BIOLOGIA MOLECULAR Y NEFROLOGIA Análisis del DNA-I E.

Salido Departamento de Anatomía Patológica. Facultad de Medicina.

Universidad de La Laguna. Department of Pediatrics. University of
California at San Francisco (UCSF) La respuesta a un gran número de
problemas en Biología y Patología Molecular pasa por el análisis de
DNA. Dos características, en gran parte contrapuestas, definen
funcionalmente el DNA: estabilidad y mutabilidad. La primera es la base
de la transmisión hereditaria de características y enfermedades. En la
mutabilidad del DNA resid e la capacidad de evolución y la flexibilidad
de los seres VIVOS en su adaptación al medio ambiente. En la práctica
médica, el análisis de DNA va enfocado eminentemente a la detección de
mutaciones responsables de enfermedades. En principio, cualquier
diferencia en la secuencia de DNA distinta de la secuencia normal del
genoma humano es una mutación. En términos cotidianos, usamos
«mutación» para cambios en la secuencia de DNA asociados a una
condición patológica. Ahora bien, la inmensa mayoría de cambios en la
secuencia de nuestro genoma no implica enfermedad alguna, sino que
son la base de la variabilidad dentro de la norma en nuestra especie; a
estos cambios les llamamos polimorfismos. La estrategia a seguir en el
análisis de DNA depende lógicamente del objetivo del mismo: detectar
un cierto tipo de mutación en la mayoría de los casos. En función de esto
se hace la elección de la técnica que más eficientemente la detecta,
dentro de las posibilidades tecnológicas del laboratorio en cuestión. La
técnica seleccionada determina a su vez qué grado de purificación e
integridad del DNA es preciso y, por tanto, qué muestra biológica es
válida como fuente de DNA. Tipos de mutaciones: En la tabla I se
recogen los tipos de mutaciones implicados en patología humana. 1.
Mutaciones puntuales: Los cambios de una sola base son un tipo
frecuente de mutación y tienen consecuencias muy variadas. 1.1. Con
alteración de la transcripción: En ciertos casos, las mutaciones puntuales
afectan regiones críticas, promotores, que controlan la transcripción. Así,
por ejemplo, un cambio de A a G en el promotor del gen d e I factor IX
de la coagulación hace que factores transcripcionales esenciales no se
unan al promotor (fig. 1) y, por tanto, los niveles de transcripción son
muy bajos; de ahí que Ios pacientes sufran hemofilia B 1. 1.2. Con
alteración del procesado del mRNA: En otros casos, cambios de una sola
base afectan el proceso de «splicing», por el cual las regiones intrónicas
son eleminadas del mRNA nuclear. Este es el caso de las mutaciones que
afectan los dinucleótidos de los extremos 5' (siempre CT) y 3' (siempre
AG) de los intrones. En talasemias de origen mediterráneo se ha descrito
una mutación de A a G en el extremo 3' (AG) del intrón 2 del gen de la
cadena beta de la hemoglobina (fig. 2). Esto hace que el mRNA sea
procesado de modo aberrante, incluyendo porciones del intrón 2 en el
exón 3 2. 1.3. Con alteración de la traducción y localización proteica:
Otras veces, la mutación puntual afecta la traducción proteica, de modo
que la localización celular de la proteína se ve alterada. Así, un tercio de
los pacientes con hiperoxaluria primaria tienen una mutación en la
porción 5' de la alanina-gliosilato aminotransferasa (AGT) 3 que parece
ser responsable de que la traducción proteica del mRNA incluya varios
codones adicionales en el extre- Tabla I. Tipos de mutaciones Cambios
de base (mutaciones puntuales): - Con alteración de la transcripción. -
Con alteración del procesado del mRNA. - Con alteración de la
traducción y localización proteica - De sentido erróneo. - Sin sentido.
Deleciones: - Con cambio del marco de lectura. _ Con pérdida de
codones. - Deleción de todo un gen o genes contiguos. Correspondencia:
Dr. Eduardo Salido Ruiz. Departamento de Anatomía Patológica.
Facultad de Medicina. Universidad de La Laguna. La Laguna, Tenerife.
Con cambio de marco de lectura. - Con ganancia de codones. -
Duplicación de todo un gen o región genómica. _ De elementos
repetitivos. DNA inestable. - 18 ANALISIS DEL DNA-I FACTOR IX
Fig. 1.-Mutación A-G en la región próxima al inicio de transcripción (*)
del gen del factor IX de la coagulación, que resulta en unos n de
transcripción insuficientes. El rectángulo hace referencia al exón y su
parte sólida a la zona codificante para proteína. El E2 E3 1.5. Sin
significado o : En estos casos, las mutaciones puntuales transforman un
codón codificante de aminoácido en un codón de parada (TAG, TAA o
TGA), lo que resulta en una proteína truncada en ese punto. Así, por
ejemplo, una mutación puntual en el exón ll del gen de la fibrosis
quística (CFTR) consiste en un cambio de la G a T en el codón 542, lo
que conlleva una parada de la traducción proteica en lugar de incorporar
un aminoácido glicina en este punto (fig. 5). La proteína CFTR, de 1.480
aminoácidos en condiciones normales, queda truncada a los primeros 541
aminoácidos, con pérdida de su función en el transporte de cloro. Aun
cuando un cambio de base en la DNA puede dar lugar a las mutaciones
descritas previamente, en la mayoría de los casos estos cambios son
silentes, es decir, no se asocian a enfermedad, sino que dan Iugar a
polimorfismos a nivel de DNA. Este es el caso de la mayoría de los
cambios que afectan a regiones no codificantes del ge- ATG Tri-
CTrTCAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CGG 1 Extra E3 CTC l 1 E3 --`- I)
PEROXISOMA t T ; -0 MITOCONDRIA SEC"&A SEÑAL
