2º Parcial
2º Parcial
2º Parcial
MICROBIANA
TEMA 9: Producción
de Ácidos Orgánicos
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
INTRODUCCIÓN
Los ácidos orgánicos presentan diversos usos en la actualidad, como aditivos, en la industria química, etc.
Es importante destacar que todos los ácidos derivados del ciclo de Krebs se pueden producir en grandes
cantidades. También los derivados indirectamente (ácido itacónico), los que derivan directamente de la
glucosa (ácido glucónico) o los formados como producto final a partir de piruvato y etanol (ácido láctico y
acético).
Para sus diferentes producciones existe competencia entre producción microbiana y química:
• Ácido cítrico: microbiana
• Ácido láctico y acético: química y microbiana
• Otros: tecnología microbiana desarrollada, pero no frecuentemente implementada
ÁCIDO CÍTRICO
Se lleva produciendo a nivel industrial desde 1923; siendo actualmente el 99% de la producción dada por
fermentaciones microbianas. Usado, ordenado de mayor a menor medida, en industria de alimentos y
bebidas; farmacéutica; química; y metalurgia.
Como bien sabemos, se trata de un metabolito primario tipo II que proviene del ciclo de Krebs. Es
producido por Aspergillus Niger (cepa usada en industria, existen otras), a partir de la glucólisis de
glucosa, de donde se obtiene piruvato y entra en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. De esta manera
formará citrato, que va a presentar dos retroinhibiciones al nivel de piruvato quinasa (va a detener la
glucólisis, constituyendo esta retroinhibición el cuello de botella en la producción de ácido cítrico) y de la
fosfofructoquinasa (sufre retrorregulación por citrato).
Debido a esto último, requerimos de mutantes, pero en este caso trabajaremos con la cepa silvestre en
la que iremos modificando las condiciones de cultivo y seremos capaz de eliminar esas retroinhibiciones.
Entrando en materia, Aspergillus es un hongo: célula eucariota y con mitocondrias. Dicho esto, la
producción del citrato se va a producir en el interior de la mitocondria, por lo que es intracelular, pero
nosotros vamos a hacer que sea extracelular para obtenerlo por filtración. Para sobreproducir nuestro
ácido, necesitaremos tener las siguientes condiciones:
PH ÁCIDO
Se va a necesitar un pH muy ácido, en torno a 2 (1,6 - 2,2). Podríamos pensar que no es condición óptima
para nuestro hongo, y así es; pero como se trata de un metabolito primario de tipo II, nos la suda.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Va a servir como fuente de nitrógeno, pero hay que controlarlo para mantener el pH ácido
El paso de fosfoenolpiruvato a piruvato es nuestro cuello de botella, que es el paso que va a catalizar
piruvato quinasa
En los microorganismos que producen citrato,
entre ellos Aspergillus niger (mirar si es solo
Aspergillus o también los otros), vamos a
encontrar un conjunto de reacciones
anapleróticas que hacen que el fosfoenol
piruvato pase al ciclo de Krebs sin tener que
pasar a piruvato, eliminando ese cuello de
botella que nos limitaba.
Como vemos en la imagen, gracias a la
presencia de determinadas enzimas vamos a
ser capaces de llevar a cabo este tipo de
reacciones, pasando de fosfoenol piruvato a
oxalacetato sin pasar piruvato, y, por lo tanto,
sin utilizar piruvato quinasa que era el punto
flaco de nuestro proceso (como Hazard en el
Real de Madrid).
La enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es la que depende y se potencia con el NH4+ y es la que nos
va a permitir este proceso, de ahí a que se use altas concentraciones de NH4+ a pesar de que esta molécula
alcaliniza el pH.
Se va a requerir una alta concentración de azúcar, entorno a 120 - 250 g/L, que va a tener dos funciones
principales:
• Va a activar la producción de Fructosa 1-6 Bifosfato, eliminando la retroinhibición sobre la
fosfofructoquinasa que ya no se inhibe por el citrato y la otra retroinhibición la anula
parcialmente
• Se comienza a producir mucho glicerol. El citrato está dentro del ciclo de los ácidos tricarboxílicos
y se va a transformar en otros ácidos, pero nosotros no queremos eso. Este glicerol hace que
baje o que se anule la actividad de esas enzimas del ciclo que gastan citrato, pero esto no se
consigue al 100%. Además, potencia a citrato sintasa, de forma que gracias a la producción de
glicerol se va a acumular citrato.
CONDICIONES AEROBIAS
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Para concluir, destacar que como el citrato es un metabolito primario van a ser consumidos en parte por
el microorganismo para crecer.
MEDIO DE CULTIVO
Como hemos dicho anteriormente, el citrato es un metabolito primario de tipo II, es decir, que su
producción no va a estar asociado al crecimiento. Para producirlo, en primer lugar, haremos que nuestros
microorganismos crezcan en gran cantidad (trofofase) y para ello usaremos pH 5, que es el ideal para el
crecimiento de nuestro microorganismo.
El ácido cítrico se va a producir casi llegando a la idiofase, por lo que vamos a tener que forzar un estrés
en nuestro microorganismo para que este no siga en trofofase, y esto se va a realizar mediante una
disminución de pH, que va a ser el propio sistema el que la va a producir de forma local, debido a la
exportación de ácido cítrico, que conforme vaya pasando el tiempo, va a producir que la bajada de pH
ocurra de manera global en el tanque.
Con respecto a las fuentes de carbono hay que seguir suministrándolas porque sino ya entraríamos en
idiofase y nosotros no queremos eso. Por lo tanto, nuestro medio de cultivo es el siguiente:
• Fuente de Carbono: se suelen utilizar melazas o jugo de glucosa, pero tener cuidado con los
metales que puedan tener ya que pueden evitar esa deficiencia de Mn2+ que necesitamos.
También se puede usar almidón, pero dependerá de si nuestro Aspergillus produzca amilasas.
• Fuente de Nitrógeno: con la alta concentración de NH4+ messirve, pero controlar para que no
suba el pH
• Fuente de Fósforo: la concentración de fósforo en la trofofase tiene que ser más 10 mM y en
idiofase menos de 10mM
• Fuente de Azufre: medir índice NPK
• Sal
• Metales:
o Hierro (0,05 – 0,5 ppm): es importante que esté en ese rango (favoreciendo la
producción de ácido cítrico) porque este hierro puede potenciar la formación de otros
ácidas reduciendo rendimientos y la posterior purificación
o Cobre: Aspergillus es un hongo filamentoso y que además produce micelio, donde la
viscosidad no va a ser constante, lo que va a impedir la utilización de biorreactores
sumergidos. Si somos capaces de controlar el micelio del hongo podemos usar un medio
líquido (fermentador sumergido), pero si no, tendremos que usar un medio sólido
(fermentador en superficie), donde no hace falta agitar porque la oxigenación se
produce de forma natural, pero la posterior separación será más complicada. Esto se
puede controlar con la concentración de cobre, que a determinadas concentraciones va
a limitar la formación de micelio
o Mn2+: baja concentración como hemos visto anteriormente
o Zn
o Mo
• pH: el pH inicial es 5 para que se inicie la trofofase ya que es un metabolito primario, pero
conforme se vayan produciendo los ácidos se va a acidificando poco a poco el medio. Cuando el
pH es menor a 3 se va a suprimir la formación de ácido oxálico y glucónico.
• Agua
RENDIMIENTO
Teóricamente se van a producir rendimientos mayores al 100% (g ácido citrico / g fuente de C)
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PROCESO DE PRODUCCIÓN
Vamos a poder elegir fermentador en superficie o fermentador sumergido. Sabemos que Aspergillus es
muy sensible a la falta de oxígeno, de forma que este tiene que ser insuflado y además habrá que agitar
para que llegue a todas las zonas. La agitación se va a ver condicionada por el micelio, por lo que es posible
que no haya una buena agitación, por lo que se perderá efectividad al no haber buena oxigenación.
FERMENTACIÓN EN SUPERFICIE
Este tipo de fermentador lo vamos a elegir si no sabemos controlar el micelio y este va a crecer
masivamente en bandejas con medio sólido donde crece en superficie formando micelio sin límite de
oxígeno.
En este caso el medio de cultivo (sólido o líquido) se va a preparar sobre bandejas de entre 3 -5 cm de
grosor de medio, que se inoculan (spray o corriente de aire; 2 – 5 *107 esp/m2).
FERMENTADOR EN SUMERGIDO
Este tipo de fermentador se va a elegir cuando sabemos controlar el micelio o este resulta muy corto.
Necesita el uso de antiespumantes que van a evitar la formación de espumas durante la agitación. La
producción de ácido cítrico no se suele hacer en cultivo contínuo por la formación del micelio.
Son un 25 % más baratos en infraestructuras, pero gastan más energía y necesitan personal más
especializado. Hay que tener en cuenta tres factores:
• Material fermentador resistente a ácido o acero inoxidable: no puede liberar metales. Se suelen
usar fermentadores de entre 120 – 220 m3.
• Formación y estructura del micelio: hacen falta pellets pequeños y sólidos (depende de (fe/cu).
A veces se inocula con las esporas en vez de con el cultivo semilla.
• Aporte oxígeno > 20 – 25 % de saturación
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PROCESO DE DOWNSTREAM
El ácido cítrico lo vamos a tener en medio líquido, donde nuestro parámetro de control va a ser el pH. La
característica diferencial para separar el ácido cítrico es su producto de solubilidad, que los va a
diferenciar del resto de los componentes del sistema. De esta forma, lo vamos a purificar como un cristal,
un cristal de citrato de calcio.
Para llevar a cabo la recuperación del ácido cítrico tendremos que llevar a procesos:
1. En la mayoría de ocasiones vamos a tener mucho ácido cítrico y un poco de ácido oxálico que va
a precipitar antes que el cítrico. Por ello, en primer ligar lo que vamos a hacer es quitar del medio
este oxálico, para ello, añadiremos Ca2+, de forma que se formará oxalato cálcico (sólido). En
este medio tendremos un sobrenadante, donde está el cítrico y luego sólidos (micelio junto con
oxalato de calcio).
2. Separación del micelio y oxalato cálcico (sólidos) del resto de componentes mediante
centrifugación.
3. Adición de más cantidad de calcio. Tendremos que ajustar también las condiciones de pH, el
medio tiene que tener pH neutro, alcanzándose de esta forma las condiciones óptimas de
precipitación del citrato cálcico.
4. Filtración donde en este caso nos quedaremos con el precipitado (citrato cálcico)
5. Adición de ácido sulfúrico que tiene una mayor afinidad por el calcio que el ácido cítrico,
formándose de esta forma sulfato cálcico.
6. Filtramos de nuevo y lo que nos queda en el filtro será el sulfato cálcico, mientras que lo que nos
queda en el sobrenadante va a ser ácido cítrico 100 % puro y ya estaría listo para la venta.
7. Si hay impurezas podemos usar carbón activo.
ÁCIDO LÁCTICO
Fue el primer ácido producido industrialmente (desde 1880). Su producción se realiza mediante métodos
biológicos y químicos. Solo se comercializa el L – ácido láctico. La producción microbiana supone unas
2000 toneladas de ácido láctico por año.
Lo van a producir las bacterias del ácido láctico que son quimiorganotrofos, que son Gram + y catalasas-.
La catalasa - significa que estas bacterias son anaerobias o anaerobias facultativas. La catalasa es una
enzima que rompe el H202, un producto tóxico derivado del metabolismo aerobio de azúcares. Es lógico
que las bacterias del ácido láctico sean catalasa – porque son anaerobias
Estas bacterias van a oxidar la glucosa mediante una fosforilación a nivel de sustrato. En una respiración
el aceptor de electrones es externo, pero en una fosforilación a nivel de sustrato va a ser interno, en este
caso el piruvato, que va a aceptar los electrones del poder reductor (con un rendimiento neto de 2ATP) y
en vez de seguir oxidándose se reduce a lactato y oxida a NADH2. Este piruvato reducido va a ser
excretado como lactato (producto extracelular que se va a encontrar en el sobrenadante).
El rendimiento es más alto que el del ácido cítrico debido a que el ácido cítrico era requerido por la
bacteria, por lo que solo excreta lo que le sobra. En el caso del lactato, este no va a ser requerido por la
bacteria, de forma, que el rendimiento va a ser mayor.
Rendimiento teórico 2 mol de lactato / mol de glucosa y el real es el 90% * rendimiento teórico.
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MEDIO DE CULTIVO
• Fuente de carbono o energía: melazas o cualquiera que rinda glucosa
• Fuente de Nitrógeno: fosfato amónico ((NH4)2HPO3). El amonio va a servir como fuente de N2 y
como tampón de pH. Amonio sube el pH mientras que el lactato va a bajar el pH de forma, que
el amonio va a compensar esta bajada de pH. Nuestro punto de control va a ser el pH. El fosfato
sirve como fuente de fósforo
• Fuente de Azufre: medir índice NPK
• Fuente de Fósforo: por encima de 10 mM para que se entre en trofofase
• Agua
• pH: acidófilas (5,5 – 6,5)
• Temperatura: relativamente alta. Forman parte de el microbiota comensal humana, por lo que
su temperatura óptima rondará entre los 45 – 50ºC.
• Condiciones anerobias
• Vitamina B: requeridas por las bacterias del ácido láctico
Industrialmente debemos tener en cuenta que el pH va a ir bajando debido a la excreción del ácido láctico,
por lo que se puede producir que salgamos de la zona de confort del microorganismo, haciendo que este
reduzca su crecimiento y, por tanto, produciendo menor cantidad de ácido láctico (metabolito primario
tipo I). Para evitar esto se añade Carbonato Cálcico, que nos ayuda a neutralizar el exceso de ácido.
También puede servir retirar el ácido láctico.
PROCESO DE DOWNSTREAM
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OTROS ÁCIDOS
ÁCIDO GLUCÓNICO
Necesitan oxígeno, así como una fuente de carbono que rinda glucosa. Se usa en la industria del metal,
comida y cuero
Tener cuidado que el glucónico lo producen tanto bacterias (Acetobacter suboxydans) como hongos
(Aspergillus niger), de forma, que el medio de cultivo va a ser distintos en estos dos casos. Tener en cuenta
el pH y que los hongos requieren más nitrógeno que las bacterias. También tener en cuenta que
Aspergillus puede producir micelio, por lo que la extracción del producto se puede complicar. Fuente de
fósforo por encima de 10 mM para que se entre en trofofase.
