Una de las más usadas es la tripsina, que degrada las proteí-
nas de superficie que une a las células entre sí, mientras que el
EDTA es una solución de sales sódicas del ácido etilendiamino-
tetracético que además de ser un agente quelante de iones diva-
lentes como el calcio y el magnesio, necesarios para la adhesión
célula-célula, célula-sustrato, actúa como inhibidor de metalopro-
teasas implicadas en la hidrólisis o descomposición específica de
proteínas, proceso necesario para que, entre otras cosas, ocurra la
activación o desactivación de esas proteínas. Ambas soluciones
trabajan rápidamente para remover las células ancladas y producir
una suspensión celular. La tripsina es inactivada rápidamente por
los inhibidores que se encuentran en el suero fetal de bovino
(Herrero, 2004).
2.2 Materiales
 Material biológico: Ratones hembras con 15-16 días de ges-
tación de la cepa NMRI
 Pinzas de puntas finas rectas y curvas
 Tijeras de punta fina rectas y curvas
 Placas de Petri de 60 mm de diámetro
 Placas plásticas de 35 mm de diámetro
 Frascos plásticos de 25 cm2
 Pipetas de 5 y 10 mL
 Frasco de vidrio
 Magnetos
 Tubos de centrífuga de 15 mL
 Hemocitómetro.

2.3 Soluciones y medio de cultivo

Etanol al 70%
Solución Buffer Fosfato libre de calcio y magnesio
Medio de cultivo Eagle´s modificado por Dulbecco’s
(DMEM) (Gibco) suplementado con 10% Suero Fetal
Bovino (SFB) (Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y
mezcla de antibióticos-antimicóticos.
Solución de Tripsina- EDTA (0,125%, 0,02%).

2.4 Procedimiento
a) Disección del ratón y aislamiento de los fetos de los
cuernos del útero

1. Sacrificar al ratón por dislocación cervical colocando al ani-

mal sobre una superficie donde se sostenga y con una mano to-
marlo por la base de la cola, mientras que con la otra se sostiene
por la base del cráneo. Tirar de la base de la cola en sentido
opuesto a la del cuerpo del animal, ocasionando la separación de
la columna vertebral del cráneo.

2. Realizar una incisión media ventral seguida de un corte

transversal en la piel de la línea media del abdomen, previamente
impregnada con etanol al 70%. Separar la musculatura adyacen-
te, exponiendo las vísceras las cuales se apartan teniendo
cuidado de no perforar los intestinos.
En esta fase, se logran observar los fetos en los cuer-
nos del útero, los cuales se transfieren a una placa de Petri
con solución PBS, para luego realizar la disección de los
fetos.

3. Los fetos se extraen de los cuernos del útero y se dejan

expuestos envueltos únicamente en su membrana extraem-
brionaria, el amnios, el cual se encuentra unido a su vez, a
la placenta (Figura 1A y 1B). Posteriormente, se le extraen
las vísceras y se corta la cabeza para usar solamente la car-
casa

4. Transferir la carcasa a otra placa de Petri con PBS para

retirar los restos de sangre, las cuales se someterán a diso-
ciación mecánica usando tijeras finas hasta obtener seccio-
nes pequeñas de aproximadamente 2 mm.
 Figura 1. A. Cuerno del útero de ratón en una placa de Petri con solución PBS. B.
Fetos fuera del cuerno del útero rodeados con la membrana amniótica y placenta
(Tomado de Meyer, 2012).

b) Obtención y establecimiento de cultivos primarios a

partir de explantes
1. Los trozos de tejidos obtenidos a partir de los fetos se colocan
en una placa Petri equidistantemente y luego de su adhesión a la
placa (5-10 minutos), se agrega medio nutritivo y se incuban a 37
ºC con atmósfera húmeda al 5% de CO2. Transcurridas 24 horas
se sustituye el medio para eliminar restos celulares. Posteriormen-
te, se realizan cambios de medios periódicos hasta que se observa
la migración celular desde los explantes (Romero y col., 2005).

2. Cuando se vea el halo de crecimiento alrededor de los explan-

tes cuatro o cinco veces mayor que el tamaño de los trozos origi-
nales, se realiza el subcultivo (Figura 2). Para esto, se separa el
explante de su capa de crecimiento, realizando cortes perpendicu-
lares por los bordes originales del explante. Luego se realiza la
tripsinización de la zona de crecimiento, utilizando una mezcla de
Tripsina 0,125% - EDTA 0,02%.
Figura 2. A. Se puede observar el halo de crecimiento a partir del explante. 100X B.
Detalle de células similares a epiteliales que han migrado a partir del trozo. 200X. Mi-
croscopio de contraste de fase.

c) Obtención y establecimiento de cultivos primarios a partir

 Figura 3. Imagen descriptiva de la Cámara de Neubauer. Extraído de Rodak,
2005 y modificado por Meyer, 2012.

Observar al microscopio óptico y contar aquellas células

que no estén coloreadas de azul. El azul tripano es un colorante
azoico que se utiliza en tinciones histológicas para ensayos de
viabilidad que permiten diferenciar células vivas de células muer-
tas. Las células vivas con la membrana celular intacta no son co-
loreadas, por lo que permanecen refringentes; sin embargo, atra-
viesa la membrana de las células muertas mostrando un distintivo
color azul bajo el microscopio (Herrero, 2004). Contar el número
de células en los cuatro cuadrantes del hemocitómetro (Figura 3).
Sacar el promedio y calcular el número de células/ml de la si-
guiente manera:

5. El medio se reemplaza de manera aséptica en la campana de

flujo laminar vertical, 2 o 3 veces por semana para eliminar los
restos de células y detritos, hasta que se alcanza la semiconfluen-
cia. Una vez que las células se multiplican cubriendo 80-90% del
espacio disponible del recipiente de cultivo, se realizan los sub-
cultivos con el fin de amplificar la población celular.

2.5 Subcultivos de líneas celulares

2.5.1 Materiales
 Frascos plásticos de 25 cm2
 Pipetas de 5 y 10 mL
 Tubos de centrifuga de 15 mL
 Hemocitómetro.
2.5.2 Soluciones y medios de cultivo
Solución Buffer Fosfato libre de calcio y magnesio.
Medio de cultivo Eagle´s modificado por Dulbecco’s (DMEM)
(Gibco) suplementado con 10% Suero Fetal Bovino (SFB)
(Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y mezcla de antibióticos-
antimicóticos.
Solución de Tripsina-EDTA (0,125%, 0,02%).

2.5.3 Procedimiento
1. Para realizar el subcultivo los cultivos celulares deben tener
una confluencia de alrededor del 80% del área donde están cre-
ciendo las células. Se debe chequear en el microscopio invertido
para asegurarse que no exista contaminación de bacterias, levadu-
ras u hongos.
2. Bajo la campana de flujo laminar se descarta el medio nutritivo
de los frascos y se realizan 2 lavados con solución de PBS para eli-
minar restos celulares.
3. Añadir la solución de Tripsina-EDTA de modo que cubra la su-
perficie del frasco e incubar por 5 minutos en una incubadora a 37
o
C en una atmosfera húmeda al 5% CO2. Transcurrido este tiempo
chequear en el microscopio si las células se disociaron de la superfi-
cie, que en este caso se observan de morfología redondeada.
4. Inactivar la acción de la enzima añadiendo medio nutritivo que
contiene suero, el cual incluye inhibidores de proteasas.
5. Centrifugar por 5 minutos a 618 g, descartar el sobrenadante y
resuspender las células con el medio nutritivo. Contar y sembrar
bajo las mismas condiciones como se indicó anteriormente.

2.6 Bibliografía del capítulo

Freshney, I. (2010). Culture of animal cells. A manual of basic
technique. Editorial Wiley-Liss.6thEdition, Toronto, Ca-
nadá.
Herrero, L. (2004). Procedimientos en Virología Médica. Edito-
rial de la Universidad de Costa Rica, Primera Edición.
San José de Costa Rica, Costa Rica.
Meyer, M. (2012). Establecimiento del cultivo de células madre
mesenquimales de la membrana amniótica. Caracteriza-
ción y diferenciación in vitro. Licenciatura en Biología.
Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
Rodak, B. (2005). Hematología: Fundamentos y Aplicaciones
Clínicas. Editorial Panamericana, Segunda Edición. Bue-
nos Aires, Argentina.
Romero, L., Rodríguez, M., Guillen, A. y Merentes, E. (2005).
Establishment of rat adipose tissue stromal cells and dif-
ferentiation in vitro. Histology and Histopathology Cellu-
lar Mol. Biol. Supplement 1:S93.
Urbaneja, M., De Gugig, M., Bello, R. (1975). Trabajo de Labo-
ratorio Cultivo de Tejidos Animales. Venezuela. Caracas.
Vunjak-Novakovic, G. y Freshney, R. I. (2006). Culture Cells for
Tissue Engineering. Editorial John Wiley & Sons, Inc.
 CAPITULO 3

I
El crecimiento implica el incremento de todos los ele-
mentos de la célula, lo que se traduce en un aumento en la
masa celular y, posteriormente, su multiplicación. Para po-
der predecir la proliferación del cultivo es importante cono-
cer la cinética de crecimiento de éste, lo que nos permite
estudiar las respuestas de la célula ante un estímulo particu-
lar. La curva de crecimiento permite corroborar el óptimo
crecimiento y mantenimiento de las células en cultivo a tra-
vés del tiempo. El patrón de proliferación característico de
las células en cultivo, cuando son sembradas a baja densi-
dad, consta de tres fases: una fase de latencia (Lag), segui-
da de una fase exponencial (Log) y, finalmente, una fase
estacionaria (Plateau) (Colter y col., 2000).
La fase exponencial permite conocer la capacidad pro-
liferativa que se desarrolla en el cultivo, cuando se repre-
senta la proliferación en papel semilogaritmo. Esta fase log
se ajusta a una recta, cuya pendiente indica el grado de pro-
liferación de las células que se han adaptado. Cuando se
detiene la actividad mitótica la pendiente de la curva co-
mienza aplanarse, las células comienzan un proceso de ex-
presión genética que permite la síntesis de proteínas más
complejas que conduce a la diferenciación celular (Gil -
Loyzaga, 2011).
La tasa de proliferación celular genera información
acerca de las propiedades que presentan las células en culti-
vo, así como también facilita el diseño de experimentos , ya
que permite determinar la cinética del cultivo.
Mediante esta información obtenida se establece el tiempo
requerido para realizar los subcultivos, puesto que los cultivos
celulares varían significativamente en sus propiedades dependien-
do de la fase en que se encuentren. El tiempo más apropiado para
realizar los subcultivos es la fase logarítmica, ya que el cultivo se
encuentra en su forma más reproducible, siendo altamente unifor-
me y viable. (Helgason y Miller, 2005).