MITOCONDRIAL Fig. 3.-Mutación en la región 5' del gen alanina-
glioxilato aminotransferasa, que resulta en la codificación d e una
secuencia señal que dirige la proteína a la mitocondria en l u g a r de ir al
peroxisoma. Este defecto molecular de la hiperoxa una primaria presenta
puntos oscuros en su explicación que han sido omitidos en esta
simplificación. Fig, 2.-Mutación A-G en el duplete receptor AG del
intrón 2, que resulta en un splicing anormal, que usa una secuencia T T T
T A TCTC G presente dentro del propio intrón 2 como receptor del
fenómeno de splicing. El resultado es que una porción del intrón 2 queda
englobada en el exón 3 (E3). mo amino terminal de la AGT. Estos
codones extra contienen una señal de localización mitocondrial, por lo
que la AGT es transportada a la mitocondria en lugar de ir a los
peroxisomas (fig. 3). Como en el humano la mayor parte de la síntesis de
glioxilato tiene lugar en los peroxisomas hepáticos, la AGT es incapaz de
llevar a cabo su función destoxificadora de glioxilato si se encuentra
localizada en las mitocondrias. No obstante, existen aún puntos oscuros
en la patogenia de esta mutación de la AGT. 1.4.Con significado erróneo
o : Existen numerosos ejemplos en patología humana en que una
mutación puntual supone un cambio de codón que hace que la proteína
tenga un aminoácido distinto de la secuencia normal. De hecho, el primer
ejemplo de patología molecular consiste en una mutación puntual
«missense»: el grupo de Pauling4 demostró que la anemia falciforme era
el resultado de la presencia de una hemoglobina anormal (HbS), y
posteriormente se comprobó que la HbS resulta de la presencia de valina
en la posición 6 de la cadena beta de la hemoglobina, donde
normalmente va glutámico5. Este cambio de aminoácido es el resultado e
una mutación puntual de A a T en el codón sexto del gen de la cadena
beta de la hemoglobina 6 (fig. 4). 6" Pro' Gld CIU' CC3GAG-GAG BA
BS / 1,15 I / Mstll: CCT NAG G 1,35 Fig, 4.-Mutación A-T en el codón
6 de la cadena beta de la hemoglobina, que resulta en la anemia
falciforme. Esta mutación afecta la diana del enzima de restricción Mstll
(CCTNAGG), por lo que el alelo mutado (Bs) es cortado por Mstll en un
fragmento de 1,35 kb, mientras que el alelo normal (BA) lo es en dos
fragmentos de 1,15 y 0,2 kb. 21 E. SALIDO l `2% EXON ll CGA 1 t
TGA SrOP ======- CFTRTRUNCADO Fig. 5.-Mutación C542X del
gen CFTR de la fibrosis quística, que resulta del cambio C-T en el codón
542 (CGA), que se conviene en un codón de parada (TGA) y, por tanto,
la proteína queda truncada en este punto. noma o bien implican la tercera
base del triplete (codón), lo que en la mayoría de los casos no altera la
traducción proteica o, incluso si el cambio de base se traduce en un
aminoácido distinto, la proteína en su conjunto funciona normalmente.
Uno de los cambios de base más frecuentes es la mutación puntual de C a
T, donde C forma parte de dupletes CC en los que C está metilada (metil-
C). Cuando metil-C pierde el grupo -NH, (deaminación espontáneo o
inducida por mutágenos), se transforma en T. Este tipo de mutación se ha
observado frecuentemente asociada a enfermerdad, pero también es la
base de polimorfismos corrientes; de ahí que enzimas de restricción (ver
después) que incluyen la secuencia CC en su diana -tales como Taql
(T.CGA)- sean muy útiles en la detección de polimorfismos. 2 .
Deleciones e inserciones: Un número importante de mutaciones
consisten en la pérdida (deleción) o ganancia (inserción) de material
genético. 2.1. Con alteración del marco de lectura: Cuando el número de
pares de bases perdido o ganado no es múltiplo de tres, la consecuencia
de deleciones e inserciones es similar: alteración del marco de lectura del
mRNA, de modo que la secuencia del mRNA 3' a la mutación cambia
totalmente de significado y la proteína tiene una secuencia de
aminoácidos completamente distinta, apareciendo con frecuencia
codones de parada. Un ejemplo clásico de alteración del marco de lectura
es el que da Iugar al grupo sanguíneo 0 a partir del grupo A 7 (fig. 6A).
El antígeno de grupo A resulta de la glicosilación de la proteína H por
parte de la glicosiltransferasa A. La deleción de una G en el gen de la
glicosiltransferasa altera el marco de lectura, de modo que la secuencia
de la proteína, que en este caso se conoce como glicoproteína 0, es
distinta e incapaz de glicosilar la proteína H. Si bien éste es un claro
ejemplo de polimorfismo, ya que no conlleva enfermedad, los efectos de
alteraciones del marco de lectura tienen una repercusión tan importante
en la estructura proteica que con frecuencia se asocian a enfermedad.
Este es el caso de la inserción de 4 bases (TATC) en el gen de la
hexosaminidasa A 8 (fig. 6B), que da lugar a una proteína truncada en la
enfermedad de Tay-Sachs,porque, después de cuatro codones en marco
de lectura erróneo, aparece un codón de parada (TGA). 2.2. Sin
alteraciones del marco de lectura: Cuando el número de bases implicadas
en la inserción o deleción es tres o un múltiplo pequeño de tres, el
resultado es una proteína con uno o varios aminoácidos de más o de
menos. Estas modificaciones discretas de la estructura proteica no se
traducen siempre en pérdida de función, pero existen ejemplos donde la
pérdida de un solo aminoácido en una región crítica de la proteína anula
la función de la misma. La mutación más frecuente del gen de la fibrosis
quística CFTR consiste precisamente en la deleción de las bases C T(fig.
