FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

MENCIÓN NEUROCIENCIA

Caracterización y análisis de la viabilidad celular en cultivos

organotípicos de retina bajo condiciones normales y altas en glucosa, y la

contribución de moléculas antioxidantes

Bárbara Cádiz Ramírez

Proyecto de Tesis para optar al grado de

Magíster en Ciencias Biológicas Mención Neurociencia

Director de Tesis:

Dr. Oliver Schmachtenberg

1
 Índice

Resumen……………………………………………………………………………………. 3

Abstract……………………………………………………………………………………...4

Introducción…………………………………………………………………………………5

Planteamiento del problema………………………………………………………………..32

Hipótesis y Objetivos………………………………………………………………………33

Materiales y métodos………………………………………………………………………34

Resultados………………………………………………………………………………….38

Discusión…………………………………………………………………………………...54

Conclusión………………………………………………………………………………….64

Anexo………………………………………………………………………………………65

Bibliografía………………………………………………………………………………...69

2
 Resumen

La retinopatía diabética (RD) es una complicación de la diabetes y una de las principales

causas de ceguera en el mundo. La RD trae consigo un daño progresivo e irreversible en la
retina que involucra activación de procesos inflamatorios, isquemia, cambios en la
bioquímica neuronal, cambios morfológicos de células gliales y una sobreproducción de
especies oxidativas capaces de alterar el funcionamiento celular.
La sobreproducción de especies oxidantes se ha asociado a varias enfermedades
neurodegenerativas que incluyen la RD, sin embargo, los mecanismos involucrados junto
con la patogénesis de la enfermedad no han sido entendidos en profundidad. En este trabajo
relacionamos la exposición de componentes celulares de la retina a altos niveles de glucosa
y su efecto sobre la generación de estrés nitrosativo y la viabilidad celular . Para ello
utilizamos un modelo de cultivos organotípicos de retina de rata que fueron cultivadas en
condiciones moderadas y altas de glucosa por 7 y 14 días. Mediante estudios histológicos,
microscopía de fluorescencia y electrónica, pudimos confirmar que la exposición directa de
explantes de retina a altas concentraciones de glucosa produce un aumento de la muerte
celular en los fotorreceptores a consecuencia de un aumento de estrés oxidativo-nitrosativo
en la retina.

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 Abstract

Diabetic retinopathy (DR) is a complication of diabetes and one of the leading causes of
blindness in the world. DR brings with it progressive and irreversible damage to the retina
involving activation of inflammatory processes, ischemia, changes in neuronal
biochemistry, morphological changes in glial cells and an overproduction of oxidative
species capable of altering cell function.
The overproduction of oxidative species has been associated to several neurodegenerative
diseases including DR, however, the mechanisms involved along with the pathogenesis of
the disease have not been understood in depth. In this work we relate the exposure of
cellular components of the retina to high levels of glucose and its effect on the generation
of nitrosative stress and cell viability. For this purpose, we used a model of rat retinal
organotypic cultures that were cultivated under moderate and high glucose conditions for 7
and 14 days. By means of histological studies, fluorescence and electron microscopy, we
could confirm that direct exposure of retinal explants to high concentrations of glucose
produces an increase in cell death in photoreceptors as a consequence of an increase in
oxidative-nitrosative stress in the retina.

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 Introducción

La retina

La retina de los vertebrados es una estructura en capas con gran diversidad de células
capaces de formar un circuito morfológico y funcional (Hoon et al. 2015). La morfología de
la retina está compuesta por 7 capas muy bien definidas (Fig 1): segmentos externos de
fotorreceptores (SE), segmentos internos de fotorreceptores (SI), capa nuclear externa
(ONL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear interna (INL), capa plexiforme interna
(IPL) y capa de células ganglionares (GCL). Las capas nucleares corresponden al lugar
donde se ubican espacialmente los somas de los tipos celulares y las capas plexiformes son
los sitios donde las células hacen sinapsis (Grossniklaus, Geisert, and Nickerson, 2015)
(Esquema 1).

Estas capas están conformadas por 6 tipos neuronales, siendo los somas de los
fotorreceptores localizados en la ONL, mientras que las células bipolares, amacrinas y
horizontales forman parte de la INL, las células ganglionares corresponden a la GCL, y, por
último, las células gliales, o de Müller, se distribuyen a lo largo de todo el tejido retiniano y
sus somas también forman parte de la INL.

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 ECL

OS

IS

ONL

OPL

INL

IPL

GCL
Esquema 1. Capas celulares de la retina. ECL= epitelial cells layer, OS= outer segment, IS= inner
segment, ONL= outer nuclear layer, OPL= outer plexiform layer, INL= inner nuclear layer, IPL=
inner plexiform layer, GCL= ganglion cell layer.

La retina cumple un rol importante en el sistema nervioso central, ya que es capaz de

convertir los fotones de luz en señales eléctricas - proceso conocido como fototransducción,
y termina enviando la información visual desde la red retinal hacia el cerebro, donde es
codificada (Grossniklaus, Geisert, and Nickerson, 2015). La fototransducción ocurre en los
fotorreceptores, cuyos procesos (o segmentos) externos son los que llevan a cabo este
proceso. El fotón genera el cambio de 11-cisretinal a su forma trans-retinal, que da como
resultado la activación de la cascada de fototransducción. De esta manera la opsina activa la
transducina, una proteína G que activará cGMP fosfodiesterada (PDE6), hidrolizando
cGMP a GMP. cGMP es un efector alostérico del canal de sodio, reduciendo el flujo de
iones y la liberación del neurotransmisor glutamato (Grossniklaus, Geisert, and Nickerson,
2015). Los fotorreceptores harán sinapsis con las células bipolares glutamatérgicas en la
OPL, cuya transmisión es modulada por las células horizontales, que son células que se
interconectan lateralmente y proporcionan retroalimentación inhibitoria a los

6
fotorreceptores. Luego, las células bipolares, harán contacto con las células ganglionares,
que son las células de salida de la retina, cuyos axones se proyectan por el nervio óptico
hacia el núcleo geniculado lateral del tálamo y colículo superior, para finalmente llegar
hacia la corteza visual primaria, encargada de ejecutar la mayor parte del análisis visual y,
que luego pase a áreas de asociación, como la corteza preestriada (Glickfeld and Olsen
2017). Las células amacrinas, al igual que las horizontales, son las encargadas de generar
señales inhibitorias en la IPL u OPL respectivamente (Hoon et al. 2015).

La retina, cuando se encuentra en condiciones patológicas, puede sufrir cambios

morfológicos, bioquímicos y en sus balances excitatorios/inhibitorio que pueden gatillar
muerte celular, desencadenando discapacidad visual y ceguera (Ramdial, Franco, and
Estevez 2017; Sahajpal et al. 2018).

Diabetes y retinopatía diabética (RD)

La diabetes es un trastorno metabólico crónico, cuya principal característica está en una

baja producción y/o ineficiente regulación por parte de la insulina que, como consecuencia,
produce un aumento de la concentración de la glucosa en sangre (Jiang et al. 2011). La
Federación Internacional de Diabetes calculó hasta el año 2017 que 425 millones de adultos
padecen de esta patología y 318 millones de personas con tolerancia a la glucosa alterada.
Las proyecciones apuntan a que en el año 2040 unos 642 millones de personas tendrán
diabetes, por lo tanto, es un problema de salud pública que va en ascenso a nivel mundial
(International Diabetes Federation (IDF) 2017).

Hay tres tipos de diabetes conocidas: tipo I, II y gestacional, siendo la diabetes tipo II la
forma más común, ya que causa un metabolismo anormal de carbohidratos, lípidos y
proteínas asociado con resistencia a la insulina y secreción de insulina alterada (Marian
Valko et al. 2007). La insulina es una hormona que se produce en el páncreas y es la
encargada de regular la absorción de glucosa en células del hígado, grasa y músculo
(International Diabetes Federation (IDF) 2017). La resistencia a la insulina es un factor
importante que contribuye a la progresión de la enfermedad y las complicaciones de la

7
diabetes (International Diabetes Federation (IDF) 2017). Actualmente, se reconoce una
cascada de eventos que son los causantes de la diabetes tipo II, donde están involucrados
ciertos defectos relacionados con el estrés oxidativo en la maquinaria de fosforilación
oxidativa y la oxidación mitocondrial, que, en su conjunto, conducen a una acumulación
excesiva de triglicéridos intracelulares, que traen como consecuencia la resistencia a la
insulina (Rosca et al. 2020). Cuando las células beta pancreáticas, a pesar de aumentar la
producción de insulina, ya no son capaces de compensar adecuadamente la producción de
esta, se produce una alteración en la tolerancia de la glucosa, caracterizada por la presencia
de hiperglicemia, produciendo un deterioro en el páncreas que conlleva al desarrollo de la
diabetes tipo II (International Diabetes Federation (IDF) 2017). La diabetes produce
complicaciones multiorgánicas como neuropatías, nefropatías, daño cardíaco y retinopatía
diabética (Brownlee 2001), siendo esta última, una de las principales causas de ceguera y
discapacidad visual, afectando a un tercio de los pacientes diabéticos en el mundo
(Lasker/IRRF 2014).

El desarrollo de la RD tiene una etapa no proliferativa, que es la fase inicial de la

enfermedad, caracterizada por la formación de microaneurismas (Aliseda and Berástegui
2008). En casos más severos, o RD proliferativa, se observa neoangiogénesis, cuyos vasos
sanguíneos son frágiles y propensos a generar hemorragias en el humor vítreo. También se
ha observado edema macular e incluso desprendimiento de retina en los casos más graves
(Cunha-Vaz 2015).

La RD es diagnosticada mediante una evaluación de fondo de ojo que examina alteraciones

en la red vascular (Calbiague et al. 2019). Si bien la RD se considera una enfermedad
microvascular, existen evidencias que demuestran que la neurodegeneración es un evento
temprano en el desarrollo de la patología y ha sido observada antes del daño vascular
(Simó, Stitt, and Gardner 2018). A través del electroretinograma (ERG), una técnica que
mide la respuesta eléctrica de las células de la retina, se ha demostrado en pacientes
diabéticos patrones anormales de los registros eléctricos. Específicamente se ha
evidenciado una disminución significativa en la amplitud de la onda b y de los potenciales
oscilatorios, lo que indica un deterioro en la respuesta de las células bipolares ON y del

8
feedback inhibitorio producido por las células amacrinas, respectivamente (Bearse et al.
2004, 2006). También se ha observado, mediante una correlación entre la evaluación de
visión de color y ERG multifocal (una variante de ERG que mide múltiples respuestas de
distintas zonas de la retina), un deterioro en la visión en colores en pacientes diabéticos que
aún no presentan RD (Simó, Stitt, and Gardner 2018; B. E. Wolff et al. 2020). Otros
estudios realizados en ratas diabéticas inducidas por streptozotocina (STZ) han mostrado un
déficit en la agudeza y contraste visual (Aung et al. 2013), sugiriendo un daño retinal que
podría afectar principalmente a los fotorreceptores.

Bases moleculares de la diabetes y la retinopatía diabética

La relación entre los niveles de glucosa del músculo y las neuronas difiere notablemente
(Tomlinson and Gardiner 2008). La retina, al ser un tejido neuronal, tiene una alta demanda
metabólica que la hace vulnerable a daños neurodegenerativos causados por la diabetes, por
lo tanto, la captación neuronal de glucosa depende de su concentración extracelular
(Tomlinson and Gardiner 2008). En el sistema nervioso central, la absorción de glucosa
depende principalmente del transportador GLUT1, presente también en la retina junto a
GLUT2, GLUT3 y GLUT4. Mediante RT-PCR se ha determinado que GLUT1 y GLUT3
se expresan principalmente en cultivo de epitelio pigmentado y en células endoteliales de la
retina (Ban and Rizzolo 2000). Otros estudios con western blot e inmunofluorescencia
pudieron mostrar la expresión de GLUT1 en los segmentos externos de los fotorreceptores
y en células de Muller (Hsus and Molday 1991; Devaskar 2015), GLUT2 expresado en
células horizontales (colaboración con F. Paquet-Durand, no publicado) y GLUT3
expresado principalmente en las células de retina interna (Devaskar 2015). En los últimos
años se ha reportado que GLUT4 también estaría presente en la retina, específicamente en
los fotorreceptores, capa nuclear interna y en células ganglionares (Pen et al. 2012). El
transporte de glucosa de las isoformas GLUT1, GLUT2 y GLUT3 es independiente de
insulina y ocurre mediante difusión facilitada (Sandoval-muñiz et al. 2016).

Varios estudios han descrito que en la RD ocurren daños irreversibles en la retina que
involucran cambios morfológicos, como el adelgazamiento de la retina, aparición de

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pericitos fantasmas, gliosis, aumento de la muerte celular por apoptosis, necrosis, isquemia
retiniana, sobreproducción de lactato y cambios en la bioquímica neuronal (Obrosova et al.
2006). De acuerdo con este último punto, varias vías son alteradas en la RD. Una de las
más conocidas es la vía del poliol, que corresponde a la aldosa reductasa, la primera enzima
involucrada en esta vía. Esta es una oxidorreductasa monomérica que cataliza la reducción
de una amplia variedad de compuestos carbonilos, incluidos la glucosa en presencia de
NADPH (Brownlee 2001). En general, esta enzima tiene una baja afinidad a la glucosa, sin
embargo, en un entorno hiperglicémico, el aumento de las concentraciones de glucosa
intracelular genera la conversión enzimática a polialcohol sorbitol dependiente de NADPH
(Tomlinson and Gardiner 2008). El sorbitol puede oxidarse a fructosa producto de la
catálisis de la enzima sorbitol deshidrogenasa, esto tiene como consecuencia, una
acumulación de sorbitol y fructosa dentro de la célula, por lo tanto, debido a la baja
permeabilidad de la membrana celular para el sorbitol, se desencadena estrés osmótico y
eventualmente muerte celular (Sahajpal et al. 2019). Se ha propuesto que la reducción de
glucosa a sorbitol consume NADPH, siendo este último importante para regenerar el
glutatión reducido (GSH), por lo tanto podría inducir estrés oxidativo en la célula
(Brownlee 2001).