3.2 Materiales
 Material biológico: Líneas celulares
 Placas plásticas multipozos 6 x 4 y placas de 96 pozos fon-
do plano
 Frascos plásticos de 25 cm2
 Pipetas de 5 y 10 mL
 Tubos de centrífuga de 15 mL
 Hemocitómetro
 Lector de ELISA.
3.3 Soluciones y medios de cultivo
Solución Buffer Fosfato libre de calcio y magnesio.
Medio de cultivo Eagle´s modificado por Dulbecco’s
(DMEM) (Gibco) suplementado con 10% Suero Fetal Bo-
vino (SFB) (Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y mezcla
de antibióticos-antimicóticos.
Solución de Tripsina-EDTA (0,125%, 0,02%)
Azul tripano al 0,4%
MTT
Dimetilsulfoxido.

3.4 Métodos para determinar la proliferación celular

3.4.1 Determinación de la curva de crecimiento por con taje

celular con hemocitómetro

A continuación se señala el procedimiento:

1. Chequear las células de los cultivos en el microscopio invertido para
determinar cualitativamente la densidad de éstas y poder asegurar que
éste se encuentra semiconfluente o confluente.
2. Realizar el subcultivo con Tripsina-EDTA y sembrar a bajas densida-
des (20.000 cel/pozo) en placas multipozos 6x4. Esto permite tener un
n= 6 por 7 días. Las células son mantenidas en atmósfera húmeda a 37°
C y al 5% CO2. Secuencialmente a los 1, 3, 5, 7 días indicados, se dis-
gregan 6 pozos usando Tripsina-EDTA y son contadas las células en el
hemocitómetro utilizando el colorante de exclusión azul de tripano.
3. A partir de la información del número de células obtenidas, se realiza
la curva de crecimiento celular, tal como se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Comparación del patrón de crecimiento de las células del estroma de la membrana
amniótica de fetos de ratón, en medio de cultivo DMEM suplementado con 15% SFB y 20%
SFB. En los 2 casos, los cultivos mostraron el comportamiento típico de las células mantenidas
in vitro, caracterizado por tres fases: una fase de latencia en el primer, segundo y tercer día de
cultivo, seguida de una fase exponencial entre el cuarto y noveno día y, finalmente, una fase de
saturación. (Tomado de Meyer, 2012).

3.4.2 Método MTT

A continuación se señala el procedimiento:
Para determinar la proliferación celular también se utiliza
el método del MTT [3-(4.5 Dimetiltiazol-2y1)-2,5 Bromuro de
Difenil Tetrazolium)], el cual se basa en la transformación de
la sal de tetrazolium soluble en agua a un compuesto insoluble
de color morado, denominado formazán, debido a la ruptura
del anillo tetrazolium por las enzimas deshidrogenasas de las
mitocondrias activas.
 La cantidad de células viables es proporcional a la cantidad
de formazán producido (Figura 2). Los cristales de formazán for-
mados se disuelven con dimetilsulfóxido (DMSO), se determina
espectroscópicamente la densidad óptica a 570 nm (Mosmann,
1983) y, después, se grafica como se muestra en la Figura 3.

Figura 2. Microplaca de 96 pozos donde se puede observar los cristales de formazán de color vio-
leta en diferentes tonalidades.

A continuación se señala el procedimiento:

1. Sembrar las células en microplacas de 96 pozos a una densidad
de 2000 células/pozo y cultivar en los medios a ensayar. El man-
tenimiento se lleva a cabo en atmósfera húmeda y 5% de CO2 a
37 °C.
2. Secuencialmente a los 3, 6 y 10 días cada placa se le retira el
medio de cultivo y se le agrega MTT disuelto en PBS a 0,4 mg/ml
(Sigma).
3. Incubar por 3 horas a 37 °C en atmósfera húmeda con 5% CO2,
descartar el MTT y se agrega Dimetilsulfoxido (DMSO).
4. Realizar la lectura a la densidad óptica a 570 nm en el lector
espectrofotométrico de microplacas (ELISA).

Figura 3. Curva de proliferación de las células mesenquimales del cordón umbilical

humano. Intervalo de confianza 95%. Células mesenquimales del décimo pasaje. Se
observa un comportamiento de fase logarítmica que se atenúa luego de los 6 días de
cultivo (Tomado de Calderón, 2007).

3.4.3 Población celular acumulativa

Con la finalidad de observar el comportamiento proliferati-
vo de las células a través de los sucesivos pasajes, también se
puede realizar el cálculo de la frecuencia acumulada de la pobla-
ción de la siguiente forma:
Disgregar las células mantenidas en los subcultivos con
Tripsina-EDTA y centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos. La sus-
pensión celular obtenida se resuspende en medio nutritivo y luego
se toma una muestra para determinar el número de células con el
hemocitómetro y el colorante de exclusión azul de tripano. Poste-
riormente, se calcula la población utilizando la siguiente fórmula
propuesta por Zuk y col. 2001:
 Frecuencia acumulada de la población celular = log N1/log
N2, donde N1 es el número de células antes del pasaje y N2 es el
número de células sembradas después del pasaje.
La población acumulativa puede ser usada generalmente
como un índice de edad biológica, en el que un mayor potencial
de proliferación indicaría que posiblemente las células son bioló-
gicamente más jóvenes que otras células adultas (Bruder y col.,
1997).

Figura 4. Población acumulativa a través de los pasajes de las células del

estroma del tejido adiposo. Media 1,06 y desviación estándar 0,06. n=5. (Tomado de
Rodríguez, 2005).
3.5 Bibliografía del capítulo

Bruder, S., Jaiswald, N. y Haynesworth, S. (1997). Growth kinet-

ics, self-renewal and the osteogenic potential of purified
human mesenchymal stem cells during extensive subculti-
vation and following cryopreservation. J. Cell. Biochem.
64: 278-294.
Calderón, D. (2007). Establecimiento del cultivo de células me-
senquimales del cordón umbilical humano y estudio de su
potencialidad de diferenciación in vitro. Licenciatura en
Biología. Universidad de Carabobo.
Colter, D., Class, R., Di Girolamo, C. y Prockop, D. (2000). Rap-
id expansion of recycling stem cells in culture of plastic-
adherent cells from human bone marrow. Proc. Natl.
Acad. Sci. 97: 3213-3218.
Gil-Loyzaga, P. E. (2011) Cultivo de células animales y humanas.
Aplicaciones en Medicina Regenerativa. Editorial Visión
Libros, Madrid España.
Helgason, C. y Miller, C. (2005). Methods in Molecular Biology.
Vol. 290. Basic Cell Culture Protocols. 3ra. Edición. Edi-
torial Humana Press.
Meyer, M. (2012) Establecimiento del cultivo de células madre
mesenquimales de la membrana amniótica. Caracteriza-
ción y diferenciación in vitro. Licenciatura en Biología.
Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
Mossman, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth
 cytotoxicity assays. JIM. 65:55-63.
Rodríguez, M. (2005). Establecimiento de cultivo de células
estromales del tejido adiposo. Potencial osteocondrogé-
nico in vitro. Licenciatura en Biología. Facultad de
Ciencias.
Zuk, P., Zhu, M., Mizuno, H., Huang, J., Futrell, J. W., Katz,
A. J., Benhaim P., Lorenz, H. P. y Hedrick, M. H.
(2001). Multilineage cells from human adipose tissue:
implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7(2):
211-228.
 CAPITULO 4

CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA E INMU-

N O H I S TO Q U Í M I C A D E L A S C É L U L A S E N C U L-
TIVO

4.1 Introducción
4.2 Materiales
 Líneas celulares.
 Tubos de Leighton con laminillas.
 Portaobjetos.
 Cubreobjetos 24 x 50 mm.

4.3 Soluciones y medios de cultivo

Solución Buffer Fosfato libre de calcio y magnesio Medio
de cultivo Eagle´s modificado por Dulbecco’s (DMEM) (Gibco)
suplementado con 10 % Suero Fetal Bovino (SFB) (Gibco), L-
glutamina 2 mM (Gibco) y mezcla de antibióticos-antimicóticos.
Solución de Tripsina-EDTA (0,125%, 0,02%)
Reactivos:
 Colorantes: Azul de Toluidina, Giemsa, Hematoxilina, May
-Grunwald, Rojo de Alizarina, Sudan III
 Formalina al 10% en solución PBS
 Medio de montaje resinoso (Entellan)
 Acetona
 Etanol
 Xileno

Inmunocitoquímica:

Anticuerpos monoclonales en contra de Pan-citoqueratinas

(Santa Cruz Biotechnology), desmina (DAKO) y vimentina
(Santa Cruz Biotechnology) diluidos 1/100.
Kit VECTOR Laboratories.
4.4 Coloración histológica de rutina MAY-GRÜNWALD-
GIEMSA
1. Sembrar las células en tubos de Leighton a una densidad de
50.000 células/tubo y cultivar a diferentes tiempos.
2. Extraer la laminilla del tubo de Leighton y lavar los cultivos
con solución PBS.
3. Fijar con metanol por 5 minutos.
4. Colorear con May-Grünwald por 5 minutos.
5. Colorear con Giemsa diluido en una proporción 1:18 por 20
minutos.
6. Deshidratar en una batería acetona-xileno y montar la laminilla
en un portaobjeto con medio de montaje resino (Entellan o Per-
mount).