7), con pérdida del aminoácido feT nilalanina-508, en una de los
dominios de unión a ATP del CFTR, lo que resulta en pérdida de función
9 , 1 0 . 2.3. Deleciones e inserciones grandes: Deleciones de grandes
porciones de un gen, la totalidad del mismo o incluso varios genes
contiguos resultan casi siempre en pérdida de función. En determinadas
enfermedades, la mayoría de las mutaciones implicadas son del tipo
deleción grande; tal es el caso de la distrofia muscular de Duchen- @
ABC3 'A ASO `0 LBL "al "BI Th, PI0 CTC GTG GTG>CC CCT T CTC
GTG GTA CCC WJ @ HEXA TAY SACHS m lle ser TYi GIY Pi0 ASP
CGT ATA TCCZ GCC CCT GAC CGT ATA TCT ATC CTA TGC
CCC TGA A% 118 Ser ue Le" CYS PI0 SIOP Fig 6.-A) Deleción de una
G en el gen de la glicosiltransferasa A, responsable del grupo sanguíneo
A, que resulta en un cambio del marco de lectura que da lugar a una
proteína no funcional propia del rupo sanguíneo 0. B) Inserción de cuatro
bases TATC en el gen de a hexosaminidasa A, que resulta en cambio del
marco de lectura, con aparición de un codón de parada (TGA) después de
cuatro aminoácidos. Ile Ile Phe G~Y Val CFTR A T C - AT: - T;T -
GGT - G T T 1l Fig. 7.-Deleción F508 del gen CFTR de la fibrosis
quística, donde se pierde el triplete m, pero el resto de la secuencia queda
indemne. No obstante, la proteína CFTR sin el aminoácido fenilalanina
508, enn la región de unión a ATP de la molécula, no es funcional. 22
ANALISIS DEL DNA-I DELECION 5232 Fig. 8.-Deleción del gen de la
sulfasa esteroidea (STS) por recombinación homóloga desigual entre
secuencias repetidas 5232 a ambos lados del mismo. La flecha indica la
recombinación que genera la deleción que se muestra en la parte inferior
del gráfico. radoja de Sherman (las madres y las hijas de varones
asintomáticos portadores del síndrome del X frágil tienen riesgos muy
distintos de tener descendencia con retraso mental). la mutación del
síndrome del X frágil consiste en una secuencia de DNA inestable
debido a cambios en el número de copias repetidas del trinucleótido CCC
localizados en la región 5' del gen FMR-1 13. Curiosamente, el número
de repeticiones del trinucleótido aumenta cuando la mutación es
transmitida por mujeres, mientras que permanece constante o se reduce
cuando es transmitida por hombres; retraso mental importante se asocia a
números elevados de secuencias repetidas. En los casos de la distrofia
miotónica y de la enfermedad de Kennedy, el trinucleótido que se repite
es AGC, en los genes de la proteín kinasa DM-114 y del receptor de
andrógenos 1 5 , respectivamente. Extracción y purificación de DNA
Dada la estabilidad de la doble cadena de DNA, numerosas muestras
biológicas son útiles como fuente de DNA. En principio, cualquier
muestra que contenga células nucleadas, desde un lavado bucal hasta un
fragmento tisular, pasando por la más frecuentemente usada muestra de
sangre, es válida para análisis de DNA. De igual modo, líquidos
biológicos son válidos para análisis de DNA de gérmenes. En cuanto a la
estabilidad de la muestra una vez tomada, aunque el procedimiento ideal
es hacer la extracción del DNA de inmediato y almacenarlo refrigerado,
es posible conseguir DNA útil para análisis a partir de tejidos
conservados en parafina. Es más, con la tecnología de que disponemos
en la actualidad es incluso posible cierto tipo de análisis a partir de DNA
anciano, conservado en momias de miles de años 1 6 . La calidad del
DNA extraído tiene definida por el tamaño medio de molécula obtenido.
Teóricamente, todo el DNA de un cromosoma podría obtenerse como
una sola molécula de 50 millones de pares de bases (cromosoma 21, el
más pequeño) hasta 250 millones de pares de bases (cromosoma 1, el
más grande). Sin embargo, la gran sensibilidad al cizallamiento debida a
la propia estructura del DNA (una cadena de hasta 15 cm de largo -
cromosoma 1-, pero sólo 2 nm de diámetro) hace que normalmente se
purifique DNA de tamaño medio muy inferior a una megabase. Cuando
el tipo de análisis requiere DNA de alto peso molecular es preciso, pues,
evitar el cizallamiento (usando pipetas de boca ancha y sin agitaciones
turbulentas) y la acción de enzimas que degradan DNA (DNasas). Puesto
que las DNasas precisan cationes divalentes (Ca++ o Mg*+), la
degradación enzímática del DNA se evita bastante eficazmente
incluyendo EDTA en las soluciones de purificación y almacenamiento de
DNA. Las soluciones de DNA se mantienen rutinariamente en el
denominado buffer TE (10 mM TrisHCL, pH 8,0, 1 mM EDTA). Existen
numerosos métodos sencillos que permiten ais23 ne (DMD) y del déficit
de sulfatasa esteroidea (STS). Fenómenos de recombinación genética
entre varios genes de una familia o entre secuencias homólogas no
codificantes se han visto implicados como mecanismo causal de estas
deleciones. Así, por ejemplo, recombinación entre los elementos no
codificantes S232 localizados a ambos lados del gen STS (fig. 8) resulta
en deleciones de las casi dos mebagases comprendidas entre ellos11. 2.4.
Inserciones de elementos repetitivos: Un 15 % de nuestro genoma
consiste en DNA de secuencia repetitiva y se halla disperso,
entremezclado con genes de secuencia única. Existen dos familias
principales de elementos repetitivos: Alu, elementos de unas 300 bases
repetidos medio millón de veces en el genoma; y L1, elementos de hasta
6.000 bases repetidos unas 10.000 veces en el genoma. El papel que los
elementos repetitivos juegan en el genoma es desconocido y existe la
sospecha de que se trata de secuencias «egoístas» sin otra función que la
de perpetuarse a sí mismas. Tanto secuencias Alu como L1 pueden
causar enfermedad por uno de estos mecanismos: recombinación entre
secuencias homólogas con pérdida, deleción, del fragmento de DNA
intermedio; y disrupción de un gen por inserción de elementos repetitivos
que interrumpen la secuencia. Este es el caso de ciertas mutaciones de la
hemofilia A, donde elementos L1 se han visto insertados en el gen del
factor VIII de la coagul a c i ó n 12. 3 . DNA inestable: En el último año
se han descrito los tres primeros ejemplos de mutaciones debidas a
secuencias de DNA inestables, que contienen un número variable de
trinucleótidos repetidos n veces. El análisis molecular de las secuencias
inestables ha permitido explicar fenómenos genéticos como el de
anticipación (generaciones sucesivas en una misma familia tienen formas
de la enfermedad más severas o de aparición más temprana), que era bien
conocido en la distrofia miotónica, o la pa- E. SALIDO Tabla II.
Extracción de DNA Separar células blancas de hematíes o triturar
muestra de tejido. 2 . Suspender núcleos celulares en solución de lisis:
100 mM NaCI, 10 mM Tris HCI, pH 8.0, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS con
1 ug/ml de proteinasa K. Incubar a 55ºC x 2 h. 3 . Extraer con 1 vol.
