Capítulo 14

Microscopía e imágenes
Margaret J. Barch 1 y helen J. Lawce 2
1*( fallecido) anteriormente, Laboratorio de Citogenética Frank F Yen, Centro de Evaluación Infantil Weisskopf, Universidad de Louisville,
Louisville, KY, EE. UU.
2 Laboratorio de diagnóstico Knight de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

14.1 El microscopio estándar

El microscopio es una herramienta indispensable en citogenética. Los tecnólogos dedican muchas horas a utilizar este notable instrumento en el
análisis de cromosomas y FISH. Por lo tanto, un conocimiento práctico informado de la teoría del microscopio y la fotomicrografía es un activo que
roza la necesidad.
Los microscopios más simples y complejos contienen los siguientes componentes (ver Figura 14.1):

1. Ocular o lentes oculares. Los oculares amplían aún más la imagen del espécimen, ya sea para los ojos o para la cámara. Tubo de
2. microscopio o tubo corporal. Es posible que el cuerpo del microscopio no se parezca a un tubo en el microscopio actual, pero es la
sección que conecta el objetivo y los oculares.
3. Muserola. La mayoría de los microscopios tienen un revólver portaobjetivos que sostiene varios objetivos.
4. Lentes objetivas. Los objetivos enfocan y amplían la imagen de la muestra. Algunos están equipados con un collar de corrección para corregir las
aberraciones en el grosor de los cubreobjetos para obtener el mejor contraste y calidad de imagen.
5. De pie o en una extremidad. El soporte es la columna vertebral del microscopio y contiene todos los mecanismos del escenario, la subplaca y el tubo.
6. Etapa de muestra. El escenario sostiene el tobogán.
7. Condensador de sub-etapa. El condensador enfoca la luz sobre la muestra.
8. Diafragma de diafragma de diafragma de diafragma o diafragma. El tope de apertura se encuentra en el condensador de la subplaca.

9. Ajuste grueso. Este mecanismo de enfoque mueve las lentes o la platina hacia arriba y hacia abajo, según el modelo de
microscopio.
10. Ajuste fino. Esta perilla mueve la lente o el escenario una distancia corta para un enfoque fino.
11. Ajuste del condensador. Por lo general, hay un mecanismo de piñón y cremallera que mueve el condensador hacia arriba y hacia abajo en relación con el escenario.

12. Diafragma de tope de campo. El tope de campo se encuentra debajo del condensador, generalmente en la base del microscopio. Se puede colocar un
filtro aquí para aumentar el contraste.
13. Base de microscopio.
14. Fuente de luz.

En los primeros días de la microscopía, la luz del día era la fuente de luz y un espejo simplemente reflejaba la luz de una ventana cercana al
condensador. Con el tiempo, la luz artificial se convirtió en la fuente preferida porque es más brillante y no depende de la hora del día ni del clima.
Cuando se descubrieron las ventajas de la iluminación Köhler (iluminación mejorada mediante el ajuste del condensador de la subplaca), la
tendencia fue incorporar la fuente de luz en el microscopio para que la lámpara pudiera alinearse fácilmente. Los microscopios de luz modernos
generalmente contienen una lámpara eléctrica de filamento de tungsteno incorporada. Debido a que esta lámpara tiene un ligero

* Nota del editor: Perdimos a Margaret en las etapas finales de la producción de este libro. Que su espíritu brille y el lector se sienta conmovido por su amor por la ciencia
y su pasión por transmitirla.

El Manual de laboratorio de AGTCytogenetics, Cuarta edición. Editado por Marilyn S. Arsham, Margaret J. Barch y Helen J. Lawce. ©
2017 La Asociación de Tecnólogos Genéticos. Publicado en 2017 por JohnWiley & Sons, Inc.
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Figura 14.1 partes del microscopio. (1) ocular u ocular (2) Tubo corporal (conecta objetivos y oculares) (3) revólver portaobjetivos (4) Lente objetivo (5)
Soporte o extremidad (6) Platina para muestras (7) Condensador con tornillos de centrado para iluminación Köhler (8) ) Iris o diafragma de tope de
apertura (9) Ajuste grueso (10) Ajuste fino (11) Ajuste del condensador (12) Diafragma de tope de campo (controla el destello) (13) Base del microscopio
(14) La fuente de luz con tornillos de centrado está en la parte posterior ( no mostrada).