Figura 1. Caracterización morfológica de células en cultivo. A. Monocapa de células

tipo fusiforme derivadas del tejido adiposo. Microscopio de contraste de fase. 200X.
B. Espermatozoides y células del epidídimo. Coloración con azul de toluidina 200X.
C. Población celular heterogénea. 200X D. Detalle de las características de las célu-
las se puede visualizar el citoplasma, núcleo y nucléolos. 400X. Coloración May-
Grunwald-Giemsa.
4.5 Coloración Sudan III
La presencia de adipocitos se detecta mediante esta colora-
ción. Para ello, los cubreobjetos son previamente fijados durante
10 minutos con formalina neutra al 10%. Una vez fijados se co-
locan en etanol 70% durante 10 minutos para luego colorear con
Sudan III por 5 minutos. Transcurrido este tiempo se lava con
etanol 70% y con agua destilada, se contrastan los núcleos con
hematoxílina por 5 minutos y se lava con agua corriente por 10
minutos. Finalmente, se montan las láminas en un medio acuoso.

Figura 2. Células similares a adipocitos positivas a la coloración histo-

química con Sudan III se observan con diferentes grados de maduración,
donde se aprecian numerosas inclusiones lipídicas coloreadas. Colora-
ción histoquímica con Sudan III. 200X. (Tomado de Acosta A., 2001).

4.6 Rojo de Alizarina

La presencia de depósitos de fosfatos de calcio se evidencia
usando una solución de Rojo de Alizarina al 2% a la que previa-
mente se le ajusta el pH en un rango de 4.1-4.3. Para llevar a
cabo esta coloración las láminas fijadas son hidratadas hasta al-
cohol 50%, se lavan rápidamente en agua destilada y se cubren
con la solución colorante por 10 minutos, luego de lo cual se la-
van 3 veces con PBS y se procede a deshidratar en acetona y xi-
leno para montar en medio de montaje resinoso (Entellan).

Figura 3. Células del tejido adiposo en matriz de colágeno tipo I en presencia de

medio osteogénico. A. Zona densa donde se pueden apreciar los depósitos de fosfa-
to de calcio que se colorea con el rojo alizarina. 400X. B. Células cuboidales inmer-
sas en la zona mineralizada localizadas en la zona periférica del gel. Azul de Tolui-
dina. 1000X. (Tomado de Rodríguez, M., 2005).

4.7 Caracterización inmunohistoquímica

Para determinar los diferentes tipos celulares presen-
tes en los cultivos, se realizan ensayos inmunohistoquímicos con-
tra diferentes antígenos. La visualización de éstos se logra me-
diante la aplicación de anticuerpos específicos. Por ejemplo, en
contra de filamentos intermedios, tales como la desmina (Figura
4), vimentina (Figura 5) y citoqueratinas (Figura 6), que son ex-
presadas en el citoplasma de todas las células de origen muscular,
mesenquimal y epitelial, respectivamente, también se pueden usar
marcadores de superficie, etc.
Figura 4. A. Cultivo de células embrionarias se pueden observar miotúbulos en
diferentes orientaciones. Contraste de Fase. 200X. B. Determinación inmunoci-
toquímica contra de la desmina donde se puede observar la expresión de esta
proteína solo en las células multinucleadas (flechas). 400X.

Figura 5.Evaluación inmunocitoquímica con el anticuerpo en contra de vimenti-

na. Se muestra el marcaje de todas las células mesenquimales de la medula
ósea.200X. (Tomado de Acosta, 2003).
Tipos de mé-
todos:

Figura 6. Evaluación inmunocitoquímica con el anticuerpo en contra de pancitoquerati-

na. Se muestra el marcaje de todas las células similares a epiteliales de la membrana
amniótica humana con diferentes niveles de expresión. 200X. (Tomado de Navarro,
2013).

Directo: Se emplea un anticuerpo primario biotinilado

dirigidos contra el antígeno de interés y un complejo enzimáti-
co con un sustrato cromogénico. La activación enzimática del
cromógeno produce una reacción visible en el sitio donde está
presente el antígeno, indicando que ha ocurrido su expresión.
Indirecto: Un anticuerpo primario dirigido contra el antí-
geno de interés, un anticuerpo secundario biotinilado y un
complejo enzimático con un sustrato cromogénico. La activa-
ción enzimática del cromógeno produce una reacción visible
en el sitio donde está presente el antígeno indicando que ha
ocurrido su expresión.
A continuación vamos a describir el procedimiento del mé-
todo indirecto para llevar a cabo el marcaje de células cultivadas
en monocapa:
1. Fijar con metanol por 5 minutos e incubar en PBS con albúmina al
0,5% por 15 minutos, lavar con PBS durante 10 minutos, para final-
mente incubar con el respectivo anticuerpo primario.
2. Evidenciar la reacción del anticuerpo utilizando un kit, tal como el
Vectastain ABC (vector), el DAKO, el Santa Cruz.
3. Contrastar los núcleos con hematoxilina y deshidratar las láminas
en una batería creciente en etanol con dos cambios en xilol para
montar en medio resinoso. Estos kits hacen uso de un anticuerpo
secundario biotinilado que se une al complejo estreptavidina-biotina-
peroxidasa, el cual reacciona con el sustrato para peroxidasa
(diaminobencidina) y, finalmente, permitir evidenciar la unión antí-
geno-anticuerpo.

La estreptavidina es una proteína de 60 kDa procedente de

Streptomyces avidinii, tetramérica, con alta afinidad por la biotina.
La biotina es una proteína soluble en agua (vitamina H) de bajo peso
molecular (244 Da). Presenta un grupo carboxílico que permite su
unión a los grupos amino de las proteínas.
La biotinilización es una reacción bioquímica que permite unir
biotina a una gran variedad de moléculas como enzimas, lectinas,
anticuerpo, ácidos nucleicos, etc., mientras que la peroxidasa HRP es
una enzima termoestable hasta 63 °C y a temperatura ambiente con-
serva su actividad oxidante durante semanas. La actividad peroxida-
sa (oxidación del sustrato apropiado) convierte sustratos incoloros en
un producto insoluble de un color específico que se precipita en el
sitio de la reacción enzimática. Uno de los cromógenos (sustratos)
apropiados para la peroxidasa es la diaminobencidina (DAB) dando
posibilidad de doble marcaje.

Tabla 1. Tabla resumen de los diferentes cromógenos para la enzima peroxidasa.

Tomado de Morel y col., 2000.

4.8 Bibliografía del capítulo

Acosta, A., (2003). Cultivo de células del estroma de médula de ósea
de rata y su potencial de diferenciación in vitro. Licenciatura
en Biología. Universidad Central de Venezuela.
Morel, G., Cavalier, A., Caballero, T., Gallego, R. (2000). Hibrida-
ción in situ en microscopía óptica. Universidad de Santiago
de Compostela, Servicio de Publicaciones e Intercambio
Científico. Santiago de Compostela, España.
Navarro, E. (2013). Membrana amniótica humana como fuente de
células y biosustrato. Licenciatura en Biología. Universidad
Central de Venezuela.
Rodríguez, M. (2005). Establecimiento de cultivo de células estro
males del tejido adiposo. Potencial osteocondrogénico in
vitro. Licenciatura en Biología. Universidad Central de
Venezuela.
 CAPITULO 5

M ÉTODOS DE C R IOP R ES ER VAC IÓN C E LU LAR Y

DES C ONGE LAC IÓ N

5.1 Introducción
La criopreservación es un proceso por medio del cual célu-
las o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, general-
mente entre -80 °C y -196 °C, con el fin de mantener las caracte-
rísticas morfológicas y fisiológicas viables por largos periodos de
tiempo. La metodología involucra cuatros pasos: agregar la sus-
tancia crioprotectora, congelación, descongelación y remoción de
la sustancia crioprotectora.
Es importante que se mantengan las características de la
línea celular después del proceso de congelación, para esto es
básico el uso de agentes protectores de la congelación para evitar
la formación de cristales que dañen irreversiblemente el citoplas-
ma celular (Freshney, 2010)
Actualmente existen dos métodos de criopreservación, el
primero de ellos es denominado congelamiento lento, ya que uti-
liza lentas tasas de enfriamiento aproximadamente de -1 °C/min
y el segundo la vitrificación, el cual utiliza tasas de congelación
de -100 °C/min, logrando deshidratar a la célula rápidamente, de
tal forma que no se alcanza a formar cristales
La vitrificación es una técnica de congelación ultra rápida
del material celular, que permite que la célula y su entorno se
solidifiquen en una forma similar al vidrio sin que se formen
cristales de hielo dentro de la célula. Durante el proceso de vi-
trificación toda el agua del interior de la célula se sustituye con
la solución crioprotectora, lo que permite que las células se
puedan colocar en nitrógeno líquido sin la formación de crista-
les de agua. Debido a que este método utiliza altas concentra-
ciones de crioprotector en un volumen mínimo y elevadas velo-
cidades de enfriamiento, es más eficiente en la eliminación del
agua de la célula permitiendo que estén más protegidas de los
efectos perjudiciales del proceso de congelación (García y col.,
2011). El método de congelación tradicional es más lento y, a
menudo, no consigue deshidratar totalmente las células por lo
que las deja más susceptibles al daño. El resultado de la vitrifi-
cación es una estructura muy homogénea y una estructura cris-
talina amorfa.

5.2 Congelación Tradicional

5.2.1 Procedimiento
1. Las células son resuspendidas en un medio de congelación,
compuesto de medio DMEM suplementado con SFB al 20% y
glicerol al 10%, y son almacenadas a -70 ºC para su posterior
uso.
2.Para descongelar estas células, los criotubos son colocados en
agua bidestilada a 37 ºC hasta solubilizar la muestra y luego se
agrega medio nutritivo base.
3.Centrifugar a 724,5 g por 5 minutos y el taco celular obtenido
se resuspende en medio nutritivo para sembrar en placas de
cultivo de 35 mm.
Se debe calcular la viabilidad celular con el colorante
azul tripano y caracterizar las posibles modificaciones de las
células después de la congelación.

