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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Diversidad genética de Mycobacterium tuberculosis resistente a
fármacos y multifármacos circulantes en Veracruz, México
Daniela MunroRojas1,2, Esdras FernandezMorales1,3, JoseÂZarrabalMeza4 , Mamá.
Teresa MartõÂnezCazares4 , Aurora ParissiCrivelli4 , Javier FuentesDomínguez5 , María
Nancy SeÂraphin6 , Miguel L auzardo6 , Jorge Alberto GonzálezyMerchand7 ,
Sandra RiveraGutiérrez7 , Roberto ZentenoCuevas1 *
1 Instituto de Salud Publica, Universidad Veracruzana, Jalapa, Veracruz, Mexico, 2 Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud, Instituto de
a1111111111
Ciencias de la Salud, Universidad Veracruzana, Veracruz, Mexico,
a1111111111 3 Programa de MaestrõÂa en Ciencias de la Salud, Universidad Veracruzana, Veracruz, MeÂxico, 4 Laboratorio
a1111111111 Estatal de Salud Pública, Secretaría de Salud, Veracruz, México, 5 Programa Estatal de Micobacteriosis,
a1111111111 Secretaria de Salud, Veracruz, Mexico, 6 Division of Infectious Diseases and Global Medicine, College of
a1111111111 Medicina, Universidad de Florida, Gainesville, Florida, Estados Unidos de América, 7 Escuela Nacional de Ciencia
Biologicas, Instituto Politecnico Nacional, Ciudad de Mexico, Mexico
* [email protected]
ACCESO ABIERTO
Cita: MunroRojas D, FernandezMorales E, Zarrabal
Abstracto
Meza J, MartıńezCazares MT, Parissi Crivelli A,
FuentesDomıńguez J, et al. (2018)
Diversidad genética de Mycobacterium tuberculosis
resistente a fármacos y multifármacos circulantes Fondo
en Veracruz, México. PLoS ONE 13(3): e0193626.
México es uno de los más importantes contribuyentes de tuberculosis farmacorresistente y multidrogorresistente en
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193626
América Latina; sin embargo, el conocimiento de la diversidad genética de las cepas aisladas de tuberculosis
Editor: Igor Mokrousov, Instituto Pasteur de San farmacorresistente es limitado.
Petersburgo, FEDERACIÓN DE RUSIA
Recibido: 21 de noviembre de 2017
Aceptado: 14 de febrero de 2018 Métodos
Publicado: 15 de marzo de 2018 En este estudio, se determinó la estructura genética de 112 cepas de Mycobacterium tuberculosis del sureste
de México mediante espoligotipado y MIRUVNTR de 24 loci.
Copyright: © 2018 MunroRojas et al. Este es un artículo
de acceso abierto distribuido bajo los términos de Creative
Commons Attribution License, que permite el uso, la
distribución y la reproducción sin restricciones
Hallazgos
en cualquier medio, siempre que se acredite el autor
original y la fuente. Los resultados muestran ocho linajes principales, la mayoría de los cuales fue T1 (24%), seguido de
LAM (16%) y H (15%). Un total de 29 (25%) aislamientos fueron identificados como huérfanos. Las SIT
Declaración de disponibilidad de datos: la base de
datos que contiene la información de genotipado está más abundantes fueron SIT53/T1 y SIT42/LAM9 con 10 aislamientos cada una y SIT50/H3 con ocho
disponible en Figshare (https://figshare.com/ aislamientos. Se observaron cincuenta y dos patrones de espoligotipo, veintisiete grupos y diez
s/b5f09b456e3e1c8b7c14 ).
complejos clonales, lo que demuestra una importante diversidad genética de cepas de tuberculosis
Financiamiento: DMR fue becario CONACYT número resistentes a fármacos y multirresistentes en circulación y el nivel de transmisión de estas formas
41603, del Doctorado en Ciencias de la Salud del Instituto
agravadas de tuberculosis. Estar definido como huérfano o como parte de un conglomerado de
de Ciencias de la Salud de la Universidad
Veracruzana. EFM es becario CONACYT número huérfanos fue un factor de riesgo para tuberculosis multidrogorresistente (OR 2,5, IC 1,05±5,86 y
850447 de la Maestrıá en Ciencias de la Salud del Instituto OR 3,3, IC 1±11,03, respectivamente). Los análisis de correspondencia múltiple mostraron asociación
de Ciencias de la Salud de
de algunos conglomerados y SIT con ubicaciones geográficas específicas.
PLOS UNO | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193626 15 de marzo de 2018 1 / 18
Diversidad genética de M. tuberculosis en Veracruz
la universidad veracruzana. Este trabajo fue
Conclusiones
apoyado por CONACyTProyecto de desarrollo cientı´fico
para atender problemas nacionales no.
Nuestro estudio proporciona una de las descripciones más detalladas de la estructura genética de las cepas
213712: Desarrollo de un sistema de vigilancia de tuberculosis resistentes a fármacos y multifármacos en el sureste de México, estableciendo por primera
epidemiológico molecular de TB. Los patrocinadores no
vez una línea de base de los genotipos observados en los aislamientos resistentes que circulan, sin embargo,
tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la
se requieren más estudios para dilucidar mejor la estructura genética de la tuberculosis en la región y los
recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o
la preparación del manuscrito. factores que podrían estar participando en su dispersión.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no
existen conflictos de intereses.