Realmente lo único que vamos a necesitar de ellos es la glucosa oxidasa, por lo que podemos extraerla de
ellos o hacerla recombinante e inmovilizada y no emplear microorganismos.
ÁCIDO ITACÓNICO
Se usa Aspergillus itaconicus, hongo ambiental quimiorganotrofo. Debemos añadir calcio, porque hay una
enzima que es la encargada de degradar el ácido itacónico y se ve inhibida en presencia de calcio.
Para el proceso industrial se usan células inmovilizadas. Va a ser muy importante la adición de Ca para
inhibir la enzima del ácido itacónico oxidasa que produce ácido succínico e itartárico no deseados.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
INTRODUCCIÓN
Hasta recientemente se ha usado el petróleo y sus derivados para la producción de energía y como
materia prima de la industria química. Sin embargo, en la actualidad se empieza a potenciar la producción
microbiana de materias primas mediante fermentaciones.
Para que sea rentable la producción de materias primas a partir de los hidratos de carbono de los cultivos,
han de cumplirse los siguientes requisitos:
• Transporte barato
• Bajo coste para la conversión de los polímeros en monómeros
• Que se puedan usar cultivos mixtos para metabolizar diferentes substratos
• Que se puedan usar termófilos para ahorrarse el enfriamiento, aumentar la cinética y disminuir
las contaminaciones
• Que se pueda realizar la fermentación en anaerobiosis
• Que se pueda hacer un proceso continuo
• Que tenga un bajo coste de recuperación del producto y de concentración
Todos los alcoholes van a ser metabolitos primarios de tipo I y extracelulares, excepto el glicerol que
tendremos que hacer algo para excretarlo.
ETANOL
USO
MICROORGANISMOS
El principal productor de etanol es Saccharomyces Cerevisiae, que su principal problema es que no resiste
las altas concentraciones de azúcar. Va a ser sensible al propio etanol que ella produce, lo que va a hacer
que salga de la trofofase y se va a ralentizar mucho la producción.
Para evitar esto, se realizan procesos de mutagénesis para obtener mutantes o bien, usar otros
microorganismos que sean más resistentes a etanol como Zymomonas que es similar a Pseudomonas.
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ALMIDÓN
Para usar el almidón hay que hacer una pre-hidrólisis, usando una mecánica o enzimática (con amilasas
inmovilizadas o poniendo un microorganismo que produzca amilasa, donde el tiempo en el que tenemos
que tener este cultivo va a ser de vital importancia, para evitar que ese microorganismo se lleve más de
lo que deba). Destacar que el proceso de degradación enzimática se va a dar en condiciones mejores si
calentamos un poco.
• Un fermentador: primero se hacen crecer a los microorganismos que van a ser capaces de
degradar el almidón y a medida que vayan liberando azúcares simples se fomenta el desarrollo
de Sacharomyces
• Dos fermentadores: En el primero se usa como fuente de carbono almidón, y se cultivan en este
los microorganismos que van a ser capaces de hidrolizarlo, de forma que se va a formar un caldo
rico en los productos hidrolíticos que será transferido al segundo fermentador (con una
membrana de filtración) donde inocularemos con Sacharomyces o Zymomonas. Esto se utiliza
cuando no sabemos controlar el ritmo de producción de los microorganismos hidrolíticos
En primer lugar, se va a requerir un pre-tratamiento, en el que los tubérculos o los granos se van,
posteriormente se produce la hidrólisis del almidón por los microorganismos hidrolíticos generando
azúcares más sencillos (maltosa y glucosa) que ya van a poder ser usados por nuestros microorganismos
fermentadores.
MELAZAS
Contienen fundamentalmente sacarosa, además de una fuente de nitrógeno, e incluso de P y S, debido a
que es una fuente de carbono impura.
Tienen el problema de que tienen mucho SO2 que inhibe el crecimiento de muchas cepas de
Saccharomyces, lo que posteriormente usaremos como agente selectivo.
La madera y los desechos de poda están formados por celulosa y hemicelulosa, envuelta en una red de
lignina, que impide el acceso de los microorganismos a la celulosa y hemicelulosa. Lo que ocurre es que
hay muy pocos microorganismos que sean capaces de degradar la lignina (métodos químicos muy
complejos).
DEGRADACIÓN DE LA LIGNINA
Recientemente, se ha descubierto un hongo (Phanerochaete chrysosporium) que va a producir unas
enzimas extracelulares, la lignina peroxidasa (metabolito primario tipo II), que van a degradar la lignina.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Consiste en poner al microorganismo en trofofase y cuando se haya alcanzado suficiente densidad óptica
limitamos un poco la fuente de carbono del medio, de forma que el microorganismo va a comenzar a
producir estas enzimas para degradar la lignina.
Es importante el EPS, debido a que estas células extracelulares gracias al EPS, se van a concentrar, que va
a permitir una actividad más eficiente.
Vamos a distinguir diferentes microorganismos que van a ser capaces de producir enzimas que degradan
la celulosa y la hemicelulosa. Estas enzimas van a ser metabolitos primarios de tipo II. Distinguimos:
Es importante el EPS, debido a que estas células extracelulares gracias al EPS, se van a concentrar, que va
a permitir una actividad más eficiente. No va a ser importante en Clostridium al producir celulasas
intracelulares.
CONCLUSIÓN
De esta forma, para utilizar la madera como fuente de carbono, en primer lugar, vamos a tener que hacer
un pretratamiento con microorganismos degradadores de lignina, posteriormente otro tratamiento con
microorganismos degradadores de celulosa y de hemicelulosa. Finalmente, se llevaría a cabo la
fermentación.
Los productos de las hidrólisis de la celulosa es glucosa, y de la hemicelulosa es una mezcla de pentosas y
hexosas. Estas pentosas no pueden ser usadas por muchos microorganismos, de forma que vamos a
perder una fracción de Carbono que no va a poder ser usada. Por ello vamos a tener que hacer un cultivo
mixto con un microorganismo que si pueda usar esas pentosas.
BIOSÍNTESIS
ANAEROBIOSIS
En este caso el intermediario es el acetaldehído, que va a aceptar los electrones, transformándose en
etanol que va a ser llevado al exterior.
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Al ser un metabolito primario de tipo I vamos a tener que hacer que nuestros microorganismos se
encuentren en condiciones de crecimiento óptimas. En cuanto a las condiciones aerobias o anaerobias,
destacar que como hemos dicho anteriormente, es muy complicado iniciar desde el minuto 0 las
condiciones de anaerobiosis, de forma que lo normal va a ser que al comienzo el cultivo tenga oxígeno.
Durante el proceso de producción hay que tener cuidado con el etanol que se está produciendo para
evitar llegar al límite del microorganismo. El rendimiento de nuestro proceso va a depender de la
resistencia de los microorganismos a su propio producto de fermentación. Para solucionar esto podemos
utilizar por ejemplo un fermentador continuo, de forma que el etanol se va a extraer conforme se va
produciendo.
El parámetro de control de nuestro proceso va a ser la densidad. La densidad tiene que ir bajando debido
a que el alcohol es menos denso que el agua, de forma que cuando la densidad se estabiliza va a significar
que la fermentación ya se ha parado.
El proceso de escalado consiste en el paso de nivel de laboratorio a nivel industrial. Vamos a tener un
aumento del volumen de inóculo desde el nivel de laboratorio hasta llegar a tener la suficiente biomasa
como para inocular un fermentador industrial. Durante este proceso de escalado se tiene que mantener
una temperatura ambiental (30ºC) y pH en torno a 5 -7, y, además, la densidad se tiene que ir controlando.
Todo lo que se refiere a escalado del inóculo es en aerobiosis, donde también se va a producir etanol,
pero de manera menos eficiente.
Los microorganismos anaerobios facultativos son aquellos es los que va a ocurrir lo que se denomina como
Efecto Pasteur, proceso por el que:
Sin embargo, hay una forma de que se produzca fosforilación a nivel de sustrato desde un primer
momento sin encontrarnos en condiciones anaerobias, y es mediante lo que se conoce como Efecto
Crabtree.
• Cuando hay mucha cantidad de azúcar, por encima de 1g/L, se va a inhibir la fosforilación
oxidativa a pesar de que haya O2 en el medio, y se va a dar fosforilación a nivel de sustrato.
Por ello, para hacer más efectivo nuestra producción, en nuestro cubato vamos a tener que añadir azúcar
al inicio del proceso, y no más, debido a que conforme pasa el tiempo, se van a pasar a condiciones
anaerobias, produciéndose por tanto fosforilación a nivel de sustrato
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Hay microorganismos capaces de degradar las pentosas. Una vez realizada la hidrólisis de celulosa y
pentosa, obteniendo hexosas y pentosas, vamos en primer lugar, realizar una separación química de las
hexosas y pentosas, donde las hexosas pueden ser usadas por Saccharomyces, y las pentosas las usaremos
para aquellos microorganismos que puedan usarlo como Pachysolen, de forma que usaremos toda la
fuente de carbono que tenemos para producir etanol haciendo de esta forma el proceso mucho más
eficiente. (FOTO DE ARRIBA)
También se podría hacer un cultivo mixto, donde se hace una primera inoculación con Sacharomyces que
degradará la hexosa y obtendrá etanol, y posteriormente, inoculamos con aquellos microorganismos que
sean capaces de degradar las pentosas como en el caso de Pachysolen y producir etanol (estos
microorganismos van a tener que ser poco sensibles al etanol, sino tendremos que sacar el etanol
producido por Saccharomyces), es decir, en este caso vamos a mezclar todas las fracciones juntas si
separar en dos corrientes. (FOTO DE ARRIBA)
PROCESO DE DOWNSTREAM
Al ser un proceso extracelular, vamos a llevar a cabo una destilación en la que hay que controlar muy bien
la temperatura. Es el paso que más consume energía. Un abaratamiento de este proceso contribuye
mucho al abaratamiento de los costes totales.
BUTANOL
Es mucho más estable y tiene más poder calorífico que el etanol. Podría usarse como combustible para
los coches, como solvente o como biocida.
Lo produce Clostridium acetobutylicum (anaerobio estricto) que va a realizar una fermentación a nivel
de sustrato, produciendo acetona, butanol y etanol (Fermentación ABE). Al contrario que en los casos
anteriores que había solo un aceptor de electrones, en este caso vamos a distinguir varios aceptores de
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electrones, lo que va a hacer que se produzcan los tres productos citados anteriormente. La materia prima
van a ser biomasa y residuos orgánicos.
1. Hace falta investigar más para mejorar su producción, entre otros, la supervivencia de las cepas
implicadas
PROCESO DE PRODUCCIÓN
La ruta se va a ramificar:
Si quisiéramos cultivarlos solo habría que asegurar un fermentador anaerobio burbujeando todas las
soluciones anteriores para eliminar el oxígeno, y asegurar una fuente de carbono que rinda mucha
glucosa, como melaza o almidón preparados.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Sin embargo, no se usa porque tiene muy baja tolerancia a su producto de fermentación; cuando alcanza
una concentración superior al 1.3%, la bacteria muere.
GLICEROL
Se produce de la misma manera y con los mismos microorganismos que el etanol, pero vamos a tener que
cambiar a otro aceptor final de electrones distinto al del etanol.
En la actualidad solo se obtiene por métodos químicos. Lo forman las levaduras y es un ejemplo de cómo
modificando las condiciones de fermentación se modifica el producto final
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Tema 11:
Transformaciones
por Microorganismos
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INTRODUCCIÓN
• Especificidad de sustrato
• Especificidad de sitio de acción
• Estereoespecificidad, van a ser capaces de distinguir entre distintos isómeros de la molécula
• Condiciones de reacción poco agresivas para el substrato
Estas reacciones posibles para dicha transformación son las oxidaciones, reducciones, reacciones
hidrolíticas y condensaciones.
Este proceso en cuestión presenta un protocolo definido, basado en un cultivo en fermentador (batch) al
cual se añade el compuesto a biotransformar en un momento determinado. Para ello usaremos cultivos,
células en reposo (se evita la inhibición del crecimiento y la contaminación), células inmovilizadas
(permiten hacer el tratamiento en continuo) y extractos de enzimas sin células/enzimas inmovilizadas
(esto con el fin de prevenir la posterior bioconservación y/o acortar el tiempo evitando el tiempo de
transporte a través de la membrana). A continuación, describiremos algunas peculiaridades:
• Substratos hidrófilos, por lo que se inocula con una solución concentrada de substrato.
Podremos hacer una disolución homogénea de ellos en agua, y están totalmente accesibles para
los microorganismos ya que ambos están en la fase acuosa.
• Substratos con poca solubilidad, por lo que a la solución se le suele añadir un emulsificante
(Tween) o solventes (etanol, acetona…) para incrementar la solubilidad, de forma que así
aumentaremos el área superficial que forma una interfase con la acuosa, y luego inocular.
• Substratos lipofílicos, por lo que creamos un sistema de dos fases (acuosa con el cultivo y sobre
ella una inmiscible para el substrato), ya que no vamos a poder emulsionarlo y mezclarlo con la
capa acuosa. Nos va a interesar la interfase, que es la superficie de contacto, por lo que no nos
van a interesar capas gruesas, sino que más bien finas y extendidas. Cabe recalcar que este es el
método más común dado para la transformación de esteroides.
TRANSFORMACIÓN DE ESTEROIDES
Los esteroides presentan propiedades hormonales (como los corticoides, los andrógenos, estrógenos,
progesterona, etc.), lo que les lleva a presentar diversas utilidades como son:
• Terapéuticas
• Anticonceptivas (derivados de progesterona y estrógenos)
• Antiinflamatorias (cortisonas y prednisonas).
La investigación actual se centra en optimizar los procesos de obtención, lo que llevaría a un ahorro de su
producción.
Con las biotransformaciones dadas sobre los esteroides no se pretende una síntesis total; sino
transformaciones dadas sobre los grupos funcionales de ciertos sitios específicos. El carbono 11, su
sustitución va a dar lugar a diferentes transformaciones ya que cambiando el grupo funcional de ese
carbono va a dar lugar a esteroides con distintas propiedades.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Este tipo de transformaciones la van a realizar microorganismos en trofofase, pero no lo van a usar como
fuente de carbono (cometabolito). Corynebacterium va a ser capaz de dar lugar a esteroides con distintas
propiedades.