5.3 Vitrificación de Células

Método de 2 pasos para criopreservar células y tejidos
utilizando soluciones de equilibrio y de vitrificación según la
metodología de Moon y col. (2008) con ligeras modificaciones

5.3.1 Procedimiento
1. La solución de equilibrio utilizada es 20% de etilenglicol (EG)
y la de vitrificación: 40% EG, 18% Ficoll 70 y 0,3 M sacarosa.
Todas las soluciones se preparan en tampón PBS que contiene
20% de Suero Fetal de Bovino
2. El taco celular con alrededor de 1 x 10 6 células (10
µL) se resuspende en 50 µL de la solución de equilibrio
por 5 minutos y luego se mezcla con 500 µL de la solu-
ción de vitrificación por 40 segundos. La suspensión celu-
lar se coloca en un criotubo de 1,2 mL y se colocan direc-
tamente en nitrógeno líquido.
3. Las células se descongelan a las 2 semanas, colocando
los viales en un baño de María a 37 oC y se resuspende en
PBS que contiene 20% SFB y sacarosa a diversas concen-
traciones (0,5 M, 0,25 M). La viabilidad celular se deter-
mina con el método del azul tripano. Las células son sem-
bradas a una densidad de 100.000 células /frasco 75 cm 2 .
5.4 Vitrificación de Tejidos
Para vitrificar tejidos, se sigue el mismo procedimiento men-
cionado anteriormente, la única diferencia es el incremento del
tiempo con la solución de equilibrio por 10 minutos.
Posteriormente, se extraen las ámpulas con las secciones del
tejido del nitrógeno líquido y directamente se descongelan en un
baño de María a 37 °C y rehidratan en una solución de PBS. En el
laboratorio se ha aplicado este procedimiento al estroma de la
membrana amniótica para ser utilizado como biosustrato celular
(Navarro, 2013).
5.5 Bibliografía del capítulo
Freshney, I. (2010). Culture of animal cells. A manual of basic technique. Edi-
torial Wiley-Liss, 6th Edition, Toronto, Canadá.
García, M., Martínez, R., Ruvalcaba, L. (2011). Vitrificación de
ovocitos y embriones. Revista Mexicana de Medicina de la
Reproducción. 3(4): 143 – 149.
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Central de Venezuela.
Vunjak-Novakovic G., Freshney RI (2006). Culture of Cells for Tissue
Engineering. John Wiley & Sons, Inc.
 CAPITULO 6

UTILIZACIÓN DE

6.1 Introducción
La reconstrucción de tejidos y órganos in vitro, así
como también la terapia celular, son alternativas para la
sustitución de tejidos dañados en el ser humano. Pueden
ser obtenidos a partir de células del mismo paciente. Para
esto se toma una pequeña biopsia de tejido, se disgregan
las células y se cultivan para luego ser implantadas in
vivo, luego de cierto tiempo estas células contribuyen a
la regeneración el tejido dañado.
Estudios in viv o e in v itro han mostrado como dife-
rentes factores epigenéticos tienen una profunda influen-
cia en la diferenciación de las células madre mesenqui-
males (MSCs). Los más estudiados son la composición
del medio, la densidad celular, la organización espacial,
las fuerzas mecánicas, los factores de crecimiento espe-
cíficos y las citoquinas (Pittenger y col., 1999).
También, se conoce que la interacción de la célula
con la matriz extracelular (MEC) es una fuente importan-
te de señales que influyen en el com port am iento de l a
célula, afectando el crecimiento, la migración, la diferen-
ciación y la adhesión celular (Adams y Watt, 1993).
Particularmente el uso de biomatrices ha brindado
la posibilidad de simular de alguna manera la arquitectu-
ra del tejido y las condiciones in vivo, permitiendo ubi-
car las células espacialmente y retener sus funciones, lo
cual resulta importante en la inducción de la expresión de
un fenotipo, pues entran en juego la acción de fuerzas
químicas y mecánicas como la difusión y la tensión, ade-
más de afectar el comportamiento celular por medio de
las interacciones MEC-célula y alterando las interaccio-
nes célula-célula (Merentes, 2009).
Entre los materiales que más se han utilizado para
la elaboración de biomatrices están: los colágenos y sus
derivados, los polímeros y los hialuronatos. Sin embargo,
una biomatriz ideal debe poseer una gran cantidad de ca-
racterísticas para permitir su uso terapéutico, en la rege-
neración y funcionabilidad de un tipo celular específico
(Ponticiello y col., 2000; Mizuno y Kuboki, 2001).
Las poblaciones homogéneas de células del estroma
con morfología fusiforme, obtenidas de diferentes fuen-
tes de tejido como medula ósea o tejido adiposo, se pue-
den sembrar y/o embeber en una matriz tridimensional de
colágeno tipo I. Esto permite brindar a las células un mi-
croambiente circundante que induzca la expresión de ca-
racterísticas de un fenotipo diferenciado, además de utili-
zar diversos factores en el medio base.

6.2 Obtención de Colágeno Tipo 1 a partir de la cola

de rata
El colágeno es obtenido de la cola de rata según la
metodología de Van Bockmeer y col. (1982) con ligeras
modificaciones. El sustrato tridimensional utilizado para
embeber las células del estroma está formado por una red
intrincada de fibras de colágeno tipo I obtenido de la cola
de rata. Este gel posee una consistencia flexible y trans-
parente. Para preparar esta matriz tridimensional de colá-
geno se utiliza una concentración teórica de colágeno de
15 mg/ml.

6.2.1 Procedimiento
1. La cola de rata se coloca en etanol al 70% durante 1 hora
(Se realizan 2 cambios de 30 minutos), luego se desprende
la piel, se corta en segmentos de 3 cm aproximadamente y
se incuba de nuevo en etanol al 70% por 30 min. Transcurri-
do este tiempo se lavan los trozos tres veces en etanol al
70%, se incuban en solución Buffer Fosfato (PBS) 30 minu-
tos. Posteriormente, se realizan 3 lavados con PBS.
2. Los trozos se mantienen en PBS y con 2 pinzas gruesas se
les da unos movimientos de rotación, para extraer con ma-
yor facilidad los tendones del tejido conjuntivo que los ro-
dea. Las fibras obtenidas se colocan en una placa (La placa
estéril es pre-pesada, se colocan las fibras y por diferencia se
conoce el peso de los tendones extraídos).
3. Los tendones se colocan en una solución estéril de ácido
acético glacial diluido 1/1000 en agua. Por cada gramo de
tendones se añade 100 ml de la solución y se mantiene en
agitación continua 48-72 horas a 4 o C.
4. Finalmente, se filtra la solución a través de una gasa y se
centrifuga a 25.000 x g por 1 hora a 4 o C. La solución de
colágeno al 1% obtenida se almacena en alícuotas a 4 o C,
para su posterior utilización en la preparación de los geles
de colágeno. El pH de la solución de colágeno es ajusta-
do a 7.4 con hidróxido de sodio, antes de su utilización en
el cultivo.

6.3 C élul as embebi das en Colágeno Ti po 1

6.3.1 Procedi mi en to
1. Las células son mezcladas con el colágeno a una densi-
dad de 400.000 por gel en placas de 35 mm (Pineda y col.,
2004), dejando polimerizar el colágeno en una estufa a 37
°C por 30 minutos para finalmente agregar el medio de
cultivo correspondiente e incubar a 37 ºC, en atmósfera
húmeda al 5% de CO 2 por 2-4 semanas, con cambios de
medios periódicos, luego de lo cual se realizan las evalua-
ciones histológicas correspondientes.
2. Los geles de colágeno son fijados con formalina neutra
al 10%, deshidratados en una batería creciente de etanol e
incluidos en parafina, para cortar secciones de 5 micras de
espesor en un microtomo rotatorio. Las secciones obteni-
das son procesadas mediante técnicas inmunohistoquími-
cas e hist oquímica s (Figura 1).

Figura 1 A. Corte histológico de cartílago. Coloración Azul Alcian pH 1. B. Matriz de

colágeno tipo I donde están incluidos los condrocitos. Se puede observar la coloración
azul en la región pericelular en la mayoría de las células incluidas en la matriz similar
al tejido nativo (Pineda y col., 2004).

6.4 Bibliografía del capítulo

Adams, J. y Watt, F. (1993). Regulation of development
and differentiation by the extracellular matrix.
Development 117: 1183-1198.
Merentes, E. (2009). Fuentes de obtención de células madre
mesenquimales. Potencialidad de diferenciación in
vitro. Trabajo de ascenso a Titular. Universidad
Central de Ve nezuela. Caracas.
Mizuno, M. y Kuboki, Y. (2001). Osteoblast-related gene ex
pression of bone marrow cells during the osteo-
 blastic differentiation induced by type I collagen. J.
Biochem. 129:133-138.
Pineda, K., Merentes, E. y Starosta, R. (2004) Caracterización
morfológica y bioquímica de condrocitos in vitro. Re-
vista del Instituto Nacional de Higiene ”Rafael Rangel”,
35(1):6-11.
Pittenger, M., Mackay, A., Beck, S., Jaiswal, R., Douglas, R.,
Mosca, J., Moorman, M.; Simonetti, D.; Craig, S. y Mar-
shak, D. (1999). Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147.
Ponticiello, M., Schnagl, R., Kadiyala, S. y Barry, F. (2000). Gel-
atin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human
mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy.
J. Biomed. Master Res. 52:246-255.
Van Bockmer, F. y Clayton, E. M (1982). Measurements of cell
proliferation and cell mediated contraction in 3-
dimensional hydrated collagen matrices. J. Tiss. Cult.
Methods. 7 (4): 163-167.
 CAPITULO 7