La glucosa puede reaccionar directamente con los grupos amino libres en proteínas y
lípidos, produciendo un grupo de modificaciones denominadas productos finales de
glicación avanzada (AGE) (Marian Valko et al. 2007). Básicamente, es una glicación no
enzimática de proteínas formada mediante una base de Schiff, que implica una adición
directa de glucosa de cadena abierta a una lisina. Una vez adicionada la glucosa, este
producto sufre un reordenamiento para formar AGEs (Rhee and Kim 2018). Los AGEs se
encuentran en casi todos los tejidos examinados de ratas diabéticas y en pacientes humanos
insulinodependientes, siendo algunos tejidos, como el hígado, los riñones y los eritrocitos,
más susceptibles a la formación de AGEs que otros (Brownlee 2001). Por tanto, la
formación de AGEs es probablemente un contribuyente significativo a la aparición de
complicaciones diabéticas, principalmente aterosclerosis (Marian Valko et al. 2007).
Además, los AGEs tienen la capacidad de inducir respuestas celulares. Esto se debe a que
se han identificado varias proteínas de unión asociadas a AGEs, como OST-48, galectina-3

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receptor captador de macrófagos tipo II y receptores de productos de glicación avanzada
(RAGE) (Brownlee 2001). Se sugiere que en algunos casos puedan contribuir a la
eliminación de los AGEs, mientras que en otros casos sean capaces de activar vías de

señalización como la vía NF-κB, vinculada a procesos inflamatorios (Dro 2002). También

se ha observado la activación de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), que

es capaz de interrumpir vías de señalización celular (Haslbeck et al. 2007). La activación

tanto de NF-κB como de MAPK permiten la regulación de la transcripción, a través de la

modulación de la expresión de distintos genes, por ende, modifican directamente la

actividad y expresión de ciertas proteínas (Yang, Sharrocks, and Whitmarsh 2003). Si bien

la vía NF-κB es conocida por la transcripción de proteínas proinflamatorias (Tomlinson and

Gardiner 2008), se ha determinado que su activación puede desencadenar cascadas pro y

antiapoptóticas, no obstante, en la diabetes tipo I, la presencia de interleuquinas y
citoquinas activa esta vía en las células β del páncreas, jugando un papel pro apoptótico (S.
Patel and Santani 2009).

La sobreactivación de fosfoquinasa C (PKC) también es uno de los cambios bioquímicos

involucrados en la diabetes. Se ha observado que la expresión de diacilglicerol (DAG) en la
retina está aumentada en animales diabéticos. PKC también puede ser activado por la unión
de AGEs a sus receptores extracelulares (Brownlee 2001). Se ha observado que la anormal
activación de PKC puede inhibir la expresión del ARN mensajero para la óxido nítrico
sintasa endotelial (eNOS) (Brownlee 2001). La producción de NO y su efecto en
condiciones hiperglicémicas se profundizará más adelante.

Uno de los efectos más perjudiciales causados por la toxicidad de la glucosa, que no solo
afecta neuronas, es el estrés oxidativo (Opatrilova et al. 2018; Sharma et al. 2015; Sasaki et
al. 2010). Dentro de ellos, se encuentran diferentes especies oxidantes que participan,
siendo las más conocidas el peróxido de hidrógeno, el radical hidroxilo, el NO, el anión
superóxido y el peroxinitrito (Martínez-Ruiz, Cadenas and Lamas 2011). Este último es
generado por el aumento del metabolismo oxidativo de la mitocondria producto del
incremento de la concentración intracelular de la glucosa (Tomlinson and Gardiner 2008).

11
Se ha propuesto que el aumento del estrés oxidativo es una de las principales causas que
desencadenan las complicaciones diabéticas inducidas por la hiperglicemia. Ya que el
aumento de las concentraciones intracelulares de glucosa estimula la formación de especies
reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS por sus siglas en inglés), a partir de una
variedad de fuentes, que incluyen fosforilación oxidativa, autooxidación de la glucosa,
NADPH oxidasa, lipooxigenasa, citocromo P450 monooxigenasas y óxido nítrico sintasa
(NOS) (Marian Valko et al. 2007).

En condiciones fisiológicas, la formación de anión superóxido, en la membrana

mitocondrial, se produce en la cadena transportadora de electrones, específicamente en el
complejo I y III (Martínez-ruiz, Cadenas, and Lamas 2011; Nishikawa et al. 2000). Sin
embargo, la diabetes tipo II altera los sitios primarios de generación de superóxido de modo
que el complejo II se convierte en la fuente principal de electrones que contribuyen a la
formación de superóxido en condiciones de diabetes (Nishikawa et al. 2000). También, se
ha observado en ratones que los niveles de glucosa en la diabetes conducen a un aumento
de la glicólisis, que da como resultado una generación aumentada de piruvato, lo que
aumenta el potencial de la membrana mitocondrial interna, y, en consecuencia, genera una
disfunción mitocondrial y un aumento de la producción de ROS en el complejo II (Jie Li et
al. 2013; Jiang et al. 2011). Experimentos donde se utilizó un inhibidor del complejo II y un
desacoplador de la fosforilación oxidativa permitieron observar una disminución en la
formación de ROS en varias células expuestas a altas concentraciones de glucosa
(Brownlee 2001). Se ha establecido que, en la patología de diabetes tipo II, la NADPH
oxidasa, un complejo enzimático encargado de producir ROS en células del sistema inmune
mediante el estallido respiratorio, también funciona como un importante productor de ROS
en otros tipos celulares (Jian-mei Li and Shah 2003). A su vez, en condiciones de
hiperglicemia, la NADPH oxidasa puede ser suprimida por una variedad de inhibidores de
PKC, lo que sugiere que esta quinasa participa en la regulación de la actividad de NADPH
oxidasa en la diabetes (Marian Valko et al. 2007).

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Formación de especies oxidantes

Las ROS y RNS son moléculas cuya principal característica es que poseen un electrón
desapareado en su orbital (Jakubczyk et al., 2020). En el caso de los radicales libres, tales
como ROS y RNS, el electrón se encuentra solo en un orbital (Phaniendra and Babu 2015),
esto significa que la molécula poseerá una alta reactividad en relación con otras, ya que ese
electrón desapareado tendrá la tendencia de buscar alguna molécula para poder alcanzar la
configuración electrónica más estable, formando un par apareado (Lay et al. 2014).

ROS y RNS son producidas como consecuencia del metabolismo aeróbico fisiológico
normal de la célula, y tienen funciones fisiológicas importantes, modulando vías de
señalización celular, proliferación, inducción de respuesta mitogénica y defensa contra
patógenos por ejemplo (Dro 2002). Sin embargo, una sobreproducción de estas moléculas
oxidantes está asociada fuertemente a estados patológicos (Brownlee 2001; Marian Valko
et al. 2007; R. Patel et al., 2017).

Existe una gran variedad de ROS y RNS, siendo los más reportados en la RD el anión
superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrógeno, óxido nítrico y peroxinitrito
(Phaniendra and Babu 2015; Mittal et al. 2014; Lushchak et al. 2014). El anión superóxido
es el ROS más abundante y es formado mediante procesos enzimáticos, reacción de
autooxidación y por reacciones de transferencia de electrones, en las que un electrón se
transfiere al oxígeno molecular (Phaniendra and Babu 2015) en las mitocondrias
(Nishikawa et al. 2000). Sin embargo, otras enzimas citosólicas como la xantina oxidasa
(XO), lipooxigenasa, ciclooxigenasa y NADPH oxidasa también son capaces de producir
anión superóxido (Marian Valko et al. 2007).

Por otro lado, el radical hidroxilo es un radical libre altamente reactivo, capaz de reaccionar
con el ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos y moléculas inorgánicas (R. Patel et al.,
2017). Debido a su alta reactividad, puede causar un daño severo en la célula (Halliwell B.,
1991). El radical hidroxilo es generado mediante la reacción de Fenton, que consiste en que
el peróxido de hidrógeno reacciona con iones de hierro o cobre, dando como productos

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radicales hidroxilo (Phaniendra and Babu 2015). Bajo condiciones de estrés oxidativo, un
exceso de radical superóxido libera hierro de la ferritina, por lo tanto, este hierro libre
participa en la reacción de Fenton, aumentando las concentraciones intracelulares de radical
hidroxilo (Phaniendra and Babu 2015). Otro ROS es el peróxido de hidrógeno, que es una
molécula que en sí no es un radical libre, no obstante, es un precursor de ROS, tal como se
mencionó anteriormente. Es formado por una reacción de dismutación catalizada por la
enzima SOD (Y, Veronique, and Hua 2000).

El óxido nítrico (NO) corresponde a un RNS, es una molécula de gran importancia

biológica, ya que es un radical que es capaz de actuar como una molécula de señalización
biológica en una gran variedad de procesos, como la neurotransmisión, regulación de la
presión arterial, mecanismos de defensa, relajación del músculo liso y la regulación
inmunitaria (Marian Valko et al. 2007; Dro 2002). El NO difunde fácilmente en el
citoplasma y también a través de la membrana plasmática (Sharma et al. 2015). En
condiciones patológicas, un aumento de RNS provoca estrés nitrosativo en la célula, que
puede gatillar reacciones de nitrotirosinación (una adición de un grupo nitro a una cisteína)
que pueden alterar la estructura de las proteínas e inhibir su función normal de forma
irreversible (Martínez-ruiz, Cadenas, and Lamas 2011). Esto ocurre porque el óxido nítrico
y el anión superóxido pueden reaccionar juntos para producir cantidades significativas de
una molécula mucho más oxidante: el anión peroxinitrito, que es un potente agente
oxidante que puede causar fragmentación del ADN, modificación de proteínas y oxidación
de lípidos, evento conocido como peroxidación lipídica (Sharma et al. 2015; Opatrilova et
al. 2018; Pál Pacher et al. 2005). Este último es altamente reactivo y tóxico, siendo capaz
de reaccionar directamente con el dióxido de carbono para formar otro compuesto reactivo:
el peroxocarboxilato y el ácido peroxinitroso, este último es capaz de hacer homólisis para
formar radical hidroxilo (Jakubczyk et al., 2020). La formación del peroxinitrito tiene una
de las constantes de velocidad más altas, lo que hace que la toxicidad del NO esté
relacionada principalmente con su capacidad de combinarse con aniones superóxido
(Marian Valko et al. 2007). Los residuos de 3-nitrotirosina se consideran un marcador de
daño celular inducido por el peroxinitrito y son altamente estudiados (M. Souza et al.
1999).

14
Fuentes endógenas productoras de ROS y RNS en la célula

Las ROS y RNS pueden ser producidos a partir de fuentes endógenas como exógenas.
Dentro de la célula, las principales fuentes endógenas de ROS incluyen diferentes
organelos cuyo consumo de oxígeno es mayor como las mitocondrias, peroxisomas y el
retículo endoplasmático (Phaniendra and Babu 2015), a través de procesos que incluyen
síntesis de prostaglandinas, autooxidación de adrenalina, reducción de riboflavina, FADH2,
citocromo P450, activación de células inmunitarias, inflamación, entre otros procesos
(Jakubczyk et al., 2020).

La mayoría de ROS son producidos en la mitocondria, principalmente el radical

superóxido, que es producido en los complejos I (NADPH deshidrogenasa) y III (citocromo
c reductasa) de la cadena transportadora de electrones (Marian Valko et al. 2007). En la
cadena respiratoria cerca del 2% del oxígeno molecular es transformado en radical
superóxido en condiciones fisiológicas, aunque la tasa de la producción se eleva cuando
hay daño mitocondrial (Jakubczyk et al., 2020). La transferencia de electrones del complejo
I da como resultado que la coenzima Q sea reducida a QH2. Esta forma reducida regenera
la coenzima Q, a través de un anión intermedio, la semiquinona, que es inestable por la
presencia de un electrón desapareado, por lo tanto, esta semiquinona inmediatamente
transfiere electrones al oxígeno molecular, formando el radical superóxido (Phaniendra and
Babu 2015). Este radical es el más producido en la célula y es el que da origen a otras
especies oxidantes, tales como el peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y radical
peroxilo (Mittal et al. 2014). En condiciones fisiológicas, el anión superóxido, el peróxido
de hidrógeno y el NO son las especies reactivas con mayor importancia biológica en la
célula (Marian Valko et al. 2007).

La presencia de enzimas mitocondriales como monoamino oxidasa, α-cetoglutarato

deshidrogenasa y glicerol fosfato deshidrogenasa, también contribuyen a la formación de
ROS (Finkel and Holbrook 2000), siendo esta última una fuente importante de producción
de ROS, ya que es una proteína localizada en el espacio intermembranal de la mitocondria,

15
que, bajo estrés oxidativo, se puede translocar y asociarse con el citocromo c, de esta
manera aporta a la generación de ROS que puede gatillar un daño severo mitocondrial
(Giorgio et al. 2005). Si bien la mitocondria es el organelo con mayor tasa de producción de
especies oxidantes, la célula tiene mecanismos que permiten mantener las concentraciones
de ROS bajas. En el caso del anión superóxido, este puede ser rápidamente catalizado por
la enzima SOD a peróxido de hidrógeno, una molécula menos reactiva, que, a su vez, será
catalizado por la enzima CAT y la GPx, de esta forma se mantiene el equilibrio entre
oxidantes/antioxidantes (Rodríguez-Carrizalez et al. 2014).

A pesar de que la mitocondria es el principal productor de ROS en la célula, hay otros

organelos que también son productores de especies oxidativas (Jakubczyk et al., 2020;
Jiang et al. 2011; Phaniendra and Babu 2015), dentro de ellas, el retículo endoplasmático
contribuye en la producción de ROS, mediante una cadena transportadora de electrones
constituida por un grupo de citocromos conocido como citocromo P450 y las enzimas b5 y
diamino oxidasa (Meo et al. 2016). Además, otra importante enzima, la tiol oxidasa,
Erop1p, cataliza la transferencia de electrones de los ditioles al oxígeno molecular y da
como resultado la formación de peróxido de hidrógeno en el retículo endoplasmático
(Gross et al. 2005).

En el citoplasma, las enzimas NADPH oxidasas y la xantina oxidasa (XO) también forman
parte de fuentes productoras de ROS, principalmente de anión superóxido (Rodríguez-
Carrizalez et al. 2014). La NADPH oxidasa es un complejo enzimático que está unido a la
membrana y transfiere electrones de NADPH al oxígeno, en cambio XO, en su forma
interconvertible como xantina oxidorreductasa (XOR), tiene una gran importancia como
catalizadora de la hipoxantina a xantina y ácido úrico, siendo este último un potente
antioxidante y eliminador de radicales libres (Marian Valko et al. 2007). A diferencia de
XOR, XO es capaz de sintetizar numerosos ROS y RNS. Por lo tanto, XOR al producir la
síntesis de ácido úrico lo convierte en un importante regulador y protector del redox celular
(Vorbach, Harrison, and Capecchi 2003). Estudios realizados en diabéticos han demostrado
que la expresión de XO es mayor y se ha asociado a un aumento en la producción de ROS
en esta patología (Mittal et al. 2014).

16
Los peroxisomas también tienen una vía respiratoria que involucra transferencia de
electrones de varios metabolitos al oxígeno, formando principalmente peróxido de
hidrógeno en condiciones fisiológicas (Phaniendra and Babu 2015). Este es utilizado para
oxidar una variedad de moléculas (Marian Valko et al. 2007). Para poder contrarrestar un
ambiente tan oxidante, este organelo contiene catalasa (CAT), una enzima capaz de
descomponer el peróxido de hidrógeno y así evitar la acumulación de este oxidante (Y,
Veronique, and Hua 2000). Cuando los peroxisomas se dañan y las enzimas se regulan
negativamente, el peróxido de hidrógeno es liberado al citosol, contribuyendo al estrés
oxidativo (Marian Valko et al. 2007). Por otro lado, se han encontrado otras enzimas, como
acil CoA oxidasas, D-aminoácido oxidasa, L-α-hidroxi oxidasa, urato oxidasa y D-aspartato
oxidasa, que son capaces de producir diferentes ROS dentro de los peroxisomas (Schrader
and Fahimi 2006).