Medio de cultivo para ese microorganismo crezca en trofofase y le echamos esas moléculas que queremos
transformar. El problema es que los esteroides son lipofílicos y que el medio es polar. La transformación
se va a dar en la interfase, de forma que vamos a trabajar en fermentadores extendidos donde echamos
una capa fina de medio de cultivo con los microorganismos y encima una capa fina con el esteroide de
forma, aumentando la zona de contacte.
Por ejemplo, para entender lo que supone esta técnica, la obtención de cortisona a partir de progesterona
ha supuesto una baja del coste de producción de 200 dólares/gramo a menos de 1 dólar/gramo.
En este caso, esta transformación va a ir ligada al crecimiento celular, por lo que va a ser un metabolito
primario de tipo I.
Otra transformación a destacar dentro del grupo de transformaciones de esteroides es la dada de cortisol
a prednisolona por parte de Arthrobacter Simplex. Es importante destacar el hecho de que son varios los
hongos y bacterias (por ejemplo, una que nos debe sonar es Corynebacterium) capaces de transformar
esteroides, obteniendo así sustancias que como vemos son de gran importancia sanitaria y económica.
Para el proceso de producción, como podemos apreciar en la imagen, se va a requerir la necesidad de dos
o más microorganismo para conseguir las modificaciones necesarias para obtener el producto de interés
necesario.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Los microorganismos pueden degradar una gran cantidad de moléculas, aunque no sean sus moléculas
específicas debido a estos errores. Durante este proceso de transformación puede que algunas sustancias
tóxicas pasen a ser no tóxicas
Sin embargo, es posible que no se excrete cuando se haya producido la transformación, entonces
necesitaremos acoplarlo a un cultivo de otro microorganismo que sea capaz de terminar la transformación
hasta la molécula que queremos. Habría que acoplar tantos cultivos como fueran necesarios para llegar a
la que queremos.
Entonces no se utilizan cultivos puros, sino cultivos mixtos acoplados donde unos microorganismos
utilizan los residuos de otros. Las transformaciones pueden ser resultado de metabolismo o de co-
metabolismo.
Los principales problemas son la falta de substratos o elevado precio de los mismos
Para este problema, es usual usar esteroides baratos (esteroides que tiene de 27 a 29 carbonos de
longitud como el colesterol). A estos lo que se haría para tratarlos es eliminarles las cadenas laterales
hasta el C17, asegurándose de no romper los anillos, de forma que así obtendremos el esqueleto básico
de los esteroides. Es importante además tener las siguientes precauciones:
• Usar inhibidores como agentes quelantes, que impidan reacciones en C1, C9 y C12. Estos lo que
hacen es unirse a aquellos carbonos que puedan colapsar evitando que de esta forma que lo
hagan.
• Usar mutantes que tengan inactivadas las enzimas que reaccionan con esos carbonos y que
puedan dar lugar al colapso.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Tenemos que tener precaución, y es que hay que usar inhibidores para evitar el colapso de la molécula
de colesterol que se produce tras la rotura de su enlace, de forma que se estabiliza.
Hay algunos microorganismos que rompen ese enlace del colesterol, pero luego lo siguen degradando,
algo que no queremos. Por ello, en ocasiones vamos a usar mutantes que van a tener estas enzimas
inactivas de forma, que vamos a conseguir romper ese enlace del colesterol y no se va a seguir con la
degradación.
PRODUCCIÓN L – SORBOSA
Lo que haremos será hacer crecer primero al microorganismo usando como fuente de carbono etanol,
hasta que tengamos una gran densidad óptica, y posteriormente añadimos glucosa que va a ser
transformada en sorbitol el cual será transformado en Sorbosa por la enzima de Acetobacter.
A continuación, describiremos condiciones y protocolo, con el fin de hacernos a una idea de lo que
sucedería en una planta industrial:
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
El paso de D-glucosa a Ácido 2-Keto-L-gulónico. Para ello se necesitan dos etapas dadas por dos
microorganismos diferentes.
• Erwinia (anaerobio facultativo) se encarga del paso de la glucosa al intermediario (2,5-DKG), con
una eficiencia del 94%. Obtiene energía a partir de la oxidación de la glucosa.
o Le vamos a poner al principio una gran cantidad de fuente de carbono que le sea fácil
de metabolizar, y a medida que crezca la biomasa, vamos cambiando la fuente de
carbono por D – glucosa.
• Corynebacterium sp se encarga del paso de dicho intermediario a el producto final, también con
una eficiencia del 94%.
o El intermediario es reducido hasta ácido glucónico
De esta manera, decimos que existen nuevas líneas de investigación que se centran en hacer de este
proceso un proceso dado en una sola etapa. Para ello, están clonando en Erwinia los genes de
Corynebacterium responsables de la reacción; sin embargo, ello presenta ciertos problemas, como los
dados por la inhibición por altas concentraciones de glucosa y baja productividad.
Por lo tanto, el glicerol actúa como fuente de C, en un proceso que es aerobio. Como producto metabólico
recogeremos la dihidroxiacetona. Esta producción es muy interesante ya que sus usos van destinados
hacia la producción de lociones solares y cosméticos.
Aunque, como podemos entender, las bacterias del ácido acético son muy usadas; pueden no ser las
únicas (cepas de Gluconobacter Melanogenus se ha visto que, en medio enriquecido con O2, pueden
llegar a triplicar su producción).
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
PRODUCCIÓN DE PROSTAGLANDINAS
Son ácidos grasos insaturados de 20 carbonos, que funcionan como hormonas. Se usan como
anticonceptivos, para aliviar dolores del parto o para tratamientos de enfermedades congénitas de
corazón. Es importante recalcar que pueden obtenerse por transformaciones microbianas (con hongos)
de ácidos grasos insaturados.
TRANSFORMACIÓN DE ANTIBIÓTICOS
El objetivo de este campo no es producir como tal, sino llevar a cabo transformaciones de sustancias
conocidas para ampliar así su espectro, mejorar su absorción oral, y reducir su toxicidad y resistencia.
TRANSFORMACIÓN DE PESTICIDAS
Es importante mencionar que todos los pesticidas no son biodegradables, depende del número de
halógenos y de donde estén situados. Ellos pueden transformarse en reacciones para la obtención de
energía, o en reacciones de cometabolismo (básicamente quiere decir que es una sustancia el pesticida
capaz de producir procesos metabólicos, lo que pasa es que su generación no implica una producción de
energía como tal, sino que es parte de la ruta y ya).
Al hablar de la capacidad de estos pesticidas para que se den reacciones metabólicas o cometabólicas (no
implica ganancia de energía), debemos decir que las que sí implican una ganancia son las reacciones redox.
Las reacciones metabólicas son otras, como la hidroxilación o la condensación. Además, las reacciones
microbianas de transformación decimos que son muy específicas, algo que las hace más ventajosas
respecto a las reacciones químicas (la especificidad conlleva un gasto mayor, a su vez).
Entrando en materia, decimos que las arqueas metanógenas y bacterias sulfato reductoras, trabajando
en anaerobiosis, van a crecer con dicho sustrato y, como fruto de su metabolismo, generarán reacciones
de cometabolismo, con el que eliminarán cloros o ciertos halógenos.
Entonces, en un tratamiento dado, por ejemplo, sobre tierra, las condiciones de anaerobiosis
mencionadas podrían darse encharcando dicha tierra con exceso de agua. Sin embargo, ¿cómo sabemos
cuánto tiempo debe estar en anaerobiosis?
Para entenderlo, lo ejemplificamos con degradadores del petróleo. Para ello, aislamos de nuestro hábitat
metabolitos que degradan el petróleo (lo que nos interesa en nuestro caso ejemplo). Entonces, lo
echamos en placa y sembramos. Si no crece, es porque aún tiene muchos cloros que les resulta tóxico e
impide su crecimiento. Vamos muestreando ese hábitat hasta que el microorganismo crezca, lo que
significa que ya se han eliminado los cloros que eran tóxicos, debido a que se ha dado esa reacción
cometabólica y transformación tras haber mantenido las condiciones óptimas necesarias para ello.
Entonces, una vez visto esto, iremos tratando la transformación y degradación de diferentes compuestos
o elementos
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Los compuestos halocarbonado son moléculas de hidratos de carbono en el que alguno de los hidrógenos
se ha sustituido por un halógeno. Es importante en la transformación de pesticidas la eliminación de
alguno de estos halógenos (no todos); los suficientes para que no sea tóxico. Esto se logra mediante una
deshalogenación reductiva, lo que es un proceso cometabolico (no lo hacen para obtener energía, sino
que lo hacen como producto de su crecimiento).
Para ello, las condiciones serán anóxicas; mientras que las bacterias se deben tener en trofofase (hace
falta que las bacterias estén metabolizando). Este proceder es el dado para aquellas sustancias que
presenten un alto número de halógenos, y viene dado por arqueas metanógenas y BSR.
Por otro lado, en caso de que hablemos de sustancias con un bajo número de halógenos, lo que se llevará
a cabo es un proceso de oxidación hasta ácido graso, y una posterior beta-oxidación hasta CO2 y agua.
PERCLOROETILENO
Si solo tuviéramos el etileno, podría oxidarse con los hidrocarbonoclásticos en aerobiosis y
biomineralizarse a CO2 y agua. Para que esto pase, hay que quitarle cloros. No habrá que quitar todos,
sino solo tantos como dejen de ser tóxicos para los microorganismos hidrocarbonoclásticos y otros.
Esta molécula no puede ser atacada porque tanto cloro resulta tóxico, no por otra cosa. Se les quita por
transformaciones microbianas en anaerobiosis. Este proceso se llama deshalogenación reductiva, y lo
hace una población microbiana formada por arqueas metanógenas y bacterias sulfatoreductoras en
condiciones de anaerobiosis.
En estas condiciones van eliminando los cloros y sustituyéndolos por hidrógenos. Cuanto más tiempo los
tengamos en anaerobiosis, más cloros se van a eliminar y podemos llegar a una sustitución parcial o total
EJEMPLO 1
Se contamina el jardín con un derrame de pesticida (PCE)
Primero encharcar para crear condiciones de anaerobiosis (encharcando con aguas residuales, de forma
que los microorganismos que van a degradar el pesticida, mostrados a continuación, van a encontrarse
en condiciones óptimas), donde las arqueas metanógenas y las bacterias sulfato reductoras van a
comenzar a deshalogenar, van a degradar el pesticida, pero sin obtener energía.
Como sabemos cuánto tiempo tenemos que estar. Tenemos que muestrear a lo largo del tiempo, es decir,
tomamos un microorganismo de ese hábitat y le metemos una muestra de la zona del jardín contaminada
con PCE como única fuente de carbono y dependiendo de si muere o no el microorganismo querrá decir
que requiere más tiempo o que no.
Para parar el proceso aramos y creamos condiciones de aerobiosis donde los microorganismos van a
poder degradar estos PCE debido a que las arqueas metanógenas y bacterias sulfato reductoras le han
quitado los cloros (Cl2 se evapora) que le hacían que esa sustancia fuese tóxica, por lo que ahora en
condiciones de aerobiosis y sin toxicidad van a poder actuar los microorganismos hidrocarbonoclásticos
reduciendo el pesticida a CO2 y H2O.
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DDT no es fácilmente biodegradable, debido a que tiene demasiada acumulación de cloros. Por ello, hay
muy pocos microorganismos que pueden llevar a cabo esa deshalogenación.
Su biodegradación viene dada por hidroxilaciones del anillo aromático y posterior ruptura del mismo. Es
una degradación lenta como tal, pero más favorable en anaerobiosis. A veces lo que sucede es que no se
llega a la mineralización, sino que se forman polímeros.
Entonces, aunque estos compuestos no sean el sustrato de nuestros microorganismos, estos son capaces
de degradarlo (por transformación), pudiendo llevar a cabo una transformación de degradación total o
parcial, como ya habíamos mencionado (siempre que alguna enzima no se de cuenta que se está actuando
sobre un sustrato que no es el propio). De esta manera se puede obtener la biodegradación. A
continuación, se representa un ejemplo
Como vemos en la imagen, las cadenas con los grupos nitro van a poder ser intercambiados por grupos
amino, y es algo que nos interesa debido a su toxicidad. Sin embargo, no hay ningún proceso que las
pueda eliminar como tal, solo se pueden sustituir.
Este programa de biorremediación, si lo hacemos en aerobiosis, solo podremos sustituir un grupo nitro;
mientras que en condiciones de anaerobiosis podemos llegar a sustituir los 3 nitros (tal y como se
representa en la imagen). No hay ningún proceso que, con el resultado, nos lleve a radicales hidrógenos
que puedan ser aprovechados por otros organismos. Entonces, el TNT no es biodegradable** (no
podemos reducirlo a CO2 y agua), como mucho, lo que hacemos es reducir su toxicidad. Al final,
tendremos una molécula que polimeriza y que se quedará en el ambiente para siempre (recalcitrante).
Esto es un problema muy persistente en los campos de tiro.
Es un ejemplo de reacción metabólica, pueden usar alcanos e hidrocarburos alicíclicos y aromáticos como
fuente de carbono para obtener energía. Estos se llaman bacterias hidrocarbonoclásticas que hemos
mencionado ya en el ejemplo anterior. Entre ellas están Artrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aspergillus…
Son géneros que estarán en los hábitats de por sí, cuando se produce un vertido de petróleo no
necesitamos inoculantes, sino que hay que favorecer el crecimiento de los que ya hay ahí para que puedan
degradar el petróleo.
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Como sabemos, el petróleo se trata de una mezcla de hidrocarburos. Algunos de estos serán fuente de
carbono de microorganismos quimioorganotrofos. Los hidrocarburos en cuestión serán los de cadena
media. Los de cadena corta suelen ser volátiles, por los que se evaporan; mientras que los largos suelen
ser tóxicos, por lo que no pueden ser biodegradables y se deben retirar manualmente (no son
biodegradables porque poseen un PM muy elevado para los microorganismos, al igual que pasa con el
plástico).