Introducción
En las últimas décadas, el resurgimiento mundial de la tuberculosis (TB) ha sido un desafío para las instituciones de
salud. Según el informe global de TB de la Organización Mundial de la Salud, en 2015 la TB fue responsable de la
muerte de 1,5 millones de personas y generó 10,4 millones de casos, de los cuales 100.000 fueron tuberculosis
farmacorresistente (TBDR) con resistencia específica frente a rifampicina resistente. (TBRR), 480.000 presentaban
resistencia combinada a rifampicina e isonia zid y se consideraban multirresistentes (TBMDR), y 7579 presentaban
resistencia extrema a los medicamentos (TBXDR) [1]. En 2015, solo 125 000 (20 %) de las 480 000 personas con
RR y MDR, y 7234 pacientes con XDRTB se inscribieron para recibir tratamiento; sin embargo, los resultados
exitosos fueron del 83 % para pacientes con TB (cohorte de 2014), 52 % para MDR/RRTB y 28 % para XDRTB.
Estas cifras demuestran claramente la magnitud del fenómeno de la resistencia a los medicamentos en la TB y
su impacto en la meta de erradicación de la TB para 2030[2].
El uso de herramientas que permiten la caracterización y el análisis genotípico de la TB, como 24locus
mycobacterial interspersed repetitive unitvariablenumber tandemrepeat (MIRUVNTR) y la tipificación de
oligonucleótidos espaciadores (spoligotyping), permiten comprender la dinámica y la complejidad de la estructura
poblacional de Mycobacterium tuberculosis dentro de una población [3,4]. Estos procedimientos permiten la identificación
de los diferentes linajes en circulación dentro de regiones específicas y su relación con la patogenicidad y virulencia
potenciales [5,6] . Además, varios informes de diferentes regiones geográficas han descrito los niveles de asociación
con características demográficas, epidemiológicas y de resistencia a los medicamentos. [7–12].
Según el reporte mundial de TB de la OMS, en 2016 se reportaron 22,869 nuevos casos de TB en México, con
una incidencia de 22/100,000 habitantes y 610 casos de TBMDR [1 ], y según la Organización Panamericana de la
Salud ( OPS) se ubica como uno de los cinco países con más aportes de casos de TBDR y TBMDR en América Latina
[13]. Sin embargo, hay datos limitados sobre las características genotípicas de las cepas de TB en circulación [14–16],
incluidos los aislados resistentes a fármacos y multifármacos [14,17–20]. Además, hay datos limitados sobre la
asociación entre los linajes de TB en circulación y los perfiles clínicos, epidemiológicos y resistentes a los medicamentos
de estos aislados [18]. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es caracterizar la diversidad genética de las cepas
DR y MDRTB aisladas en el sureste de México e identificar los factores de riesgo para la infección con los linajes
específicos resistentes a los medicamentos que circulan en Veracruz, México.
material y métodos
Población de estudio y aislamiento de muestras clínicas
Realizado entre abril de 2013 y mayo de 2015, se trata de un estudio transversal en el que
se tomaron 400 muestras de esputo clínico de igual número de individuos con sospecha de TB.
El Laboratorio de Salud Pública de la Secretaría de Salud del Estado de Veracruz recolectó todas las muestras como
parte del procedimiento estándar de diagnóstico para confirmar la presencia de TB y resistencia a los medicamentos.
Este laboratorio brinda el servicio de diagnóstico de TB y también la prueba de susceptibilidad contra
Fig 1. Distribución de las zonas geográficas, jurisdicciones y linajes incluidos en Veracruz, México. Zona Norte (NZ):
Panuco, Tuxpan, Poza Rica, Martıńez de la Torre. Zona Centro (ZC):Xalapa, Córdoba, Orizaba, Veracruz.
Zona Sur (SZ): Cosamaloapan, San Andre´s Tuxtla, Coatzacoalcos.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193626.g001
drogas de primera línea, a la población del estado de Veracruz; que roza los 7,5 millones de habitantes,
situado en un área cercana a los 72.000 km2 . Las muestras de esputo se descontaminaron utilizando
el método modificado de Petroff [21] y el aislamiento primario se logró con medio Lo¨wensteinJensen.
Las pruebas de susceptibilidad para los fármacos de primera línea estreptomicina (S), isoniazida (H),
rifampicina (R), et ambutol (E) y pirazinamida (Z) se realizaron mediante el método fluorométrico (MGIT
960 BectonDickinson)
De las historias clínicas de cada paciente se recuperaron variables como edad, sexo, lugar de
residencia, tipo de diagnóstico y tratamiento. Las características geográficas se incluyeron
considerando dos niveles; (1) la jurisdicción o “distrito” donde se recolectó cada aislado, y (2) la zona
geográfica en la que se ubicaron las jurisdicciones sanitarias. Considerando estas tres grandes
zonas se definieron: Zona Norte incluyendo las siguientes jurisdicciones: 1 (Panuco), 2 (Tuxpan), 3 (Poza
Rica) y 4 (Martínez de la Torre), Zona Centro considerando: 5 (Xalapa), 6 ( Córdoba), 7 (Orizaba), 8
(Veracruz), y Zona Sur que incluye: 9 (Cosamaloapan), 10 (San Andrés Tuxtla) y 11 (Coatzacoalcos).
(figura 1)
Purificación de ADN, 24loci MIRUVNTR y análisis de spoligotyping. El ADN se extrajo con un
asa de cultivo de micobacterias, siguiendo las recomendaciones de Van Soolin gen et al.[22]. La
concentración del ADN se determinó por espectrofotometría en un Nano drop 1000 (Thermo
Scientific). La tipificación MIRUVNTR de 24 locus se realizó siguiendo las recomendaciones de
Supply et al. [4]. Cada locus se amplificó individualmente y los fragmentos de PCR se separaron
mediante electroforesis utilizando un gel de agarosa al 2%. El tamaño del fragmento se estimó por
comparación con escalas de peso molecular de ADN de 100 pb y se verificó de forma independiente por
dos individuos distintos. El número de repeticiones en cada locus se calculó aplicando la tabla de
conversión correspondiente [23].