Se ha estudiado en los últimos años la relación que tiene el aparato de Golgi y su

contribución en el estrés oxidativo. Este organelo tiene funciones que incluyen el
procesamiento y transporte de proteínas y lípidos, especialmente de aquellas proteínas
destinadas a ser exportadas de la célula. También es encargado de la homeostasis iónica,
apoptosis celular y detección de estrés oxidativo (Jiang et al. 2011). Se ha vinculado a este
organelo con la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas mediadas por
estrés oxidativo (Fan et al. 2008). Resultados en experimentos realizados en levaduras han
sugerido que el aparato de Golgi tiene un papel significativo en el mantenimiento de la
homeostasis del calcio celular, particularmente bajo condiciones de estrés oxidativo,
mediante ATPasas Ca+2/Mn+2 (Southall et al. 2020). Es sabido que el calcio intracelular es
un segundo mensajero importante para una serie de procesos fisiológicos, sin embargo, un
aumento en la concentración puede dañar las células (Berridge, Bootman, and Lipp 1998).
ROS pueden interactuar con las vías de señalización de calcio y modificarlas, lo que a
menudo conduce a la entrada de calcio al citoplasma desde el entorno extracelular y desde
el retículo endoplasmático, promoviendo la generación de ROS y RNS, activando enzimas
como fosfolipasas, NOS, XO y vías de apoptosis celular (Joseph et al. 1997). De hecho,
experimentos han demostrado que ROS induce la liberación de calcio de las reservas

17
intracelulares, lo que da como resultado la activación de diferentes quinasas (Parekh 2020).
En la RD, la presencia de estrés oxidativo inicia la apoptosis celular gatillada por
mecanismos que involucran disfunción mitocondrial, sobrecarga de calcio, modificación de
proteínas y desestabilización lisosomal, donde el aparato de Golgi juega un papel
importante en la apoptosis (Jiang et al. 2011). Estudios han demostrado que la caspasa-2
proapoptótica se localizó en este organelo, además de las mitocondrias, el núcleo y el
citoplasma (Mancini et al. 2000). La inhibición de la caspasa-2 evita la liberación de la
enzima citocromo c de las mitocondrias y la activación de las caspasas posteriores, que se
cree que son manifestaciones tempranas de la apoptosis (Robertson et al. 2002). Otro
estudio evidenció que el aparato de Golgi tiene otras proteínas relacionadas con procesos
apoptóticos como la anexina II, y que es fosforilada por la Src quinasa durante el estrés
oxidativo, translocando esta anexina II fosforilada desde Golgi hacia el retículo
endoplasmático para transducir la señal apoptótica (Jiang et al. 2011). Esto sugiere una
fuerte relación entre ambos organelos en respuestas a estrés oxidativo y, también al aparato
de Golgi como un actor importante en las vías de señalización del estrés celular.

Control antioxidante

Para mantener bajas las concentraciones de especies oxidantes, es importante tener un

sistema que mantenga las concentraciones de ROS y RNS dentro de los parámetros
fisiológicos. Los mecanismos de defensa contra el estrés oxidativo implican mecanismos
preventivos, mecanismos de reparación, defensas físicas y defensas de antioxidantes
(Marian Valko et al. 2007). Dentro de este último punto, los mecanismos antioxidantes
pueden ser enzimáticos y no enzimáticos. En los sistemas no enzimáticos existen moléculas
de bajo peso molecular como las vitaminas E, C, bilirrubina, biliverdina, ácido úrico,
glutatión y diversos flavonoides (Yeh Siiang Lau et al. 2015; Rodríguez-Carrizalez et al.
2014; Williams, Hogg, and Chakravarthy 2013). Dentro de estos antioxidantes, hay varios
que funcionan a nivel extracelular, como el ácido úrico. Sin embargo, hay otros, como los
flavonoides, que son capaces de detener la oxidación de varias moléculas mediante la
donación de átomos de hidrógeno a los radicales libres, generando moléculas relativamente
estables y que no pueden realizar reacciones en cadena (Jie Li et al. 2013).

18
El glutatión (GSH), es uno de los antioxidantes más conocidos y abundantes dentro de la
célula y se puede encontrar en el citosol, la mitocondria y el núcleo (Rodríguez-Carrizalez
et al. 2014; Lushchak et al. 2014). La forma oxidada del glutatión es GSSG, por su puente
disulfuro. Debido a que el GSH se sintetiza en el citosol mediante la acción secuencial de la
glutamato-cisteína ligasa y la glutatión sintetasa, su presencia mitocondrial requiere el
transporte hacia la membrana interna (Marian Valko et al. 2007). El GSH tiene funciones
antioxidantes importantes frente al estrés oxidativo, ya que es un cofactor de varias enzimas
antioxidantes, como la enzima glutatión peroxidasa (GPx). Además, elimina el radical
hidroxilo directamente, eliminando el peróxido de hidrógeno y los peróxidos de lípidos
mediante la acción catalítica de la GPx, y, por último, GSH es capaz de regenerar los
antioxidantes más importantes como las vitaminas C y E a sus formas activas (Marian
Valko et al. 2007). Para seguir funcionando como un antioxidante, GSH debe ser
regenerado nuevamente, y esto es realizado de forma enzimática mediante la enzima
glutatión reductasa (Lushchak et al. 2014).

Hay moléculas antioxidantes como la transferrina, ceroloplasmina y la albúmina que actúan

principalmente como quelantes de iones metálicos, lo que los hace capaces de evitar la
producción de radical hidroxilo, producido por la reacción de Fenton (Biswas 2016). Esto
es de suma importancia, ya que, en los metales de transición, los átomos tienen la
característica de tener varias valencias, que permiten aceptar y donar electrones
individuales. Esta característica hace a los iones metálicos muy buenos promotores de las
reacciones de radicales libres, por ejemplo, los iones de hierro y cobre pueden convertir el
anión superóxido y el peróxido de hidrógeno en el radical hidroxilo (Jakubczyk et al., 2020;
Lushchak et al. 2014). Estudios han demostrado que este radical reacciona rápidamente con
las biomoléculas, y que ningún antioxidante a concentraciones fisiológicas es capaz de
competir con las moléculas generadas por el radical hidroxilo (Halliwell B., 1991). De esta
manera se ha propuesto como una buena estrategia para minimizar el daño producido por
este radical, remover ya sea el peróxido de hidrógeno o secuestrar los metales de transición
necesarios para la producción de hidroxilo por la reacción de Fenton (Halliwell 2012). Sin
embargo, hay que considerar que no todos los tipos de moléculas oxidantes tienen la misma

19
reactividad, por lo tanto, es importante que la célula pueda contar con otros sistemas
antioxidantes.

La célula tiene respuestas adaptativas al estrés oxidativo, como la activación de genes en el

núcleo que codifican enzimas de defensa contra ROS, factores de transcripción y proteínas
estructurales (Marian Valko et al. 2007; Jakubczyk et al., 2020). Dentro del control
antioxidante enzimático se encuentra la enzima SOD, capaz de convertir el anión
superóxido en peróxido de hidrógeno (R. Patel et al., 2017). La familia de SOD incluye tres
tipos enzimáticos que dependen del lugar en que se localizan en la célula: CuZnSOD se
encuentra localizado en el citoplasma y en el núcleo. Por otra parte, está MnSOD y ECSOD
ubicados en la matriz mitocondrial y, la última, en dominios extracelulares respectivamente
(Mikhak et al. 2008). La SOD trabaja en conjunto con otras enzimas como la CAT, GPx y
la peroxiredoxina (Prx), que remueven rápidamente el peróxido de hidrógeno, manteniendo
de esta forma el balance oxidante/antioxidante en la célula (Rodríguez-Carrizalez et al.
2014). La reducción del peróxido de hidrógeno depende de cada enzima, por ejemplo, la
CAT reduce rápidamente el peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno en presencia de
NADPH (Kozakowska and Alicja 2016), en cambio, GPx requiere de la presencia de
selenio para reducir el peróxido de hidrógeno (Jie Li et al. 2013).

Si bien SOD, CAT y GPx son el sistema enzimático antioxidante más conocido y
abundante en la célula, existen otras enzimas que pueden reducir las concentraciones de
ROS, tales como las peroxirredoxinas (Prx), catalizadoras no sólo de peróxido de
hidrógeno, sino que también de peróxido lipídico, sin embargo, se ha establecido que su
eficiencia a la hora de catalizar el peróxido de hidrógeno no es tan eficiente como SOD,
CAT y GPx (Handy and Loscalzo 2012).

El uso de antioxidantes ha sido ampliamente estudiado como una solución terapéutica para
eliminar el exceso de ROS generado en la célula, haciendo énfasis en la generación de ROS
mitocondrial, lugar donde se concentra la producción de anión superóxido (Jiang et al.
2011). Estudios donde se utilizó suplementación de antioxidantes no ha mostrado
resultados favorables en la supresión de la generación de ROS mitocondrial (Jiang et al.

20
2011; Williams, Hogg, and Chakravarthy 2013; Rodríguez-Carrizalez et al. 2014), lo que
permite tener la pregunta abierta acerca de los mejores métodos para poder contrarrestar los
efectos perjudiciales de una sobreproducción de especies oxidantes.

Funciones fisiológicas de ROS

Las especies oxidantes son moléculas que, además de estar asociadas al desarrollo de varias
patologías, también tienen un rol fisiológico (Dro 2002). Ya es bien conocido que las
células son capaces de generar ROS de forma endógena y que son utilizados en la
inducción y mantenimiento de vías que transducción de señales implicadas en una amplia
variedad de procesos fisiológicos (Marian Valko et al. 2007), como la proliferación,
diferenciación, procesos apoptóticos (Meo et al. 2016) y de defensa contra patógenos
(Mittal et al. 2014).

Se ha demostrado que la mayoría de los tipos de células provocan una pequeña explosión
oxidativa que genera bajas concentraciones de ROS cuando son estimuladas por citoquinas,
factores de crecimiento y hormonas (Dro 2002). Esto llevó a la suposición de que el inicio
y el funcionamiento de varias vías de transducción de señales dependen de la acción de las
ROS como moléculas de señalización y que pueden actuar en diferentes niveles en la
cascada de transducción de señales (Marian Valko et al. 2007). Por tanto, las ROS pueden
desempeñar un papel fisiológico muy importante como mensajeros secundarios (Dro 2002).
La explosión oxidante juega un papel fundamental en células del componente inmune, cuyo
estallido permite la liberación de grandes cantidades de anión superóxido y sus derivados
con el uso de la NADPH oxidasa, jugando un papel fundamental en la eliminación de
patógenos (Jakubczyk et al., 2020).

En general, se acepta que ROS pueda activar vías iniciadas por ligando-receptor,
principalmente, receptores tirosina quinasas (RTK), que desempeñan un papel clave en la
transmisión de información desde el exterior de la célula hacia el citoplasma y el núcleo
(Marian Valko et al. 2007), por lo tanto, las ROS funcionan como verdaderos segundos
mensajeros y son capaces de mediar en funciones celulares importantes, como la

21
proliferación y la muerte celular programada (Marian Valko et al. 2007). Las vías que son
activadas por factores de crecimiento, señalización de MAPK, receptores de citoquinas
como TNF-α, IFN-γ y algunas interleuquinas corresponden a vías activadas por tirosina
quinasas (Aslan 2003; Pathways 2002). Además de las tirosina quinasas receptoras, varias
proteínas quinasas no receptoras (PTK), pertenecientes a la familia Src y JAK, también se
ha demostrado que pueden ser activadas por ROS (Abe and Berk 1999). El peróxido de
hidrógeno y el radical superóxido inducen la fosforilación de tirosina de varias PTK en
fibroblastos, linfocitos, macrófagos y células mieloides, mientras que la Src activada se une

a las membranas celulares e inicia las vías de señalización MAPK, NF-κB y PI3K (Marian

Valko et al. 2007).

El anión superóxido y el peróxido de hidrógeno están involucrados en la transducción de

señales debido a su baja reactividad, selectividad y distribución en la célula (Jakubczyk et
al., 2020). Ambos pueden activar la cascada MAPK al nivel de MEK y ERK1/2 (Dro
2002), una vía asociada con la regulación de la proliferación celular (Marian Valko et al.
2007). Estudios sobre la regulación de las MAPK mediante el tratamiento con peróxido de
hidrógeno demostraron que la activación de cada vía de señalización es específica del tipo y
del estímulo de ROS, donde la producción de peróxido de hidrógeno activó
específicamente ERK1/2 (Mehdi, Azar, and Srivastava 2007). Por otro lado, se ha
evidenciado que ROS también pueden actuar como mensajeros secundarios o moduladores
en la vía de señalización de la adenilato ciclasa y fosfolipasa C (Marian Valko et al. 2007;
Jakubczyk et al., 2020), así como también, durante la oxidación de ácidos grasos
poliinsaturados, donde los radicales producidos mantienen la homeostasis redox
intracelular, activando vías se señalización y expresión de genes (Dro 2002).

Las proteínas sufren diversas modificaciones oxidativas por parte de los ROS, tales como la
oxidación de metionina, cisteína, derivados hidróxidos y carbonilos y la oxidación de las
cadenas laterales de ciertos aminoácidos como lisina, arginina, prolina, treonina, cisteína e
histidina, siendo los aminoácidos cisteína y metionina los más propensos a la modificación
por acción de ROS y RNS (Martínez-ruiz, Cadenas, and Lamas 2011; Dro 2002). El
peróxido de hidrógeno tiene como blancos principales los grupos tiol, sulfhidrilo y residuos

22
de cisteína de las proteínas (Jakubczyk et al., 2020). Una vez que interactúan, se generan
modificaciones que pueden causar cambios reversibles en la estructura de la proteína y que,
como consecuencia, puede alterar la función de la misma de manera transitoria (Meo et al.
2016). Un ejemplo de ello es la proteína tirosina fosfatasa, que posee una cisteína en el sitio
activo de esta enzima, por lo tanto, una oxidación reversible puede inactivar a la enzima de
manera momentánea, esto implica cambios en la propagación de la señal del receptor
(Sainz, Lombo, and Mayo 2012). Por lo tanto, las modificaciones transitorias de ciertas
proteínas en condiciones fisiológicas, les permite cumplir roles en diversas vías de
señalización. Las enzimas disulfuro reductasa y metionina sulfóxido disulfuro reductasa
son capaces de revertir estas modificaciones gatilladas por ROS (Jie Li et al. 2013). De esta
misma manera, múltiples proteínas, sensibles a redox, pueden tener modificaciones
ocasionadas por ROS que permitan modular eventos celulares, donde el estado redox de la
célula está relacionado en gran medida por las concentraciones intracelulares de los iones
de hierro y cobre (Marian Valko et al. 2007), por ende, se ha sugerido que la regulación del
hierro asegura que no haya hierro intracelular libre, de manera que no pueda ser precursor
de ROS. Sin embargo, estudios han revelado que, en condiciones de estrés, un exceso de
anión superóxido libera hierro de las moléculas que lo contienen, por lo tanto, en
condiciones de estrés, el anión superóxido facilita la producción de radical hidroxilo a partir
de peróxido de hidrógeno al hacer que el hierro esté disponible para la reacción de Fenton
(M Valko, Morris, and Cronin 2005).