tinte amarillo, a menudo se usa un filtro azul delgado para corregir el color y se puede encontrar en la base de muchas marcas de microscopios. La
iluminación desigual del filamento en la bombilla suele corregirse mediante el uso de un disco de vidrio esmerilado delante de la lámpara o mediante el uso
de bombillas esmeriladas. Un espejo incorporado refleja la luz hasta el condensador. Todas las demás modificaciones del microscopio son complementos de
estas partes básicas y las ayudan a trabajar de manera más eficiente en una amplia variedad de condiciones.
Ambos diafragmas mencionados anteriormente son componentes importantes de un microscopio. Todos los microscopios tienen al menos dos diafragmas, el

diafragma de tope de campo y el diafragma de tope de apertura. El uso adecuado de estas dos paradas es la clave para producir imágenes nítidas y proporcionar una

claridad óptima al usar el microscopio. Los diafragmas de tope de campo y de tope de apertura son similares, en el sentido de que ambos son hojas de metal que se abren

y cierran para cambiar el tamaño de una abertura a través de la cual pasa la luz, pero tienen funciones completamente diferentes. El tope de campo se utiliza para ver el

haz de luz para centrar y controlar el deslumbramiento durante los ajustes de iluminación de Köhler; no debe usarse para cambiar la intensidad de la iluminación. Este

diafragma limita el diámetro del haz de luz, permitiendo que sus bordes sean fotografiados (enfocados) en el campo de visión al mismo tiempo que el objeto está

enfocado. Para obtener el nivel de luz óptimo, el tope de campo debe abrirse un poco más de lo necesario para iluminar el campo de visión. El tope de apertura, por otro

lado, solo se puede obtener en la lente trasera del objetivo. Para ver su imagen, retire un ocular para que se pueda ver la lente trasera del objetivo y cierre el tope de

apertura hasta que sus bordes sean visibles. El tope de apertura cambia el ángulo del cono de luz dentro del objetivo y se usa para ajustar la resolución y el contraste. Este

ajuste también afecta la profundidad de campo. Al igual que la parada de campo, la parada de apertura no debe usarse para cambiar el brillo. La luminosidad debe

ajustarse mediante el transformador regulador o mediante un cambio de filtros. el tope de campo debe abrirse un poco más de lo necesario para iluminar el campo de

visión. El tope de apertura, por otro lado, solo se puede obtener en la lente trasera del objetivo. Para ver su imagen, retire un ocular para que se pueda ver la lente trasera

del objetivo y cierre el tope de apertura hasta que sus bordes sean visibles. El tope de apertura cambia el ángulo del cono de luz dentro del objetivo y se usa para ajustar la resolución y el contraste.

14.1.1 El camino de la luz

El haz de luz se origina en la lámpara, es desviado hacia el objeto por un espejo, viaja a través del diafragma de campo donde se ajusta
su diámetro y luego se mueve hacia el condensador de la subestación, que enfoca (condensa) el haz de luz sobre el objeto. El
condensador de la subetapa incluye el tope de apertura, o diafragma de iris, que cambia el ángulo del cono de luz dentro del
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objetivo. La lente del objetivo acepta la luz y enfoca una imagen del objeto dentro del tubo del cuerpo (esto se llama imagen primaria), y
el ocular enfoca y amplía la imagen primaria para que el ojo la perciba a través de su propia lente. Los fabricantes de microscopios
colocan dispositivos para alterar esta luz en varios puntos a lo largo del camino, como delante de la fuente de luz, justo antes del
diafragma de campo, en el objetivo o en cualquier otro lugar, dependiendo del diseño individual [1-3].