Los hidrocarburos de cadena media son fuente de quimiorganotrofos heterótrofos que viven en el medio.
Lo usarán como fuente de C en un proceso de respiración aerobia. Ese hidrato de C será degradado, tras
una fosforilación oxidativa, a CO2 y H2O.
A este proceso se le conoce como biomineralización: paso de compuesto orgánico a sus componentes
inorgánicos más simples.
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• Fuente de C: petróleo añadir tierra para que el hidrato de carbono sea del 10% (dilución fuente
de carbono)
• Fuente de Nitrógeno: medir el índice NPK del suelo y si está bien, no añado nada, si está mal,
puedo añadir una sal, peptona
• Fuente de fósforo por encima de 10mM
• T ambiental
• Agua y arar para mantener condiciones aerobias
• pH neutro
Con mantener esta serie de condiciones, potenciamos a los microorganismos degradadores de petróleo,
teniéndolos en condiciones óptimas de crecimiento. Mientras estén en trofofase, ellos serán los
encargados de la degradación.
Además, debemos recordar que antes de la preparación del cultivo, tenemos un mix de hidrocarburos de
los cuales nos interesan los de cadena media. Los de cadena corta se volatilizan; mientras que los de
cadena larga se separan como alquitrán de manera manual.
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INTRODUCCIÓN
A comienzos del siglo XX se descubrió en Japón que el glutámico posee cualidades mejoradoras del sabor
de los alimentos; hasta que se vió que un microorganismo concreto (Corynebacterium glutamicum) era
capaz de producirlo y excretarlo en grandes cantidades. Su producción por métodos bioquímicos se
extendió, al igual que su uso: mejora del sabor y conservación de alimentos; aditivos de alimentos
humanos y piensos animales; medicina; industria química; o industria de cosméticos.
Ahora sería interesante destacar que hay procesos que compiten en la producción de aminoácidos. Estos
son la extracción a partir de proteínas hidrolizadas, la síntesis química y la producción por
microorganismos. Dentro de esta última, hay tres enfoques posibles: fermentación directa de
aminoácidos, producción mediante técnicas de ADN recombinante o producción con enzimas
inmovilizadas.
Este aminoácido en concreto es el más importante desde el punto de vista cuantitativo. Su producción es
muy alta, presentando un precio de 1,2 ADA/Kg. Sus usos son variados: cocina oriental, sopas, salsas,
snacks, etc.
Es importante mencionar las características de las cepas productoras de L-glutámico: son cepas de
bacterias Gram-positivas, normalmente no móviles y no esporulantes del grupo Brevibacterium-
Corynebacterium, incluyendo Arthrobacter y Microbacterium. Todas las cepas comerciales tienen un
buen rendimiento de producción (más de 30g/l glutámico).
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
PRODUCCIÓN
Ahora, una vez abiertos los poros en la pared celular, debemos hacer lo mismo en la membrana. Si
aumentamos la permeabilidad de la membrana citoplasmática, aumentaremos por ende la producción y
excreción de glutámico. La permeabilidad de la misma se puede aumentar por tres mecanismos (actuando
sobre diferentes auxótrofos, adición de ácidos grasos saturados o adición de penicilina). Procederemos a
describirlos:
• Biotina: Sabemos que nuestras bacterias en cuestión son auxótrofas naturales para la biotina
(es el único caso que veremos de auxótrofos naturales) por lo que, si hiciéramos a nuestro
medio de cultivo mínimo en biotina, su membrana se volvería anómala, no tan robusta. Cabe
destacar que no puede faltar la biotina, simplemente, al ser mínimo, debemos añadir una
pequeña cantidad para que no sintetice bien los ácidos grasos de su membrana.
o Podemos explicar el mecanismo de la deficiencia de biotina, aunque la profesora se lo
pasó por los huevos: si la concentración de biotina es mayor de 5 microgramos/l, la
biotina funciona como grupo prostético de la acetil-CoA carboxilasa (la primera enzima
de la ruta biosintética de ácidos grasos), lo que conlleva la síntesis de ácido oleico,
generando así un gran contenido de fosfolípidos de membrana. Entonces, el glutámico
se retiene y acumula hasta que, por retroinhibición, se detiene la síntesis del mismo. En
caso de que la concentración sea inferior a la estipulada, se evita dicha inhibición.
o Por el contrario, si la concentración de biotina es menor a 5 microgramos /l, va a
disminuir la síntesis de ácidos grasos → disminución de fosfolípidos → aumento de
permeabilidad → excreción de glutámico → se evita la retroinhibición
• Ácido oléico: Si nuestra bacteria es auxótrofa para el oleico, deberíamos hacer lo mismo, pero
con respecto al ácido oleico.
• Glicerol: Si nuestra bacteria es auxótrofa para el glicerol, deberíamos hacer lo mismo, pero con
respecto al glicerol.
Estos son los tres casos de auxótrofos posibles, siendo el de la biotina el típico debido a que, como ya
hemos mencionado, nuestras bacterias lo son de manera natural.
• Ácidos grasos: Por adición de ácidos grasos saturados, de una longitud de 16 a 18 carbonos, o
sus derivados. Este método lo usaremos en el caso de que no sean auxótrofos, ya que también
intervienen en la propia síntesis de ácidos grasos de la membrana, al reprimir a la enzima acetil-
CoA carboxilasa.
• Penicilina: Por adición de penicilina, siguiendo el mismo proceder que en la pared celular.
Al tratar este tema, estamos viendo que solo nos centramos en el L-Glutámico, pero ¿por qué? ¿Por qué
no otros aminoácidos? Las razones se exponen a continuación:
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Hasta aquí todo lo podéis memorizar bien, pero ¿sabéis qué puto significado biológico tiene todo esto de
la producción de glutamato? Pues no, ni yo tampoco, así que lo copio tal cual la diapositiva:
• Si la bacteria crece en un medio pobre en biotina (suelo, agua), la excreción sirve para reducir la
presión sobre la membrana citoplasmática (más permeable).
• Al limitar la producción de lactato, sirve para mantener neutro el pH.
• Sirve para la regeneración de NAD(P)+:
Esta reacción está catalizada por una glutamato deshidrogenasa (GDH) dependiente de NADPH. El
metabolismo de los productores de glutámico se trata de una oxidación incompleta. Aunque la oxidación
incompleta rinde menos ATP que la completa, es más ventajosa que la fermentación anaerobia. Pues el
glutamato nos permite regenerar el NAD(P)+, para poder llevar a cabo la reacción y obtener así energía.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
El objetivo es buscar las condiciones óptimas para nuestras bacterias con las que, en este caso,
lograríamos una conversión del 60% del carbono que le añadamos hacia L-glutámico. Los parámetros en
cuestión que afectan al proceso son:
• Fuente de carbono:
o Monosacáridos: glucosa y sacarosa (también fructosa, maltosa, ribosa y xilosa)
o Melazas de caña de azúcar o remolacha azucarera sin sustancias tóxicas; adicionadas de
penicilina o ácidos grasos porque las melazas contienen biotina por lo que habrá que
controlarla
o Hidrolizados de almidón
o Acetato
• Fuente de Fósforo
• Fuente de nitrógeno:
o Sales de amonio o amoniaco, que lo que permiten es controlar el pH.
o Urea, donde la mayoría de productores son ureasa-positivos.
o Factores de crecimiento:
▪ Biotina
▪ Cisteína
• Sal
• Factores de crecimiento:
o Biotina: dependiendo de la fuente de carbono; 10% de glucosa → 5 ug/L de biotina,
acetato → 0,2 – 1,0 ug/L
o Cisteína. Tiamina (medios con n alcanos). Hay que ponerlo sí o sí, pero tiamina solo si la
fuente de carbono son alcanos.
• pH neutro
• Temperatura ambiental
• Penicilina: en pocas cantidades, pero suficiente
• Suministro de oxígeno: kd es de 3,5 *10-6mol O2/atm*min*ml
Las células no excretan fácilmente los aminoácidos, ya que son sillares constitutivos de biomasa, para
cuya síntesis la célula gasta ATP. Para los procesos industriales ha habido que recurrir a mejorar las cepas,
en la mayor parte de los casos por métodos genéticos que tienden a alterar los mecanismos reguladores
originales.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
La estrategia que vamos a seguir es obtener mutantes defectivos para la enzima que usa a dicho
intermediario como sustrato. Esto supone que el mutante es auxotrófico para el aminoácido de esa ruta.
Así, se trata de seleccionar auxotrofos para ciertos aminoácidos, tras un tratamiento previo mutagénico.
PRODUCCIÓN DE L – ORLITINA
Destacar que en este caso estos aminoácidos son intracelulares y que, además, hay que preocuparse de
las enzimas que degradan estos aminoácidos porque la bacteria los necesita, son intermediarios, por lo
que, como hemos dicho anteriormente, habrá que hacer u mutante que inactive las enzimas que lo
degradan.
Entre las ventajas que presenta este proceso destacar que la cepa va a poder crecer en medios complejos
(indefinidos) que son más baratos.
• Selección de mutantes resistentes a algún análogo estructural del aminoácido, que tenga efectos
tóxicos sobre cepas silvestres, pudiendo deberse este a:
o Su unión al sitio alostérico de la primera enzima de la ruta
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
o Su unión al represor
o En ambos casos desconecta la síntesis de ese aminoácido
• Los mutantes buscados pueden ser:
o Afectados en la primera enzima de la ruta biosintética (insensible a la retroinhibición)
o Afectados en el represor (el mutante no puede reprimir los genes biosintéticos, ni
siquiera en presencia del aminoácido)
• Selección de los mutantes auxotrofos
SUPERPRODUCCIÓN DE HISTIDINA
• Mutante resistente al anti metabolito tóxico de la histidina, y mutarlo otra vez para que se
altere la enzima que degrade la histidina. También se podrían hacer dos mutantes por separado
y posteriormente realizar una fusión de protoplastos.
o Destacar que hay dos antimetabolítos tóxicos, uno que afecta al sitio alostérico de la
primera enzima de la ruta (2MH) y otro que afecta a la regulación de la primera
enzima de la ruta (TRA)
• Retrocruzar con cepa silvestre
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Lo de la empresa es que hicieron dos mutantes anti metabolitos tóxicos y los fusionaron (fusión de
protoplastos). Se muestra a continuación.
La regulación se logra porque uno o unos pocos de los productos finales de la ruta ejerce retroinhibición
sobre la primera enzima común. Algunos ejemplos de rutas ramificadas son la familia del aspártico (lys,
met, thr, ile), la familia del piruvato (val, leu) y la familia de aminoácidos aromáticos (trp, phe, tyr)
PRODUCCIÓN DE LISINA
Corynebacterium glutamicum (hay que saber que este microorganismos produce lisina por una ruta
poco regulada)
Mutante resistente al anti metabolito tóxico de la lisina y al igual que antes, mutar la enzima que
degrada la lisina.
Por ejemplo, en Brevibacterium flavum, un mutante Thr-, Ile-, Met-, produce 34 g/L de lisina. Ello se
debe a:
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
El uso de tecnología de ADN recombinante permite incrementar la dosis génica de enzimas que
normalmente actúan como cuellos de botella mediante el uso de vectores plasmídicos.
• Pérdida de los plásmidos (las cepas deben crecer durante muchas generaciones en los tanques
de fermentación)
• Difícil de conseguir una expresión balanceada de los genes implicados
• Problemas con productos tóxicos resultantes de la superexpresión heteróloga
PROCESOS DE PRODUCCIÓN
Condiciones de trofofase en todos los casos anteriores, además de que, si somos capaces de jugar con la
permeabilidad de la membrana junto con un medio hipotónico fuera, vamos a conseguir que el metabolito
sea extracelular.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Tras hacer estos programas de mejoras, vamos a acumular muchas mutaciones negativas (infección por
fagos), por lo que tendremos que retrocruzar por fusión de protoplastos con la cepa silvestre para
eliminar esas mutaciones negativas y posteriormente, realizar un rastreo.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
INTRODUCCIÓN
Los nucleótidos son metabolitos primarios son tipo II intracelulares, vamos a tener que trabajar con
mutantes para que sean extracelulares. Los microorganismos van a necesitar estos nucleótidos o
nucleósidos, de forma que nosotros solo vamos a obtener lo que les sobra (velocidad de producción va a
estar desplazada con respecto a la velocidad de crecimiento).
Los microorganismos van a producir nucleótidos, pero los van a expulsar como nucleósidos como forma
general, hay algunas excepciones.
• Potenciadores de sabores
o Ácido guanilico (5’ – GMP)
o Ácido ionosinico (5’ – IMP)
o Ácido xantilico (5’ – XMP)
• Usos terapéuticos (quimioterapia y
herpes)
Hay que tener ojo con la fuente de carbono, hay que usar una fuente impura, pero con mucho cuidado de
que no tengan nada que pueda ser tóxico. En este caso estaría justificado el uso de fuentes puras.
La ruta del GMP está más favorecida que la del AMP. Cuando
queramos producir nucleótidos, en la mayoría de los casos
vamos a tener que:
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
PRODUCCIÓN
Hay que superproducir el IMP, lo desfosforilamos dentro de la célula, lo acumulamos y excretamos como
nucleósido, lo recuperamos del sobrenadante y lo fosforilamos a nucleótido. Sin embargo, hay algunos
nucleótidos que las células sí pueden expulsar, y es este.
Que puedan expulsarlo como nucleósido hay más microorganismos; como Bacillus, Brevibacterium,
Corynebacterium, Streptomyces y Saccharomyces. Todos quimiorganotrofos heterótrofos ambientales.
Saccharomyces es el único eucariótico de aquí.
Crecerlos en torno a la neutralidad y el último en torno a pH 5. Todos pueden usar la misma fuente de
carbono, se suele usar almidón hidrolizado o glucosa. De nitrógeno puede ser amoniaco. Son m.o.
aerobios o aerotolerantes, necesitaremos poner aireación en el cultivo
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
• IMP es un nucleótido, pero nosotros lo vamos a excretar como nucleósido. De forma que hay
que hacer una segunda cepa para tener una actividad nucleotídica aumentada
• Actividad nucleosídica reducida
• Permeabilidad a nucleósidos aumentada
• Retrocruzar con una cepa silvestre (lo normal es realizarlo mediante la fusión de protoplastos)
En Bacillus para excretar IMP al medio hay que jugar con la penicilina añadiendo siempre concentraciones
menores que la concentración mínima inhibitoria, Saccharomyces no podremos usar penicilina porque es
un hongo y la penicilina es un antibiótico. También lo van a producir Brevibacterium, Corynebacterium y
Streptomyces.