Como ya se mencionó antes, probablemente el efecto más significativo de ROS sobre las
vías de señalización se ha observado en las vías MAPK, que implica la activación de

factores de transcripción nucleares como AP-1, NF-κB y NFAT (Dro 2002; Marian Valko

et al. 2007), ya que, se ha demostrado que bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno

participan en una parte de la activación de NF-κB, un factor de transcripción que estimula la

expresión de varios genes relacionados a interleuquinas y superóxido dismutasa (Jakubczyk

et al., 2020), a través de TNF-α e IL-1 (Marian Valko et al. 2007).

23
ROS también juegan un papel importante en los procesos de envejecimiento (Jie Li et al.
2013; Jakubczyk et al., 2020), contribuyendo a la aceleración de este proceso, como
también en la determinación de la muerte o sobrevivencia celular. Bajas dosis de ROS
activan factores de transcripción que estimulan la diferenciación celular y ayudan a que la
célula pueda adaptarse a diferentes condiciones (Jakubczyk et al., 2020). Por otro lado,
altos niveles de ROS pueden dirigir a las células hacia la activación de vías apoptóticas,
haciendo lo posible para eliminar células que tienen un daño severo y pone el riesgo al
organismo (Sasaki et al. 2010; Ramdial, Franco, and Estevez 2017). Mantener la
homeostasis entre estos procesos es necesario para la función celular normal.

Dentro de los RNS, el NO es, sin duda, el radical libre con funciones fisiológicas de gran
relevancia en células endoteliales, células inmunes y en neuronas. Como se mencionó en
anteriormente, NO es una molécula mensajera intercelular en vertebrados muy conocida
por su función a nivel vascular, encargada principalmente de la vasodilatación, también
participa en procesos inflamatorios y en diversas funciones dentro del sistema nervioso
central (P Pacher, Beckman, and Liaudet 2007). El NO es sintetizado por la conversión de
L-arginina a L-citrulina, cuya reacción es catalizada por la enzima óxido nítrico sintasa
(NOS) en presencia de oxígeno y NADPH (Vielma, Retamal, and Schmachtenberg 2012;
Agurto et al. 2017; P Pacher, Beckman, and Liaudet 2007). En vertebrados se encuentran 3
isoformas de NOS: endotelial (eNOS), neuronal (nNOS) e inducible (iNOS), donde eNOS
está expresada en vasos sanguíneos, nNOS en neuronas e iNOS está principalmente
asociado a procesos inflamatorios (Knowles RG and Salvador M 1994). La síntesis de NO
es calcio dependiente para las isoformas eNOS y nNOS. El aumento de las concentraciones
de calcio en el sistema nervioso central es producido por la activación de canales de calcio
voltaje dependientes, permitiendo la síntesis de NO. En la isoforma de iNOS la síntesis es
independiente de calcio.

En las neuronas el NO actúa como un neuromodulador a través de la activación del receptor

guanilato ciclasa soluble (sGC). De esta forma incrementa los niveles de cGMP que, a su
vez, activa la proteína quinasa G (PKG), o bien, canales iónicos regulados por nucleóticos
cíclicos(Vielma, Retamal, and Schmachtenberg 2012; Agurto et al. 2017). Además de la vía

24
clásica del NO, esta molécula es capaz de modificar de forma postraduccional y covalente
residuos de cisteína mediante la S-nitrosilación y S-glutación. La primera implica una
incorporación de un grupo nitroso a una cisteína, esta formación se denomina nitrosotiol
(R-S-N=O). Es una modificación reversible y se cree que podría actuar como un
señalizador de proteínas (Martínez-ruiz, Cadenas, and Lamas 2011; Vielma, Retamal, and
Schmachtenberg 2012). Por tanto, la S-glutación, también conocida como S-tiosilación, es
la unión de un tiol a una proteína mediante la formación de un puente disulfuro mixto entre
un residuo de cisteína y el grupo tiol. Esta modificación está involucrada en mecanismos de
señalización redox (Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas 2011).

En la retina se ha determinado la expresión de nNOS en tres tipos de células, siendo las más
conocidas las amacrinas tipo NOAC. La NOAC tipo I y II se localizan en la retina interna,
y la tipo III corresponde a células amacrinas NOAC desplazadas hacia la capa ganglionar.
Se ha evidenciado la presencia de nNOS en células ganglionares (Vielma, Retamal, and
Schmachtenberg 2012) y también en algunos tipos de células bipolares (Agurto et al. 2017).

NO en condiciones patológicas

El aumento de las concentraciones de NO ha sido asociado a condiciones patológicas y está

vinculada a vías no canónicas del NO (Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas 2011). Hasta la
fecha, ha sido un gran desafío medir las concentraciones de esta molécula, ya que es un
señalizador dinámico que alcanza concentraciones a nivel local. Algunos autores han
demostrado que las concentraciones fisiológicas en las neuronas están en el orden de los
nM (Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas 2011), sin embargo, en los últimos años se ha
determinado, mediante el uso de detectores ultrasensibles, que las concentraciones
fisiológicas de NO están en el orden de pM (Wood et al. 2011).

En pacientes diabéticos, la concentración de NO es mucho mayor, siendo detectado en el

plasma sanguíneo, en forma de nitrato, llegando a magnitudes de µM (Ghosh et al. 2011;
Adela et al. 2015). En estos casos el NO puede interactuar con otros blancos. Una de ellas
es, a través de la unión de NO en los centros mitocondriales de hierro y azufre y, además en

25
el sitio de unión de O2 en la citocromo oxidasa c (CcO), en la matriz mitocondrial. Esta
unión de NO, producida por competencia con el O2, genera la inhibición de la enzima
(Martínez-ruiz, Cadenas, and Lamas 2011). Si bien algunos autores consideran que esta
inhibición reversible podría cumplir un rol regulador en la mitocondria, otros
investigadores han considerado que el producto de la reacción del NO con el radical
superóxido, el peroxinitrito, disminuiría de forma irreversible la afinidad de la CcO con el
O2 en condiciones patológicas; por lo tanto, al interactuar con esta enzima podría traer
complicaciones importantes en la respiración y el metabolismo celular (Cooper et al. 2003).

Las altas concentraciones de NO pueden generar derivados más reactivos de RNS, siendo el
más conocido el peroxinitrito, tal como se mencionó anteriormente (Martínez-Ruiz,
Cadenas, and Lamas 2011). Esta molécula es capaz de reaccionar con proteínas,
macromoléculas, lípidos y el ADN mediante la nitración de residuos de tirosina (J. M.
Souza, Peluffo, and Radi 2008). Si bien hasta la fecha aún existen vacíos en los
mecanismos en que está involucrado el peroxinitrito (Radi 2013; P Pacher, Beckman, and
Liaudet 2007), hay suficiente evidencia de que genera un daño de forma permanente en
proteínas y afecta, por ejemplo, los poros de transición de permeabilidad mitocondrial,
alterando la homeostasis de calcio mitocondrial (J. M. Souza, Peluffo, and Radi 2008), a
través de la nitración o incorporación de un grupo nitro al anillo fenólico de los residuos de
tirosina, formando 3-nitrotirosina. La nitración se considera una reacción irreversible, ya
que es termodinámicamente estable en condiciones fisiológicas, además, hasta la fecha, aún
no se ha encontrado un mecanismo endógeno de desnitración (Martínez-Ruiz, Cadenas, and
Lamas 2011). Por ende, el daño por peroxinitritos es de mayor interés por la implicancia
patológica que está involucrada, ya que se le ha asociado a una alteración de los ácidos
grasos y proteínas, e incluso, se sugiere la pérdida de actividades enzimáticas en algunos
casos, afectando la funcionalidad en la fisiopatología de varias enfermedades (J. M. Souza,
Peluffo, and Radi 2008; Yamakura and Kawasaki 2010; Freeman et al. 2008).

En resumen, junto con la vía canónica, el NO tiene varios otros blancos moleculares que
están principalmente asociados a las altas concentraciones intracelulares de NO. Estas vías
alternativas siguen siendo material de investigación, sobretodo la nitración y la inhibición

26
de CcO, ya que están asociadas al estrés nitrosativo y al desbalance oxidante celular. Estos
cambios pueden generar una cadena respiratoria disfuncional que podría contribuir a la
sobreproducción de RNS, y a su vez, al desarrollo de RD.

Los efectos del estrés oxidativo, gatillado por RNS, sobre las neuronas en la RD son
complejos y aún no se entienden bien los mecanismos involucrados. Es por ello que, en esta
investigación, nos centramos principalmente en el estudio de NO y el anión superóxido,
cuya sobreproducción ha sido vinculada en enfermedades como la diabetes.

Estrés oxidativo/nitrosativo en diabetes y RD

La hiperglicemia puede inducir una mayor producción de radicales libres a través de cuatro
rutas diferentes: 1) aumento de la glicólisis, que da como resultado una mayor proporción
entre la tasa de oxidación, después de un aumento de la relación NADH/NAD+, lo que
genera un desequilibrio redox; 2) vía del poliol, que provoca la acumulación tanto de
sorbitol como de fructosa, dando como resultado una disminución del GSH reducido y un
aumento de la relación NADH/NAD+; 3) la autooxidación de la glucosa, que genera un
aumento de diferentes radicales libres como el peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo,
anión superóxido y cetoaldehídos; y 4) la glicación de proteínas no enzimática, da como
resultado la formación de AGE que al interactuar con los RAGEs generan estrés oxidativo
(Jiang et al. 2011; Marian Valko et al. 2007; Jakubczyk et al., 2020; Halliwell B., 1991).

La mitocondria, al ser uno de los mayores productores de ROS, es uno de los organelos que
sufre más daño por parte de las especies oxidantes. Bajo estrés oxidativo, se ha observado
cambios en la glicólisis que conllevan a una depleción de ATP (Jakubczyk et al., 2020).
Esto desencadena una incrementada permeabilidad de la membrana mitocondrial interna, lo
que genera una liberación de la enzima citocromo C desde la mitocondria hacia el citosol,
activando rápidamente caspasas, que son los principales mecanismos de muerte celular
(Jiang et al. 2011; Dro 2002).

27
Se ha vinculado la generación de peroxinitritos con la causa de varias patologías
inflamatorias, autoinmunes y enfermedades neurodegenerativas (Ramdial, Franco, and
Estevez 2017; P Pacher, Beckman, and Liaudet 2007), esto se debe porque esta molécula es
capaz de oxidar y dañar, además de las proteínas, lípidos y ADN, gatillando la activación
de mecanismos de muerte celular (Szabó 1996). Si bien el ADN es uno de los blancos no
sólo de ROS, sino que también de RNS, se ha demostrado que el ADN más vulnerable al
ataque de moléculas oxidantes es el ADN mitocondrial porque está ubicado muy cerca del
lugar generador de ROS y carece de protección de cromatina. Además, la mitocondria no
dispone de mecanismos de reparación para los efectos de oxidación en la membrana,
cambios estructurales, modificaciones funcionales de las proteínas y de daño del ADN
mitocondrial (Jakubczyk et al., 2020; Rodríguez-Carrizalez et al. 2014). Se ha determinado
que el peroxinitrito puede interaccionar con la guanina, produciendo lesiones nitrosativas y
oxidativas en el ADN y ARN, como la 8-nitroguanina y la 8-oxodesoxiguanosina, siendo el
primer componente muy inestable, sin embargo, puede eliminarse espontáneamente, lo que
da lugar a la formación de un sitio apurinínico. Por el contrario, la adenina puede
emparejarse con la 8-nitroguanina durante la síntesis de ADN, dando lugar a transversiones
de GT, que, en consecuencia, producen una lesión de ADN mutagénica que se ha implicado
fuertemente en la carcinogénesis (Ferri and Kroemer 2001).

Algunos autores sostienen que el tipo de señalización para muerte celular es dependiente de
la concentración de peroxinitritos: concentraciones bajas y moderadas son capaces de
gatillar apoptosis (Szabó 1996; S. Park et al. 2003; Robertson et al. 2002), un mecanismo
de muerte programada por la activación de caspasas (Sasaki et al. 2010), mientras que
concentraciones altas de especies oxidativas estimulan necrosis, cuyo daño celular es mayor
y se caracteriza por la pérdida de la integridad de la membrana y la liberación del contenido
intracelular (Ramdial, Franco, and Estevez 2017).

Probablemente, la oxidación de las proteínas sea uno de los daños causados por RNS más
estudiados, ya que, al igual que el daño producido hacia los ácidos nucleicos y los lípidos,
las proteínas pueden ser modificados tanto por ROS y RNS. De hecho, la mayoría de los
radicales conocidos tienen la capacidad de reaccionar con las proteínas30. Los ROS oxidan

28
diferentes aminoácidos presentes en las proteínas, siendo los más susceptibles la metionina
y cisteína (Phaniendra and Babu 2015; Marian Valko et al. 2007). Estas interacciones
pueden generar la formación de enlaces cruzados proteína-proteína que conlleva a una
pérdida del funcionamiento de las proteínas, pérdida de la actividad enzimática o de la
función de receptores y proteínas transportadoras (Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas
2011). La modificación de residuos como lisina, prolina, treonina y arginina pueden
producir derivados de carbonilo bajo la interacción con ROS, siendo un biomarcador de
oxidación de proteínas como consecuencia de ROS, junto con la O-tirosina, un reconocido
marcador de radical hidroxilo (Jiang et al. 2011), y la 3-nitrotirosina, un marcador de
peroxinitrito (M. Souza et al. 1999).