Spoligotyping se llevó a cabo siguiendo técnicas estándar [3, 24]. La región de repetición directa
(DR) se amplificó con los oligonucleótidos DRa (5´GGTTTTGGGTCTGACGAC3´biotinilado) y DRb (5
ĆCGAGAGGGGA CGGAAAC3´). Los productos de PCR biotinilados se hibridaron con una
membrana que contenía un conjunto de 43 oligonucleótidos correspondientes a cada espaciador. ADN
de M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis CDC1551 y M. bovis BCG fueron
utilizados como controles. Los productos de PCR hibridados se incubaron con conjugado de estreptavidina
peroxidasa y la membrana se expuso a un sistema de quimioluminiscencia, seguido de exposición a una película de
rayos X. A continuación, la película se reveló utilizando procedimientos fotoquímicos estándar (Amer sham
International, Buckinghamshire, Reino Unido). El tipo internacional de espoligotipo (SIT) y la asignación de
familias se realizaron utilizando las bases de datos SITVIT3 y SPOLDB4 (http://www.pasteurguadeloupe.fr/tb/
bd_myco.html)[25,26 ].
Asignación de linaje, análisis de conglomerados y complejos clonales. Los genotipos se expresaron
como códigos numéricos que representan el número de MIRUVNTR para cada locus. Los linajes se
identificaron individualmente utilizando el módulo de búsqueda de similitud [27] de la base de datos MIRU
VNTRplus (http://www.miruvntrplus.org/MIRU/index.faces)[28].
El arreglo polar del árbol fue realizado por el programa FigTree (Tree Figure Drawing Tool Versión
1.4.3. http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree), mediante archivo Nexus generado por el algoritmo UPGMA
sobre la base de datos MIRUVNTRplus considerando datos de patrones de spoligotyping y 24 lociMIRU
VNTR. El índice discriminatorio de HunterGaston (HGDI) se calculó como se informó anteriormente para
24 lociMIRUVNTR [29].
Los complejos clonales se identificaron utilizando el módulo de árbol de expansión mínimo en la base de
datos MIRUVNTRplus [28], considerando 24 loci MIRUVNTR, con diferencias máximas dentro de un
complejo clonal de cinco loci.
Análisis estadístico y asociación de variables epidemiológicas y genotipos Los datos de los
pacientes
incluidos en el estudio se analizaron mediante frecuencias y estadísticos Chicuadrado con corrección de
Yates y prueba exacta de Fisher. La asociación entre las variables fue
determinado con base en el análisis de razones de probabilidad, considerando la inclusión dentro de un
linaje específico edad, conglomerados o SIT y variables como género, edad, ubicación geográfica
(Jurisdicciones o zona geográfica) y farmacorresistencia considerando significativo un valor de p< 0.05 .
Todos los cálculos se realizaron con el software SPSS V.12. Para explorar más a fondo la relación entre
características como el género, la edad, el perfil de resistencia a los medicamentos, la jurisdicción, los
conglomerados y las TIE, realizamos un análisis de correspondencia múltiple[30]. Este análisis se utiliza
para identificar, dentro de un pequeño número de dimensiones, las desviaciones más significativas que
están determinadas por una función de chi cuadrado, que se conoce como la inercia total. La dimensión
1 representa la mayor desviación de independencia de los datos, y la dimensión 2 la segunda mayor
desviación, y así sucesivamente en orden descendente. Cuanto más distante esté un valor del origen de la
categoría de respuesta en una dimensión, mayor será su importancia en la interpretación de esta
dimensión. Los conglomerados o categorías de respuesta que están muy cerca dentro de un gráfico de
puntos, y con su carga en la misma dimensión, tienden a indicar similitudes entre respuestas con correlaciones de mod
Preocupaciones éticas
No se realizaron intervenciones físicas con los pacientes. Toda la información recopilada se trató de
forma confidencial y se obtuvo el consentimiento por escrito de cada individuo. La Ética
comités del Instituto de Salud Pública de la Universidad Veracruzana supervisaron y aprobaron las
cuestiones éticas involucradas en este estudio, y no se incluyeron animales de experimentación.
Resultados
Población y muestras clínicas
Durante el periodo abril 2013 a mayo 2015 se recolectaron 410 muestras de esputo de pacientes
diagnosticados con TB pulmonar de las once jurisdicciones sanitarias de Veracruz como se describe
arriba. De estos, ciento doce (25%) aislados mostraron resistencia a al menos un fármaco de primera línea
y, por lo tanto, se incluyeron en el análisis.
Los individuos que portaban una cepa resistente a los medicamentos eran predominantemente hombres
(79 individuos; 71 %) con una edad promedio de 44 ± 16,7 años. Por grupos de edad, 18 (16%) de las
personas tenían entre 18 y 24 años, 38 (34%) entre 25 y 44 años y 56 (50%) mayores de 45 años. Un
total de 91 (81%) personas fueron diagnosticadas con TB por primera vez, mientras que 21 (15%) habían tenido previ
nuestro tratamiento.
Características y distribución geográfica de los aislamientos farmacorresistentes Se identificaron
veinte perfiles diferentes de farmacorresistencia; 31 (28%) cepas fueron monorresistentes (MR), 18 (16%)
presentaron resistencia a cualquier combinación de dos o más fármacos, con excepción de la combinación
rifampicina e isoniazida, fueron reconocidas como polirresistentes (PR), 62 (55%) eran MDR y uno (1%) era
extremadamente resistente a los medicamentos. Este último aislado fue inicialmente identificado como MDR,
pero luego confirmado como XDR por el Instituto Nacional de Referencia Epidemiológica, México.
De los 31 aislados de MR, once presentaron resistencia a isoniazida (H), diez a estreptomicina, siete
a rifampicina y tres a pirazinamida. No se encontró monorresistencia al etam butol (E). En los aislados de
PR se identificaron ocho perfiles diferentes. De estos, la proporción más alta (9/18) fue una combinación
de resistencia a isoniazida y estreptomicina (HS).