CULTIVO DE CÉLULAS M ES E NQ U IM A LE S
DEL TEJ IDO ADIPOSO HUMANO

7.1 Introducción
El tejido adiposo es un tejido conectivo especializado el
cual, se deriva del mesodermo embrionario. En los mamíferos
existen dos tipos de tejido adiposo, que se diferencian por el co-
lor entre otras características. El tejido adiposo amarillo o blanco
representa la mayor parte del tejido adiposo del adulto. También
se denomina tejido adiposo unilocular porque las células solo
contienen una única gota grande de lípido.
El tejido adiposo marrón es muy escaso en los adultos,
mientras que en el feto y en recién nacidos está muy desarrolla-
do. Este tejido también se denomina multilocular porque las célu-
las contienen muchas gotas pequeñas de lípido. El estroma del
tejido adiposo está constituido por células sanguíneas, células
endoteliales, precursores de los adipocitos, fibroblastos y una po-
blación de células mesenquimales indiferenciadas.
Estudios in vitro han demostrado que el tejido adiposo es
una fuente rica en MSCs que tiene propiedades similares a las de
la médula ósea. Esta población de células, también es capaz de
diferenciarse a distintos linajes celulares como el condrogénico,
adipogénico, miogénico y neurogénico. Estos resultados hacen
pensar que el tejido adiposo puede ser una fuente alternativa de
MSCs con capacidad de diferenciarse hacia estos linajes celulares
(Zuk y col., 2002, Romero y col, 2005). La utilización de estas
células madre para su aplicación en el tratamiento de diversas en-
fermedades es de gran significado si se tiene en cuenta la facili-
dad de obtención de estas células del tejido graso y su expansión
in vitro.
Para caracterizar específicamente el fenotipo de las MSCs
del tejido adiposo se ha desarrollado una serie de anticuerpos mo-
noclonales que permite determinar el fenotipo de estas células, las
cuales expresan marcadores CD29, CD73(SH3/SH4), CD90, con-
siderados como marcadores de las MSCs (Tolar y col., 2010).
Adicionalmente se ha demostrado por inmunofluorescencia y
análisis de citometría de flujo que las células provenientes del
estroma de tejido adiposo expresan un marcador característico el
CD49d, que permite diferenciarlas de la población de MSCs del
estroma de la médula ósea (Zuk y col., 2002). Sin embargo, se ha
demostrado que estos dos tejidos comparten una serie de marca-
dores específicos (Kern y col., 2006).
Aunque la médula ósea es la mejor fuente de obtención de
las células humanas, se ha planteado que hay algunos aspectos
que dificultan su uso como es la limitada tasa de crecimiento, la
capacidad de diferenciación de acuerdo con la edad del donante
de la médula, así como el riesgo de la toma de la muestra (Beyer
y Da Silva, 2006). Recientemente se ha demostrado que las célu-
las del tejido adiposo no muestran rasgos de senescencia in vi-
tro sino cuando tienen muchos pasajes, contrastando con
lo señalado para la medula ósea (Dimitrieva y col.,
2012).

Respecto al aislamiento y cultivo a partir del tejido adi-

poso, las células obtenidas de esta fuente tienen una morfolo-
gía, un fenotipo y una capacidad de diferenciación in vitro,
similar a las obtenidas de la médula ósea y es posible obtener
estas muestras fácilmente a partir de liposucción o abdomino-
plastia (Rodríguez y col., 2009).

7.2 Materiales
 Material biológico: Tejido adiposo obtenido del
tejido subcutáneo de la piel obtenida de cirugías
estéticas con consentimiento del paciente.
 Solución PBS
 Medio F12 con 2% antibióticos -antimicóticos
 DMEM suplementado con 10% de SFB
 Colagenasa tipo I
 Tripsina 0,125% - EDTA 0,02%,
 Pipetas
 Frascos de 25 cm 2
 Placas de Petri
 Tubos de centrífuga 15 mL
 Fiolas
 Magnetos.
7.3 Procedimiento
Obtención de las células provenientes del estroma del tejido
adiposo se sigue el método de Zuk y col. 2001 con algunas modi-
ficaciones.
1. Las muestras de piel obtenidas de cirugías estéticas son transportadas al
laboratorio en medio F12 con antibióticos (penicilina 200 U/ml, estrepto-
micina 100 µg/ml y anfotericina 4 µg/ml), a una temperatura de 4 ºC
(Bello y col, 1998).
2. Separar el estroma del tejido adiposo humano de las otras capas de
la piel, lavar varias veces con PBS para eliminar los restos de sangre y
seccionar en pequeños trozos, añadiendo colagenasa tipo I (SIGMA)
al 0,075% y colocar en agitación durante 30 minutos a 37 oC. La sus-
pensión celular resultante se filtra y se centrifuga durante 15 minutos a
2500 rpm. Posteriormente, el taco celular obtenido, se resuspende en
un medio DMEM suplementado con 10% de SFB, 100 U/ml penicili-
na G y 2 mg/ml anfotericina.
3. La viabilidad celular es determinada con el colorante de exclusión
azul tripano y se cuantifica el número de células con un hemocitóme-
tro. Las células se siembran a una densidad de 7 x 105 a 1,3 x 106 célu-
las en frascos de 25 cm2.
4. Los cultivos son incubados a 37 °C, en atmósfera húmeda al 5%
CO2. Posteriormente, se cambia el medio a las 24 horas de cultivo
para así eliminar los restos de células y se mantiene hasta alcanzar la
semiconfluencia con cambios de medios periódicos, luego de lo cual
se realizan los subcultivos con el fin de amplificar la población de cé-
lulas progenitoras de morfología fusiforme (Figura 1). Para ello las
células se disgregan con tripsina 0,125% - EDTA 0,02%, se centri-
fuga a 618 g por 5 minutos y el taco celular obtenido se resuspende
en medios de cultivos para sembrar nuevamente.
Una vez amplificadas las células por los subcultivos, pue-
den ser utilizadas para realizar ensayos de proliferación, carac-

Figura 1. Subcultivo de células del tejido adiposo humano se puede

apreciar la morfología fusiforme. Contraste de fases.200X.

terización e inducción de la diferenciación.

7.4 Bibliografía del capítulo

Bello, G., Merentes, E. y Arvelo, F. (1998). Cultivo de quera-
tinocitos humanos in vitro, Gaceta Médica 106 (4): 491
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Beyer, N. y Da Silva, M. L. (2006). Mesenchymal stem cells: isolation,
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col. 174:249-282.
Dmitrieva, R. I., MinullinaI, R., Bilibina, A. A., Tarasova, O. V., Anisi-
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Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. (2006).
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bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.
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Rodríguez, M. y Merentes, E. (2009). Potencial de diferenciación
de las células mesenquimales del tejido adiposo humano y
de ratón. IV Congreso ALABAT. Punta Del Este. Uru-
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Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. (2010). Concise
Review: Hitting the right spot with mesenchymal stromal
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Zuk, P., Zhu, M, Ashjian, P., De Ugarte, D., Huang, J., Mizuno,
H., Alfonso, C., Fraser, J., Benhaim, P., Hedrick, M.
(2002). Human adipose tissue is a source of multipotent
stem cells. MBC.13 (12):4279-95.
Zuk, P., Zhu, M., Mizuno, H., Huang, J., Futrell, JW, Katz, A.J.,
Benhaim, P., Lorenz, H. P. y Hedrick, M. H. (2001). Mul-
tilineage cells from human adipose tissue: implications for
cell-based therapies. Tissue Eng. 7(2): 211-228.
 CAPITULO 8

CULTIVO DE CÉLULAS DE CARTÍLAGO NA-

SAL HUMANO

8.1 Introducción

El cartílago es un tejido avascular al igual que la epider-

mis, por lo cual los nutrientes difunden a partir de los vasos
sanguíneos del tejido conectivo que los circundan. Según esta
característica, es posible establecer cultivos de condrocitos y
reconstruir tejidos cartilaginosos in vitro, pero es importante
tener en cuenta que la proliferación, expresión y mantenimien-
to del fenotipo característico de los condrocitos dependen de
las condiciones de cultivo, tales como suplementos del medio
de cultivo (factores de crecimiento y otras sustancias), densi-
dad de siembra y tipo de sustrato utilizado (matrices naturales
o sintéticas) (Perka y col., 2000).

La optimización de las técnicas in vitro utilizando estas

condiciones ha permitido que los cultivos de condrocitos pue-
dan ser usados para la restauración de daños en el cartílago ar-
ticular humano. La bioingeniería de tejidos ha logrado producir
cartílago ex vivo, teniendo en cuenta parámetros como la fuen-
te de células, moléculas de señalización, andamios e influen-
cias biomecánicas que permiten producir un tejido que puede
ser implantado con características similares y funcionales al
tejido nativo (Kock y col., 2012).

8.2 Materiales
Material biológico: Muestras de cartílago nasal humano
de edades comprendidas entre 15-25 años, provenientes de ci-
rugías reconstructivas de la nariz bajo consentimiento informa-
do.
 Tripsina 0,25%
 Colagenasa Tipo II (2 mg/ml)
 Medio Ham’s F-12 con 10% SFB
 Medio nutritivo: DMEM: F12 (3:1) con 10% SFB, 50 µg/
mL ácido ascórbico, 10ng/mL EGF, 10 µg/mL Insulina.
 Tripsina 0,125% - EDTA 0,02%
 Gelatina al 1%
 Placas de Petri
 Pipetas
 Tubos de centrifuga 15 mL.