Si bien se ha asociado que el estrés oxidativo/nitrosativo podría jugar un rol importante en

el desarrollo de la patología de la RD (Baynes 1991), la fuente de NO aún es controversial,
ya que, en algunas investigaciones se ha relacionado la adhesión de los leucocitos en los
vasos sanguíneos, o leucostasis, con un aumento de los peroxinitritos, cuya fuente de NO es
vinculada directamente por una regulación positiva ICAM-1 mediada por NO proveniente
de eNOS (Joussen et al. 2002). También se ha vinculado la leucostasis y la descomposición
de la barrera sanguínea de la retina con un aumento de iNOS (Leal et al. 2007). El uso de
ratones diabéticos knock out de eNOS presentaron un desarrollo acelerado de retinopatía
diabética (Q. Li et al. 2010), así mismo, el uso de inhibidores de iNOS, como la
aminoguanidina, en animales diabéticos sugieren un posible papel de esta isoforma en la
patogénesis de la diabetes (Yunpeng Du et al., n.d.). El uso de animales knock out de iNOS
demostró que este modelo no presentó degeneración de los capilares de la retina a
diferencia de animales wild type diabéticos, lo que refuerza la idea de que iNOS es la
enzima clave para el desarrollo de la enfermedad (Zheng, Du, and Miller 2007). No
obstante, otras investigaciones con ratones diabéticos inducidos por STZ han demostrado
mediante inmunohistoquímica y western blot que nNOS desempeña un papel importante en
proporcionar NO en las etapas iniciales de RD (Giove et al. 2009). Dentro de la
controversia en la fuente de NO, un estudio demostró que el número de células bipolares
nNOS positivas a las 12 semanas post tratamiento con STZ aumentó tres veces con respecto
a las condiciones controles. Además, ellos observaron cambios morfológicos,

29
principalmente en una disminución del grosor de la retina después de iniciada la diabetes,
pudiendo ser un indicador de neurodegeneración retiniana gatillada por nNOS (J. Park et al.
2006). Cuáles son las isoformas de NOS que estén involucradas en este proceso, y los
mecanismos moleculares que lo subyacen, sigue siendo materia de discusión. Faltan
estudios asociados al daño directo en neuronas ya que, como se mencionó anteriormente, la
RD es una enfermedad vascular que presenta daños neurodegenerativos antes de ser
observado cambios vasculares en la retina.

Actualmente, los tratamientos para la RD incluyen diversos tratamientos con péptidos,

fármacos e inhibidores de factor de crecimiento endotelial vascular, mediante inyecciones
altamente invasivas y dolorosas que, hasta la fecha, es el primer tratamiento eficaz que hay.
Es sumamente necesario desarrollar tratamientos efectivos para poder revertir la RD,
sobretodo en sus primeras etapas, para ello es importante comprender los mecanismos que
subyacen este desbalance metabólico producido por el efecto de hiperglicemia crónica. El
uso de inhibidores de NOS o de antioxidantes podrían ser alternativas para mejorar el
funcionamiento de la retina en la retinopatía diabética.

Uso terapéutico de flavonoides e inhibidores de NOS

Al ser el estrés oxidativo un factor importante en la fisiopatología de la RD, la terapia con

antioxidantes se considera beneficiosa para poder prevenir el daño en la retina. Un estudio
reportó que una dieta rica en flavonoides estaba relacionada a una reducción de la
prevalencia de RD en pacientes diabéticos en una 30% (Mahoney and Loprinzi 2014).
Otros estudios han descubierto que el tratamiento con flavonoides fue capaz de eliminar
radicales libres y estableció mecanismos de defensa, a través de las enzimas superóxido
dismutasa, glutatión y catalasa, evitando el desarrollo de RD (Dene et al. 2005). Los
flavonoides son compuestos bioactivos que poseen anillos aromáticos que contienen grupos
hidroxilo (Kumar and Pandey 2013). Se han asociado que su capacidad antioxidante está
relacionada con su estructura química, principalmente por el número y posiciones de los
grupos hidroxilo, ya que aceptan electrones provenientes de ROS para formas radicales
fenoxilo estables (Ola, Al-dosari, and Alhomida 2018).

30
En Chile existe una gran diversidad de plantas utilizadas por nuestros antepasados con
propiedades curativas y que hasta el día de hoy se siguen utilizando. Dentro de ellas, el
árbol de boldo (Peumus boldus) es una de las más usadas y cuyas propiedades se siguen
estudiando (Yeh Siiang Lau et al. 2015; Jang et al. 2000; Hernández-salinas et al. 2013; Yi
et al. 2017). El principal compuesto activo del boldo, la boldina ((S)-2,9-dihidroxi-1, 10-
dimetoxiaporfina) corresponde a un flavonoide alcaloide encontrado en las hojas y la
corteza del boldo y, en investigación, se ha utilizado como un posible bloqueador de
hemicanales en células gliales (Yi et al. 2017), además de atribuirle propiedades anti
inflamatorias (Backhouse et al. 1994), antioxidantes (Yeh Siiang Lau et al. 2015) y
protectoras de daño mitocondrial (Jang et al. 2000). Por otro lado, inhibidores de NOS han
sido utilizados para reducir los niveles de NO en animales diabéticos (Guthrie, Osswald,
and Kang-mieler 2014; Hernández-Ramírez et al. 2017); sin embargo, estas alternativas son
estudiadas principalmente a nivel de células endoteliales, sin tener en consideración la
circuitería neuronal de la retina. En consideración con lo anterior, más estudios son
necesarios para entender el funcionamiento y los mecanismos de moléculas terapéuticas en
condiciones patológicas sobre la retina, por lo que consideramos el uso de la boldina y L-
NAME (N omega-nitro-L-arginina metil ester hidrocloruro), un inhibidor no selectivo de
NOS, para realizar este estudio.

31
 Planteamiento del problema

Como se ha descrito anteriormente, en la RD, se generan cambios en las neuronas de la

retina antes de que exista un daño vascular aparente. Estos cambios podrían alterar células
de la retina interna e incluso hay evidencia de que podrían afectar directamente a los
fotorreceptores. Aún es materia de debate si estos cambios neuronales son causados por
daños microvasculares o si ocurren de manera independiente mediante un daño glucotóxico
directo. Por otro lado, aún no están claros los mecanismos que involucran la toxicidad
mediada por RNS, principalmente por acción de la molécula oxidante peroxinitrito, y si
éstos son claves en la patogénesis de la RD. Por lo tanto, entender los mecanismos que
involucran la toxicidad mediada por RNS y peroxinitritos debe seguir siendo investigada.
Frente a todos los antecedentes, proponemos un modelo ex vivo para estudiar la
neurotoxicidad de la glucosa usando explantes de retina, proporcionando de manera
controlada y reproducible las condiciones experimentales. Todo ello con el fin de establecer
una relación entre la viabilidad y la presencia de moléculas inflamatorias relacionadas a
estrés celular y nitrosativo.

32
 Hipótesis

Altas concentraciones de glucosa afectan negativamente la viabilidad celular, a través de la

sobreproducción de NO y peroxinitritos, produciendo un daño irreversible en la retina. De
esta manera, el uso de antioxidantes e inhibidores de NOS son capaces de reducir la muerte
celular en explantes de retina de rata.

Objetivo General

Establecer una relación entre la exposición a altos niveles de glucosa, el uso de

antioxidantes y de inhibidores de NOS en la viabilidad celular y la expresión de marcadores
de estrés oxidativo en explantes de retina.

Objetivos específicos

1) Determinar si altos niveles de glucosa generan cambios morfológicos en explantes

de retina de 1 y 2 semanas de cultivo.
2) Confirmar la relación entre la exposición de altos niveles de glucosa y la viabilidad
celular en explantes de retina de 1 y 2 semanas de cultivo.
3) Evidenciar que la exposición de altos niveles de glucosa favorece un ambiente
inflamatorio y de estrés nitrosativo en explantes de retina de 1 y 2 semanas de
cultivo.
4) Evaluar el efecto de la molécula clorhidrato de boldina y de L-NAME en la
viabilidad celular y estrés nitrosativo en explantes de retina de 1 y 2 semanas de
cultivo.

33
 Metodología

Animales

Se usaron ratas Sprague Dawley sanas de 14 días de edad. Los animales nacieron y se
criaron en la instalación de animales de la Universidad de Valparaíso, mantenida a 20-25 °
C bajo un fotoperíodo de 12 horas con agua y comida a voluntad. Los protocolos
experimentales fueron aprobados por el comité de bioética de la Universidad de Valparaíso
y de conformidad con la ley chilena de protección animal No. 20.380.

Cultivos organotípicos

Los cultivos organotípicos de retina han sido preparados a partir de diferentes animales y
aplicados de manera exitosa en varios estudios (Ames 3rd and Nesbett 1981; Smalheiser
1981; Smalheiser, Crain, and Bornstein 1981; Kaempf et al. 2008; Lecleire-Collet et al.
2005). Los cultivos de retina provienen de ratas sanas y son útiles para simular condiciones
diabéticas por adición de glucosa en los medios de cultivo (Valdés et al. 2016; Matteucci et
al. 2015), permitiendo tener las concentraciones de glucosa controladas. Otra de las
ventajas es que mantiene la circuitería neuronal intacta a diferencia de cultivos celulares
por ejemplo, y no se dispone del componente vascular, lo cual facilita el estudio del efecto
directo de la glucosa sobre las células neuronales en la retina.

Los explantes en roedores han sido utilizados satisfactoriamente para estudiar diferentes
enfermedades de la retina, y han demostrado ser un modelo útil en la caracterización de
mecanismos de muerte celular y pruebas farmacológicas de drogas (Bujakowska et al.
2009; Paquet-Durand et al. 2009; T. V Johnson and Martin 2008), también como medición
de funciones celulares con la técnica de patch clamp (Pollak et al. 2013; Vallazza-
Deschamps et al. 2005), y generación de ROS después de irradiación con luz azul
(Roehlecke et al. 2011). Para este proyecto los explantes serán obtenidos de ratas porque la

34
retina de estos animales ha mostrado ser más susceptible a la alta glicemia que la retina de
ratón (Obrosova et al. 2006). Para ello, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano (Abbott)
y se sacrificaron por decapitación. Los ojos se retiraron asépticamente bajo un microscopio.
Para aislar la retina, se eliminó cuidadosamente el segmento anterior, el humor vítreo y la
esclera. Las retinas se cortaron en 4 partes, y se cultivaron de manera independiente, para
ello, las retinas fueron depositadas con la capa de fotorreceptores mirando hacia los insertos
de cultivo (Millicell, PIHA03050, Merck) en placas de cultivo celular con 2 ml de medio de
cultivo DMEM con suero fetal bovino al 10% (Sigma-Aldrich). Para la condición de
glucosa moderada (GM) se utilizaron 15 mM y en alta glucosa (AG) 30 mM glucosa. En
ratas, los valores de glucosa en sangre son de 5 mM, sin embargo, en nuestro laboratorio
hemos demostrado que una concentración de 15 mM es necesaria para el mantenimiento de
los explantes de retina en el tiempo. Una vez cultivados los explantes se da un período de
adaptación de 48 horas a los explantes, y posterior a ello, se agregan los medios utilizados
en este estudio. Las moléculas utilizadas en este estudio son boldina (antioxidante), L-
NAME (inhibidor NOS), SIN-1 (dador de especies oxidativas). Cada pieza de retina tuvo
una de las siguientes condiciones: 15 mM; 15 mM + boldina (100 uM); 15 mM + SIN-1 (10
uM), 15 mM + SIN-1 + boldina; 30mM; 30 mM + boldina (100 uM); 30mM + L-NAME
(1mM). El medio fue reemplazado todos los días. Los explantes fueron incubados a 37 ° C
en 5% de CO2 y 95% de humedad durante 7 a 14 días en una incubadora con camisa de
agua (Thermo Scientific).

Histología

Los explantes de retina fueron sumergidos en paraformaldehído al 4% durante 3 h, y

posteriormente lavados en tampón PBS (pH 7,4) y se mantuvieron a 4 ° C. 24 horas antes
de realizar los cortes, los explantes fueron criopreservados en un gradiente de 15% y 30%
de sacarosa consecutivamente. Las muestras fueron embebidas en medio de congelación de
tejidos (Tissue-Tek, Sakura Finetek), y se obtuvieron secciones transversales de 20 µm en
criostato (Leica CM-1900). Los cortes fueron montados en portaobjetos previamente
tratados con poli-L-lisina. Las rodajas fueron teñidas con azul de toluidina 1% durante 10
minutos y lavadas durante otros 10 minutos. Las imágenes fueron obtenidas con un

35
microscopio confocal (Nikon C1 plus) en transmisión. Las imágenes se analizaron con los
programas EZ-C1 Freeviewer (Nikon) e ImageJ.

Microscopía electrónica de transmisión (MET)

Los explantes de retina de rata de 1 semana fueron fijados en solución de Karnovski (2,5%
de glutaraldehído en buffer cacodilato 0,1M) por 1 hora, luego las retinas fueron lavadas en
buffer cacodilato 0,1M y luego inmersas en osmio reducido por 2 horas. Después se realizó
una deshidratación en un gradiente de alcoholes y fueron embebidas en resina epóxica. Los
tacos de resina con la muestra embebida se le realizaron cortes transversales ultrafinos de
70 nm, fueron montados en gradillas de cobre y teñidos con citrato de plomo y acetato de
uranilo y fueron vistas en el microscopio electrónico de transmisión JEM1400 a 80-120 kV.

Inmunohistoquímica

Los cortes de retina fueron rehidratados con PBS, luego fueron incubados por 1 h en
solución de bloqueo que contenía 1% de BSA, 1% de suero de caballo y 0,3% de Triton X-
100 en PBS. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti rabbit iNOS 1:100
(Invitrogen Cat # PA1-036, RRID: AB_10013382), anti rabbit nNOS 1: 250 (ThermoFisher
Scientific Cat # 37-2800, RRID: AB_2533308), y para estudiar el efecto del estrés
nitrosativo se utilizó anti rabbit N-Tyr 1: 100 (Invitrogen Cat # A-21285). Los anticuerpos
primarios fueron diluidos en solución de bloqueo y fueron incubaron durante la noche a 4 °
C en cámara húmeda. Los cortes fueron lavados en PBS e incubados durante 1 hora a
temperatura ambiente en el anticuerpo secundario, anti rabbit Alexa Fluor 488 1: 1000.
(Thermo fisher scientific Cat # A11034, RRID: AB_2576217). Los cortes fueron teñidos
con DAPI 0,25 µg/ml por 10 minutos y fueron montados en medio de montaje para
fluorescencia (Dako Industries, Carpenteria, CA, EE. UU.). Las imágenes fueron obtenidas
en microscopio confocal (Nikon C1 plus) y los análisis se realizaron en el programa
ImageJ.

Ensayo TUNEL

36
El kit de marcado de final de corte de desoxinucleotidil transferasa (TUNEL) (Roche
Diagnóstico) fue utilizado para la detección de células muertas en explantes de retina de
rata. Los cortes de retina fueron rehidratados con PBS y permeabilizados durante 30
minutos con Triton X-100 al 0,3%, citrato de sodio al 0,1% en PBS. Luego, la reacción
TUNEL se realizó durante 1 hora a 37 ° C según las indicaciones del fabricante. Los cortes
fueron lavados en PBS y teñidos con DAPI 0,25 µg/ml. Finalmente, fueron montados en
medio de montaje para fluorescencia. Las imágenes fueron obtenidas en microscopio
confocal (Nikon C1 plus). El análisis consistió en contar núcleos TUNEL positivos para
cada capa nuclear de la retina en un área definida (120x120 µm).

Análisis Estadístico

Los datos utilizados para el análisis estadístico fueron testados con la prueba de Shapiro-
Wilk para evaluar la distribución de los datos. En los análisis de fluorescencia, la
significación estadística fue determinada con la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la
prueba post hoc de Dunn usando el programa Graph Pad Prism, con una diferencia
significativa definida como p <0,05. Los resultados se muestran como la media ±
desviación estándar (DE).