14.1.2 Ampliación, apertura numérica y resolución

Los microscopistas novatos a menudo preguntan cuánta ampliación puede dar el microscopio. Aunque puede ser capaz de
aumentar el objeto 2000 veces, se perderán tantos detalles y nitidez con ese aumento que la imagen será inútil. La ampliación
que no revela más detalles se denomina ampliación vacía. Para comprender este concepto, use una lupa para observar los
detalles en la fotografía de un periódico; en lugar de mostrar más detalles, la lente muestra muchos puntos negros.
Esto se aplica al microscopio debido a la naturaleza ondulatoria de la luz. Considere una fuente puntual P, que envía ondas en una esfera (vea
la figura 14.2). Cuando este frente de onda esférica golpea la lente frontal del objetivo, solo una parte de ella puede pasar a través de la apertura,
por lo que las ondas de luz que enfoca el objetivo no son una réplica perfecta de P. Una apertura de lente más grande (apertura ) permite que se
admita una fracción mayor de luz de P y que se representen con precisión más detalles de P. Por lo tanto, la capacidad de discernir detalles
(resolución) puede expresarse mediante la fracción del frente de onda que admite la lente. Esta fracción de luz se expresa mediante un valor
llamado apertura numérica (NA). Este número está grabado en cada lente y tiene una importancia fundamental para el microscopista. Determina
la capacidad de discernir los detalles, y tiene un efecto marcado sobre la intensidad de la iluminación. El NA de una lente [1] es igual al seno del
ángulo μ multiplicado por el índice de refracción del medio entre el objeto y la lente (n), donde 2 μ es el ángulo del cono de luz admitido por la
lente (ver Figura 14.3). (Recuerde que el seno de un ángulo es la razón del lado opuesto a un ángulo agudo y la hipotenusa, de modo que a
medida que aumenta el seno, aumenta el ángulo).

N / A norte pecado

El seno de un ángulo no puede exceder de 1, por lo que el NA máximo es igual an, el índice de refracción del medio de inmersión. Por lo tanto, ningún
objetivo seco puede tener un NA superior a 1 (el índice de refracción del aire) y ninguna lente de aceite puede superar un NA de 1,52 (el índice de refracción
del aceite). Si dejamos n = 1, encontramos que a medida que aumenta el NA, aumenta el ángulo de luz admitido por la lente.

PAG

Figura 14.2 Ampliación vacía debido a la naturaleza ondulatoria de la luz. la fuente puntual p envía ondas de luz en una esfera. cuanto más grande
sea la lente utilizada para observar p, más detalle de p se representará hasta que la fracción del frente de onda que se admita en la lente ya no sea
suficiente para proporcionar una réplica de p. por tanto, la resolución depende de la fracción del frente de onda admitida por la lente. esta fracción de
luz se expresa como la apertura numérica de la lente.

Objetivo seco

NA = n sen u

n (índice de refracción del medio

2u
entre objeto y lente; en este
caso n = 1, el índice de aire)
Portaobjetos de muestras

Figura 14.3 Apertura numérica. la apertura numérica de una lente es un índice de su capacidad de captación de luz.
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El límite de aumento útil está determinado por el poder de resolución de la lente ( r). La resolución es la capacidad de distinguir dos puntos
cercanos como entidades separadas, y la distancia mínima que se puede resolver está determinada por el NA y la longitud de onda de la luz:

r / 2NA

Aquí λ es la longitud de onda de la luz y r es la distancia mínima a la que los objetos pueden verse como dos puntos. Por lo tanto, a medida que aumenta el
NA, r disminuye. Además, a medida que se acorta la longitud de onda, aumenta la resolución.
La difracción es la curvatura de los rayos de luz que se produce cuando un objeto (la muestra) impide el paso libre de un frente de onda. A
medida que disminuye la distancia entre las estructuras de difracción (detalle fino), aumentan los ángulos de difracción. Para recrear fielmente la
imagen del objeto, la lente debe recoger todos los rayos difractados así como los rayos de luz no difractados. Solo una lente con una gran
apertura puede admitir los rayos altamente difractados, por lo que una lente con NA alta puede dar mejores imágenes.
Igualmente importante es la apertura numérica del condensador. El NA del condensador debe ser igual o mayor que el NA
del objetivo. Para el trabajo crítico de la citogenética, el condensador debe ser apocromático y planático (corregido por el color y
la planitud del campo). Si el NA del condensador cae por debajo del objetivo, las ondas de luz se vuelven menos independientes
y la resolución se ve afectada. Si el NA del condensador es demasiado bajo o si falta el condensador, aparecen anillos y halos
alrededor del objeto, causados por la interferencia de ondas. Por tanto, el poder de resolución del microscopio depende del NA
y la calidad del objetivo, el índice de refracción del medio de montaje y el NA del condensador.
La resolución no es la única cualidad importante que se puede lograr, porque el contraste (la diferencia relativa de intensidad entre
el objeto y su entorno inmediato) también es necesario; la resolución sin contraste tendría poca utilidad. Por ejemplo, en las mejores
condiciones posibles de resolución, un objeto transparente sería invisible. Un buen equilibrio de resolución y contraste es ideal.