Fenol-cloroformo dos veces. 4 . a ñ a d i r 1/10 vol. 3M Na acetato y 2.5
vol. Etanol. 5 . Tomar el precipitado y resuspender en Te (10 mM
TrisHCI, pH 8,0, 1 mM EDTA). 1. Enzimas de restricción El
descubrimiento del fenómeno de restricción y la purificación de los
enzimas responsables de este mecanismo de defensa bacteriano contra
DNA foráneo supuso el principio de la denominada tecnología del DNA
recombinante. Muchas bacterias tienen enzimas (endonucleasas: cortan
el eje azúcar-fosfato de ácidos nucleicos -DNA- en puntos internos) que
reconocen y cortan secuencias de DNA invasor, al que reconocen como
extraño merced a un sistema complementario que marca (por metílación)
el DNA propio; cada bacteria posee un sistema endonucleasa/metilasa
propio, que se denomina sistema de restricción (restringe el DNA que es
tolerado por la bacteria a aquel que es reconocido como propio), algo
parecido al sistema inmune de organismos superiores. Aunque hay varios
tipos de endonucleasas, sólo las endonucleasas tipo ll son de interés
práctico porque reconocen secuencias específicas en el DNA (a las que
denominamos «dianas») y lo cortan en ese punto o región
inmediatamente adyacente. Las enzimas de restricción se denominan con
una abreviatura de tres letras del nombre de la bacteria en la que se
encontró (ej.: Hin de Haemophilus influenzae); una letra adicional
identifica la cepa o serotipo, si es preciso (ej.: Hind), y finalmente un
número romano refleja el orden en que se identificó (ej.: Hindlll).
Aunque en un principio los laboratorios tenían que purificar sus propios
enzimas de restricción a partir de cepas bacterianas, en la actualidad
existen varias casas comerciales que los proporcionan. La lista de
enzimas de restricción de que disponemos está en continua expansión,
existiendo muchos enzimas que reconocen secuencias específicas de 4-6
nucleótidos y algunos que lo hacen con secuencias mayores (7-8
nucleótidos, y excepcionalmente más). El tamaño de la diana determina
en gran medida con qué frecuencia el enzima va a cortar un cierto DNA
y, por tanto, el tamaño medio de los fragmentos generados. En el
supuesto de que la secuencia de DNA sea totalmente aleatoria, con las
cuatro bases representadas por igual, se podría predecir que un enzima
que reconozca 4 nucleótidos (un 4-cutter en el argot), como la Taql,
cortará cada 256 bases (44); uno que reconozca 6 bases, como el popular
EcoR1, cortará fragmentos de unas 4 kilobases (kb). Pero en la realidad,
las secuencias de DNA no son aleatorias, sino que la proporción de C+G
en una región genómica puede ir de un 1/4 a 3/4. Alrededor de 500
enzimas de restricción han sido aisladas hasta el presente, y se
denominan isosquizómeros a aquellos enzimas que reconocen la misma
secuencia, aunque pueden cortar en distintos puntos de la misma. Por
ejemplo, Xmal ( C ^ C C G G G ) y Smal (CCC^CGGG), donde (^)
indica el punto de corte en la secuencia. Las secuencias de nucleótidos
habitualmente reconocidas por los enzimas de restricción se denominan
«PaIíndromes». De manera similar a su significado lingüístico, un
palíndrome en bioquímica es una secuencia de DNA lar DNA de tamaño
adecuado para análisis. Sólo en casos en que el destino del DNA a aislar
sea la clonación de grandes fragmentos (alrededor de 1 megabase) en
cromosomas artificiales de levadura (YACs), o de fragmentos por
encima de 100 kilobases en cósmidos, se han de seguir protocolos
especiales que reducen al mínimo el cizallamiento del DNA. El
procedimiento habitual de extracción de DNA (tabla II) consiste en la
homogeneización del tejido o suspensión celular en una solución de lisis,
que contiene el detergente SDS -rompe membranas celulares- y la
proteinasa K -digiere proteínas-. Posteriormente se suelen separar los
ácidos nucleicos del resto de los componentes celulares mediante
extracción fenólica -a pH 8,0, el DNA particiona con la fase acuosa-, y a
continuación se precipita el DNA con etanol. Si la concentración de
DNA es suficiente, el precipitado de DNA se observa como una madeja
filamentosa que se puede transferir con la punta de una pipeta a un nuevo
tubo. Este protocolo básico proporciona DNA de hasta 100 kilobases en
la mayoría de los casos, suficientemente bueno para análisis tipo
Southern y para clonación en bacteriófago. En casos en que la muestra de
partida es tejido incluido en parafina, los cortes tisulares son
desparafinados con xilol e hidratados en una serie de soluciones de
etanol previamente a la digestión con proteinasa K. En el momento
presente, la detección de mutaciones puntuales y deleciones e inserciones
pequeñas se tiende a hacer mediante amplificación de DNA por la
reacción en cadena de polimerasa (PCR). Aunque esta técnica será objeto
de futuras presentaciones en esta serie de la revista NEFROLOGíA,
conviene aquí adelantar dos características de la PCR: 1) permite trabajar
con cantidades mínimas de DNA, y 2) el DNA no tiene que ser altamente
purificado. Por tanto, si el objetivo es el análisis por PCR, se puede usar
un método alternativo más simple (tabla III) para preparar DNA a partir
de tejidos o incluso de unas pocas células descamadas (líquidos
amnióticos, citologías aspirativas, frotis vaginales, lavados bucales, etc.).
Tabla III. Extracción de DNA para PCR 1. centrifugar las células. 2 .