37
 Resultados

La exposición prolongada a altos niveles de glucosa produce cambios morfológicos en la

retina y en sus mitocondrias

Se logró obtener cultivos organotípicos de retina de rata hasta 2 semanas de cultivo en

medio de 15 mM y 30 mM (Fig 1). No se observó desorganización morfológica de las
capas de la retina en ninguna de las dos condiciones, sin embargo, un adelgazamiento
progresivo del grosor de las capas de la retina fue evidente en la condición de explantes con
respecto a la retina control (ex vivo) (Fig 1a, c, e). En condiciones AG, se observó una tasa
de adelgazamiento gradual y significativamente mayor que en condiciones de GM, tanto en
el largo total como en las capas plexiformes, siendo la OPL la capa de la retina que fue más
afectada (Fig 1b). El grosor de la retina fue dramáticamente reducido durante la primera
semana de cultivo (Fig 1b, d). Las capas nucleares también sufrieron una reducción
significativa de su grosor en condiciones de AG. Estudios comparativos entre explantes de
retina de ratón y rata han establecido que el modelo de rata parece ser más susceptible a las
diferencias de concentración de glucosa (Calbiague et al. 2019). Si bien se observa que la
OPL es la capa más afectada, también la IPL sufre una drástica disminución con el paso del
tiempo, lo que estaría indicando que la exposición a altas concentraciones de glucosa podría
tener un efecto no sólo en la retina externa, sino que también, en la retina interna. El
adelgazamiento de la retina es un fenómeno que ha sido descrito anteriormente y puede
deberse principalmente porque el tejido se encuentra fuera de su condición fisiológica
(Rettinger and Wang 2018), sin embargo, la disminución del grosor de la retina en
condiciones de AG podría indicar un efecto glucotóxico y un cambio en las conexiones
sinápticas por el progresivo adelgazamiento de las capas plexiformes, sitio donde ocurre
sinapsis y acoplamiento eléctrico entre los distintos tipos celulares.

38
Figura 1. Análisis comparativo en cultivos organotípicos de retinade rata cultivados hasta por 2
semanas (a-f). Imágenes representativas de criosecciones de retina teñidas con azul de toluidina
0.1% (a, c, e) en 15mM (GM) y 30mM (AG) de glucosa. La morfología de la retina se conserva en
los explantes de retina, sin embargo, un evidente adelgazamiento de las capas de la retina es
afectado en el transcurso del tiempo en que las retinas son cultivadas (b), siendo las capas
plexiformes OPL e IPL las más afectadas tanto en la primera (d) como la segunda semana de
cultivo en AG (f). Los asteriscos representan diferencias significativas en los análisis de grosor de
las capas de la retina en explantes comparados con la retina control ex vivo (b, d, f). Barras: ± DS.
Escala: 50 µm, aplicada en todas las imágenes. * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001.
Abreviaciones: TT total thickness, ONL outer nuclear layer, OPL outer plexiform layer, INL inner
nuclear layer, IPL inner plexiform layer, GCL ganglion cell layer. N 7 d= 5, N 14 d=3.

Una vez observado este incremento en el adelgazamiento de las capas de la retina por la
exposición de altas concentraciones de glucosa, sobre todo en la primera semana de cultivo,
decidimos estudiar si la AG genera un cambio morfológico a nivel mitocondrial en el día 7

39
de cultivo. En condiciones patológicas, como la exposición prolongada de AG sobre la
retina, se podría generar la sobreproducción de RNS a nivel celular y producir la activación
de vías de NO no canónicas (Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas 2011). Dentro de ellas, la
unión de NO en los centros mitocondriales de la CcO, en la matriz mitocondrial podría
generar la inhibición de la enzima (Martínez-ruiz, Cadenas, and Lamas 2011), o bien, la
presencia de peroxinitrito, podría disminuir de forma irreversible la afinidad de la CcO con
el O2, alterando la dinámica mitocondrial (Cooper et al. 2003). Es por ello, que, mediante
MET, estudiamos la morfología de las mitocondrias en los segmentos internos de los
fotorreceptores, lugar donde se concentran las mitocondrias.

Se observaron diferencias a nivel ultraestructural en la morfología de las mitocondrias entre

los explantes de rata en condiciones GM y AG (Fig 2). Las mitocondrias, en estado
fisiológico, tienen una morfología alargada, y también, son capaces de fusionarse para
formar una red mitocondrial en la célula. En nuestra condición control (GM) se observaron
mitocondrias con forma alargada, a su vez, se observaron las crestas mitocondriales, que
son los repliegues internos y donde se encuentran variedades de citocromos en la
mitocondria. Sorprendentemente, bajo una exposición de AG se evidenció un cambio en la
forma mitocondrial, presentando un tamaño reducido con respecto a GM y con una
anatomía redondeada. Se analizaron más de 1200 mitocondrias del SI de los fotorreceptores
y se realizó un radio entre el ancho y el largo de cada mitocondria: mientras más cerca
estuviera el valor a 1 significa que la mitocondria tiene una forma circular. El análisis
demostró que en condiciones de AG las mitocondrias tienen una forma redonda, a
diferencia de condiciones de GM, cuya forma es alargada (Fig 2b), sin embargo, el análisis
del ancho de mitocondrias no muestra diferencias significativas (Fig 2c). Este cambio en la
morfología de la mitocondria, producto de una exposición a AG, podría sugerir una
respuesta de este organelo frente al exceso de glucosa en la célula, produciendo un daño
que afectaría el metabolismo celular de los fotorreceptores de la retina.

40
Figura 2. Análisis ultraestructural de las mitocondrias de fotorreceptores. Mediante TEM se
obtuvieron imágenes de retinas expuestas a MG y HG (a). Se observaron diferencias morfológicas
en las mitocondrias en las dos condiciones de estudio. El análisis de largo/ancho de las mitocondrias
indican una diferencia significativa en las condiciones HG (b), siendo esta diferencia dada
principalmente por el largo de las mitocondrias, ya que, el análisis del ancho de las mitocondrias no
arroja diferencias significativas tanto en MG y HG (c). Las barras representan ± DS. Barra: 1 µm,
inset 0.5 µm. *** p < 0,001. N=1

La muerte celular es incrementada por la exposición a altas concentraciones de glucosa

De acuerdo a los resultados publicados por Calbiague et al 2019, mediante ensayo TUNEL
se pudo determinar que existe un aumento significativo de la muerte celular en condiciones
de AG con respecto a GM en explantes de retina de rata cultivadas por dos semanas
(Calbiague et al. 2019). Es por esto, que se decidió incorporar más condiciones de estudio
con el fin de establecer con mayor exactitud si la muerte observada corresponde realmente
a un daño oxidativo producido por RNS. Para ello, agregamos una condición de GM con

41
SIN-1, molécula capaz de liberar tanto NO como el anión superóxido, por lo tanto,
funciona bien como dador de peroxinitritos en condiciones fisiológicas. A su vez, quisimos
estudiar si las moléculas de boldina y L-NAME son capaces de revertir el efecto
ocasionado por la exposición a altas concentraciones de glucosa. Como se describió
anteriormente, la boldina se ha estudiado tanto como un antioxidante y también como un
bloqueador de hemicanales en diferentes tejidos y L-NAME es un inhibidor no selectivo de
NOS que también ha sido utilizado en diversas investigaciones.

En el ensayo TUNEL se confirmó que hubo muerte celular en la retina tanto a la primera
como a la segunda semana de cultivo. Para poder corroborar que las marcas eran núcleos
apoptóticos, se realizó una marcación con DAPI, cuya unión de la molécula es en las
adenina-timina del ADN, marcando núcleos exclusivamente núcleos (Fig 3). Además, se
pudo observar un aumento significativo en el número de células positivas para TUNEL en
la capa ONL, lugar donde se encuentran los somas de los fotorreceptores, con respecto a la
INL y GCL (Fig 3 b, c). La muerte celular fue mayor en la primera semana de cultivo (Fig
3 b), y tanto en la primera como en la segunda semana, se observó un número
significativamente mayor de células TUNEL positivas en las condiciones AG y
15mM+SIN-1 (Fig 3 b), sugiriendo que la muerte celular estaría relacionada a un daño
nitrosativo por la presencia de peroxinitritos. Un resultado similar fue obtenido en la GCL,
donde la condición de AG tuvo un incremento en la muerte de células ganglionares a la
segunda semana de cultivo con respecto a las otras condiciones (Fig 3 c). Por otro lado, no
se observaron diferencias significativas en la tasa células TUNEL positivas para la INL,
lugar donde se ubican células bipolares y amacrinas (Anexo 1). El uso del inhibidor de
NOS, L-NAME, y la boldina lograron reducir la muerte celular tanto en los fotorreceptores
como en las células ganglionares, generando una disminución en la apoptosis en presencia
de AG y SIN-1 (Fig 3 b,c).

En relación con todo lo anterior, se pudo observar un aumento significativo en la muerte

celular en condiciones de AG que afectó principalmente a los fotorreceptores y que estaría
vinculado con un ambiente oxidante, principalmente nitrosativo, por la presencia de SIN-1.
La boldina y L-NAME fueron capaces de revertir este efecto, disminuyendo la apoptosis en
los fotorreceptores, lo que estaría sugiriendo que la boldina podría ser un quelante de RNS

42
y que en conjunto con la inhibición de NOS podrían mantener el balance
oxidante/antioxidante.

43
44
Figura 3. Ensayo TUNEL en explantes de retina de rata cultivados hasta dos semanas. Núcleos
marcados en verde confirman la muerte celular (a). Un aumento de muerte celular es observado
principalmente en ONL y presentó diferencias significativas en condiciones de AG y SIN-1. En
presencia de boldina y L-NAME se observa que el número de células TUNEL positivas son
similares a MG (b). En condiciones de AG se observó que en GCL tiene un aumento significativo
en el número de células muertas a las 2 semanas de cultivo (c). Las barras representan ± DS. Barra:
50 um. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. N=5.

Altas concentraciones de glucosa favorecen el estrés nitrosativo

La 3-nitrotirosina (N-Tyr) es un producto estable formado por la reacción de la molécula

peroxinitrito con el aminoácido tirosina, esta reacción es carácter irreversible y trae como
consecuencias la inactivación o pérdida de función de las proteínas (Martínez-ruiz,
Cadenas, and Lamas 2011). El inmunomarcaje de N-Tyr mostró una marca que se extiende
en toda la retina (Fig 4a). Un aumento en la intensidad de fluorescencia promedio se
evidenció a la primera semana con respecto a la segunda semana de cultivo, sin embargo,
en ambos casos se observa un aumento significativo en la fluorescencia en explantes de
retina de rata bajo las condiciones de SIN-1 y AG (Fig 4 b-c), lo que confirmaría la
presencia de estrés nitrosativo y daño celular por modificación proteica en condiciones de
AG (Fig 4 a-c). Coherente con los resultados anteriores, se confirmó que el uso de boldina
funcionaría como un quelante de especies oxidantes, ya que mostró una disminución de la
fluorescencia cuando se encuentra en presencia de SIN-1, un dador de peroxinitritos. De la
misma manera, la inhibición de NOS, a través del uso de L-NAME mostró una disminución
de la fluorescencia, llegando a valores similares a los de GM, por lo tanto, el uso de boldina
y L-NAME por separado podrían ser sugeridos como posibles moléculas terapéuticas.

45
46
47
Figura 4. Expresión de estrés nitrosativo en explantes de rata cultivados hasta 2 semanas. El
inmunomarcaje de 3-nitrotirosina (N-Tyr) mostró un aumento significativo de la fluorescencia en
toda la retina a la primera semana de cultivo bajo condiciones de HG y SIN1 (a) y también en la
segunda semana de cultivo. Después de dos semanas de cultivo se observa una marca en los IS bajo
las condiciones de HG y SIN-1 (b). La presencia de boldina es capaz de revertir el estrés nitrosativo
frente a condiciones de HG (b, c), confirmado por una diferencia significativa en la intensidad de
fluorescencia a la primera (b) y segunda semana de cultivo (c). Escala 50 µm. Barras de error: ±
DS. * indica p < 0,05; ** indica p < 0,01; *** indica p < 0,001.

La exposición prolongada a alta glucosa propicia un ambiente inflamatorio y un

aumento de NO proveniente de iNOS en explante de retina

Una vez confirmada la presencia de estrés nitrosativo en explantes de retina en condiciones

de AG de 1 y 2 semanas de cultivo, buscamos la fuente de NO para la sobreproducción de
peroxinitritos. El modelo de cultivos organotípicos tiene como ventaja el estudiar el efecto
neurotóxico de la exposición de altas concentraciones de glucosa directamente sobre la
circuitería retinal sin tener el componente vascular, es por ello, que en este caso no se
estudió eNOS, isoforma que se encuentra principalmente en células endoteliales de los
vasos sanguíneos.

Se realizaron inmunohistoquímicas para nNOS y iNOS (Fig 5 y 6). En rata, nNOS está
distribuida principalmente en células amacrinas tipo NOAC, algunas células bipolares y
ganglionares (Agurto et al. 2017). En el inmunomarcaje contra nNOS, se evidenció la
presencia de células NOAC positivas en todas las condiciones de estudio (Fig 5). Luego se
cuantificaron los números de células nNOS positivas para INL (Fig 5 b-c) y GCL (Fig 5 d-
e), donde se encuentran las células bipolares y amacrinas tipo NOAC para INL y células
ganglionares en GCL. No se encontraron diferencias significativas en el curso temporal, en
las condiciones oxidantes (SIN-1 y AG) ni en presencia de boldina y L-NAME (Fig 5 b-e),
lo que sugiere que en condiciones de AG la sobreproducción de NO no proviene de nNOS.

48
49
Figura 5. Expresión de nNOS en explantes de rata cultivados hasta 2 semanas. La fuente de NO fue
determinada mediante inmunohistoquímica para nNOS (a-e), marcándose en verde las células
amacrinas tipo NOAC, principales productoras de NO en la retina. No se observaron diferencias
significativas en células nNOS positivas ni en la primera ni segunda semana de cultivo en INL (b, c)
ni GCL (d, e). Escala 50 µm. Barras de error: ± DS.

La isoforma iNOS se encuentra expresada en células inmunes y en condiciones

inflamatorias. La inmunohistoquímnica de iNOS en explantes de retina mostró la misma
tendencia que en el marcador de N-Tyr (Fig 4): un aumento significativo en la intensidad
de fluorescencia en presencia de SIN-1 y AG fue evidente en la semana 1 y 2 de cultivo
(Fig 6 a-c), siendo observada una mayor expresión en las capas plexiformes en las
condiciones de AG, sin embargo, la fluorescencia fue vista también en los segmentos

50
internos de los fotorreceptores. Esto sugiere que la sobreproducción de NO podría dañar
directamente la red mitocondrial y alterar su morfología, tal como se observó en la Fig 2.
Nuestros resultados apoyan la idea de estudios que demuestran que la hiperglicemia gatilla
la activación de procesos inflamatorios, mediante la sobreexpresión de iNOS (Zheng, Du,
and Miller 2007).