14.1.3 Lentes
Lentes objetivas
Las lentes de objetivo de alta calidad son una inversión importante en el laboratorio de citogenética. Pueden ser costosos, pero son sorprendentemente
intrincados y su costo está justificado por los beneficios. Los siguientes son los tipos de objetivos que se encuentran con mayor frecuencia en el laboratorio
de citogenética.

objetivos planapocromáticos
La lente planapocromática es la lente ideal para la citogenética y es esencial para obtener imágenes de los cromosomas. Este objetivo se
corrige para visualizar un campo plano (plano) de modo que la mitad del campo y los bordes estén enfocados al mismo tiempo. La
designación apocromática indica que están corregidos para cuatro longitudes de onda de luz. Estos objetivos suelen tener las aperturas
numéricas más altas.

objetivos apocromáticos
Los objetivos apocromáticos también traen cuatro longitudes de onda a un foco común en lugar de solo dos [4], pero carecen de planitud de campo. Estos
lentes suelen tener un NA alto y, por lo tanto, tienden a dar una mejor resolución que los acromáticos.

objetivos acromáticos
Los objetivos acromáticos, que corrigen para dos colores, suelen ser los menos costosos. Una lente simple no hará que todas las longitudes de onda de la luz
(colores de la luz) se enfoquen en el mismo plano porque cada longitud de onda se difracta de manera diferente. Los halos, por ejemplo, resultarán de los
rayos azules que se enfocan en un punto más bajo que los rayos rojos a través de una lente simple. En los acromáticos, las lentes que tienen diferentes
índices de refracción se combinan en el objetivo, llevando así rayos de dos colores, azul y rojo, a un foco común. Los lentes acromáticos están diseñados para
funcionar mejor con luz verde, que ayuda a filtrar la luz violeta, que no es corregida por los acromáticos.

Objetivos semiapocromáticos o de fluorita

Los objetivos semi-apocromáticos o de fluorita tienen correcciones ópticas intermedias entre acromáticos y apocromáticos. Los objetivos Neofluar
(tipo fluorita) tienen una alta apertura numérica con una reproducción precisa del color y están disponibles con un campo plano. Estas lentes son
muy adecuadas para trabajar en microscopía de fluorescencia debido a su vidrio de baja dispersión y alta NA.

Lentes de cuarzo y lentes para fluorescencia.

A diferencia de las lentes de vidrio que detienen gran parte del espectro UV, las lentes de cuarzo permiten que la luz ultravioleta pase fácilmente, lo que las
hace más ideales para la microscopía ultravioleta. No confunda la microscopía ultravioleta con la microscopía de fluorescencia, porque muchas lentes
utilizadas para microscopía fluorescente tienen un iris incorporado para controlar el destello.
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Características de la lente

Curvatura del campo

Las lentes pueden corregirse por la curvatura del campo. Sin ninguna corrección, las lentes brindan una mejor calidad de imagen en el centro del
campo, y cuando el centro está enfocado, los bordes del campo están desenfocados. Esto es aceptable para fines visuales, porque el
microscopista puede volver a concentrarse en cualquier parte del campo que desee. Sin embargo, para la fotomicroscopía, la situación es muy
diferente. La cámara exige un campo de visión completamente enfocado. Los avances en la corrección de la curvatura del campo han dado como
resultado lentes de campo plano u objetivos planapo de muy alta calidad. En el laboratorio de citogenética, la lente de inmersión en aceite
utilizada para la fotomicroscopía debe ser una lente plana, preferiblemente planapo, que se corrige por curvatura de campo y tres colores.