8.3 Procedimiento
1. Las muestras de cartílago se exponen a un tratamiento enzimático
realizado de forma secuencial. Primero se incuban en una solución de
tripsina a una concentración de 0,25% durante 30 minutos en agitación a
37 ºC. Una vez transcurrido este tiempo, se extrae el sobrenadante y se
incuban los trozos en una solución de Colagenasa Tipo II (2 mg/ml) en
medio Ham’s F-12 durante 12 horas a 37 ºC.
2. Dejar sedimentar los trozos que no han sido digeridos y la suspensión
que contiene las células se recoge en tubos de centrífuga y se inactiva
con medio frío.
3. Centrifugar por 10 minutos a 681,8 g descartar el sobrenadante y
resuspender el taco celular obtenido, en medio nutritivo y realizar el
contaje celular con un hemocitómetro para determinar la viabilidad de
las células con el colorante de exclusión azul tripano.
4. Sembrar las células con el medio nutritivo en placas de 51 mm pre-
viamente gelatinizadas.
5. Cuando los cultivos primarios de condrocitos humanos alcanzan la
semiconfluencia se procede a realizar los subcultivos celulares de la si-
guiente manera: Las células se disgregan con tripsina 0,125 % - EDTA
0,02 %, se centrifugan a 681,8 g por 5 minutos, y el taco celular obteni-
do se resuspende en el medio nutritivo para sembrarse nuevamente en
frascos de cultivo de 25 cm2.
Las células de diferentes pasajes se pueden congelar para
evaluar las características morfológicas y la potencialidad de
proliferación antes y después de la congelación. El comporta-
miento proliferativo de estas células se calcula determinando la
frecuencia acumulativa de la población celular (Zuk y col.,
2001).
Los condrocitos humanos cultivados sobre plástico a al-
tas densidades muestran un crecimiento en monocapa en los
primeros días de cultivo, destacándose una apariencia celular
de tipo poliédrica con espacios prominentes entre ellas (Figura
1). Las células subcultivadas mantienen las mismas caracterís-
ticas morfológicas hasta el segundo subcultivo y se observa
una marcada proliferación celular. A partir del 3er. pasaje se
evidencian cambios morfológicos en algunas poblaciones del
cultivo donde se pueden observar células con morfología fusifor-
me, planteándose una desdiferenciación de los condrocitos
(Figura 1). No obstante, se logra mantener los cultivos hasta el
9no. pasaje sin rasgos aparentes de senescencia y se mantienen
su potencial de proliferación (Márquez y col., 2012).

Figura 1. 1era fase en la producción de tejido cartilaginoso in vitro.

En presencia de una matriz de colágeno tipo I, se brinda a los con-

drocitos un espacio tridimensional que simula las condiciones en
que se encuentra in vivo, por lo cual los condrocitos mantienen su
morfología esférica y sintetizan componentes de matriz característi-
cos, como son GAG y colágeno tipo II, que son marcadores de la
estabilidad fenotípica de estas células. (Figura 2).
 Figura 2. Equivalente de cartílago. Se
puede apreciar las células de morfolo-
gía esférica. Expresión de colágeno
tipo II en la matriz extracelular (flecha)
(Tomado de Pineda y col., 2004).

8.4 Bibliografía del capítulo

Márquez, M. L., Hernández, A., Scioscia, D. y Merentes, E.
(2012). Cultivo de células de cartílago nasal humano.
Gac. Med. 120(1):48-54.
Perka, C., Spitzer, R., Lindenhayn, K., Sittinger, M., Schultz,
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Pineda, K., Merentes, E. y Starosta, R. (2004). Caracterización
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vista del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”,
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sue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng.
7, 211-228.
 CAPITULO 9

CULTIVOS DE CÉLULAS DE LA PIEL

9.1 Introducción
La epidermis es un tejido constituido principalmente por
queratinocitos, los cuales se organizan histológicamente en di-
ferentes estratos: basal, espinoso, granuloso y corneo. Las cé-
lulas del estrato superior son constantemente removidas y tie-
nen una alta tasa de recambio. Ellas surgen a partir de las célu-
las que conforman el estrato basal, sufriendo progresivamente
el proceso de diferenciación y desplazándose hacia los estratos
superiores.
La diferenciación de las células madre de la piel es un
proceso complejo que se caracteriza por una secuencia ordena-
da de cambios morfológicos y bioquímicos, los cuales son
acompañados por la expresión y modificación de ciertos pro-
ductos específicos de diferenciación (Eckert, 1989).
Una de las propiedades de la epidermis es que no está
vascularizada. Los nutrientes difunden a partir de los vasos
sanguíneos de la dermis, característica que permite reconstruir
la epidermis bajo ciertas condiciones in vitro, lo cual nos brin-
da la oportunidad de estudiar los procesos de diferenciación
epidérmica.
Los cultivos de queratinocitos humanos in vitro han sido
usados como modelo ideal para realizar estudios de diferencia-
ción celular, ya que se ha logrado reproducir la organogénesis
in vivo bajo ciertas condiciones de cultivo (Bello y col.,
1998; Merentes, 2001). Igualmente, han sido utilizados am-
pliamente en biomedicina, para recubrimiento cutáneo con
amplias aplicaciones clínicas, como tratamientos de lesiones
y para reconstrucción de la piel (Tanabe y col., 1992). Ade-
más representa una alternativa confiable para ser aplicada a
pacientes con daño parcial o externo de su piel que ameriten
de sus propias células especializadas para su recuperación.
Muchas han sido las técnicas de cultivo de queratino-
citos desarrolladas en los últimos años con fines terapéuti-
cos a partir de las cuales se pueden obtener láminas de epi-
dermis en períodos relativamente cortos, entre 20 a 22 días.
A nivel práctico hay que considerar que actualmente
se han ido perfeccionando las técnicas de cultivo con fines
terapéuticos. El desarrollo de una técnica de esta naturaleza
ha sido de gran transcendencia tanto desde un punto de vista
básico como aplicado, ya que representa una alternativa
confiable para todos aquellos pacientes que presentan que-
maduras, así como otras afecciones de la piel pudiendo ser
considerada como una técnica irremplazable para la aplica-
ción en este tipo de patología. (Gil-Loyzaga y col., 2011).
A pesar de que existe la metodología que permite estu-
diar los procesos de diferenciación de las células epiderma-
les, todavía es necesario optimizar la técnica para tratar de
encontrar un modelo in vitro que se asemeje mucho a lo que
ocurre en el compartimiento in vivo. Recientemente se han
obtenido mejores resultados cuando los queratinocitos son
cultivados sobre equivalentes dérmicos (gel de colágeno
tipo I más fibroblastos) y en una interfase aire-líquido. Bajo
estas condiciones las células epidermales expresan los mar-
cadores de diferenciación terminales, tales como la filagri-
na, transglutaminasa tipo I, citoqueratina tipo 10.

9.2 Materiales
 Medio de transporte: F12 que contiene doble concen-
tración de antibióticos (penicilina G; 100 U/ml, estrep-
tomicina; 100 µg/ml) y antimicóticos (anfotericina B;
10 µg/ml).
 Dispasa tipo II (Bacillus polymyxa, Gibco BRL)
 Tripsina-EDTA (0,13%, 0,02%)
 Colágeno tipo I obtenido de la cola de la rata
 Solución PBS
 Frascos plásticos de 25 cm 2
 Fijador Rossman
 Citoqueratina 10 (DAKO).
Medio para mantenimiento de las células epidermales:
Medio definido para queratinocitos (KM1, SIGMA) y el
MCDB 153 (SIGMA) con bajas concentraciones de calcio
suplementado con 5% de suero fetal de bovino, hidrocorti-
sona (0,5 µg/ml), insulina (0,5 µg/ml), factor de crecimiento
epidermal (10 ng/ml) y transferrina humana (10 ng/ml).
 Medio de inducción: Dulbecco's modificado (DMEM) y
el Ham F12 mezclado en una proporción 3 a 1, respectivamen-
te, suplementado con 10% de suero fetal de bovino (SFB), hi-
drocortisona (0,5 µg/ml), insulina (0.5 µg/ml), triodotironina
(2 x 10-9 M), toxina de cólera (0,1 nM), adenina (1,8 x 10 -4M),
factor de crecimiento epidermal (10 ng/ml) y transferrina hu-
mana (10 ng/ml).
Medio nutritivo para fibroblastos: DMEM suplementado
con 10% de SFB.

9.3 Procedimiento

9.3.1 Obtención de las Células Epidérmicas

Las muestras de piel humana son obtenidas a partir de
cirugías estéticas, las cuales son colocadas inmediatamente en
medio F12 y transportadas en hielo al laboratorio para su pro-
cesamiento.
1. Para la separación de la epidermis de la dermis, se pro-
cede de la siguiente manera:
Las muestras se colocan en una solución de Dispasa tipo II a
una concentración de 2,4 U/ml en PBS durante 18 horas a 4 oC, para
posteriormente hacer la separación, la cual es llevada a cabo manual-
mente mediante la utilización de pinzas para microcirugía. Para eva-
luar la separación de los componentes de la piel, la epidermis y der-
mis, éstas son fijadas en Rossman durante 24 horas a 4 oC y procesa-
das con las técnicas convencionales de histología (Figura 1).
 Figura 1. A. Componente epi-
dérmico con su membrana
basal aislado por acción de la
Dispasa B. Componente dér-
mico aislado. Coloración He-
matoxilina-Eosina. 100X.
(Tomado de Bello y col.,
1998).

2 La epidermis separada se corta en fragmentos pequeños y se coloca

en una solución de Tripsina-EDTA (0,13%, 0,02%) para ser sometida a
tripsinación fraccionada con agitación continua de 10-15 minutos a 37 oC.
Con este tratamiento se logra separar y obtener un elevado porcentaje de
células epidermales, se determina la viabilidad celular mediante el método
del azul de tripano.
3 Los queratinocitos obtenidos se siembran en frascos plásticos de 25
cm2 (2,3 x 106 células/frasco), que contienen previamente una película de
colágeno tipo I. Posteriormente, los cultivos se incuban en una atmósfera
húmeda de 5% C02 a 37 oC. Al cabo de cierto tiempo una vez que los culti-
vos primarios alcanzan la semi-confluencia, se procede a realizar los sub-
cultivos.
4 Analizar las características morfológicas y el comportamiento in
vitro de las células epidérmicas realizando observaciones periódicas al
microscopio (Figura 2A y 2B). Por otra parte, también se puede utilizar un
anticuerpo en contra de la integrina α2β1, la cual se expresa en las células
básales de la epidermis (Figura 2C).
Figura 2. A. Colonias de queratinocitos.100X B. Monocapa de queratino-
citos donde se puede observar las células de forma poliédricas y las unio-
nes intercelulares. 200 X. Microscopio de contraste de fases. C. Ensayo
inmunocitoquímico con el anticuerpo contra integrina α2β1 donde se ob-
servan células positivas al marcaje, específicamente a nivel de la mem-
brana celular. 200X.