Varias investigaciones han sugerido que la boldina podría actuar como un antioxidante,
nuestro estudio apoya esta idea, ya que la presencia de 100 µM de boldina en el medio de
cultivo fue capaz de mantener los niveles de fluorescencia similares a los explantes bajo
GM, tanto en la primera (Fig 6 b) como en la segunda semana de cultivo (Fig 6 c). El rol
del inhibidor de NOS, L-NAME, corroboró la disminución de la actividad inflamatoria
hasta las 2 semanas de cultivo mediante la inhibición de la sobreproducción de NO (Fig 6
b-c).

Por lo tanto, los explantes de retina expuestos a AG generan estrés nitrosativo confirmado
por el aumento de la fluorescencia de N-Tyr, además favorece un ambiente inflamatorio por
el aumento de la expresión de iNOS, esta sobreexpresión produce un aumento de NO y, a
su vez, favorece la producción de peroxinitritos. La presencia de un ambiente altamente
oxidante e inflamatorio causado por AG sugiere un daño irreversible que afecta
principalmente a los fotorreceptores, activando vías que gatillas muerte celular por
apoptosis.

51
52
53
Figura 6. Expresión de iNOS en explantes de rata cultivados hasta 2 semanas. La fuente de NO
proviene de iNOS (a-c). Se observó un aumento significativo bajo condiciones de cultivo HG y
SIN1 en la primera (b) y segunda semana de cultivo (c). Al igual que en el marcaje de 3-
nitrotirosina (Fig 4), la boldina y L-NAME son capaces de revertir los niveles de iNOS en
condiciones de HG. Escala 50 µm. Barras de error: ± DS. * indica p < 0,05; ** indica p < 0,01; ***
indica p < 0,001.

54
 Discusión

Comprender los mecanismos que subyacen la patogénesis de la RD y que afectan

directamente a la función retinal es de suma importancia para el desarrollo de terapias y
mecanismos neuroprotectores (Tomlinson and Gardiner 2008). Es por ello, que el modelo
de cultivos organotípicos de retina ofrece la ventaja de estudiar el efecto glucotóxico sobre
la red neuronal en la retina, manteniendo las concentraciones de glucosa controladas y
eliminando el componente vascular. En general, los estudios que abarcan la patogénesis de
la RD sólo se centran en el efecto de la hiperglicemia sobre pericitos y células endoteliales;
sin embargo, se ha demostrado que hay un proceso de neurodegeneración retiniano antes de
que sean evidentes los cambios vasculares (Bearse et al. 2004, 2006). Por lo tanto, es
importante entender el efecto neurotóxico de la glucosa sobre las neuronas de la retina.

Hay diversas investigaciones que han demostrado diferencias morfológicas en la RD,

principalmente en capilares acelulares y pericitos fantasmas en la retina de animales
diabéticos (Zheng, Du, and Miller 2007), sin embargo, se ha llegado a la conclusión que,
dentro de los cambios más característicos, el grosor de la retina sería un fuerte indicador de
degeneración retiniana (Rettinger and Wang 2018). En este estudio, se observó un
adelgazamiento significativo en el largo total de la retina, esto ya ha sido previamente
documentado tanto en animales como en explantes (Zhu et al. 2015; Rettinger and Wang
2018); no obstante, en condiciones de AG se observó un adelgazamiento mayor de las
capas, siendo la OPL e IPL las capas más afectadas, similar a los estudios realizados por
Zheng et al 2007, que observaron una diferencia considerable en el largo total, OPL, IPL y
GCL en ratones wild type diabéticos inducidos por STZ (Zheng, Du, and Miller 2007).
Otras investigaciones han confirmado una reducción en la ONL en etapas avanzadas de la
RD, lo que indica la degeneración de las células fotorreceptoras (J. Park et al. 2006).
Estudios en humanos utilizando tomografía de coherencia óptica (TCO), han demostrado el
adelgazamiento de la retina interna (Tan et al. 2020) e incluso se ha logró establecer una
relación entre el adelgazamiento de la IPL y GCL con una disminución en la densidad de
vasos sanguíneos en pacientes diabéticos que aún no poseen RD (K. Kim et al. 2019). En
síntesis, este adelgazamiento observado en las capas plexiformes podría ser perjudicial para

55
la circuitería de la retina, ya que es en ese lugar, donde ocurre la interconexión entre
neuronas y los balances excitatorios/inhibitorios, lo que podría sugerir que la exposición a
altos niveles de glucosa podría reducir las conexiones sinápticas entre las neuronas,
produciendo un daño retinal directo y de esta forma alterar la función de la retina.

Otro cambio morfológico observado fue la diferencia de la forma de las mitocondrias en los
SI de los fotorreceptores en condiciones de GM y AG, observándose en, exposición de
concentraciones altas de glucosa, una morfología mitocondrial redondeada e inferior en
tamaño con respecto a retinas cultivadas con GM. Es importante considerar que los ángulos
de cortes realizados en la microscopía electrónica son críticos para poder realizar análisis
morfológicos, lo que podría significar que éste sea un factor que influya en este resultado,
por lo que es importante realizar más ensayos. Basándonos en la literatura, se analizó el
largo y el ancho de 1200 mitocondrias y se estableció un radio, observando diferencias
significativas en condiciones de alta glucosa. Luego, se realizó un análisis del ancho de las
mitocondrias que no arrojó diferencias significativas, lo que sugiere que el largo es lo que
se ve afectado en condiciones alta glucosa.

Hasta la fecha, hay múltiples estudios que confirman que la disfunción mitocondrial genera
apoptosis, y que ambos procesos son mecanismos que podrían estar involucrados en la
patogénesis de la RD (Sahajpal et al. 2018). Yu et al 2006 demostró mediante microscopía
de fluorescencia, que en condiciones de AG aumentan las especies reactivas de oxígeno
(ROS) y generan un cambio en la morfología mitocondrial en la línea celular de mioblastos
de rata H9c2, sugiriendo que un aumento en la tasa de respiración celular, produce el
aumento de ROS, producto de las elevadas concentraciones de glucosa y que esto podría
ser un evento temprano en la célula que induce una fragmentación en las mitocondrias,
formando un desbalance irreversible en la dinámica de fisión/fusión de la red mitocondrial
(Yu, Robotham, and Yoon 2006). De esta manera, los cambios morfológicos en la
mitocondria podrían indicar una respuesta frente a los altos niveles de glucosa en la célula,
que trae como consecuencia un daño mitocondrial. Esto podría deberse ya sea por
inhibición de CcO, u otros mecanismos, que conlleva a una variedad de efectos que varían
desde la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial hasta el control de la

56
apoptosis y la generación de ROS (Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas 2011). Son
necesarios más estudios para confirmar esto, sin embargo, experimentos con la sonda
DCFH usada in vivo en explantes de retina han mostrado un aumento de ROS proveniente
principalmente de SI de los fotorreceptores en condiciones de AG y SIN-1 (Anexo 2). El
mismo resultado fue obtenido con el uso de otra sonda, MitoSOX®, apoyando el resultado
obtenido con DCFH en condiciones de AG y SIN-1. MitoSOX® es una sonda que se oxida
rápidamente con el anión superóxido proveniente de la mitocondria en condiciones in vivo,
lo que permite visualizar la sobreproducción de especies oxidantes en la mitocondria, lo
que podría asociarse a daño en condiciones patológicas (Anexo 3). Hay suficiente
evidencia que apoya estos resultados, demostrando el aumento de estrés oxidativo en
diferentes células de la retina (Du et al. 2003; Hernández-Ramírez et al. 2017), incluso se
ha mencionado, mediante estudios con análisis morfológicos, sondas, inmunohistoquímica
e inmunoblot, a los fotorreceptores como los mayores productores de anión superóxido
generado en la retina en modelos de diabetes inducido por STZ (Y Du et al. 2013; Tonade,
Liu, and Kern 2016), que podría explicar el aumento de la muerte de los fotorreceptores
obtenidos mediante ensayo TUNEL en condiciones de AG y SIN-1 en este estudio (Fig 3).

La muerte neuronal en la retina inducida por diabetes ha sido también documentada

anteriormente (Valdés et al. 2016; S. Park et al. 2003). Existe evidencia que antes de
observarse la muerte de los fotorreceptores, ocurren una serie de cambios morfológicos,
tales como la degeneración de los segmentos externos y cambios en la distribución de las
opsinas (Énzsöly et al. 2014). Esto nos podría sugerir que, frente a la exposición de niveles
elevados de glucosa, se producen alteraciones moleculares que podrían gatillar la apoptosis
y que alteran directamente la función retinal. Según los resultados obtenidos, los
fotorreceptores son las neuronas más afectadas en condiciones de AG, coherente con la idea
que ha tomado fuerza en los últimos años: los fotorreceptores podrían ser los principales
contribuyentes en el desarrollo de la RD (Yunpeng Du et al. 2013; Kern and Berkowitz
2015). Sin embargo, los mecanismos que gatillan estas anormalidades aún no están bien
entendidos (Tonade, Liu, and Kern 2016). El daño y la muerte en los fotorreceptores podría
explicar los síntomas oculares que presentan los pacientes con RD, tales como el deterioro
de la visión de colores (Simó, Stitt, and Gardner 2018; B. E. Wolff et al. 2020), un déficit

57
en la agudeza y contraste visual (Aung et al. 2013), que estaría vinculado principalmente a
estas células.

La importancia de los fotorreceptores en la función retinal es primordial, ya que son los

encargados de realizar el proceso de fototransducción, por lo tanto, tienen una gran
demanda metabólica, y para ello requieren de una gran cantidad de mitocondrias. Se estima
que tienen al menos el 75% de todas las mitocondrias retinales, ubicadas principalmente en
el SI (Tonade, Liu, and Kern 2016). En condiciones fisiológicas las especies oxidantes
pueden ser rápidamente neutralizadas por mecanismos enzimáticos, tales como, catalasas,
superóxido dismutasa, glutatión, vitamina C, entre otros (Zheng et al. 2009). Sin embargo,
en condiciones patológicas como la diabetes, se ha demostrado que existe una disminución
de enzimas antioxidantes (Zheng et al. 2009) generando un desbalance entre las especies
oxidantes/antioxidantes y, en consecuencia, provocar daños irreversibles en los
fotorreceptores que gatillarían la muerte celular.

Luego de observar una neurodegeneración por el efecto glucotóxico en explantes de retina,

confirmado por un adelgazamiento progresivo del grosor de la retina y la muerte celular
que afectó principalmente de los fotorreceptores, quisimos investigar si el estrés nitrosativo
estaba vinculado a este efecto. La producción de peroxinitritos implica la formación de
estrés nitrosativo en la célula (J. M. Souza, Peluffo, and Radi 2008). Nuestro trabajo
demostró que en condiciones de AG aumenta la expresión de 3-nitrotirosina en los
explantes de retina. Éste es un marcador que muestra la nitración proteica, correspondiente
a la adición de un grupo nitro a una tirosina para formar nitrotirosina (J. M. Souza, Peluffo,
and Radi 2008; Beckman and Koppenol 1996; Pál Pacher et al. 2005). Frente a un dador de
peroxinitritos, SIN-1, y AG se observó a la primera semana un aumento en la fluorescencia
en toda la retina, no obstante, a la segunda semana de cultivo, la fluorescencia se concentra
principalmente en los segmentos internos de la retina, sugiriendo un daño principalmente
en los fotorreceptores. Desde que se descubrió el peroxinitrito y nitrotirosina en los
sistemas biológicos, varios investigadores informaron que la incubación de varios tipos
celulares con peroxinitrito exógeno induce apoptosis o necrosis, dependiendo de la
concentración del oxidante, esto estaría mostrando que el peroxinitrito podría ser capaz de

58
activar rutas de señalización intracelular específicas para estimular la apoptosis en lugar de
sólo causar oxidación molecular inespecífica (Franco and Estévez 2014). Además, se ha
relacionado la sobreproducción de peroxinitritos con la causa de varias patologías
inflamatorias, autoinmunes y enfermedades neurodegenerativas (Ramdial, Franco, and
Estevez 2017; P Pacher, Beckman, and Liaudet 2007), esto se debe porque son capaces de
oxidar y dañar, no sólo proteínas, sino que también lípidos y ADN de manera inespecífica e
irreversible, gatillando muerte celular, tal como se ha dicho anteriormente.

Hasta el momento no hay certeza de qué tipo de proteínas son las más afectadas por la
acción de peroxinitritos, sin embargo, estudios realizados con inmunoprecipitación han
mostrado que las bandas de proteínas de la retina de animales diabéticos eran superiores a
los controles (Yunpeng Du et al. 2002). Por lo cual, la susceptibilidad a la nitración podría
variar de acuerdo con la estructura de la proteína, su abundancia en el citoplasma y la
cantidad de residuos de tirosina disponibles (M. Souza et al. 1999).

Aún queda mucho por entender acerca de los efectos que produce la generación de
peroxinitritos, sin embargo, se ha propuesto un par de mecanismos que gatillarían muerte
celular: uno es mediante la inactivación de la proteína de pro-supervivencia heat shock
protein 90 (Hsp90), cuyo cambio transformaría a la proteína en un ejecutor de la muerte
celular, a través de la activación de la vía P2X7/Fas(Franco and Estévez 2014; Ramdial,
Franco, and Estevez 2017). El otro mecanismo es mediante la activación de la poli-ADP-
ribosa polimerasa-1 (PARP-1), enzima que actúa como un sensor del daño a nivel de ADN.
Frente a un daño, la enzima comienza a unir los homodímeros e hidroliza NAD+ para
formar ADP-ribosa. La actividad de PARP-1 genera un a depleción de NAD+, lo cual
implica que se detiene la glicólisis, por lo tanto, no hay energía en la célula y se induce la
muerte celular (Szabó 1996).

La inactivación de proteínas producida por la nitración por peroxinitritos incluye una

diversidad de éstas, dentro de las cuales, hay varias que son de tipo antioxidante endógeno
en la célula, no obstante, una de las primeras proteínas que se descubrieron que eran
afectadas por acción de los peroxinitritos es la superóxido dismutasa de manganeso

59
(MnSOD) (Franco and Estévez 2014), una enzima endógena, localizada en la matriz
mitocondrial, cuya principal función es de defensa celular mediante la conversión de ROS
en peróxido de hidrógeno, que, finalmente, reacciona con las enzimas catalasa y glutatión
peroxidasa para formar agua (Mikhak et al. 2008). La nitración por parte de los
peroxinitritos sobre esta enzima sería perjudicial para mantener el balance
oxidante/antioxidante, ya que comenzaría a acumularse ROS en la mitocondria, lo que
conllevaría a un daño permanente en el metabolismo mitocondrial y, por ende, se
produciría la activación de vías de muerte celular, tal como se ha observado en los
fotorreceptores en este trabajo. Identificar las vías involucradas y si los daños observados
van por estas vías requiere de estudios adicionales.