Entre los aislados MDR se observaron 8 perfiles de resistencia diferentes y el 21% (13/62) presentó
resistencia a todos los fármacos de primera línea (SHREZ).
Según su origen, 23 (20,5%) aislamientos procedían de la Zona Norte (NZ, incluyendo
jurisdicciones sanitarias 1 a 4), mientras que setenta y seis (67,8 %) se encontraron en la Zona
Central (CZ, incluidas las jurisdicciones 5 a 8) y 13 (11,16 %) procedían de la Zona Sur (SZ, incluidas las
jurisdicciones 9 a 11) . Considerando el carácter MDR de los aislamientos de TB, la Zona Central aportó el
mayor número de aislamientos MDR (45/76), seguida de NZ (13/23) y finalmente SZ (4/13). (Figura 1 y
Tabla 1)
Cuadro 1. Distribución geográfica de los aislamientos recuperados de Veracruz, México.
Jurisdicciones SEÑOR relaciones públicas MDR XDR Total
Zona Norte (N)
1 0 1 2 0 3 (2,68%)
2 0 0 1 0 1 (0,89%)
3 5 1 9 0 15 (13,39%)
4 2 1 1 0 4 (3,57%)
Total 23 (20,53%)
Zona Centro (C)
5 4 2 7 1 14 (12,5%)
6 3 2 9 0 14 (12,5%)
7 1 0 0 0 1 (0,89%)
8 11 7 29 0 47 (41,96%)
Total 76 (67,86%)
Zona Sur (S)
9 1 3 0 0 4 (3,57%)
10 1 1 0 0 2 (1,78%)
11 3 0 4 0 7 (6,25%)
Total 13 (11,6%)
Total 112 (100%)
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193626.t001
Descripción de la estructura de espoligotipos poblacionales de la RD y
Cepas de TBMDR
De los 112 resistentes, 83 (74 %) aislados se clasificaron en 34 (66 %) SITS reconocidos incluidos
en ocho linajes principales, predominando el linaje global “euroamericano” 4 (69 %). Teniendo en
cuenta el espoligotipo, SIT/linaje y formación de grupos, los aislamientos se clasificaron en
tres grupos principales (Fig. 2). El primer grupo incluyó 70 (63%) aislamientos con 19 SIT/linajes,
formando el mismo número de grupos. El segundo grupo incluyó 13 (12%) aislamientos con el
mismo número de SIT pero sin formación de grupos (singletons). El tercer y último grupo
incluyó 29 (25%) aislamientos sin SIT/asignación de linaje (huérfanos) y con siete conglomerados
que incluían 19 aislamientos.
El linaje más frecuente fue el T1, que se encontró en 27 (24%) aislamientos e incluyó tres
sublinajes (T1, T3 y T1RUS). El linaje LAM se detectó en 18 (16%) cepas, incluidos cuatro
sublinajes (LAM1, LAM3, LAM4 y LAM9). El linaje Haarlem (H) se observó en 17 (15%)
aislamientos e incluyó tres sublinajes (H1, H2 y H3). Los linajes encontrados con menor
frecuencia fueron X, observados en ocho (7%) aislados, clasificados en dos sublinajes (X1 y X3).
En una proporción menor, los linajes East Asia IndiaManila (EAIManila) y S se observaron en
tres (2,6 %) aislamientos cada uno, y los linajes Beijing y EAI5 se observaron en dos (1,7) y uno
(0,8 %) aislamientos. , respectivamente. Casi todos estos linajes se observaron en las diferentes
zonas geográficas del estado (Fig. 1 y Fig . 2).
Los SITS más abundantes fueron SIT53 (T1) y SIT42 (LAM9), con 10 aislamientos cada
uno, y SIT50 (H3) con ocho aislamientos. Le siguieron SIT 119 (X1) con cinco aislamientos, y
luego SIT19 (EAIManila), SIT46 (ND), SIT92 (X3), SIT 376 (LAM3), SIT707 (S), SIT948 (H3) y
SIT1123 (T1RUS), con tres cepas cada uno (Fig. 2). Se observaron SIT1 (Beijing), SIT2 (H2),
SIT 20 (LAM1), SIT51 (T1), SIT258 (T1), SIT398 (LAM4), SIT602 (ND), SIT 2642 (H1) con dos
aislamientos cada uno (Fig . 2). Es importante mencionar que en el tercer grupo 18 (16%)
aislamientos huérfanos formaron siete clusters: ORF1V con cinco aislamientos
(700076717760771), ORF2V (777777763760771) con tres y ORFV3
(770077777760771), ORFV4 (773577777760631), ORFV5 (777675777760771), ORFV6
(677777607720771) y ORFV7 (700017607720771) con dos aislados cada uno (Fig. 2).
Análisis MIRUVNTR e identificación de complejos clonales Los resultados
del análisis MIRUVNTR de 24 loci mostraron que los 31 aislamientos se clasificaron en diez
complejos clonales, que correspondieron a los siguientes linajes por espoligotipado: CC1T11
(n = 8, 293245433335336204344a62), CC2LAM9 (n = 5, 25221643242411615 4403933);
CC3X1 (n = 3, 253234442334525153344043), cc4h31 (n = 3, 223236333344
4251543433843), cc5orfv1 (n = 2, 263244342355355256544444444) CC7ORFV5 (n = 2,
2342345234252362354444623), cc8orfv 6 (n = 2, 24421633333453626444436443), CC9
EAI (n = 2, 21422254323532622435526262), CCC y CCC (n = 2,
214222543235326224355262262).