Los cultivos secundarios se dejan crecer hasta alcanzar la

confluencia. La monocapa epidermal obtenida se desprende de
la superficie en forma de láminas coherentes con la ayuda de la
proteasa Dispasa II, la cual separa el tejido manteniendo su in-
tegridad. Finalmente, la monocapa es fijada para su evaluación
morfológica.

Figura 3. Estratificación in
vitro de las células epiderma-
les. Células basales (b) y ex-
presión de la citoqueratina 10
en las capas suprabasales (s).
3 semanas de cultivo. 100X.
9.3.2 Cultivo de Células Dérmicas Humanas
Para la obtención de los fibroblastos se procede de la
siguiente manera:
La dermis se corta en fragmentos finos (1 mm) y se colocan
en placas de cultivo con medio nutritivo DMEM suplementado
con 10% de SFB. Los cultivos son incubados a 37 oC en una at-
mósfera húmeda con 5% CO2. Posteriormente, una vez que las
células irradian de los explantes, se realiza el subcultivo.

Figura 4. Subcultivo de células tipo fibroblastos.100X.

Microscopio de contraste de fases.

9.4 Queratinocitos subcultivados sobre equivalentes

dérmicos
Los equivalentes dérmicos consisten de una matriz de
colágeno tipo I, substrato tridimensional formado por una red
intrincada de fibras con la consistencia de un gel flexible y
transparente, donde son embebidos los fibroblastos dérmicos
humanos.
1. Para preparar estos equivalentes, los fibroblastos se
mezclan con el colágeno a una densidad de 5.000 célu-
las/ml, luego se deja polimerizar el colágeno por unos
minutos en la estufa de CO 2 . Estos equivalentes pueden
ser utilizados al cabo de 3-4 días de preparados.
2. Los queratinocitos se subcultivan sobre el equivalente
dérmico, sembrándolos a una alta densidad celular y se
dejan alrededor de 2-3 horas. Después de transcurrido
este tiempo, se le añade el medio nutritivo y se deja en
condiciones sumergidas por 2-3 días hasta que se alcan-
ce la confluencia.
3. Añadir al cultivo el medio inductor de diferenciación
y se coloca en una interfase aire-líquido. Las láminas
epidérmicas son fijadas en Rossman durante 15 minutos
a temperatura ambiente y luego se colocan en etanol al
70%, para posteriormente realizar las coloraciones. (ver
Figura 5).

Figura 5. Producción de lámina epidérmica estratificada usando equivalente

dérmico.
9.5 Bibliografía del capítulo
Bello, G., Merentes, E. y Arvelo, F. (1998). Cultivo de que-
ratinocitos humanos in vitro, Gaceta Médica 106 (4):
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Eckert, R. L. (1989). Structure, Function and Differentia-
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 CAPITULO 10

E S T A B LE C IM IE N T O D E L ÍN E A S C E L U L A R E S
EMBRIONARIAS PLURIPOTENTE S

10.1 Introducción
La generación de la diversidad celular, producto de la dife-
renciación, constituye uno de los procesos fundamentales del
desarrollo, donde cada uno de los tipos celulares del organismo
desciende de una sola célula, el óvulo fecundado. Esto implica
que toda la información que se requiere para generar esta diversi-
dad está presente en el cigoto. Actualmente, la biología del desa-
rrollo plantea estas interrogantes acerca de cómo este mismo gru-
po de instrucciones genéticas puede producir diferentes tipos ce-
lulares y cómo el cigoto puede generar tantos tipos celulares di-
ferentes.
Durante el desarrollo embrionario hay una restricción pro-
gresiva en la potencialidad de las células para generar los dife-
rentes tipos celulares, y para estudiar la diferenciación de células
embrionarias, éstas deben ser aisladas en etapas muy tempranas
del desarrollo antes de que ocurra el proceso de gastrulación.
Las células embrionarias denominadas stem cells (ESCs)
se obtienen de los blastocitos de ratón, específicamente de la ma-
sa celular interna. Éstas pueden ser establecidas en un corto pe-
riodo y son consideradas cultivos primarios que conservan carac-
terísticas muy similares a su tejido de origen. Además mantie-
nen su estabilidad cromosomal, son capaces de mantener su
estado indiferenciado después de prolongados períodos de cul-
tivo y, finalmente, diferenciarse en estructuras complejas bajo
ciertas condiciones in vitro (Rossant y col., 1991).
Uno de los aspectos más resaltante de estas células es
que ellas son capaces de contribuir al desarrollo normal de teji-
dos tanto somáticos como gonadales, cuando ellas son devuel-
tas a su medio ambiente embrionario mediante la producción
de quimeras (Nagy y col., 1990, Merentes, 1993).
La investigación de células madre es un tema de gran ac-
tualidad debido a las grandes expectativas que se han generado
para su utilización en la medicina del futuro, así como también
su aplicación en la biología del desarrollo, creando modelos in
vitro que permitan analizar diferentes eventos que ocurren du-
rante el desarrollo y que son difíciles de abordar en el embrión
completo. En 1998, dos grupos por separado lograron obtener
líneas celulares embrionarias pluripotentes a partir de blastocis-
tos humanos y de células germinales primordiales (Thomson y
col., 1998, Shamblott y col., 1998). Estos autores utilizaron las
mismas técnicas que se aplicaron en murinos. De esta manera
se abrió una compuerta para la investigación del siglo XXI so-
bre la biología de las células madre y su potencial aplicación en
la medicina regenerativa.
Se ha señalado que las células madre son solo “actores”
en el mantenimiento y reparación de los tejidos, ya que respon-
den a una multitud de señales extrínsecas del microambien-
te que las rodea y son las que van a dirigir su comportamiento.
Conociendo este nicho celular en el tejido, enton-
ces se pueden desarrollar modelos usando células madre
que permita promover la regeneración celular (Wagers,
2012).
Recientemente, con el mejoramiento de las técni-
cas básicas del cultivo celular y con el conocimiento de los
mecanismos básicos de reprogramación celular se ha logrado
obtener células madre pluripotentes inducidas (IPSC)
(Mostoslavsky, 2012).

10.2 Materiales
Material biológico: Establecimiento de las líneas embrionarias.
Ratones de la cepa 129, los cuales tienen el pelaje gris.
 Preparación de monocapas de fibroblastos: Ratones albi-
nos NMRI 15 días de gestación.
 Microplacas de 4 pozos
 Capilares
 Frascos plásticos de 25 cm2
 Pipetas de 5 y 10 mL
 Tubos de centrifuga de 15 mL
 Hemocitómetro

Medios y soluciones
Solución PBS
Medio de Dulbecco modificado (DMEM) suplementado
con 20% de suero fetal de bovino, 10-4 M mercaptoetanol, 1 mM
de aminoácidos no-esenciales.
Medio de congelación: DMEM más 20% SFB y 10% de Dimetil
sulfoxido (DMSO).
Solución Tripsina al 0,025% y EDTA al 0,02% en propor-
ción 1:3 para subcultivar las células embrionarias y fibroblastos.

10.3 Procedimientos
10.3.1 Obtención de los blastocitos
1. Aparear ratones hembras y machos, chequear el tapón vaginal
en las primeras horas de la mañana, una vez visualizado se consi-
dera que los ratones tienen 0,5 días de gestación (Figura 1).

Figura 1. Visualización del tapón vaginal (flecha).

2. Sacrificar los ratones hembras con 3,5 días de gestación por

dislocación cervical. Realizar una incisión media ventral segui-
da de un corte transversal en la piel de la línea media del abdo-
men, previamente impregnada con etanol al 70%. Separar la
musculatura adyacente, exponiendo las vísceras, las cuales se
desplazan teniendo cuidado de no perforar los intestinos, para extraer
los cuernos del útero, los cuales se transfieren a una placa de Petri con
solución PBS, para luego realizar la disección de los fetos.
3. Eliminar tejidos y vasos sanguíneos y realizar un lavado haciendo
fluir con una inyectadora de 1mL de medio nutritivo para recolectar los
embriones. Éstos se chequean bajo la lupa para ver las condiciones y el
estado en que se encuentran.

10.3.2 Preparación de monocapas de fibroblastos

Se sigue la metodología señalada en el capítulo 2 del estableci-
miento de cultivos primarios por explantes y/o disgregación enzimática
a partir de fetos de ratón. La suspensión celular de fibroblastos obtenidas
al subcultivar se irradia con dosis de rayos X de 6.5 Gy y se siembra en
microplacas de cultivo. Éstas pueden ser usadas hasta 4 días después de
la preparación.

10.3.3 Cultivo de blastocitos y aislamiento de las líneas celulares em-

brionarias

1. Utilizar micropipetas (preparadas de tubos capilares) para sem-

brar 2-3 embriones en las microplacas de cultivo que contienen los
fibroblastos irradiados

2. Cultivar los blastocitos por 4-5 días en una atmosfera húmeda que
contiene 5% de CO2, durante este tiempo los embriones se liberan
de la zona pelúcida y se adhieren a la monocapa celular. Descartar el
medio nutritivo de las microplacas y lavar 2 veces con PBS (Figura
2).
3. Transferir la masa celular interna (MCI) con una micropi-
peta de punta fina a 50 µL de Tripsina-EDTA y disociar en
pequeños grupos de células, las cuales se siembran en las
microplacas de cultivo que contienen los fibroblastos irra-
diados y el medio nutritivo con 10 ng/mL de factor recom-
binante inhibitorio de la leucemia (LIF).

4. Incubar las microplacas por 7 días en una atmosfera hú-

meda que contiene 5% de CO 2, es importante chequear dia-
riamente en el microscopio invertido. En el transcurso de
este tiempo se pueden observar colonias de diferentes tipos:
Células gigantes del trofoblasto, células tipo endodérmicas
y las células madre (Figura 3). Las colonias de células ma-
dre son marcadas y se dejan por 7 días. Posteriormente se
transfieren con una micropipeta capilar de punta fina a 50
uL de Tripsina-EDTA y se disocian en células individuales
que se colocan de nuevo en microplacas que contienen fi-
broblastos irradiados, realizando cambios de medio nutritivo
cada 48 horas.