El uso, tanto de la boldina como de L-NAME, demuestran ser bastantes eficaces para la
reversión de los efectos producidos por los peroxinitritos en presencia de SIN-1 y AG. Si
bien ambas moléculas están asociadas a mecanismos de acción diferentes, queda
comprobado en este estudio que, ya sea mediante la quelación de especies oxidantes, efecto
de la boldina, o la disminución de NO, producto de L-NAME (y de esta manera limitar la
producción de peroxinitritos), son mecanismos que podrían funcionar como blancos
terapéuticos en la RD.

El aumento de la expresión de N-Tyr indica de forma directa que existe una fuente de NO
de alguna de las isoformas en los explantes de retina en condiciones de AG. Mediante la
inmunohistoquímica contra iNOS pudimos confirmar un estado inflamatorio en las retinas
expuestas a SIN-1 y AG, evidente por el aumento significativo de la intensidad de
fluorescencia de iNOS en la primera y segunda semana de cultivo. Durante la diabetes, la
exposición crónica a altos niveles de glucosa activa vías bioquímicas tales como la
glicólisis, vía del poliol y de la hexosamina. Por otra parte, la actividad mitocondrial y la
autooxidación de la glucosa permite la producción de ROS, resultando en la formación de
estrés oxidativo y AGEs (Sahajpal et al. 2018). Esto se debe porque, los monosacáridos
pueden enolizar y reducir así el oxígeno molecular en condiciones fisiológicas, produciendo
acetaldehídos, peróxido de hidrógeno e intermedios de radicales libres, contribuyendo a los

60
niveles elevados de peróxidos plasmáticos que se encuentran en los pacientes diabéticos (S.
P. Wolff and Dean 1987).

Los resultados anteriores, obtenidos por la inmunohistoquímica de N-Tyr e iNOS,

demostraron que existe un desbalance metabólico en la célula, ya que el aumento de la
expresión de nitrotirosina indica una modificación en las proteínas por la presencia de
peroxinitritos, junto con una actividad inflamatoria activa dentro de las neuronas de la
retina debido a la sobreexpresión de iNOS. Como se ha descrito antes, la formación de los
peroxinitritos corresponde a la reacción de anión superóxido y altas concentraciones de NO
(Martínez-Ruiz, Cadenas, and Lamas 2011). La inmunohistoquímica contra nNOS mostró
la presencia de células NOAC, que son las principales productoras de NO en la retina en
condiciones fisiológicas (Vielma, Retamal, and Schmachtenberg 2012), aunque también
algunos tipos de células bipolares y ganglionares pueden ser productoras de NO (Agurto et
al. 2017). La cuantificación del número de células nNOS positiva no presentó diferencias
significativas en las capas nucleares de la retina INL y GCL, lo que demostró que la
contribución de la sobreproducción de NO en los explantes de retina proviene de iNOS
principalmente desde los SI de los fotorreceptores. Estudios han revelado que, en la
diabetes dependiente de insulina inducida experimentalmente, se activa la regulación
positiva de la expresión de nNOS en algunas células bipolares en la retina. La posterior
sobreproducción de NO a partir de procesos dendríticos de las células bipolares que
expresan nNOS puede exacerbar la muerte de las células fotorreceptoras a través de un
círculo vicioso de excitotoxicidad de glutamato mediada por NO (J. Park et al. 2006). En
contraposición, el uso de animales knock out para iNOS, ha logrado demostrar que iNOS es
un componente importante en los estados inflamatorios tempranos en animales que se les
ha inducido diabetes, y que su expresión es clave para inducir estrés nitrosativo y
modificación proteica por la acción de peroxinitritos (Rodríguez-Carrizalez et al. 2014).
Otros estudios apoyan esta idea, demostrando, a través de western blot, que iNOS retinal
está sobreregulado (Liebert et al. 2003), favoreciendo un microambiente inflamatorio y la
sobreproducción de NO. Sumado a lo anterior, existe una actividad mitocondrial
incrementada con una sobreproducción de anión superóxido, favoreciendo la producción de
peroxinitritos, capaces de reaccionar con proteínas y lípidos de manera inespecífica,

61
gatillando estrés oxidativo y nitrosativo (Yunpeng Du et al. 2002; Mandal et al. 2013;
Edwards et al. 2015) y, posiblemente, sea el causante de muerte celular por necrosis, o, vía
daño mitocondrial, mediante la activación de caspasas y apoptosis (P Pacher, Beckman, and
Liaudet 2007; Radi 2013). El estrés oxidativo también puede inducir la producción de
proteínas inflamatorias como ICAM-1 e iNOS en fotorreceptores (Tonade, Liu, and Kern
2016). La presencia de un ambiente inflamatorio, sumado al aumento de ROS podrían ser
efectos no excluyentes que gatillarían alteraciones proteicas en las células, principalmente
en los fotorreceptores, activando vías de apoptosis en condiciones de AG, tal como hemos
visto en este trabajo. Frente a este ambiente, se ha determinado que las células
fotorreceptoras podrían iniciar la señalización de proteínas proinflamatorias mediante la vía
NF-kB, pudiendo ser claves en la patogénesis de la RD (Sahajpal et al. 2018; Tonade, Liu,
and Kern 2016).

Existen otros mecanismos que pueden favorecen la producción de RNS, como la apertura
de los hemicanales, tanto de conexinas como de panexinas y que se han implicado en una
amplia gama de procesos biológicos que afectan directamente la viabilidad celular, por lo
tanto, la actividad anormal del hemicanal contribuye a la patogénesis de diversas
enfermedades, incluida la RD (R. G. Johnson et al. 2016). Esto se debe a que la apertura no
regulada de un canal tan grande y no selectivo que une el espacio intracelular y extracelular
podría comprometer los gradientes iónicos y de moléculas, permitiendo el movimiento no
regulado de los metabolitos, glucosa, calcio y segundos mensajeros (Y. Kim et al. 2018). El
paso de calcio podría aumentar las concentraciones intracelulares y de esta forma estimular
la producción de NO mediante nNOS. La glucosa también puede ingresar por los
hemicanales y, en condiciones de AG, podría generar un aumento de sustrato en la
mitocondria y aumentar su actividad, contribuyendo a la formación de radical superóxido
que, sumado al aumento de NO, generaría la formación de peroxinitritos, trayendo un daño
directo sobre la célula (J. M. Souza, Peluffo, and Radi 2008; Yamakura and Kawasaki
2010; Freeman et al. 2008). Saber si estas vías están implicadas en este modelo de estudio
requiere del uso de bloqueadores y de más experimentos, sin embargo ya se han asociado la
presencia de la alteración de conexinas a enfermedades a consecuencia de la diabetes, tales
como la disfunción renal (Hernández-salinas et al. 2013).

62
La búsqueda de terapias efectivas podría evitar el daño celular producido por el estrés
nitrosativo, no sólo en los fotorreceptores, sino que en todos los otros tipos celulares en la
retina. Es por esto, que en nuestro estudio usamos la boldina, un alcaloide proveniente del
árbol chileno Peumus boldus que se ha descrito que tiene propiedades antioxidantes y
antiinflamatorias (Siang et al. 2013). También estudiamos L-NAME, un inhibidor no
selectivo de NOS. Los resultados fueron sorprendentes, ya que, en ambos casos pudimos
obtener una disminución en todas las formas de producción de estrés oxidativo/nitrosativo.
Así mismo, observamos la disminución de la producción de anión superóxido y de óxido
nítrico por parte de iNOS, siendo importante para evitar la producción de peroxinitritos y,
por consiguiente, de estrés nitrosativo. Se conoce la boldina como una molécula capaz de
bloquear hemicanales (Hernández-salinas et al. 2013), pero en este estudio nos demuestra
que también puede actuar como un agente antioxidante.

El uso de la boldina se ha utilizado tanto en modelos in vitro como in vivo. En un modelo

de obesidad y diabetes, ratones LepRdb/db, la administración oral con boldina restauró el
daño endotelial de las aortas, reduciendo la expresión de varios marcadores asociados al
daño oxidativo, dentro de ellos la nitrotirosina, sugiriendo que este alcaloide mejoró la
función endotelial mediante la reducción de ROS, ejerciendo un efecto protector (Yeh
Siang Lau, Tian, and Mustafa 2013), resultados similares se han obtenidos en animales
diabéticos inducidos por STZ, donde la boldina revirtió el aumento de ROS en células
endoteliales, mediante la inhibición de estrés oxidativo, restaurando la biodisponibilidad de
NO en la célula (Yeh Siiang Lau et al. 2015). La capacidad antioxidante de la boldina
podría retrasar o prevenir el desarrollo y la progresión de la diabetes en los distintos
modelos que se han utilizado, tal como lo vimos en esta investigación. El estudio de la
función mitocondrial en ratones tratados con STZ confirmó que la boldina es capaz de
descomponer ROS y, también, inhibir la sobreproducción de NO mediante la atenuación de
la nitración por peroxinitritos, de esta forma contribuye a la reducción del desarrollo de
estrés oxidativo y de daño tisular asociado por la diabetes (Jang et al. 2000).

63
De la misma manera que la boldina, los inhibidores de NOS han sido utilizados como
posibles moléculas terapéuticas, en este estudio el uso de L-NAME demostró no sólo
revertir la sobreproducción de NO proveniente de iNOS, sino que también redujo la muerte
celular de los fotorreceptores en condiciones de AG. Estos resultados afirman los resultados
obtenidos por otros autores, que han mostrado que la administración de L-NAME es capaz
de revertir ROS y aumentar la función secretora del páncreas, mejorando la tolerancia a la
glucosa en animales diabéticos (Shahraki, Karbalaei, and Nemati 2020). El uso de
inhibidores específicos sería útil de estudiar, ya que permitiría inhibir la sobreproducción
de NO sin alterar la función fisiológica de nNOS. El uso de S-Metilisotiourea sulfato y
citicolina, ambos bloqueadores selectivos de iNOS, se han estudiado para investigar sobre
el dolor neuropático inducido por la diabetes tipo II en ratas de la cepa Wistar, atenuando el
dolor, a través de la inhibición de la sobreproducción de iNOS y, en consecuencia,
atenuando mecanismos de neurodegeneración (Ahlawat and Sharma 2018). La
administración oral de aminoguanidina se ha demostrado que inhibe el desarrollo de RD en
animales diabéticos por medio de la inhibición de iNOS, sumado a esto se observó una
disminución de nitrotirosina, sin embargo los mecanismos detrás de este efecto siguen sin
estar claros, no obstante este hallazgo podría indicar que el desarrollo de la RD podría estar
directamente relacionado a la sobreproducción de NO (Yunpeng Du et al., n.d.).

De acuerdo con lo observado en este estudio, se realizó un modelo (Fig. 7) que describe
que, una vez que la glucosa entra a la célula, el incremento metabólico por el exceso de
glucosa dentro de la célula genera fuga de electrones por la cadena transportadora de
electrones. Éstos reaccionan rápidamente con el oxígeno y forman anión superóxido, un
compuesto altamente inestable. El daño mitocondrial producido genera la activación de vías
bioquímicas que producen de factores proinflamatorios, aumentando la síntesis de iNOS,
que, en consecuencia, desencadena una sobreproducción de NO que reacciona rápidamente
con el anión superóxido producido por la mitocondria, el producto de esta reacción es el
peroxinitrito, una molécula altamente oxidante capaz de reaccionar de forma irreversible e
inespecífica con proteínas. Este daño gatilla un aumento en el estrés nitrosativo que
conlleva a un daño celular, que produce finalmente la muerte celular principalmente en los
fotorreceptores.

64
Figura 7. Modelo resumen de los efectos de los daños producidos por la exposición de alta glucosa
en fotorreceptores.

En resumen, en este trabajo comprobamos que la exposición de altos niveles de glucosa en

explantes de retina de rata generan un ambiente oxidante, confirmado por la
sobreproducción de anión superóxido mitocondrial y NO generado por iNOS. La formación
de peroxinitritos produjo estrés nitrosativo en la retina, siendo los fotorreceptores los
principales afectados. El daño mitocondrial observado por TEM demostró que todos estos
eventos funcionan en conjunto y gatillan cambios moleculares que producen la muerte
celular por apoptosis en los fotorreceptores y alteran directamente la función retinal. Por
otro lado, el uso de la boldina y L-NAME establecen que el daño oxidativo puede ser
revertido con el uso de moléculas antioxidantes e inhibidores de las fuentes de NO,
pudiendo ser consideradas como posibles terapias para la RD.

65
 Conclusiones

Mediante el modelo de explantes organotípicos de retina de rata se pudo establecer que la

exposición de altos niveles de glucosa afecta directamente la viabilidad de la retina, siendo
los fotorreceptores las células más dañadas en la retina, presentando una elevada tasa de
muerte celular por apoptosis. La muerte neuronal está vinculada con un aumento de NO
producido por iNOS y que, sumado al daño mitocondrial, genera estrés nitrosativo en la
retina. El uso de antioxidantes exógenos, como la boldina, e inhibidores de NOS fueron
capaces de revertir parcialmente los efectos generados por AG.

66
 Anexo

Anexo 1. Cuantificación de células TUNEL positivas en la INL de explantes de retina de rata

cultivados hasta dos semanas. No se encuentran diferencias significativas en el número de células
apoptóticas en INL (a). Las barras representan ± DS. N=5.

67
Anexo 2. Expresión de ROS mediante la sonda DCFH in vivo en explantes de rata cultivados por 1
semana. La sonda DCFH es altamente permeable en la membrana celular y al oxidarse con especies
reactivas de oxígeno en el citosol fluorece en color verde. La sonda mostró un aumento significativo
de la fluorescencia en toda la retina a la primera semana de cultivo bajo condiciones de SIN-1 (a,b).
Se observa un aumento en la fluorescencia en condiciones de AG, sin embargo, no alcanza a ser
significativa. Tanto la presencia de boldina como de L-NAME son capaces de revertir ROS,
manteniendo valores de fluorescencia similares a la condición GM. Escala 50 µm. Barras de error:
± DS. ** indica p < 0.01; *** indica p < 0.001. N=3.

68
Anexo 3. Expresión de anión superóxido mitocondrial mediante la sonda MitoSOX® in vivo en
explantes de rata cultivados por 1 semana. Al igual que la sonda DCFH, MitoSOX® es altamente
permeable en la membrana celular y al oxidarse con el anión superóxido mitocondrial fluorece en
color rojo. Coherente con la literatura, se observó un aumento de la fluorescencia en los SI de los
fotorreceptores, lugar donde se encuentra la mayor cantidad de mitocondrias en la retina. La sonda
mostró un aumento de la fluorescencia a la primera semana de cultivo bajo condiciones de SIN-1 y
AG (a). La boldina y L-NAME estarían disminuyendo la cantidad de ROS en la retina, ya que
disminuye notablemente la fluorescencia en condiciones de AG. N=1. Escala= 50 µm.

69
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