El HDGI global calculado fue de 0,99, y el índice de diversidad individual mostró que solo un
alelo era poco discriminante, Miru04 (0,18). Dos fueron moderadamente discriminantes Miru2
(0.5), Miru24 (0.53). Mientras que los 21 restantes fueron altamente discriminantes: Miru20 (0.62),
ETRA (0.63), Mtub 34 (0.63), Mtub 21 (0.64), ETRC (0.66), ETRB (0.66), Miru23 (0.67), Mtub
29 (0.67) , Miru 31 (0,68), Mtub 39 (0,69), Miru 39 (0,70), Miru26 (0,71), Miru27 (0,71), Miru16
(0,76), Miru 40 (0,79), Miru10 (0,79), Mtub 30 (0,82) , Mtub04 (0,83), QUB11B (0,82), QUB4 156
(0,83) y QUB 26 (0,88).
Fig. 2. Grupos según SIT/linaje y formación de conglomerados en aislamientos de TB farmacorresistente (DR) y multirresistente (MDR) de Veracruz,
México.
Formación de grupos y características de resistencia a los medicamentos
Tres grupos fueron los más abundantes (Fig. 3); (1) cluster T11, que incluye diez aislamientos, ocho de ellos
MDR, y distribuidos en todo el estado pero con predominio en la CZ, y en varones mayores de 45 años. (2)
El grupo LAM9 constaba de diez aislamientos, seis de los cuales eran MDR, nueve eran de la CZ y ocho
se observaron en machos. (3) Grupo H31, incluidos ocho aislamientos, cuatro de los cuales eran MDR,
ocho eran de la CZ y se encontraron en pacientes masculinos.
Dos grupos presentaban cinco aislamientos cada uno: el primero era X1 e incluía tres aislamientos MDR,
todos los cuales eran de CZ y predominantemente de hombres; el segundo fue ORFV1, formado por
aislados huérfanos, todos MDR, de la CZ y predominantemente en varones. (Figura 3)
Ocho grupos tenían tres aislamientos: T1Rus2, H32, LAM3, X3, S, EAI, 46 y ORFV3.
Finalmente, se encontraron dieciséis clusters con dos aislamientos: T12, T13, T14, H1, H2, LAM1, LAM3,
LAM4, LAM, 602, Beijing, ORFV2, ORFV4, ORFV5, ORFV6 y ORFV7 (figura 3).
De los 91 aislamientos de pacientes con diagnóstico por primera vez, 75 formaron 26 grupos y el resto
fueron monotipos. Solo 16 grupos (T12, T13, H1, H1, H2, LAM4, X1, X3,602, EAI, 46, ORFV2, ORFV3,
ORFV5, ORFV6 y ORFV7) fueron conformado exclusivamente por individuos con diagnóstico de primera vez
y solo cuatro (602, ORFV2, ORFV3 y ORFV6) incluyeron aislamientos exclusivamente multirresistentes.
Por su parte, de los 21 aislamientos de individuos con retratamiento, 15 se observaron en doce
conglomerados de los cuales solo uno (LAM3), estaba formado por dos individuos con retratamiento, pero
con diferentes patrones de resistencia (Fig. 3). El dendograma de arreglo polar en árbol muestra la
presencia de 6 grupos principales (Fig. 4). Los primeros incluyen tres grupos con los linajes H2, Beijing y
T14. El segundo grupo incluye solo un grupo con aislamientos que llevan el linaje EAI. El tercer grupo incluía
cinco grupos, dos con linaje H (H1H32), uno huérfano (ORFV4) y dos sin linaje (602 y 46). El cuarto
incluía cuatro grupos, solo uno era X3 y los restantes eran huérfanos (ORFV1, ORFV2, ORFV7). El
quinto grupo consideró cuatro grupos con sublinajes LAM (LAM1, LAM3, LAM4, LAM9) y un grupo huérfano
(ORFV6). El último grupo fue el más abundante y consideró 8 racimos, tres con linaje T1 (T11, T12 y
T13), y los restantes fueron S, ORFV3, ORFV5, X1 y H31.
Asociación de variables con conglomerados, SIT y linajes El análisis
de asociación entre variables solo mostró que los aislados y conglomerados con genotipo
huérfano tenían 2,5 (IC 1,055,86) y 3,3 veces más riesgo (IC 111,03) de tener una TB
MDR fenotipo, respectivamente.
Mediante análisis de correspondencias múltiples, y considerando cluster y SIT, fue posible
observar algunas asociaciones dentro de las regiones del estado de Veracruz. El conglomerado
ORVF4 mostró asociación con jurisdicción 10 San Andrés Tuxtla, (Diamante 25 con cruz 10, Fig 5A) (valores
de inercia ACS Conglomerado vs. Jurisdicción; 0.268 y 0.255, respectivamente), mientras que el conglomerado
H2 tuvo asociación con jurisdicción 2 Tuxpan (Diamante 8 con cruz 2, Fig. 5A) (valores de inercia ACS
Cluster vs. Jurisdicción 0.493 y 0.491, respectivamente). Considerando el SIT como elemento de
agregación, SIT8 (EAI5) mostró asociación con la jurisdicción 4 Martínez de la Torre (NZ) (Diamante 8 con
cruz 4, Fig 5B) ( valores de inercia ACS SIT vs. Jurisdicción, 0.241 y 0.388, respectivamente ). Se
asociaron el SIT 1123 (T1Rus) y jurisdicción 9 Cosamaloapan (Diamante 1123 con cruz 9, Fig 5B) (valores
de inercia ACS SIT vs. Jurisdicción, 0.203 y 0.229, respectivamente). Finalmente, SIT2 (H2) y jurisdicción
2 Tuxpan (NZ) tuvieron una relación significativa (Diamante 2 con cruz 2, Fig 5B) (valores de inercia ACS
SIT vs. Jurisdicción, 0.493 y 0.491, respectivamente).
Figura 3. Características de los conglomerados observados por el algoritmo UPGMA en aislamientos de Veracruz, México.
Discusión
De los 20,000 casos de TB que se reportan anualmente en México, entre 1,200 y 1,500 son RD.
El estado de Veracruz aporta el 11% (2,000) del total de casos de TB, de los cuales el 8% (150) son RD.