Resuspender el pellet en solución de lisis PCR: 50 mM KCI, 10 mM Tris
HCI, pH 8.3, 2.5 mM MgCl2, 0.5 % Tween 20 con 0,1 ug/ml de
proteinasa K. Incubar a 55 ºC x 1 h. 24 ANALISIS DEL DNA-l Smal
Y... 3'... ccc CGG ccc . ..3' l l ccc . ..5' Fig. 9.-Cortes con enzimas de
restricción tipo romo (como el de Smal) y cohesivo, con extensión 5'
(como el de EcoRI) y con extensión 3' (como el de Pstl). simétrica en la
que la sucesión de nucleótidos es idéntica en las dos cadenas de DNA,
leídas ambas en dirección 5'-3' (fig. 9). Las aplicaciones de los enzimas
de restricción caen en dos categorías: 1. Clonaje, a través de la
construcción de moléculas recombinantes. DNA recombinado es un
DNA híbrido obtenido in vitro mediante la combinación de dos DNA
pertenecientes a dos especies diferentes: por ejemplo, un gen humano se
«injerta» en un DNA bacteriano (vector). La replicación del DNA
recombinado da lugar a la obtención de numerosas copias idénticas del
DNA injertado (clonación). 2. Análisis, detección de secuencias diana
con fines diagnósticos o de construcción de mapas de moléculas. Una
clasificación de los enzimas de restricción relevante en clonaje molecular
se refiere al tipo de extremos que quedan en el DNA cortado (fig. 9): a)
Romo (blunt): numerosos enzimas cortan en el punto medio de la diana
en ambas cadenas de DNA; por ej.: Smal reconoce CCC^GGG, dejando
dos extremos romos, que pueden ser ligados a otros extremos romos
cualesquiera. La reacción de ligación es de baja eficacia, no obstante. En
resumen, enzimas de corte romo proporcionan alta versatilidad, pero baja
eficacia a la hora de construir moléculas recombinantes. b ) Cohesivo
(sticky): la mayoría de los enzimas de restricción no cortan en el punto
medio del palíndrome, sino que generan cortes que se asemejan a
«fracturas en tallo verde» con extensiones de DNA monocadena bien 5'
(como EcoR1, G^ATTC, que deja extensiones monocadena 5'-AATT en
ambos extremos del corte) o bien 3' (como Pstl) CTGCA.^G, que deja
extensiones de DNA monocadena TGCA-3' en ambos extremos del
corte). Debido a estas extensiones monocadena que protruyen en el sitio
de corte, fragmentos cortados con un cierto enzima tienen extremos
compatibles con otras moléculas cortadas con el mismo enzima o con
otro que genere extensiones monocadena idénticas. Por ejemplo, Sau3AI,
^GATC, genera extensiones 5'-GATC, compatibles con los extremos 5'-
GATC creados por BarmHl, G^GATCC. Estas extensiones dan a los
cortes cohesivos dos propiedades importantes en clonaje: especificidad
(sólo se pueden religar con extremos compatibles) y eficacia (las
extensiones monocadena compatibles establecen puentes de hidrógeno
que facilitan la reacción de ligación). La especificidad de los enzimas de
restricción por sus secuencias diana es muy alta siempre que las
condiciones de la reacción sean óptimas. De no ser así, puede que un
determinado enzima corte DNA en secuencias que no le son propias, a lo
que se denomina «actividad estrellan. EcoR1 (G^AATTC), por ejemplo,
en condiciones de baja concentración iónica, alto pH, presencia de
solventes o de Mn++ en vez de Mg++, corta en múltiples secuencias que
contengan AATT. Dada la poca consistencia de la actividad estrella, se
trata de un fenómeno sin aplicaciones prácticas y, en general, se debe
evitar usando las condiciones adecuadas para la restricción enzimática.
Determinados enzimas de restricción no cortan el DNA si ciertas bases
se encuentran metiladas en la secuencia diana, por lo que se denominan
metilación-sensibles. Tal es el caso de Hpall (C^CGG), que no corta si
existen bases metil-citosina; por el contrario, su isosquizómero Mspl no
es sensible a la metilación y corta siempre en esa secuencia. Puesto que
la inactividad transcripcional de determinados genes va asociada a
metilación de citosinas, este fenómeno se puede explotar para analizar la
inactivación del cromosoma X, por ejemplo. En la práctica, la digestión
de DNA con enzimas de restricción se lleva a cabo en reacciones que
incluyen el buffer idóneo, DNA y enzima (tabla IV). Cada enzima tiene
unas condiciones ideales diferentes, aunque se pueden agrupar en 4
grupos fundamentales, según la concentración iónica. En la actualidad, la
mayoría de los proveedol res de enzimas de restricción regaan el buffer
idóneo al comprar el enzima, por lo que hemos dejado de preparar
nuestros propios buffers en el laboratorio. La mayoría de las reacciones
se llevan a cabo a 37o C, pero existen excepciones, como Smal, que
trabaja mejor a 25o C. Ademas de elegir el buffer y la temperatura
adecuadas, una reacción de restricción depende de la calidad del DNA.
Una de las causas más frecuentes de fracaso de la digestión es la
presencia de impurezas en la muestra de DNA. Tabla IV. Digestión con
enzimas de restricción (ECOR1 en 20 ul) - 15,2 pl de H,O. - 2 ~1 de 10X
EcoRl Buffer. - 0,8 pl de Sperdimina 100 mM. - 1 pl de DNA (1 @II) - 1
PI e EcoRl (1 U/ml). Incubara 37" C x 1 h. 25 E. SALIDO En general,
extracciones fenólicas y precipitaciones con etanol son precisas para
obtener DNA sustrato de enzimas de restricción. Hibridación molecular
La interacción físico-química de cadenas de ácidos nucleicos con
secuencias complementarias es el punto en que pivota todo tipo de
análisis molecular. En el capítulo previo de «Introducción a la Biología
Molecular» ya se presentaron las bases conceptuales de la interacción
entre moléculas complementarias, ejemplificado en la estabilidad de la
doble cadena de DNA. Usando los mismos principios, el establecimiento
de puentes de hidrógeno entre bases complementarias, se pueden generar
moléculas «híbridas» donde una cadena proceda del DNA
(desnaturalizado) o del mRNA la otra sea una herramienta de Iaboratorio
(sonda mol ecular o «probe»), de secuencia conocida y marcada
convenientemente. A este proceso de formación de moléculas doble
cadena de ácidos nucleicos mediante el apareamiento específico de
monocadenas de secuencias complementarias se denomina hibridación
molecular. Conceptualmente, se trata de un proceso análogo a la
interacción antígeno-anticuerpo: de modo similar a como utilizamos
anticuerpos en el análisis de proteínas concretas, podemos usar sondas
moleculares para analizar DNA o RNA. Pero mientras que las bases de la
interacción antígeno-anticuerpo son complejas y sólo parcialmente
conocidas, la interacción entre secuencias de ácidos nucleicos
complementarias es simple y bien definida experimentalmente. El
objetivo de la hibridación molecular es, pues, la detección de secuencias
concretas de DNA o RNA. Como en cualquier otro sistema de detección,
dos parámetros resumen la utilidad del mismo: especificidad y
sensibilidad. Un buen conocimiento de las bases físico-químicas de la
hibridación permite el diseño de condiciones de óptima especificidad y
sensibilidad. El término rigor («stringency»), muy usado en
descripciones moleculares, equivale a especificidad. La estabilidad de
una molécula doble cadena depende esencialmente de la interacción tipo
puente de hidrógeno entre bases complementarias de las fuerzas
hidrofóbicas establecidas entre bases apiladas. Las condiciones que
afectan la estabilidad de moléculas doble cadena quedan resumidas en la
tablaV. Por tanto, podemos aumentar la especificidad de la hibridación
de una secuencia, de longitud y relación C+G/A+T determinadas,
aumentando la concentración de formamida, disminuyendo la
concentración de Na+ o aumentando la temperatura. Dejando el resto de
los parámetros constantes, la estabilidad de una doble cadena disminuye
conforme la temperatura aumenta, de modo que alcanzaríamos una
situación en la que todas las moléculas son monocadena, a lo que se
denomina «DNA desnaturalizado». A una temperatura intermedia
encontraríamos el 50 % de las molé26 Tabla V. Condiciones de
hibridación Parámetro Estabilidad del híbrido : ; 1 Efecto en el rigor : : t
T e m p e r a t u r a . . ..................................... Cationes monovalentes
.................... L o n g i t u d ............................................. Relación
C+G/A+T ............................ F o r m a m i d a . . .......................................