Para la producción usar como fuente de carbono almidón hidrolizado o glucosa, como fuente de nitrógeno
NH3, pH 6 y condiciones aerobias.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
MEDIO DE CULTIVO
• Fuente de Carbono: melazas a menos que usemos biotina (solo para Corynebacterium y la otra)
para aumentar la permeabilidad de la membrana o un hidrolizado de almidón, hidrolizado de
celulosa
• Fuente de nitrógeno: extracto de levadura (messirve como fuente de N2 y como fuente de AMP,
y GMP de forma que la ruta se corta por la zona de GMP)
• Fósforo y Azufre lo medimos
• Sal
• Agua
• Condiciones aerobias
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
PRODUCCIÓN DE ADENOSINA
Tendremos que conseguir mutantes con las siguientes condiciones
(microorganismo usado Bacillus subtilis):
PRODUCCIÓN DE ATP
Fosforilación de adenina y adenosina en presencia de fosfato y glucosa o metanol. El microorganismo
productor es Candida noidinii
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
INTRODUCCIÓN
Si queréis una contextualización histórica, miradlo en el anexo número tus putos muertos, gilipollas.
En cuanto a los principales productores de antibióticos, tenemos a las bacterias y a los hongos.
• Las bacterias producen más de 6000 antibióticos. Es muy habitual que una misma especie
produzca varios antibióticos diferenetes.
o Destacando el género Actinomicetos (Streptomyces y parientes), que producen más de
5000 antibióticos.
o El otro género productor a destacar es Bacillus (producción de antibióticos peptídicos).
Es muy habitual además que una misma especie produzca varios antibióticos diferentes.
• En cuanto a los hongos, destacamos:
o Ascomicetos y Deuteromicetos (Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus). Estos
pueden servir para inhibir el crecimiento de microorganismos competidores.
Como podemos intuir, las aplicaciones de los antibióticos son muchas y muy variadas: en clínica (contra
patógenos de humanos y animales); en agricultura (contra patógenos vegetales); como agentes
antitumorales (algunos antibióticos con anillos policíclicos se intercalan en la doble hélice del ADN de
células en proliferación activa, por lo que se pueden usar como citostáticos frente a tumores malignos);
como conservantes de alimentos; o en ganadería.
En cuanto a los tipos de antibióticos, los clasificaremos según dos parámetros diferentes:
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Uno de los objetivos es obtener mejoras de la fermentación industrial y del rendimiento, con reducción
de costos. Para ello, lo que se busca es un desarrollo aplicado de un nuevo antibiótico (su coste es muy
alto, por lo que muchos no llegan a la fase clínica).
Otro de los campos a los que se busca llegar cada vez más (ya lo hace) es a la medicina humana. Para su
aplicabilidad en dicho campo, debe cumplir una serie de condiciones: lograr mejoras de actividad y
disminución de efectos colaterales indeseados; tener un amplio espectro de acción antimicrobiana;
presentar una mayor selectividad contra ciertos patógenos; además de constituir una serie de
propiedades farmacológicas mejoradas.
Finalmente, el objetivo final viene dado por una visión de futuro en la que se necesitan antibióticos
efectivos frente a micosis sistémicas, frente a protozoos, virus, parásitos y tumores; también frente a
patógenos de plantas; por el futuro surgimiento de cepas resistentes.
BASES FISIOLÓGICAS
Como bien sabemos, son metabolitos secundarios que se producen en la idiofase. Suelen ser moléculas
complejas, con rutas biosintéticas con regulaciones que no se conocen. Por tanto, la fermentación es
dificultosa y no es posible la fermentación continua. Además, parece que su producción está acoplada a
la formación de endosporas.
En cuanto a su producción, decimos que está regulada por la represión catabólica. Entonces, para evitarla,
lo que se hace es añadir la fuente de C, N y P (<10mM) a pequeños incrementos, para así aislar a aquellos
mutantes insensibles a la represión catabólica. En algunos casos parece existir un mecanismo de
retrorregulación, por lo que podría evitarse si el antibiótico se excreta.
Como la producción de antibióticos parte de metabolitos primarios, es posible diseñar mejoras mediante
la manipulación de los mecanismos de control de estos metabolitos primarios precursores (es una forma
de mejorar la producción de metabolitos secundarios, como ya vimos, actuando sobre la del primario del
que depende).
• 1ª Fase: comienza con esporas, que germinan y crecen. Las células estarán sumergidas, habrá
aireación y un buen suministro de nutrientes (trofofase).
• 2ª Fase: Al entrar en la fase estacionaria (idiofase) hay que añadir pequeños incrementos de
fuentes de C, N y P.
• Mutagénesis al azar y screening: se trata de llevar a cabo una mutagénesis (con altas dosis de
mutágeno), seguido del aislamiento de los mutantes. Entonces, haremos bioensayos con el
filtrado. Es un método laborioso y poco efectivo.
• Recombinación in vivo: Sabemos que hay diferentes técnicas para ello:
o Sistemas sexuales y parasexuales: Todos los genes que regulan la producción de
antibióticos están agrupados en un operón, entonces es fácil mejorar las cepas
mediante tecnología de ADN recombinante mutando en este operón. Si hacemos un
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Para dicho rastreo, debemos llevar a cabo un aislamiento de mutantes resistentes a esta inhibición:
cultivar en medio mínimo con análogo de lisina (S-(2-aminoetil)-L-cisteína). Tales mutantes
superproducen lisina, y así, cefamicina.
Otro ejemplo de rastreo racional sería el dado para algunos antibióticos que son tóxicos para el organismo
productor. El rastreo se basaría en buscar cepas con mayores niveles de resistencia a su propio antibiótico,
permitiendo así incrementos de productividad.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
INGENIERÍA GENÉTICA
Antes de su descripción, debemos recalcar, como bien sabemos, que se usa poco. Esto es debido a que
requiere mucha información sobre el microorganismo, que generalmente no la tenemos.
Sin embargo, de aquellos de los que sí se tiene información y secuenciado el puto genoma, pues esta
técnica se ve facilitada ya que genes que codifican la producción de antibióticos suelen agruparse en un
determinado locus. Además, se pueden buscar homologías con genes ya clonados. Para ello, se pueden
diseñar sondas de ADN o búsquedas por ordenador en genomas secuenciados. A su vez, como ya hemos
visto en otras asignaturas, si se dispone de una enzima purificada de la ruta biosintética, se pueden usar
Ac frente a esa enzima para buscar los genes. A continuación, se presentan las aplicaciones que tiene la
ingeniería genética en la producción de antibióticos:
• Preparación del inóculo: Se parte de cultivos conservados, que pueden pasarse hacia agar
inclinado, del que se derivan cultivos secundarios (para evitar la fase lag). Será a partir de estos
cultivos secundarios donde se generen gran cantidad de esporas.
• Fase de crecimiento y producción de nutrientes: el medio tiene exceso de nutrientes, por lo que
el cultivo crece rápidamente durante uno o dos días, produciéndose abundante biomasa.
• Fase de producción del antibiótico, que va según el sistema de trabajo:
o En sistemas discontinuos: el nutriente clave pasa a ser un nutriente limitante, por lo
que se da comienzo a la idiofase y, por ende, producción de nuestro metabolito
(antibiótico). Dicho nutriente limitante será la glucosa para Penicillium, y el fosfato para
Streptomyces.
o En sistemas discontinuos alimentados: se mantiene la idiofase más tiempo añadiendo
el nutriente clave de modo muy controlado y en momentos determinados.
• Etapa de cosecha (recuperación y purificación del antibiótico): son extracelulares. Se separa la
biomasa del sobrenadante por filtración o centrifugación. Entonces, se lleva a cabo una
extracción (por solventes, intercambio iónico, ultrafiltración, etc.), para así precipitar y cristalizar.
De esta manera habríamos logrado recuperar nuestro antibiótico y purificarlo.
ANTIBIÓTICOS BETA-LACTÁMICOS
Los betalactámicos son los antibióticos más importantes, siendo las penicilinas y cefalosporinas los
agentes terapéuticos antiinfecciosos más empleados.
Se llaman así porque tienen el núcleo beta lactámico básico, y puede tener una estructura diferente según
las variedades. Cada uno es producido por microorganismos distintos, ligada a especie
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PENICILINAS
El núcleo de las penicilinas (penam) deriva del ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un
anillo beta-lactámico condensado con un anillo tiazolidínico. Decimos que las diversas penicilinas
dependen de la cadena lateral unida al grupo amino del carbono 6. Los productores de penicilina son
Penicillium y Aspergillus.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
TIPOS DE PENICILINAS
• Naturales: no se añaden precursores de cadenas laterales al medio (penicilina G).
• Biosintéticas: se añaden precursores de cadenas laterales (penicilina V y penicilina F).
• Semisintéticas: se parte del 6-APA (logrado a su vez por tratamiento de la penicilina G), para
luego acilarlo químicamente con diferentes acil-cloruros. Como ejemplos de penicilinas
semisintéticas tenemos:
o Penicilinas insensibles a penicilinasas: meticilina (resistente a ácidos), oxacilina y
cloxacilina (resistentes a ácidos).
o Penicilinas con actividad frente a Gram-negativas: ampicilina y amoxicilina.
o Penicilinas con grupos laterales cargados negativamente: carbenicilina. El hecho de
que sus grupos laterales estén cargados negativamente, hace que estas penicilinas
presenten una mayor estabilidad frente a beta-lactamasas periplásmicas. Se emplean
frente a microorganismos causantes de infecciones hospitalarias, como Pseudomonas,
Enterobacter, Serratia y algunas especies de Proteus.
Para la biosíntesis de la penicilina, cisteína y valina son dos aminoácidos que deben estar en el medio, ya
que con su adición permite que se forme un anillo beta-lactámico condensado en otro, formando así una
estructura conocida como isopenicilina N y formándose como residuo ácido aminoadípico. De la
isopenicilina N, recalcamos la importancia del radical situado en el carbono 6.
Una vez formada dicha molécula, el siguiente paso es romper el radical del carbono 6 y añadirle algo
nosotros. Si es algo que el microorganismo produce por su propia cuenta, la penicilina es natural; si es
algo que hemos incorporado nosotros, la penicilina será sintética.
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Más tarde (años 70) se comenzó a usar la selección racional, recombinación in vivo y fusión de
protoplastos. Aunque la ingeniería genética aún no ha tenido resultados prácticos industriales, se han
localizado y aislado genes para la síntesis de la penicilina, se dispone de una genoteca de P. chrysogenum
(cepa de mayor rendimiento) y de un sistema de transformación del hongo, que permite hacer
manipulación genética in vitro.
La mejora de cepas no solo va dirigida a la mejora en el producto, sino también a la mejora del proceso:
selección de esporulación mejorada, de morfología en bolitas, de resistencia a las fuerzas de cizallamiento,
de resistencia a las cadenas laterales tóxicas…
El microorganismo usado será aquella cepa de mejor rendimiento: Penicillium chrysogenum. Recordar
que Penicilium es un hongo y como tal, va a producir micelio, por lo que, para la producción de las mismas,
se llevará a cabo una fermentación sumergida discontinua, controlando constantemente las condiciones
el medio para evitar que el micelio crezca excesivamente. Se realiza en fermentadores de 40.000 a
200.000 litros. En ellos, se realizará un control del suministro de oxígeno para mantener la aerobiosis (0.4-
0.8 mM/l·min). Además, se precisará de unos impulsores de turbina, que trabajarán a 120-150 rpm.
Si no lo podemos hacer en fermentación sumergida también se puede realizar en sólido, pero en este caso
se va a dificultar la recuperación del antibiótico.
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o Destacar que antes de inducir la idiofase, vamos a estar en trofofase, para aumentar la
densidad microbiana, y en este caso, si usamos pH ácido. Cuando tengamos ya la
suficiente densidad microbiana ponemos pH neutro e inducimos idiofase como hemos
dicho anteriormente.
• Cadena lateral (fenilacético o fenoxiacético), que se suministra de modo continuo y
cuidadosamente controlado, para evitar los efectos tóxicos. Cabe recordar que si a nuestro
medio en cuestión le añadimos cadenas laterales, la penicilina que se producirá será biosintética.
PRODUCCIÓN EN PLANTA
En el fermentador pintado de amarillo, decimos que se produce la trofofase, para luego forzar la idiofase.
Al ser extracelular nuestro metabolito, filtramos el micelio, quedándonos con lo que se cuela, que es el
sobrenadante. Finalmente se purifica por cristalización.
Una parte difícil del proceso es lograr la aireación, que es dependiente de la agitación.
CEFALOSPORINAS Y CEFAMICINAS
Los organismos productores de estas moléculas son los hongos de los géneros Cephalosporium,
Acremonium, Emericellopsis y Paecilomyces. Son moléculas de un amplio espectro, que presentan una
mayor estabilidad frente a la enzima penicilinasa de los estafilococos.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Decimos entonces, con el fin de diferenciar cefalosporinas de cefamicinas, que, aunque ambas son beta-
lactámicos, presentan divergencias en cuanto a sus radicales, como ya hemos mencionado. Además, es
importante recalcar que la cefalosporina es producida por un hongo; mientras que las cefamicinas las
producen actinomicetos. En cuanto a las condiciones de cultivo para obtener biomasa, en cada uno de los
casos será diferente, debido a sus condiciones metabólicas. En ambos casos, el problema del micelio es
igual que al caso anterior, ya que va a dificultar las condiciones de aireación y agitación.
Como ya habíamos hecho mención, las cefalosporinas constituyen el grupo concreto más importante de
antibióticos, con una cuota de mercado de casi el 30%. Se producen comercialmente unas 15
cefalosporinas o cefamicinas diferentes (espectro amplio).
BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN
A diferencia de las penicilinas, la cadena lateral no se puede cambiar
biológicamente cambiando el medio de cultivo, por lo que las
cefalosporinas son semisintéticas o naturales.