Además, Veracruz también ocupa el primer lugar en cuanto al número de casos prevalentes de TBMDR
en el país. Por estas razones, el estado se ubica como uno de los contribuyentes más importantes al
problema de la TBDR y la TBMDR en México [31]. Estos datos ayudan a explicar por qué el 55% (62) de
los aislamientos analizados en este estudio fueron MDR, así como también por qué la muestra analizada
correspondió a casi todos los casos diagnosticados como TBDR en un año en el estado.
El 82% de los aislamientos (75/91) de pacientes diagnosticados como caso nuevo se ubicaron en un clus
ter Los linajes T y H tenían alguna tendencia a incluir estos nuevos casos, pero con diferentes patrones
de resistencia. Sin embargo, en los siete grupos que contenían los 18 aislamientos clasificados como
huérfanos, 16 eran casos nuevos y trece eran multirresistentes. Será necesario caracterizar aún más estos
aislamientos huérfanos, utilizando marcadores moleculares adicionales para establecer su pertenencia
a un linaje específico [32], así como los factores que promueven su tendencia a desarrollar resistencia a los
medicamentos. Por otro lado, el 71% (15/21) de los aislamientos de un paciente con Tb previo al
tratamiento se ubicaron en grupos. Los grupos con un linaje LAM incluyeron el 28% (6/21) de estos
individuos, de los cuales solo tres eran multirresistentes. Esta información muestra que la DRTB en la
región parece estar dominada principalmente por clones pertenecientes a diversos linajes con diversos
perfiles de resistencia y amplia dispersión. La información será de gran ayuda para sugerir mejoras en
la vigilancia de la TBDR y prevenir su propagación.
Fig. 4. Dendograma de arreglo polar de árboles, de aislamientos DR y MDR de Veracruz, México.
Fig 5. Gráfico de puntos por categoría de análisis de correspondencia múltiple de las variables edad, jurisdicción, perfil de resistencia, género y; a) Clusters yb) SIT de los 112
aislamientos de TB farmacorresistente analizados.
La resistencia a isoniazida fue la más frecuente; se observó en el 71% (80/112) de la recuperación
aislamientos erizados. De estos, el 27% (31/112) y el 50% (9/112) fueron aislados con carácter mono
y polirresistente. Recientemente se ha sugerido que la resistencia a la isoniazida surge antes de la
aparición de la resistencia a la rifampicina [33], por lo que el 35% (40/112) de los aislados estudiados
podrían evolucionar para desarrollar resistencia a la rifampicina y ser multirresistentes. En
consecuencia, es necesario desarrollar un sistema de vigilancia más estrecho en el estado, con
especial énfasis en los aislados donde se observe resistencia a isoniazida y con el fin de reducir la
evolución de DR a MDR y su posterior dispersión dentro de la población.
El análisis de los 112 aislamientos recuperados nos permitió establecer la primera descripción detallada
de la estructura genética de una de las colecciones más abundantes de aislamientos de TBDR y TBMDR
del sureste de México. Los resultados mostraron que el 69% de los aislamientos se ubicaron dentro del
Linaje global "euroamericano" 4, que incluye los linajes T, LAM y H [34,35], mientras que el 25% de las
cepas se encontraron como huérfanas, con el 6% restante en dos linajes asiáticos.
La naturaleza predominante del linaje 4 y la baja presencia de los linajes 2 y 3 (Beijing y EAIManila)
respaldan informes previos de aislamientos de TBRD y MDR del centro y norte de México, así como de
otros países de América Latina (Tabla 2 ) . El linaje T mostró la mayor frecuencia, coincidiendo con
reportes previos de aislamientos mexicanos; sin embargo, en los países sudamericanos parece predominar
el linaje LAM (Cuadro 2). A partir de estos
Cuadro 2. Estudios que informan la distribución de linajes en aislamientos de M. tuberculosis resistentes a fármacos y multifármacos en América Latina.
País y Período Nº de cepas/tipo HT LAM S Pekín X EAI Huérfanos o Referencia

sin clasificar
787/MDR 36,3% 13,9% 38,8% 2,8% 1,5% 0,9% 3,8%

Argentina, 2003–2009 [37]
951/MDR 28,9% 17,4% 37,2% 1,3%
Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Venezuela, [38]
20042008
Brasil 2015 104/DRMDR 5,7 % 14 % 66 % 1,9 % 1,9 % 8,6% [39]

Brasil 2012 121/MDR 4% 22% 57% 0,8%
[40]
Brasil 2014 99/MDR 12% 17% 47% 6% 1%
[41]
Perú 2015 13% 8,6% 59% 8% 4%
209/DR,MDR [42]
Perú 2014 142/XDR 43,6% 27,4% 16% 9% 1,4%
[43]
Colombia 2011 15% 3,8% 23,1%
76/DR, MDR 22,5 % 5,6 % 30 % [44]
México 2013 109/MDR 3,6% 56% 4,6% 2,75% 0,9% 4,6% 20,1% [18]
México 2002–2013 1237/Sensible 3,1% 20,3% 6,8% 1,29% 0,72% 11,4% 6,8%
[19]
/DR
México 2017 112/MDR 15% 24% 16% 2,6% 1,5% 7% 2,6% 25% Este
estudio
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193626.t002
observaciones, surgen dos interrogantes: ¿cómo los factores sociodemográficos, geográficos y
genéticos de la población latinoamericana podrían estar promoviendo la dispersión de los miembros del
linaje 4 sobre el 2 y el 3 [36], y cómo estos factores podrían también influir en la mayor ocurrencia de T
sobre el linaje LAM en México. Se necesitan más estudios de epidemiología molecular para responder a
estas preguntas.