culas como doble cadena y el otro 50 % como monocadena; a ésta se
denomina temperatura de fusión (Tm). La Tm de un híbrido se puede
poner en función del resto de los parámetros que controlan la estabilidad
de la molécula, resultando en la fórmula: Tm = 81,5 + 16,6 log [Na] + 41
[C+G/A+T] - 0,62 [FA] - 5OO/L Donde [Na] es la concentración molar
de cationes monovalentes, [C+G/A+T] es la fracción molar de bases
C+G (que establecen tres puentes de hidrógeno) versus A+T (que
establecen sólo dos puentes de hidrógeno), [FA] es el porcentaje de
formamida y L es la longitud del hídrido en pares de bases. Para
moléculas de menos de 50 pares de bases (bp) esta fórmula no es válida,
así, para hibridaciones con oligonucleótidos de alrededor de 20
nucleótidos (nt) , tales como los primeros usados en PCR, la fórmula de
la Tm se simplifica, de modo que para [Na] = 0,9 M, Tm = 4 [C+G] + 2
[A+T] Estas fórmulas han sido calculadas a partir de experimentos de
hibridación de DNA en solución 1 7 , pero son esencialmente válidas
para hibridaciones en membranas sólidas y otros tipos de hibridación.
Los híbridos de RNARNA son algo más estables, 10o C de media, que
los de DNA-DNA, y RNA puede desplazar una cadena de DNA,
formando híbridos RNA-DNA. Es asimismo importante considerar el
efecto de pares de bases no complementarios en la estabilidad del
híbrido. Se ha calculado que, para híbridos mayores de 150 bp, la Tm de
la doble cadena desciende 1 grado por cada 1 % de bases que no son
complementarias (mismatching). Para híbridos pequeños, en torno a 20
bp, cada reduce la Tm en 5 grados. Es precisamente en base a este efecto
desestabilizante de pares no complementarios que se pueden diseñar
condiciones de hibridación específicas para secuencias de DNA que sólo
se diferencien en una base. Asimismo, eligiendo las condiciones lo
suficientemente rigurosas, conseguimos que la sonda marcada se hibride
exclusivamente a secuencias que son 100 % complementarias. Ahora
bien, condiciones muy rigurosas reducen la sensibilidad del test, por lo
que, en general, las hibridaciones se llevan acabo en condiciones que
favorecen la hibridación, unos 25o C por debajo de la Tm, y
posteriormente se realizan lavados de los filtros en condiciones
crecientes de rigor hasta quedarnos en tomo a 5o C por debajo de la Tm
o hasta las condi- ANALISIS DEL DNA-I ciones que empíricamente nos
den una mejor relación señal/fondo inespecífico. En la práctica, los
protocolos de hibridación incluyen: 1) preparación de DNA o RNA en
forma desnaturalizada: 2) prehibridación: se busca equilibrar,el sustrato a
hibridar con las condiciones de hibridación; 3) hibridación: con la sonda
marcada, a temperaturas 25o C por debajo de la Tm, esto es, en torno a
65o C normalmente sí la solución de hibridación no contiene formamida
y 42oC si la solución contiene 50 % formamida; 4) lavados
posthibridación: con soluciones de creciente rigor -[Na] decreciente- para
limpiar el filtro de la sonda adherida inespecíficamente; 5) revelado de la
señal: bien por autorradiografía o por reacciones calorimétricas, según el
tipo de marcaje de la sonda usado. En apartados sucesivos se irán
presentando los distintos tipos de hibridación utilizados, entre los que se
encuentran: 1. Hibridación en solución: tal como el ensayo de protección
de RNasa. 2. Hibridación en fase sólida (filtro): 2.1. Con electroforesis
previa: - Southern blot: DNA. - Northern blot: RNA. 2.2. Sin
electroforesis previa: - Dot (o Slot) blot: la solución de ácidos nucleicos a
analizar se pone directamente en un filtro, a modo de puntos (dot) o
hendiduras (slot), usando como molde aparatos «manifold». -
Hibridación de colonias o placas: las colonias bacterianas o placas de
virus se transfieren directamente por contacto a un filtro (réplica) que se
hibrida. 3. Hibridación in situ: cortes tisulares en portas se someten a
hibridación de DNA o RNA en el propio porta y el resultado se visualiza
al microscopio. Sondas moleculares Se utilizan tres tipos fundamentales
de sondas -moléculas de ácidos nucleicos de secuencia específica,
marcadas de modo que se pueden visualizar-, según el origen de las
mismas: DNA, RNA y oligonucleótidos sintéticos (oligos). En cuanto al
marcaje de las sondas, hay dos parámetros a considerar: a) uso de
isótopos radiactivos o bien marcaje no isotópico; b) método de marcaje,
que depende esencialmente del tipo de sonda usada. En la presentación
que sigue describiremos los métodos de marcaje más usados para cada
tipo de sonda. a) Sondas isotópicas y alternativas no-isotópicas GTP,
dGTP, UTP o dTTP) radiactivos, que contienen fósforo-32 ("P) en la
posición alfa. En ciertas aplicaciones, en que interesa el uso de isótopos
de energía intermedia o baja, se usan nucléotidos que contienen azufre-
35 (35S) o tritio ( 3 H ) , respectivamente. Las sondas marcadas con
isótopos se visualizan mediante autorradiografía, donde la energía
radiactiva impresiona una película de rayos X. En general, si las
condiciones del laboratorio lo permiten y contando con personal
entrenado para el uso de isótopos radiactivos, el marcado de sondas por
métodos radiactivos no conlleva mayores riesgos y proporciona una alta
sensibilidad a los ensayos, por lo que es el método de elección en la
mayoría de los centros. No obstante, en sitios donde no existen contratos
entre la institución y el proveedor, como es el caso de la mayoría de los
centros en España, los isótopos resultan bastante más caros que los
métodos alternativos, debido a que al alto precio de catálogo se suman
gastos adicionales, como el de eliminación de residuos radiactivos.