Ahora veremos que la diferencia entre cefalosporina y cefamicina) es lo que está unido al carbono 7, como
ya habíamos mencionado. Lo que va unido puede ser hidrógeno u otra cosa, y constituye el residuo 3.
Entonces, los derivados metabólicos entran al residuo 2 (del residuo 1 no nos preocupamos); y del residuo
3, decimos que si es cefalosporina, puede ser cualquier cosa; en el otro caso, siempre habrá un grupo
metoxi-.
Por tanto, a diferencia de las penicilinas, que podían ser naturales, sintéticas o semisintéticas; las
cefalosporinas y cefamicinas no serán biosintéticas. Esto es debido, principalmente, a que los
microorganismos productores de las mismas (cephalosporium y actinomicetos) son muy sensibles a
cualquier cadena lateral. Por lo tanto, pueden ser naturales o semisintética. Respecto a este último tipo,
decimos que pueden ser semisintéticas si accedemos y modificamos el residuo 1 (ese que nos sudaba la
polla). Entonces, rompemos el residuo 1 y añadiremos lo que nos salga de los huevos, eso sí, a partir de
una de esas moléculas de tipo natural.
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Respecto a la regulación, se da una represión catabólica por glucosa, glicerol, maltosa; además de por
fosfato y nitrógeno, por lo que debemos controlar bien sus cantidades para evitar dicha regulación.
Respecto a los hongos, pequeñas cantidades de lisina estimulan la producción de cefalosporina, mientras
que a mayores concentraciones se ejerce retroinhibición sobre la síntesis de alfa-AAA.
En cuanto a la regulación de la lisina, debemos añadir que es muy compleja. Tenemos que tener cuidado
si queremos producir cefalosporina, puesto que no podríamos trabajar con mutantes que super
produzcan lisina, debido a que la retrorregulación en Cephalosporium es muy difícil de inhibir. Lo que sí
haremos es añadir un poco por nuestra cuenta, pero no podríamos obtener dichos mutantes.
Por tanto, en nuestro medio usamos carbohidratos puros. Sin embargo, si quisiera utilizar melazas, por
ejemplo, debería asegurarme de que éstas me van a rendir buenas concentraciones de sacarosa y glucosa,
y me debo asegurar también de que puedo controlar bien el ritmo de corte.
ANTIBIÓTICOS AMINOGLUCÓSIDOS
Los antibióticos aminoglucósidos son oligosacáridos que consisten en un aminociclohexanol unido por
enlace glucosídico a otros aminoazúcares.
Se conocen más de 100 antibióticos aminoglucósidos, siendo sus productores los actinomicetos del
género Streptomyces. Este tipo de antibiótico es usado contra bacterias Gram negativas. A modo de
ejemplo, decimos que Streptomicina y dihidroestreptomicina se usan para tratar la tuberculosis.
Este tipo de antibióticos son usados como antibióticos de reserva, por las apariciones de resistencias.
Además, son un campo de estudio muy importante ya que se están buscando y desarrollando nuevos
productos de mejor eficacia y menores efectos secundarios mediante técnicas de mejora de cepas
(algunos de sus efectos secundarios son daño renal y sordera).
Son muchos los nuevos antibióticos semisintéticos que están surgiendo con el fin de mejorar la formación
de resistencias: fortimicinas, derivados de kanamicina y netilmicina.
Respecto a la actuación de estos antibióticos, se sabe que actúan inhibiendo la síntesis de proteínas. Se
insertan en la subunidad 70S del ribosoma y se producen péptidos anómalos, que se insertan en la
membrana y rompen la bacteria.
BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN
No se sabe muy bien cuál es el proceso de producción, entonces no se sabe cómo intervenir en él. Sí se
sabe que está ligado a la esporulación, y hay una señalización de la que depende. Esta está mediada por
el factor A; cuando Streptomyces lo detecta en el medio lo interpreta como señal y se induce la expresión
de los genes que codifican la producción de estos antibióticos, así como la esporulación. El
microorganismo va a requerir el factor A poco pero suficiente.
Tienen represión catabólica de N, fundamentalmente por amonio, entonces hay que tener ojo con
introducir cosas que rindan amonio en idiofase. También inhiben los carbohidratos y fosfato. Depediendo
de la cepa será un residuo u otro el que produzca retroinhibición.
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PRODUCCIÓN
Respecto a la producción, señalaremos los siguientes puntos de interés y condiciones para la misma:
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POLISACÁRIDOS
La importancia de los polisacáridos es tan variada como sus usos: modificación de propiedades reológicas
de fluidos; estabilizantes de suspensiones; flocular partículas; encapsular materiales; producir emulsiones
(agentes emulsificantes). Aún así, la producción industrial de polisacáridos microbianos es sólo un 4% del
mercado, siendo el más importante el xantán.
Estos polisacáridos serán secretados, que básicamente es lo que conocemos como EPS. Este EPS es tan
variable como la cepa, puesto que depende del metabolismo del microorganismo y del ambiente en el
que se encuentra. Además, como ya hemos visto en temas pasados, es capaz de retener todos los
nutrientes que pasan alrededor del microorganismo que lo excreta. El problema de los polisacáridos no
es producirlos, sino recuperarlos, que es donde más se gasta, debido a que va a formarse adherido a la
pared celular del microorganismo o formando mallas laxas alrededor.
La evolución de este metabolito fue relativamente rápida: se descubrió su producción por parte de
Xanthomonas campestris, hasta llegar a su producción comercial, llegando a ser aprobada por la FDA
para su uso en alimentos. Es un metabolito primario
ESTRUCTURA
Su estructura se fundamenta en unidades de D-glucosa unidas por
enlaces beta - (1 → 4), en el que una de cada dos glucosas alternantes
lleva en posición 3 un trisacárido, que desde la posición proximal a la
terminal es alfa-D-manosa-beta-D-glucurónico-alfa-D-manosa. La
manosa proximal está acetilada en 6, mientras que la manosa terminal
lleva un pirúvico unido mediante enlace cetal a sus posiciones 4 y 6.
Además, decimos que la propia viscosidad del xantán depende de dos factores: tamaño molecular y
cantidad de piruvatos cetales.
PROPIEDADES Y APLICACIONES
Sus aplicaciones son básicamente 60% no alimentarias y 40% alimentarias. Sus usos:
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PRODUCCIÓN
La biosíntesis del xantán se produce de manera similar a la del peptidoglucano. Las enzimas claves vienen
codificadas por 12 genes agrupados en el operón gum. Como hemos dicho anteriormente es un
metabolito primario extracelular, pero va a ir asociado a la célula
Dependiendo de lo que queramos, podemos usar unas fuentes más puras para nuestra producción que
otras: para usos clínicos, podemos usar carbohidratos puros; mientras que para otras utilidades se puede
usar fuentes menos puras.
Para la recuperación, aunque sea metabolito extracelular, está ligado a la célula. Filtramos, nos quedamos
con las células y pasteurizamos el cultivo (no nos podemos quedar con las células). Una vez hemos
pasteurizado, lo que se hace es recuperar el xantano con isopropanol (este es el paso más caro): por cada
volumen de xantano le echamos el triple de isopropanol (esto es caro, obviamente).
Ahora, describiremos pasos y condiciones de producción, como hemos hecho para otros metabolitos:
Diferentes cepas de X. campestris sintetizan xantanos que difieren en el porcentaje de grupos acetilo y
piruvato (carboxietilo). Además del uso de estas cepas, para buscar dicha estabilidad se puede llevar a
cabo modificaciones en el medio de cultivo y en las condiciones ambientales; además del uso de
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mutagénesis mediante transposones. La idea clave es tener claro que el grupo acetilo estabiliza; mientras
que el carboxietilo hace lo contrario.
POLIÉSTERES: POLIHIDROXIALCANOATOS
El problema de los plásticos es que no suelen ser biodegradables, y esto es así debido a que son
hidrocarburos de cadena muy larga; y si recordamos cuando hablábamos sobre el petróleo, cuando la
cadena alcanza cierta longitud es tóxica para los microorganismos que pudieran degradarla.
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son un tipo de plástico degradable, en concreto biodegradable, producido
por bacterias (100% biodegradables). El otro tipo es fotodegradable.
ESTRUCTURA
Son poliésteres de reserva producidos por bacterias sometidas a condiciones de estrés, las cuales los
sintetizan en varias formas químicas, entre los cuales el polihidroxibutirato (PHB) es el poliéster de cadena
más corta. Las unidades pueden consistir desde 3C o 4C, hasta 14C – 16C, según la cepa y el medio de
cultivo.
El alto coste de producción puede ser disminuido mediante el mejoramiento de los procesos de
fermentación y separación; mediante el desarrollo de cepas más eficientes y usando una fuente de
carbono barata (representa el 40% del coste).
Además, los poliésteres son termoplásticos, es decir, polímeros que se funden por encima de cierta
temperatura, pero que se endurecen al enfriarse.
Estos bioplásticos son biodegradables, porque existen muchas despolimerasas que generan
microorganismos para usar estos polímeros como fuente de carbono. Es un hidrato de carbono, y hay
muchos microorganismos capaces de usarlos como fuente de carbono.
Los bioplásticos se denominan en general PHA. Cuando la cadena es de 3C, lo más corto posible, se
denomina PHB (polihidroxibutirato), que es el PHA más corto posible. Cuando varía el número de
carbonos va cambiando el nombre.
POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA NATURALEZA
Los PHAs se acumulan como gránulos de reserva cuando la bacteria crece en un medio con abundante
fuente de C, pero limitado en N o en P. Cabe destacar que el primer PHA fue descubierto en 1926 por M.
Lemoigne en Bacillus megaterium. Desde entonces se han descubierto más de 40 PHA en más de 90
géneros de bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Las bacterias que producen PHA se
pueden clasificar en dos amplios grupos:
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Al ser quimiolitotrofo del H2 destacar que podemos suministrarle H2 como gas o bien asociarlo
a un proceso que lo produzca, como lo que ocurre en vertederos
• Grupo de Pseudomonas oleovorans (quimiorganotrofo ambiental): PHAs de cadena media
(monómeros C6-C14).
Al ser un componente que se acumula como gránulo de reserva, el microorganismo debe notar que hay
exceso del nutriente esencial, en este caso el carbono, y que hay otro que empieza a ser limitante. Con
esto vemos que es un metabolito primario de tipo 2 intracelular, ya que no está asociado al crecimiento
óptimo de nuestro microorganismo.
Destacar que no en todos los microorganismos la fuente de carbono que se acumule va a tener
propiedades de bioplástico, los microorganismos que van a formar bioplásticos son los que hemos
mencionado anteriormente.
Si en algún momento la fuente de carbono falla, Ralstonia tiene una despolimerasa que es capaz de
romper el polímero que había formado y poder acceder al C, por eso en la producción no podemos
descuidar el carbono. Es por esto que interesa expresarlo en E.coli y hacer la producción ahí, ya que E.coli
no tiene esta despolimerasa.
Realmente el PHB no es tan bueno como una mezcla de PHB y PHV, combinando subunidades de ambos
mejoramos propiedades. Esto se hace suministrando junto con glucosa el propiónico y valérico, así cuando
la bacteria incorpore glucosa, formará PHB, y lo mismo con los otros; y se ordenan de manera aleatoria.
Además, jugando con la cepa podemos obtener cadenas laterales que mejorarán aún más el bioplástico
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• Fuente de carbono: fuente de carbono orgánico, glucosa es la mejor en este caso, pero es muy
caro, por lo que puedes usar también melazas. Podría usar un carbohidrato puro o almidón. No
le restringimos el carbono para que produzca bioplásticos
• Fuente de Nitrógeno: viene con las melazas, al igual que P y S
• Fuente de P: por encima de 10 mM
• pH neutro
• T ambiental
• Intracelular: recoger biomasa, lisar las células. Los PHA son insolubles en gua, necesitamos
solventes orgánicos o detergentes para recuperarlos
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PROCESOS DE PRODUCCIÓN
Queremos producir PHB (en este caso el copolímero poli (3HB-3HV)), por lo que, para ello, incubamos
nuestra bacteria en un medio base de glucosa y exceso de sales, salvo de fosfatos, hasta que se obtenga
una determinada densidad celular.
Entonces, se añade glucosa y propiónico (con cuidado para evitar efectos tóxicos) hasta que el copolímero
alcanza el nivel deseado (será un contenido del 70-80% en peso seco).
A continuación, entraríamos en el proceso de downstream con el fin de recuperar estos PHB. Lo que
hacemos es sumergido, filtramos y nos quedamos con las células. Entonces, las rompemos como
queramos (normalmente se hace por calor).
Una vez rotas, debemos quedarnos con esos polímeros, que son hidrófobos. De esta manera, los
recuperamos con solventes apolares, como por ejemplo con detergentes. Normalmente, antes del
detergente, los microorganismos encierran los polímeros en vesículas, por lo que usaremos enzimas o
detergentes para romper las vesículas que los cubren. De esta manera, habríamos solubilizado los
componentes celulares y purificado el polímero apolar; obteniéndose a una pureza del 95% (se recoge
una especie de polvo blanco).
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PRODUCCIÓN DE VINO
El vino es una bebida alcohólica elaborada por fermentación del jugo de uvas frescas. La graduación de
los vinos varía entre un 7 y un 16% de alcohol por volumen; la mayoría de los vinos embotellados tienen
entre 10 y 14 grados. Los vinos dulces tienen entre un 15 y 22% de alcohol por volumen. A mayor grado
alcohólico, mejor conservación. (no sé ni pa qué pollas explico, solo por si alguno aún no ha salido de
beber Rives xdd).
Sus características dependen del tipo de suelo, condiciones climatológicas, variedad de uva o prácticas
vinícolas aplicadas. Los vinos de denominación de origen tienen características muy particulares que se
dan en ese único lugar, porque todas esas condiciones hacen que el medio de cultivo tenga una
determinada composición química y la comunidad microbiana que vive en la superficie de la uva sea una
en concreto.
Variedades de uvas hay muchas, pero aquí las dividiremos en uva blanca y uva negra. Esta última contiene
mayor cantidad de taninos y pigmentos (antocianinas), que no están presentes en la uva blanca. Además,
decimos que el grado de madurez determina el sabor afrutado o no del vino.