Identificamos 32 SIT, de los cuales 17 (53%) (1, 2, 19, 20, 42, 46, 49, 50, 51, 53, 92, 119, 291, 334,
948, 787 y 2212) habían sido previamente descrito en aislamientos de TBDR y TBMDR que circulan en
México [18,19] y otros países de América Latina [40,41,43,44].
Dada su relación con alta virulencia y desarrollo de farmacorresistencia, llaman la atención siete SIT:
SIT1/Beijing y SIT19/IIAManila, formando dos clusters cada uno con tres aislados, de los cuales solo uno fue
MDR. El linaje WBeijing se considera importante por su predominio en países asiáticos, alta infectividad y
tendencia a desarrollar multirresistencia[45–47]. La presencia de estos linajes en el área confirma su
amplia distribución en México, así como su participación aparentemente limitada en la generación de
multidrogorresistencia [15,18,19,48].
El SIT20/LAM1 se observó en dos aislamientos formando un grupo. Esta SIT tiene especial
importancia ya que incluye específicamente aislados con el genotipo RDRio, que se caracteriza por ser
altamente virulento y causar una infección de manera más eficiente [49]. Curiosamente, uno de los aislados
que portaban esta SIT mostró resistencia a todos los fármacos de primera línea. Diez aislamientos
presentaron SIT42/LAM9 y dos aislamientos SIT398/LAM4, de los cuales nueve fueron MDR. Se ha
descrito que ambos SIT presentan una combinación de ausencia y portación del genotipo RDRio. El
SIT376/LAM3 formó un grupo con tres aislamientos, dos de los cuales eran MDR.
Sin embargo, el genotipo RDRio está ausente en los miembros de esta SIT[49,50]. A la fecha no existen
reportes que confirmen la presencia o ausencia del marcador genotípico RDRio en aislamientos con linaje
LAM circulantes en México. Por tanto, será necesario confirmar la aparición de este genotipo, así como
determinar su influencia en el desarrollo de TB multirresistente y farmacorresistente.
SIT50/H3 tiene una alta frecuencia de mutación katGS315T en cepas de TB resistentes a la isoniazida[51]
y genes de reparación del ADN que permiten una mayor adaptabilidad a entornos hostiles [52]. Los ocho
aislados con SIT50/H3 identificados aquí también fueron resistentes a la isoniazida. Este SIT ha sido
descrito en México [18,19]; sin embargo, las descripciones de mutaciones que explican DR o MDR
carácter en aislamientos con este linaje son escasos [20,53]. Tenemos planeado realizar análisis adicionales
para confirmar la presencia de mutaciones en el gen katG en SIT50 y el resto de SIT del linaje H que se
encuentran en el entorno, como SIT2/H2, SIT948/H3, SIT2642/H1, para evaluar su influencia en la generación,
dispersión y resistencia a la isoniazida.
Quince aislamientos (13%) se ubicaron dentro de siete SIT descritos por primera vez en México
(243, 376, 602, 707, 1123, 2212 y 2642). Según la base de datos SITVITWeb [26], se observaron dos
marcados comportamientos en cuanto a la ubicación geográfica de estos SIT. Se han reportado cuatro SIT solo
en países del continente americano: SIT376/LAM3 observado en Brasil, Venezuela y Guatemala; SIT707/S
descrito en Argentina; SIT2642/H1 en Paraguay y SIT2212/H3 detectado en Estados Unidos. El segundo grupo
incluía aislamientos con una distribución más amplia, incluidos SIT243/T1 descritos en Bélgica, Italia, Zambia
y Estados Unidos; SIT1123/T1RUS, detectado en Polonia, Bélgica, Bangladesh, Turquía y Estados Unidos.
El reporte de esta SIT por parte de nuestro estudio representa su primera descripción en un país latinoamericano.
Finalmente, SIT602 se observó en Alemania, Turquía, España, Brasil, Alemania, Estados Unidos, Francia
y Sudáfrica. Esta SIT incluyó dos aislamientos de TBMDR en un grupo y el tipo spoligo coincidió con un aislado
de TBMDR recuperado en 2003 del estado de Tabasco (sur de México) y clasificado como huérfano [18] .
Esta información muestra que este SIT parece haber estado circulando en México por más de 10 años y
con una fuerte tendencia a desarrollar y/o transmitir un fenotipo MDR.
El número significativo de espoligotipos (52), linajes (8), grupos (27), complejos clonales (10) y patrones
de espoligotipos huérfanos (29) identificados demuestra la alta e importante diversidad genética de los
aislamientos de TBDR y TBMDR que circulan en la zona. La tasa de transmisión se calculó en un 56 %, lo
que muestra que alrededor de la mitad de los aislamientos de TBDR se generaron por transmisión directa,
mientras que el resto se originó en diferentes fuentes. En este sentido, todas las personas incluidas en el estudio
eran originarias del estado de Veracruz y manifestaron no haber realizado viajes fuera de México en los
últimos tres años. Es importante mencionar que el estado de Veracruz cuenta con un importante flujo de
inmigrantes centro y sudamericanos cuyo destino final es Estados Unidos y además remarcar que el
estado cuenta con tres de los cinco principales puertos marítimos de México. Estos factores pueden explicar
la posible importación y posterior distribución de algunos de los genotipos que circulan en la zona, un escenario
similar se ha descrito en el estado de Baja California, estado ubicado en el norte de México [48] .
La alta diversidad de genotipos/linajes encontrados en nuestro trabajo, especialmente del Linaje 4, parece
ser una constante en los países latinoamericanos (Cuadro 2); sin embargo, esto difiere de lo observado en países
asiáticos, europeos o africanos, en los que los genotipos/linajes de los grupos 1, 2 y 3 o de un linaje más
específico (p. ej., Beijing) son los principales responsables de la transmisión y dispersión de DR Aislados de
TB y MDRTB [54–57]. Esto podría explicarse por el efecto fundador observado en aislamientos MDR de
Perú [42] y Ucrania [58] donde el predominio de linajes específicos parece confinar la dispersión de linajes
nuevos o menos frecuentes en la misma región geográfica.