Además, las sondas radiactivas tienen una vida media corta, no sólo por
la desintegración del isótopo en sí, sino también por la ruptura de la
cadena molecular por la energía radiactiva. Varios métodos han surgido
como alternativas al marcado ísotópico de las sondas18, de los cuales dos
son los más usados: sondas biotiniladas y sondas con digoxigetina.
Ambas se basan en un principio similar: el uso de nucleótidos a los que
se ha unido una molécula que puede ser reconocida específicamente en
reacciones colorimétricas. Las moléculas de biotina interaccionan con
altísima afinidad con la proteína avidina, el uso de avidina conjugada con
enzimas como la peroxidasa o fosfatasa alcalina hace que allí donde se
ha hibrídado la sonda marcada con biotina exista actividad peroxidasa o
fosfatasa, que producen depósitos de color al actuar sobre sustratos
cromógenos. De manera análoga, las sondas se pueden marcar con
digoxigenina, que es reconocida específicamente por un anticuerpo
conjugado a un enzima. Recientemente se ha incorporado una
modificación importante en el desarrollo de la señal que aumenta la
sensibilidad de las sondas no isotópicas: en lugar de usar un sustrato
cromógeno, el enzima se hace actuar sobre sustratos fotógenos, emisores
de fotones que impresionan u n a película fotográfica. b) Tipos de sonda
y métodos de marcaje Existen tres tipos de sondas moleculares, según su
origen: b.1. Sondas de DNA: consisten en fragmentos de cDNA o DNA
genómico que han sido clonados y, por tanto, se pueden purificar en
cantidades necesarias. Existen variantes según el vector usado al clonar
el DNA en cuestión, pero el método más usado consiste en escindir el
DNA clonado (inserto) del vector, mediante enzimas de restricción, y
purificar el inserto mediante electroforesis. Tradicionalmente, las sondas
moleculares se han preparado con nucleótido-trifosfatos (ATP, dATP,
CTP, dCTP, E. SALIDO Una vez identificada la banda de inserto en el
gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, se corta con una hoja de
bisturí y el DNA contenido en la banda se eluye. Una variante de
obtención de sondas de DNA que se está usando frecuentemente consiste
en la amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena
de polimerasa (PCR), que será tratada en futuras revisiones. Existen
numerosos procedimientos para eluir el DNA del fragmento de gel
aislado, desde la simple centrifugación hasta la purificación con resinas
de afinidad, pasando por la electroelución. Con cualquiera de estos
protocolos se obtiene DNA doble cadena, que puede ser marcado in vitro
de varios modos, fundamentalmente dos: 1 . Nick translation (reparación
con DNA polimerasa I) (tablaVI): consiste en generar «mellas» en
distintos puntos de la cadena de DNA con DNasa I que son reparadas por
la DNA polimerasa I utilizando nucleótidos trifosfato de la mezcla,
alguno(s) de los cuales están marcados bien isotópicamente o bien con
biotina o digoxigenina (fig. 1). Además, las mellas producidas por la
DNAasa son extendidas en sentido 5'-3' gracias a la actividad 5'-
exonucleasa (degradación del extremo 5' del DNA) de la DNA
polimerasa (fig. 10). Con ello se consiguen sondas de una actividad
específica en tomo a 10 8 cpm/pg al usar 32P. Tabla VII. Random primer
1. 2. Mezclar 0,1 vg DNA y 1,O pg hexanucleóticos en 14,O pl TE.
Hervir x 2-3 m. Poner en hielo. 2,5 PI 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP 2,5
~1 10X Random primer buffer. 5,O pl dCTP marcado. 1,O pl Klenow (3-
8 U). 3 . Añaadir: 4. Incubar 2-4 h a temperatura ambiente. Tabla VI.
Nick translation 7.0 pl H,O 2,5 pl 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP 2,5 ~1
10X Nick translation buffer 10,O pl dCTP marcado 1,0 pl DNasa I (0,l
n&l) 1,0 ~1 DNA (0,1 vgI 1,O pl E. coli DNA polimerasa I (5-15 U).
Incubar a 15 C x 1 hr 2 . Random primer (síntesis de DNA con Klenow y
hexanucleótidos) (tabla VII): consiste en la síntesis de cadenas
complementarias de DNA con el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa I, que, a diferencia del enzima completo, carece de actividad
5'-3' exonucleasa. Esta síntesis, que usa DNA desnaturalizado por calor
como sustrato monocadena, hace uso de una mezcla de oligonucleótidos
muy cortos (6,7) de todas las posibles secuencias, que actúan de
cebadores (primers) de la reacción de po1 limerización que incorpora
nucleótidos marcados (fig.1 ) a actividades específicas de 10 8 a 10 9
cpm/pg al usar 32P. b.2. Sondas de RNA: consisten en fragmentos de
RNA monocadena generados mediante reacciones de transcripción in
vitro que incorporan nucleótidos trifosfato marcados (tabla VIII). Se usan
fragmentos de cDNA clonados en vectores de expresión. Los vectores
más frecuentemente usados contienen secuencias promotoras de la
transcripción de la T7 o la SP6 RNA polimerasas inmediatamente
adyacente al inserto (fig. 12). Es importante tener en cuenta la
orientación del inserto con respecto al promotor, ya que de ello depende
el que se obtengan sondas de RNA complementario (cRNA) útiles para
hibridar mRNA celular o bien sondas de mRNA en sí, que no son
complementarias al mRNA celular, obviamente. Así, DNasa DNA 5 3''
3'- 3' 5' ^ 3' 3' ^ 5' 5 3' 5' ^ 3'5' DNA Primers - *****=******c* 3 DNA
polimerasa 5'3' *** -5 5'- \ ***** I, N \ *--***** _I -**** \ -5' 5'. I Fig.