• Pulpa (85 %): tejido frágil, que al romperse proporciona el mosto. En ella se encuentra el azúcar
(glucosa y fructosa), 75 % de agua, ácidos tartáricos, ácidos málicos y ácido cítrico. Además,
contiene minerales y sustancias nitrogenadas, potasio, hierro, proteínas, péptidos y aminoácidos
libres. Con esto vemos que la pulpa va a ser nuestro medio de cultivo
• Tallos (2-4%): contiene taninos y otras sustancias indeseables. Hay que quitarlos durante el
proceso de despalillado después de la recepción de la uva, debido a que aportan un sabor agrio.
• Piel (12 %): contiene levaduras, sustancias aromáticas y dan propiedades importantes al sabor,
además de ser responsable del color del vino
• Semilla (3 %): gran cantidad de agua y materiales leñosos. Posee lípidos que van a dar mal sabor
al vino por lo que hay que retirarlas.
Otros compuestos involucrados:
• SO2: evita la oxidación de mostos y vinos, fermentaciones salvajes, inhibe las bacterias lácticas y
conserva la frescura y el aroma (reacciona con el acetaldehído y lo bloquea bajo la forma
sulfítica). Va a ser muy importante porque al principio va a inhibir a las bacterias lácticas, que va
a hacer que lo primero que se produzca sea una fermentación alcohólica.
o Esta fermentación alcohólica va a ser realizada por Sacharomyces cerevisae
(quimiorganotrofo heterótrofo que presenta el efecto Pasteur y el efecto Crabtree), que
aunque es sensible a sulfitos, es menos sensible que otras cepas de Sacharomyces o de
levaduras.
o Va a permitir la transición de unos microorganismos y otros
• Ácido cítrico y ácido tartárico: corrigen acidez en vinos (cítrico) y mostos (tartárico).
• Ácido sórbico y ácido ascórbico: son antioxidantes. El ácido ascóbico inhibe la fermentación por
levaduras del vino rosado.
• Tiamina y fosfato amónico: factores de crecimiento.
• CO2: asegura condiciones anóxicas en los tanques de fermentación.
Con esto podemos comprobar que en el zumo de la uva tenemos todo lo necesario para que nuestros
microorganismos crezcan.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Para hacer vino no tienes que lavar la piel de la uva ya que no te interesa eliminar los microorganismos
que se encuentran ahí, pero si tienes que lavar las uvas antes de comérselas, justo antes de comérselas
ya que los microorganismos permiten conservar mejor las uvas de forma que si las lavamos mucho antes
de comernoslas van a conservarse peor.
PROCESO DE PRODUCCIÓN
En cuanto al resultado, los principales productos de la fermentación son alcohol etílico y dióxido de
carbono (liberado en forma de gas). Finalmente, decimos que la fermentación se interrumpe
normalmente cuando todos los azúcares fermentables han sido transformados en alcohol y dióxido de
carbono, o cuando la concentración del primero supera la tolerancia de las levaduras: el mosto es ahora
vino. A continuación, se explicará el proceso con mayor detenimiento
SELECCIÓN
Se realiza una selección manual. Hay que tener cuidado con la higiene para evitar la infección por hongos.
La presencia de hongos nos va a determinar que en la superficie donde se encuentran no vamos a
distinguir la presencia de nuestros biocatalizadores.
RECEPCIÓN
Se mide la cantidad de azúcar que tiene la pulpa de la uva. Se paga por la cantidad de uva recibida en
función de su grado de azúcar.
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Grado Biotecnología: Biotecnología Microbiana
Destacar que la principal diferencia de los vinos va a ser el proceso de maceración, que, como veremos,
este proceso no se va a dar en vino blanco, y si se va a dar en tinto y rosado. El proceso de maceración es
el proceso por el que los componentes de los componentes de la piel de la uva, entre ellos el colorante,
pasan a la pulpa.
• Vino Blanco: en este caso la piel no nos va a interesar, ya que presentan colorantes que no nos
van a interesar para la producción de este tipo de vino.
o Hay que extraer todo el vino el zumo de uva que podamos, proceso que se realiza
mediante el prensado. Los rodillos que presentan este proceso se pueden ajustar para
realizar solo el prensado (vino blanco, rodillos más cerca) o un estrujado (vino tinto y
rosado). En este caso, tras el prensado se forma lo que se conoce como Mosto Yema,
posteriormente se filtra la piel y se pasa al fermentador.
o Este Mosto Yema va a tener tanto el zumo obtenido de la pulpa como la comunidad de
microorganismos presentes en la piel microbiana, el resto de componentes (piel, palillos
que hayan podido atravesar) son eliminados mediante la filtración.
• Vino Tinto: en este caso vamos a estrujar, no se prensa. En este caso no filtramos, de forma que
al fermentador va a pasar la pulpa junto con la piel. Se van a mantener en contacto durante 8
días, entre 20 y 25ºC. Se produce una maceración y fermentación alcohólica. Toda la materia
colorante, además de múltiples compuestos saborizantes y taninos que se encuentran en la piel
de las uvas se van a liberar durante esta etapa de maceración, etapa que no se va a dar en vino
blanco.
o Al finalizar la primera fermentación, gracias al burbujeo de CO2, los hollejos (bagazo,
material sólido que queda tras el estrujado) quedan en la parte superior y se retiran
durante el sangrado, que es la separación del líquido sobrenadante del orujo
obteniéndose el llamado vino de yema, el orujo es prensado y se obtiene el vino de
prensa que es de menor calidad.
• Vino Rosado: en este caso se estruja, igual que antes. En este caso no filtramos, de forma que al
fermentador va a pasar la pulpa junto con la piel. La primera fermentación se hace con los
hollejos y semillas durante un tiempo corto y en frío (24 horas a 10ºC), por lo que no da tiempo
para que se extraigan todos los pigmentos, de ahí a su color rosado.
o Terminada la maceración se saca el mosto gota y el sólido se prensa para obtener mosto
de prensa, de menor calidad. Los mostos se sulfitan y se envían a los tanques de
fermentación. Esta se detiene por el enfriamiento.
FERMENTACIÓN TUMULTUOSA
La uva tiene gran cantidad de azúcares en forma de glucosa y fructosa, que está cerca del 10%, lo que a
provocar el efecto CrabTree (que ya hemos descrito en temas anteriores). La fermentación alcohólica va
a producir también CO2, generando al final condiciones de anaerobiosis dando lugar al efecto Pasteur.
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Además de azúcar, presenta gran cantidad de sulfitos que solo va a permitir crecer al principio a
Saccharomyces y no van a permitir crecer al resto, es decir, el zumo de la uva va a ser un medio selectivo
para Saccharomyces cerevisiae.
En primer lugar, se va a producir una fermentación tumultuosa debido a la gran cantidad de CO2 que se
va a generar, que va a provocar la formación de burbujas, tantas que parece que el líquido hierve. Por
ello, hay que evitar rellenar el fermentador entero, porque sino te revienta, y además este CO2 te va a
crear las condiciones de anaerobiosis.
Además, este CO2 va a hacer que todo lo que es sólido (restos de pieles y huesos) se vaya a la superficie
creando una capa denominada sombrero, que lo eliminamos y nos quedamos solo con el zumo de uva.
Además, hablando del proceso fermentativo, debemos atender a las responsables de nuestra
producción: las levaduras. Usaremos levaduras naturales, aunque también con levaduras aisladas de
viñedos (usamos cultivos mixtos de levaduras). Fundamentalmente se emplean cepas de Saccharomyces
cerevisiae, que es la cepa más resistente a sulfitos y, por ello, estarán presentes en nuestro cultivo: medio
selectivo.
Otras levaduras presentes pueden ser perjudiciales: Kloeckera, Pichia, Trigonopsis, Zygosaccharomyces.
Entre las cepas de S. cerevisiae, las hay de alta temperatura de fermentación (28ºC), que no floculan; y
las de baja temperatura de fermentación, que floculan. Estas últimas son las que más se utilizan.
Las levaduras utilizadas han de soportar altas concentraciones de azúcar y altas concentraciones de
alcohol; además de la presencia de los sulfitos ya mencionada.
Estas bacterias van a transformar el ácido málico en láctico, disminuyendo así la acidez. Decir que el málico
es el que aporta ese sabor a manzana verde agria de sus muertos, típico del vino blanco, pero no del tinto
(que obvio que para el vino tinto no, vete a por sidra si eso puta). De esta manera se obtiene un sabor
más agradable y suave. A veces, incluso se inoculan las BAL de manera artificial (como en el Chardonnay).
Esta fermentación secundaria se puede dar en diferentes momentos del proceso: en el mosto (cuando el
crecimiento bacteriano se anticipa al de las levaduras); en las etapas finales de fermentación alcohólica;
o tras el embotellamiento.
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La fermentación de estas bacterias ocurre cuando “despiertan”, no cuando se haya llegado a un momento
determinado: es debido a la presencia de unas condiciones óptimas (destacamos que los sulfitos no les
afectan) para las mismas.
ENVEJECIMIENTO EN BARRICA
Cuando han actuado las bacterias del ácido láctico como ya hemos descrito, quedaría el último paso: la
estabilización del vino. Este paso busca obtener vinos más estructurados y elegantes con matices de
madera.
Esto se lleva a cabo en barricas (que le da todo el sabor de madera, además que en dichas barricas se
desarrolla otra comunidad bacteriana, las otras Saccharomyces que estaban inhibidas por sulfitos, pero
que al ya no haber, si se desarrollarán). Se llenan ⅔ de la barrica con mosto (para evitar que se derrame
en la fermentación más tumultuosa y para que no reviente). Se suele usar mosto fermentado previamente
en un depósito para evitar derrames.
En las barricas se desarrollará una capa llamada velo en flor: el EPS que tienen dichas “nuevas”
Saccharomyces hacen que floculen (floten), pareciendo migajas de pan. Es decir, en las barricas se forman
flóculos de todas esas Saccharomyces que hasta entonces no habían podido vivir y desarrollarse debido a
la presencia de sulfitos, además de necesitar presencia de glucosa y etanol. Estos flóculos aíslan al vino
del oxígeno y hace que la fermentación ocurra en anaerobiosis (así se evita el desarrollo de las bacterias
del ácido acético). Todo esto todavía es mosto en el que ya no quedan sulfitos pero quedan fuente de
carbono (glucosa + etanol), la fuente de nitrógeno es procedente de las proteínas que contiene el zumo
de la uva.
Las barricas se apilan, siendo las de más abajo de mayor edad (solera) que las que están arriba. Destacar
que con el velo en flor de las barricas de abajo, inoculamos las barricas de arriba. Este velo en flor consume
glicerol, y lo transforma a etanol (el glicerol no nos interesa). Además, produce un aclarado del color.
De esta manera, ya tendríamos vino. Dependiendo de cuánto queramos dejar madurar, estos procesos se
darán en mayor o menor medida, siendo más o menos estable nuestro vino.
• Consumo de glicerina
• Se forma acetaldehído (aroma frutos secos)
• Se aclara el color
• Desarrollo de BAL: disminución acético y etanol
• Hay que evitar que crezca mucho, ya que perderíamos grado alcohólico y se sustituiría por un
sabor avinagrado
CLARIFICACIÓN
El objetivo de la clarificación es que decante la levadura. Para ello, emplearemos clara de huevo
(albúmina). Decantamos y nuestro vino quedará en el sobrenadante.
ENFRIAMIENTO
El objetivo de esta etapa es lograr la precipitación de sustancias insolubles que podrían dar turbidez. Al
tener estas bajas temperaturas, habrá ácidos que sobresaturen, y se formarán sales. Las retiramos
mediante filtrado y ya estaría nuestro vino para embotellar.
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FILTRADO Y EMBOTELLADO
Pues ya te lo bebes puta
CONCLUSIÓN
A lo largo de la explicación de la producción del vino,
hemos hablado del mosto. Básicamente es el resultado
del prensado de las uvas, que produce la formación de un
líquido acídico de pH 3 - 3,9. En cuanto a su concentración,
sabemos que presenta diversos azúcares: glucosa,
fructosa, pentosas y pectinas (la concentración de los
azúcares, como ya hemos visto, depende de la
maduración). Aún así, la concentración en azúcares es
grande, en torno al 10%.
TIPOS DE VINOS
VINOS ESPUMOSOS
Se presentarán algunas técnicas para obtener el vino espumoso:
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mosto no fermentado el vino resultante es muy dulce; mientras que si se endulzan vinos parcialmente
fermentados, se obtiene un vino seco.
El vino de Jerez busca matar a la levadura. Si recordáis, vimos varias técnicas para ello: exceso de azúcares,
añadiendo más sulfitos de los que necesita, enfriando la temperatura por debajo de la mínima de la
levadura; sin embargo, el vino de Jerez es único en el sentido de que no usa ninguna de estas técnicas. El
vino de Jerez lo que hace es adicionar alcohol de alta graduación, de tal manera que nuestra levadura no
lo tolera y se muere. Por esto, el vino de Jerez está fortificado (tiene más graduación de la que podrías
obtener de manera natural).
En el vino fino, S. cerevisiae se desarrolla menos; siendo el velo en flor quien de verdad se desarrolla. De
hecho, a quien se debe básicamente la formación de este vino es a dicho velo, aunque cerevisiae también
interviene; por lo que la fermentación es anaerobia.
En el oloroso, la diferencia es que no se deja que se desarrolle el velo en flor, y esto se logra fortificando
(con 18ºC). Con esto, matas al velo en flor, pero no a cerevisiae, por ello debe ser a esa graduación
determinada (fermentación aerobia).
Estos dos vinos tienen matices diferentes, pero ambos no están estabilizados.
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Por tanto, lleva ácidos, aldehídos y alcoholes superiores. La proporción y propiedades organolépticas
dependen del tipo de levadura usada y de la maduración, ya sea en barriles de roble durante años y/o si
lo pasan por virutas de roble quemadas.
PRODUCCIÓN DE CERVEZA
La normativa dice que las materias primas son la cebada malteada, agua pura, lúpulo y levadura.