5. Los cultivos confluentes de células madre se subcultivan,

manteniendo unas células in vitro, y otras células criopre-
servadas para así minimizar el tiempo de cultivo y que no
ocurran alteraciones genéticas.
Figura 2. Desarrollo in vitro del blastocito de ratón A. Blastocito recién extraí-
do sobre la monocapa de fibroblastos embrionarios (F). B. Liberación de la
zona pelúcida al 1er. día de cultivo. C. Adherencia del blastocito a través de
las células del trofoblasto (flecha). (Tomado de Merentes, 1993)

Figura 3. A. Proliferación de la masa celular interna donde se observa la

capa endodérmica externa (end), el ectodermo (ect) y las células gigantes del
trofoblasto (flechas) 250X. B. Colonias de células madre compuestas de
células indiferenciadas. 7 días después de la disociación de la MCI. 250X.
(Tomado de Merentes, 1993)
10.4 Bibliografía del capítulo
Merentes, E. (1993). Establishment of embryonic stem cells
lines (ES) and their developmental potentiality. Tesis
doctoral. Universidad de Ciencias Eötvös Lorand, Bu-
dapest, Hungría.
Mostoslavsky, J (2012). Concise Review: The magic act of
generating induced pluripotent stem cells: many rabbits
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Nagy, A., Gócza, E., Merentes, E., Prideaux, V., Iványi, E.,
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ripotent stem cells from cultured human primordial germ
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Thompson, J.A., Itskovitz-Eldor, J, Shapiro, S.S., Waknitz,
M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M. (1998).
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Wagers, A.J. (2012) The stem cell niche in regenerative
medicine. Cell Stem Cell, 10:362-369.
 CAPITULO 11

ESTABLECIMIENTO DE CÉLULAS MADRE

MESENQUIMALES PROVENIENTES DEL
CORDÓN UMBILICAL HUMANO

11.1 Introducción.
Recientemente, se ha demostrado que el cordón umbilical,
órgano que forma la conexión entre la placenta y el feto, también
es una fuente rica en células progenitoras mesenquimales y hema-
topoyéticas. A nivel histológico el cordón umbilical muestra una
morfología específica, presentando una vena y dos arterias rodea-
das por un tejido conectivo conocido como la gelatina de Whar-
ton. Este tejido conectivo mucoso del cordón umbilical es un teji-
do rico en colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) y proteoglica-
nos (Sobolewski y col, 1997). La sangre presente dentro del cor-
dón umbilical representa una fuente alternativa de células madre
hematopoyéticas, que pueden obtenerse fácilmente, aunque su
cantidad es baja (CD34+ y CD38-) (Cardoso y col, 1993).
Mitchell y col. en el año 2003 realizaron el primer aisla-
miento de células mesenquimales de cordón umbilical humano
por medio de la técnica del explante, y pudo determinar la presen-
cia de varios marcadores moleculares para células madre en las
células de la gelatina de Wharton, incluyendo el c-kit (CD117) y
la actividad de la telomerasa. Este grupo de investigadores indujo
en las células de la gelatina de Wharton la expresión del fenotipo
neural y observaron que pocas horas luego del tratamiento las
células de la gelatina de Wharton desarrollaron una morfología
similar a la de las células madre neurales. Estas células del cor-
dón umbilical bajo condiciones apropiadas tienen un alto po-
tencial de diferenciación hacia este linaje celular. Se ha podido
determinar la presencia de células similares a neuronas y astrocitos
en el cultivo (Merentes, 2009).
Estas células mesenquimales aisladas de la gelatina de
Wharton expresan moléculas de adhesión (CD44 y CD105),
marcadores de integrinas (CD29 y CD51) y marcadores de cé-
lulas madre mesenquimales (SH2 y SH3), pero no expresan
marcadores hematopoyéticos (CD34 y CD45). Estas células
pueden diferenciarse hacia diversos fenotipos, dentro de los
cuales se pueden mencionar osteocitos, condrocitos, células
musculares, entre otros (Araos, 2009 y Calderón, 2007). Re-
cientemente se ha logrado inducir la diferenciación condrogé-
nica temprana de estas MSCs usando campos electromagnéti-
cos (Esposito y col., 2013).
Las células cordón umbilical humano son de naturaleza
más primitiva que las MSCs de tejidos adultos, inclusive consi-
deradas por algunos investigadores como pluripotentes. Estas
propiedades las hace únicas como candidatas a la fuente de cé-
lulas ideal para la medicina regenerativa.
Recientemente ha sido demostrado que las células me-
senquimales aisladas de la Gelatina de Wharton presentan una
mayor eficiencia de sembrado que las células madre mesenqui-
males aisladas de la sangre presente en el cordón umbilical hu-
mano. Estos resultados son de relevancia clínica, ya que el pro-
cedimiento de rutina utilizado en los bancos de células madre,
es el almacenamiento de la sangre presente en el cordón umbi-
lical y el descarte del tejido (Secco y col, 2007). Se ha plantea-
do que células madre mesenquimales derivadas de cordón um-
bilical de bovino también pueden ser una alternativa como
fuente de células para la creación de futuros bancos de células que
permita el desarrollo biotecnológico en el campo veterinario (Cardozo y
col., 2012).

11.2 Materiales
Material biológico: Los cordones umbilicales son obtenidos de
partos naturales y cesáreas, bajo consentimiento de los pacientes y
posteriormente transportados al Laboratorio de Cultivo de Tejidos
y Biología de Tumores del Instituto de Biología Experimental, en
medio F12 con antibióticos (penicilina 200 U/ml, estreptomicina
100 µg/ml y anfotericina 4 µg/ml), a una temperatura de 4 ºC .
 Frascos plásticos de 25 cm2
 Placas plásticas 35 mm
 Pipetas de 5 y 10 mL
 Tubos de centrifuga de 15 mL
 Hemocitómetro

Medios y soluciones
Solución PBS
 Medio de cultivo DMEM y medio F12, suplementado
con Suero Fetal de Bovino al 15%, antibióticos (penicilina 100
U/ml, estreptomicina 50 µg/ml), anfotericina 2 µg/ml.
Solución Tripsina al 0,025% y EDTA al 0,02% en proporción
1:1 para subcultivar las células.

11.3 Procedimientos

11.3.1 Obtención y establecimiento del cultivo primario a

partir de las células mesenquimales del cordón umbilical
humano.

Lavar el cordón umbilical 3 veces en solución PBS y ex-

traer la vena y las arterias umbilicales, transferir a una placa
de Petri con solución PBS y disgregar mecánicamente hasta
obtener trozos de 1,5 a 4 mm, aproximadamente. Para el tejido
remanente del cordón umbilical, conocido como gelatina de
Wharton, se sigue la misma metodología.
Cultivo de explantes de los trozos de tejidos obtenidos a
partir de arterias y de la gelatina de Wharton.
Colocarlos trozos en una placa Petri equidistantemente y luego
de su adhesión a la placa, se agrega medio de cultivo DMEM y
medio F12, suplementado con Suero Fetal de Bovino al 15%,
antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 50 µg/ml),
anfotericina 2 µg/ml y se incuba a 37 ºC con atmósfera húme-
da al 5% de CO2.
 A las 24 horas el medio es sustituido para eliminar restos
celulares. Realizar cambios de medios periódicos hasta que se
observe migración celular desde los explantes.
Disgregación enzimática de los trozos de tejido obtenidos
a partir de la gelatina de Wharton:
1 Las muestras son incubadas con la enzima colagenasa de
tipo I (1mg/ml) a 37 ºC por 16 horas. Posteriormente, la sus-
pensión celular obtenida es centrifugada por 15 minutos a
724,5 g y el taco celular obtenido es resuspendido en medio
nutritivo.
2. La viabilidad celular se determina con el colorante de
exclusión azul tripano, y el contaje de las células se rea-
liza en un hemocitómetro. Las células se siembran en
placas de cultivo y se colocan en una atmosfera húmeda
al 5% CO 2 a 37 ºC.

11.3.2 Subcultivos
Cuando el explante presenta un halo de células a su
alrededor, 4 o 5 veces mayor que el tamaño del explante
original (Figura 1), se realizan los subcultivos. Para es-
to, se separa el explante de su capa de crecimiento, rea-
lizando cortes perpendiculares por los bordes originales
del explante. Luego se realiza la tripsinización de la zo-
na de crecimiento, utilizando una mezcla de Tripsina
0,125% - EDTA 0,02%.
 Figura 1. Explantes establecidos a partir de la gelatina de Wharton del cor-
dón umbilical humano. A) Explante luego de 22 días de cultivo. Aumento
40X. Se puede observar en detalle la migración de las células de tipo fibro-
blastos a partir de un trozo de tejido. B) Explante luego de 27 días de culti-
vo, se observa una monocapa confluente de células que crecen alrededor del
trozo de tejido. Aumento 100X (Tomado de Calderón, 2007).

Las células obtenidas por medio de la técnica de la dis-

gregación enzimática son tratadas directamente con el
proceso de tripsinización mencionado anteriormente. La
amplificación celular se realiza en placas de cultivo con
medio nutritivo (DMEM: F12, SFB 15% y antibióticos),
a 37 ºC y en una atmósfera húmeda al 5% de CO 2 . Estas
células obtenidas pueden ser utilizadas para los ensayos
de caracterización, proliferación y diferenciación celular
(Figura 2).
 A

Figura 2. Cultivo en monocapa de las células de la gelatina de

Wharton del cordón umbilical humano. A) Población de células
con morfología fusiforme y células en división.1er pasaje. B) La
población mantiene su fenotipo celular. 10mo pasaje Contraste
de fases. 200X. (Tomado de Merentes, 2009)

11.4 Bibliografía del capítulo

Araos, C. (2009). Cultivo de células madre mesenquimales del
cordón umbilical humano. Potencialidad osteocondro-
génica. Licenciatura en Biología. Universidad Central
de Venezuela.
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