Según el análisis de riesgo, tener solo un genotipo huérfano o estar dentro de un cluster con esta
característica (ORFV) fue la única variable que mostró riesgo asociado de desarrollar TBMDR (OR 2,5 y OR
3,3, respectivamente). Sin embargo, los análisis de correspondencias múltiples mostraron valores
relativamente altos de inercia (asociaciones) para ciertos conglomerados y SIT específicos con jurisdicciones,
lo que evidencia un aparente desarrollo inicial de brotes de aislamientos de TBMDR en ciertas áreas
geográficas. Sin embargo, para confirmar estos riesgos, será necesario realizar análisis genotípicos adicionales
que incluyan aislados de TB sensibles, considerando que en una población heterogénea la probabilidad de que
se observe un caso de TBMDR dentro de un conglomerado específico disminuye, por el contrario, los casos
sensibles aumentar. Tal vez esta herramienta estadística podría
ser útil en futuros estudios donde una evaluación de numerosas variables y la identificación de
Se realizarían posibles asociaciones, considerando datos con desagregación significativa.
Una de las limitaciones más importantes de nuestro estudio fue la imposibilidad de realizar pruebas de
sensibilidad a los medicamentos en el momento del diagnóstico inicial de TB. En México, las pruebas de
susceptibilidad a medicamentos sólo se realizan cuando se observa una baciloscopía positiva al segundo o tercer
mes de tratamiento. Por lo tanto, no fue posible determinar si los individuos portadores de ciertas SIT tenían un tipo
de resistencia primaria o secundaria y, en consecuencia, no fue posible determinar en detalle la tendencia o
capacidad de ciertas SIT para desarrollar o transmitir DR o MDR.
Una segunda limitación de nuestro estudio se relacionó con la ausencia de información genotípica sobre
los aislamientos de TB sensibles a los medicamentos, toda esta información podría ayudarnos a establecer una
proporción más correcta de aislamientos de resistencia a los medicamentos en cada grupo/clado, pérdida o sesgo
en los datos y potencial. factores de riesgo potencial. No obstante, los resultados obtenidos en este estudio muestran
tendencias de predominio de algunos linajes relacionados con farmacorresistentes que deben confirmarse con más
detalle, además este estudio indica la urgente necesidad de implementar estas herramientas de genotipado dentro
de un sistema de vigilancia epidemiológicamolecular de TB en México. .
En conclusión, nuestro estudio ilustra la utilidad del spoligotyping y MIRUVNTR para establecer una línea de
base inicial de los linajes genotípicos de las cepas de TBDR y TBMDR actualmente en circulación en Veracruz. Los
resultados destacan una diversidad importante de genotipos circulantes, con una proporción significativa de linajes
T, seguidos de LAM y H. Se requieren más estudios para dilucidar mejor la estructura genética de los linajes
de TBDR y TBMDR que circulan en México; esta información nos ayudará a determinar cómo estos linajes pueden
verse influenciados por factores geográficos, étnicos o migratorios, y también evaluar la efectividad del programa
de control de la TB, con énfasis en la vigilancia de la resistencia a los medicamentos.
Expresiones de gratitud
D. MR, fue becario CONACYT número 41603, del “Doctorado en Ciencias de la Salud” del Instituto de Ciencias de la
Salud de la Universidad Veracruzana. E. FM, es becaria CONACYT número 850447 de la Maestría en Ciencias de
la Salud del Instituto de Ciencias de la
Salud de la Universidad Veracruzana. Este trabajo fue apoyado por CONACyTProyecto de desarrollo cientı´fico
para atender problemas nacionales No. 213712:Desarrollo de un sistema de vigilancia epidemiológico molecular de
TB.
Contribuciones de autor
Conceptualización: Daniela MunroRojas, Javier FuentesDomıńguez, Michael Lauzardo, Jorge Alberto Gonza
´lezyMerchand, Roberto ZentenoCuevas.
Curación de datos: Daniela MunroRojas, Esdras FernandezMorales, Jose´ ZarrabalMeza, Ma.
Teresa MartıńezCazares, Aurora ParissiCrivelli, Javier FuentesDomıńguez, Roberto Zen tenoCuevas.
Análisis formal: Daniela MunroRojas, Esdras FernandezMorales, Jose´ ZarrabalMeza, Marie Nancy Se
´raphin, Sandra RiveraGutierrez, Roberto ZentenoCuevas.
Financiamiento adquisición: Roberto ZentenoCuevas.
Investigación: Daniela MunroRojas, Esdras FernandezMorales, Sandra RiveraGutierrez.
Metodología: Daniela MunroRojas, Esdras FernandezMorales, Jose´ ZarrabalMeza, Ma.
Teresa MartıńezCazares, Javier FuentesDomıńguez, Marie Nancy Se´raphin, Michael Lau zardo, Jorge Alberto
Gonza´lezyMerchand, Sandra RiveraGutierrez, Roberto Zenteno Cuevas.
Administración del proyecto: Aurora ParissiCrivelli, Roberto ZentenoCuevas.
Recursos: Jorge Alberto Gonza´lezyMerchand, Roberto ZentenoCuevas.
Supervisión: Michael Lauzardo.
Validación: Daniela MunroRojas, Javier FuentesDomıńguez, Marie Nancy Se´raphin.
Visualización: Daniela MunroRojas.
Redacción ± borrador original: Daniela MunroRojas, Marie Nancy Se´raphin, Michael Lauzardo, Jorge
Alberto Gonza´lezyMerchand, Roberto ZentenoCuevas.
Redacción ± revisión y edición: Daniela MunroRojas, Michael Lauzardo, Jorge Alberto Gonza´lezy
Merchand, Roberto ZentenoCuevas.
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