TIPOS DE CERVEZA
PRODUCCIÓN
De la levadura no hay que preocuparse, es de colección, hay que escalar su cultivo hasta llegar a las
condiciones de producción
El material de partida es la cebada, un compuesto muy rico en almidón, que es fuente de C. El proceso se
orienta para que ese almidón de la cebada se hidrolice y de lugar a monómeros y dímeros sencillos. Esto
lo haremos con las propias amilasas que tienen el grano de cebada.
Además, dicha cebada presenta sustancias nitrogenadas que favorecen la formación de espuma.
A lo que sí que hay que atender es al hecho de hidrolizar el almidón para poder usarlo como fuente de
carbono. Debemos fijarnos de que no haya hongos o crecimiento bacteriano, lo que significa que estos
usarían el almidón, y no nos interesa: la cebada debe estar libre de impurezas.
Además, dicha cebada no puede estar germinada (no se pudo haber empezado el proceso de hidrólisis
del almidón). Por tanto, debemos permitir que se expresen las amilasas (cuando el grano llega al punto
de germinación), pero no podemos dejar que germine. De esta manera inducimos germinación, pero no
permitimos que se dé.
• El malteado cuyo objetivo es llevar a la cebada al unto germinación sin que germine. Para ello:
o Remojo (aumentar la humedad hasta el 45%):
▪ Objetivo: inducir la germinación
▪ Condiciones de aerobiosis, alternancia de remojo – descanso aire cada 12 – 24
horas. Adicionar cal (desinfección)
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PRODUCCIÓN DE VINAGRE
INTRODUCCIÓN
Las bacterias del ácido acético, que son una comunidad bacteriana (que no somos capaz de aislar) en el
que hay simbiosis entre varias poblaciones donde destacamos Gluconobacter y Acetobacter, que son
capaces de oxidar etanol mediante un proceso de respiración aerobia (el aceptor final de electrones es
externo a la ruta, en este caso el O2) hasta ácido acético
Se suelen usar cultivos mixtos y las cepas suelen perder su carácter superproductor al cultivarlas en
agar, por eso hay que transportarlas en pequeños fermentadores.
El etanol lo oxidan estas bacterias hasta diferentes productos dependiendo del microorganismo. Como
no se van a poder separar los distintos microorganismos, unos van a producir el vinagre y otros, van a
producir CO2, creando burbujas.
BIOSÍNTESIS
Es una oxidación incompleta, más que una verdadera fermentación. Necesita oxígeno, que actúa como
aceptor final de electrones. Para crecer en condiciones óptimas, las células necesitan etanol (0.2 – 5%) y
ác. acético (13-14%).
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PRODUCCIÓN
Los nutrientes que podemos utilizar los dividimos en dos grupos, para los cuales
actuaremos de dos formas diferentes:
Se suele usar la producción sumergida frente a la de superficie porque presenta mayor velocidad de
reacción; menos coste de instalación y de personal; y necesita menos espacio.
Para la recogida del producto, se lleva a cabo una filtración, en la cual se da una separación del ácido
acético de las bacterias y finalmente para clarificarlo se usa ferrocianuro potásico K4(Fe(CN)6).
MEDIO DE CULTIVO
Va a ser un proceso exotérmico en el que se va a generar calor (aumento de temperatura). Como las
bacterias no son termófilas, tendremos que poner al sistema un sistema de enfriamiento para evitar que
nuestras bacterias mueran.
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• Agua ´
• Inóculo de fermentadores antiguis
• Producción de metabolitos
o Homofermentativas: su producto es ácido láctico y ya; presentando una acidificación
rápida y, por ende, una coagulación rápida.
o Heterofermentativas: producen otros componentes a parte del ácido láctico, como
CO2.
• Temperatura de crecimiento
o Mesófilas: óptimo en torno a los 25ºC.
o Termófilas: en la industria quesera son aquellas que tienen el óptimo en 40ºC.
A continuación, trataremos los factores que afectan al crecimiento de las BAL. Sabemos que precisan de
vitaminas; además de que debemos atender al pH (el metabolito es extracelular). Decimos esto último
puesto que, al ser un ácido y ser extracelular, su producción baja el pH: usaremos corrector de pH (las
bacterias son neutrofilas).
Por tanto, decimos que los factores a tener en cuenta son la temperatura óptima (dependiente del tipo
de BAL), la presencia de aminoácidos y vitaminas y los carbohidratos fermentables y alcoholes (sustrato
para la formación de los diferentes productos).
Su papel es relevante en todo el proceso de producción del queso (responsable del cuajado y maduración
del queso), influyendo de manera diferente en diferentes aspectos:
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parte de las bacteriocinas, son el acetaldehído (inhibe la división celular en E. coli), el diacetilo
(inhibe levaduras y algunas bacterias G- y G+) y peróxido de hidrógeno.
• Producción de exopolisacáridos (EPS), vitaminas y CO2: el EPS permite la estructura (la textura
gelatinosa y cremosa) del yogur, por ejemplo; y es que dan consistencia, viscosidad y uniformidad
al producto.
• Alimentos prebióticos: organismos (si hablasemos de microorganismos vivos (que nosotros no
nos los comemos vivos), los llamaríamos microorganismos probióticos) y sustancias que
contribuyen al balance microbiano intestinal: reducción de pH en el intestino, producción de
enzimas digestivas y vitaminas, producción de sustancias antibacterianas, reconstrucción de flora
intestinal, mejora de absorción de Ca.
Toda esta estandarización va englobada en una serie de procesos que son el filtrado y clarificación,
además de un desnatado o añadido de nata (para obtener el contenido graso óptimo).
Además, va a necesitar una homogeneización de los glóbulos grasos: hay que atender a la estructura del
liposoma, para su lipolisis y posible homogeneización.
PASTEURIZACIÓN
Una vez tenemos la leche estandarizada, debemos matar a los microorganismos que están en la misma.
De esta manera decimos que debemos seleccionar un tratamiento térmico determinado (a la vez, esto
conlleva una pérdida de proteínas o vitaminas, entre otros; por lo que hay que intentar minimizarlo). Lo
que no se hace es una UHT (un tratamiento térmico que sube tanto la temperatura en tan poco tiempo
que puede causar muchos daños en los componentes de la leche; algo que no es positivo para la
elaboración de queso).
Entonces, el tratamiento que sí utilizaremos es la pasteurización (incluso se puede usar HTST). Decimos
así que basta con una pasteurización, puesto que la mayoría de microorganismos no están esporulados.
La pasteurización es la técnica menos agresiva: 60 - 65 ºC, 30 minutos.
INOCULACIÓN
Los quesos están hechos por fermentación láctea, lo que forma la cuajada (caseína precipitada). Es
grumosa, no tiene textura y se desmorona; pero presenta mucho sabor, debido al ácido láctico. Ahora,
hablaremos de la función principal de los BAL para, a posteriori, mencionar otros microorganismos que
pueden actuar en nuestro proceso.
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Respecto a las funciones principales de las BAL, decimos que estas son la producción de ácido láctico; la
formación y desuerado de la cuajada; el hecho de evitar microorganismos patógenos; conferir sabor ácido
al queso; y la producción de sustancias que dan sabor y aroma (un poco a modo de repaso).
COAGULACIÓN
El cuajo contiene una enzima en concreto, la quimosina, que es capaz de romper y fragmentar la caseína
(sus enlaces). De esta manera, se forman fragmentos de caseína que, ante presencia de calcio, formaría
enlaces entre ellas en las tres dimensiones del espacio: red tridimensional más densa que cae. Al caer,
arrastra con ella todo lo que hay en la leche. Por ello, en realidad es una red de micelas de paracaseína
unidas a cristales de calcio.
De esta manera, se estaría llevando a cabo una proteólisis de la caseína, provocando la coagulación
(cuajado) de la leche o formación del gel de caseína. Para este proceso hay una serie de parámetros que
pueden ser influyentes: temperatura, pH, concentración de calcio y concentración de fosfatos. Al hablar
de esta coagulación, veremos que hay 2 tipos:
• Los quesos de coagulación ácida (queso fresco) presentan pequeñas cantidades de cuajo (facilita
el desuerado) y se opera a temperaturas bajas (15-20ºC).
• En los quesos de coagulación enzimática (p.ej., Gruyère) se añaden cantidades de cuajo muy
superiores y se coagula a temperatura más elevada (30-35ºC) para acelerar la formación de la
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cuajada. En estos quesos, los fermentos no deben desarrollarse de inmediato a fin de que no se
acidifique mucho la leche durante la coagulación y desuerado.
• En los quesos de coagulación mixta (p. ej., Camembert) se emplea una cantidad de cuajo
considerable a 28-32ºC.
DESUERADO
Ya tenemos la leche cuajada, por lo que hay que quitarle el suero (todo aquello que no ha cuajado y agua).
Para facilitar el desuerado lo que se hace es que la cuajada se corta, se eleva la temperatura, se agita o se
acidifican las BAL (formación de buena cuajada); pero al final es poner el cuajado en una malla y estrujarlo
hasta que salga todo el suero.
A este suero se le conoce como lactosuero, que como ya vimos puede ser utilizado por otras industrias
como fuente de carbono. Este lactosuero contiene agua y todo lo que ha precipitado. Lo que se le está
haciendo al gel de caseína o suero es una deshidratación parcial por contracción de micelas que lo forman.
MOLDEO/PRENSADO
Lo que hacemos es poner el cuajado en un molde y lo prensamos un poco más para sacarle más agua.
Además, aquí puede haber alguna otra inoculación (como para el roquefort). La producción de quesos
frescos acaba en este proceso, no se maduran más. Entonces, decimos que este proceso está compuesto
de un moldeo, donde se da forma al queso y se aglomeran los gránulos de cuajada; y un prensado, en el
que se elimina el exceso de suero y se endurece la masa del queso (este último paso no se da en los quesos
frescos).
SALADO
Con este paso, lo que hacemos es aislar el queso mediante agua, disminuyendo su actividad. Esto se hace
acomplejando con moléculas. La finalidad de este paso es proporcionar sabor al producto, evitar la
proliferación de microorganismos, ayudar al desuerado y contribuir a la formación de la corteza del queso.
Para ello, existen diversos protocolos:
• Corteza artificial o corteza microbiana: disminuir la actividad del agua acomplejando con
moléculas que previene el desarrollo microbiano. Para ello salamos la corteza, disminuyendo la
actividad del agua de la corteza, evitando el crecimiento de cualquier microorganismo.
Penicillium camemberti
o Estas cortezas se van a introducir junto con microorganismos que queremos que se
desarrollen, creciendo este frente a otros microorganismos que haya en el ambiente, ya
que va a tener ventaja competitiva, ocupa un hábitat que ya no puede ocupar otro.
Además, los productos de microorganismos van a influir en el queso, de forma que se
van a hacer quesos planos para evitar el gradiente.
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• Humedad relativa: 75 y 90%. Aunque la humedad es bastante alta, los valores de temperatura
son bastante bajos, todo ello con el fin de no tener en óptimo a los microorganismos.
• Temperatura: 2 y 16ºC.
• Tiempo variable: aproximadamente de 90 días.
Los microorganismos involucrados en esta fase de maduración son bacterias lácticas y propiónicas,
levaduras y hongos (Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti).
Los procesos que se dan en esta etapa son la fermentación de la lactosa a ácido láctico y la proteolisis y
lipolisis (componentes con buen sabor y aroma). Respecto a la fermentación, el láctico sufre
transformación microbiana hasta acético y propiónico, CO2 y diacetilo (se da hasta que se agota la
lactosa).
• Los procesos proteolíticos lo llevan las proteasas que van a generar una serie de péptidos que
solo algunos (diésteres del ácido aspártico) producen sabor, que posteriormente por peptidasas
se van a degradar a aminoácidos, isómeros D dulces y los L amargos. Los aa se van a seguir
degradando (transaminación) que van a generar alfa cetoácidos y otros aminoácidos que pueden
dar nuevo sabor. Los aminoácidos también pueden descarboxilar, por las bacterias el ácido
láctico, que según el primer inóculo que realicemos. Desaminación aldehídica generando
aldehídos que va a oxidarse a su ácido o reducirse a su alcohol, que junto con los aa y otros
aldehídos van a dar aroma y sabor al queso.
• Con respecto a la lipólisis van a romper los lípidos en ácidos grasos libres que van a dar sabor
(especialmente entre 12 a 14 carbonos, ácido grasos volátiles de cadena corta y media). Los
microorganismos de la primera y segunda inoculación van a ser responsables de este proceso.
Estos ácidos grasos además van a producir reacciones, pudiendo dar a metil cetonas y
posteriormente a alcoholes secundarios que da sabor a queso azul, también pueden peroxidase
dando lugar a aldehído y ya estamos en el caso anterior en la proteólisis.
• Quien lleve a cabo la proteólisis y la lipólisis y cuando cortemos el proceso es lo que va a
determinar el sabor y aroma del queso. Se trata de mantener a los microorganismos vivos, pero
no en condiciones óptimos ya que tenemos que controlar este proceso, por eso, usamos
temperaturas bajas
Por ello, viendo esto vemos que se deben estandarizar todos estos procesos puesto que son muy
definitorios para el sabor, e incluso tipo de queso del que hablemos:
• Quesos duros: en la maduración para este tipo de queso, lo que se busca es evitar el crecimiento
superficial de microorganismos. Es un proceso lento y uniforme, en el que el propio queso puede
recubrirse de parafina o emulsiones plásticas.
o Durante la maduración van a ir perdiendo agua, haciendo que finalmente se pare el
proceso microbiano. Es muy importante la presencia de corteza
• Quesos blandos: su maduración busca favorecer el crecimiento de microorganismos en su
superficie, tanto hongos (Penicillium camemberti, Camembert) como bacterias (Brevibacterium
linens, Limburger). Los enzimas producidos difunden al interior (gradiente de maduración). Esta
difusión se facilita por la forma plana y el pequeño tamaño del queso. Al principio predominan
las BAL, y luego Penicillium o Brevibacterium.
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• Queso azul: madurados internamente por hongos. Al inicio, los microorganismos y sus enzimas
producen cambios en el interior del queso. Posteriormente se favorece la penetración de aire al
interior del queso y se inocula Penicillium roqueforti (maduración). En este caso, tanto las BAL
como Penicillium roqueforti van a transformar los ácidos grasos a metilcetona, y de ahí a ácidos
simples.
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