11.-Marcado de sondas por random primer. El DNA es desnaturalizado
por calor y'se hibrida con oligonucleótidos d e s secuencia al azar (- -).
Estos oligos incitan la síntesis de cadenas de DNA complementarias por
la fracción Klenow de la DNA polimerasa (que carece de actividad 5'-3'
exonucleasa), incorporando los nucleótidos del medio, alguno de los
cuales está marcado (*). Fig. 10.-Marcado de sondas por nick translation.
El DNA es« m e l l a d o » por la DNasal y reparado por la DNA
polimerasa, que, merced a sus actividades 5'-3' exonucleasa y
polimerasa, sintetiza cadenas complementarias, usando los nucleótidos
del medio, alguno de los cuales se encuentra marcado (*). 28 ANALISIS
DEL DNA-l TablaVlII. Transcripción in vitro 1. Cortar (linearizar) el
plásmido 3' at inserto. 4,0 pl 5X Buffer de transcripción. 2,0 pl 100 mM
DTT. 0.8 PI RNasin. 4.0 $ 2.5 mM ATP, UTP, GTP. 2,2 ~1 100 PM
CTP. 1,O pl plásmido con inserto DNA 0 l@ 5,0 pl CTP marcado. 1,O pl
RNA polimerasa. Tabla X. Terminal-transferasa 6.0 pl H,O. 1,0 pl (1 &
oligo. 4.0 ul 5X TdT buffer 8 , 0 ;l ddATP marcado en posición alfa. 1.0
pl TdT (10 U). Incubar a 37 ºC durante 1 h. 2. Mezclar (para 20 ~1): 3.
Incubar a 37" C durante 1 h. Tabla IX. Polinucleótido kinasa 7,0 ~1 H,O.
2,0 pl 10X kinasa buffer. 9.0 pl ATP marcado en posición gamma. 1,0
I*I (1 pgl oligo. 1,0 gl T4 polinucléotido-kinasa (10 U). Incubar a 37" C
durante 30 m. cuando el inserto está dispuesto en el mismo sentido S-3'
que el promotor (orientación denominada «sense»), se generan sondas de
mRNA (útiles como control negativo o bien como fuente de mRNA para
experimentos de traducción in vitro), las llamadas sondas sense. Por el
contrario, cuando el inserto está orientado en el sentido con- forilados,
con un grupo -OH libre en el extremo 5'. Por tanto, se pueden usar
directamente como sustrato de la T4 polinucleótido-kinasa en presencia
de ATP marcado en el grupo fosfato gamma. La reacción de
fosforilación transfiere este fosfato gamma marcado al extremo 5' del
oligo. 2. Adición 3' con transferasa terminal (TdT) (tabla X): esta enzima
incorpora nucleótidos al extremo 3', grupo OH-, de una cadena sin
necesidad de la existencia de una cadena complementaria como molde.
Por tanto, TdT se puede usar para añadir nucleótidos marcados al
extremo 3' de un oligo. Cuando se usan deoxinucleótido-trifosfatos,
como dATP marcado, la TdT incorpora varias moléculas seguidas. En la
práctica es generalmente preferible incorporar sólo un nucleótido
marcado por molécula de oligo. Esto se consigue mediante el uso de
análogos dideoxi-, como el ddATP marcado, que, por carecer del grupo
OH- 3', no permiten la incorporación de nucleótidos adicionales (de
manera similar a lo que ocurre con la reacción de terminación durante la
secuenciación de DNA según el protocolo de Sanger). Análisis del DNA
tipo Southem E. Southern describió en 1975 19 un método para transferir
DNA, previamente fraccionado según tamaño en un g e l y
desnaturalizado, a una membrana que puede ser hibridada con sondas
para detectar secuencias concretas. Este procedimiento vino a ser
conocido como «Southern» y, posteriormente, a una variante del mismo
concepto para analizar RNA se denominó «Northern», jocosamente.
Siguiendo el mismo juego de palabras, «Western» se usa para un análisis
similar de proteínas. El principio físico utilizado para transferir DNA del
gel a la membrana es la capilaridad, el mismo que se había utilizado
durante años para limpiar manchones de tinta con papel secante; de ahí
que E. Southern usara los términos «blot» y «blottingn» para referirse a
su protocolo. Aunque algunos han traducido literamente estas palabras al
español, creemos que es más práctico seguir usando los términos
«Southern b l o t » o análisis tipo Southern. El término ha quedado tan
arraigado que se usa incluso en ocasiones en que un campo eléctrico o la
fuerza del vacío, en lugar de la capilar, es utilizada para transferir las
moléculas a la membrana. El protocolo del Southem blot se incluye en la
tabla XI. La esencia del análisis tipo Southern (fig. 13) es que los
fragmentos resultantes de la digestión del DNA con un en29 trario al
promotor (orientacion anti-sense), se generan sondas de cRNA,
conocidas también como antisense, útiles para detectar mRNA. b.3.
Oligonucleótidos: consisten en sondas monocadena de 35-50 nucleótidos
de secuencia específica que son sintetizados in vitro. Existen varios
protocolos de marcaje de oligonucleótidos, de los que dos son los más
usados: 1. Fosforilación 5' con T4 polinucleótido-kinasa (tabla IX): los
procedimientos normales de síntesis (bien con fosforamiditas o con
fosfotriésteres) generan oligos defos- eh******** l cRNA
************ ***************** RNA polimerasa T7 cDNA Fig.
12.-Marcado de sondas de RNA por transcripción in vitro. El vector de
expresión contiene la secuencia promotora (T7) que es reconocida por la
RNA polimerasa para sintetizar RNA usando el cDNA como molde e
incorporando nucleótidos marcados del medio (*).