Profundidad de campo

Cualquier lente enfocará a una distancia determinada más o menos un rango determinado. Este rango de distancias en las que un objetivo puede enfocar
razonablemente bien sin ningún ajuste se denomina profundidad de campo de esa lente. Cuanto mayor sea el NA, menor será la profundidad de campo. La
profundidad de campo es casi inexistente en lentes de aceite de alta potencia. Puede aumentarse cerrando el diafragma de iris del condensador, reduciendo
efectivamente el NA de trabajo, pero solo a expensas de la resolución.

Distancia de trabajo
La distancia de trabajo de una lente es la distancia entre el punto más bajo del objetivo y el objeto enfocado. A medida que aumenta el
poder de aumento de la lente, la distancia de trabajo disminuye. Se debe tener mucho cuidado con una lente de gran aumento para no
golpear la diapositiva. Además, la distancia de trabajo de una lente seca de baja potencia utilizada para escanear no debe ser tan
pequeña que corra el riesgo de mancharse de aceite al girar el revólver; en tal caso, el aceite tendría que ser eliminado del portaobjetos
después de cada observación con alta potencia. En distancias de trabajo muy cortas, si el grosor del cubreobjetos excede la distancia de
trabajo, es imposible enfocar el objeto.

Ampliación de la lente
El aumento de la lente está determinado por la longitud del tubo (la distancia desde el plano focal trasero del objetivo hasta la posición de la
imagen principal) y la distancia focal (la distancia desde la superficie de la lente hasta el punto de convergencia de los rayos). Su interrelación se
expresa mediante la siguiente fórmula:

Longitud del tubo de aumento / distancia focal

La longitud del tubo de la mayoría de los microscopios modernos es de 160 mm. Por lo tanto, la distancia focal de un objetivo estándar de 10 ×
sería 160/10, o 16 mm, y el aumento de una lente de 4 mm sería 160/4 o 40 ×. La mayoría de las lentes de inmersión en aceite acromáticas tienen
distancias focales de 1.8 a 2.0 mm. No intercambie objetivos entre microscopios a menos que las longitudes de sus tubos coincidan o estén
corregidos al infinito porque la calidad de la imagen disminuirá. En los sistemas con corrección de infinito, la distancia de la imagen se establece
en infinito y se coloca una lente de tubo dentro del tubo del cuerpo entre los objetivos y los oculares para formar la imagen intermedia.

lentes parafocales
Las lentes modernas generalmente no requieren más que un pequeño ajuste de la perilla de enfoque fino cuando se cambia de una lente a otra. Las lentes
que están tan estrechamente emparejadas se denominan lentes parafocales, y las lentes que no son parafocales a menudo pueden ser ajustadas por un
representante de ventas de la compañía de microscopios.

Lentes de inmersión en aceite

Ya se ha demostrado que la resolución de una lente aumenta a medida que aumenta el NA y que el NA = norte pecado μ. El valor de norte
en el aire es 1. Si uno pudiera aumentar norte, el NA de la lente también se incrementaría efectivamente. Esto se puede hacer colocando una gota
de líquido, como agua o aceite (con un norte valor superior al aire), entre el cubreobjetos y la lente.
La luz se difracta cuando pasa de un medio a otro que tiene un índice de refracción diferente. Esto significa que la luz que pasa a través de un
portaobjetos de vidrio o cubreobjetos hacia el aire se refracta lejos de la lente. Recuerde que el NA es una expresión de la fracción de un frente de
onda admitido por una lente. Si uno pudiera aumentar efectivamente el frente de onda admitido por la lente, el NA aumentaría y la resolución
mejoraría. Esto se puede hacer colocando algo con el mismo índice de refracción que el vidrio entre el cubreobjetos y la lente. El vidrio Crown es
un tipo de vidrio óptico utilizado en lentes debido a su bajo índice de refracción y baja dispersión. El índice de refracción del vidrio corona es de
1,51 a 1,56, por lo que los aceites utilizados para microscopía de inmersión suelen tener un índice de refracción de 1,515 a 1,520 a 23 ° C. En uso
práctico, es obvio que un objetivo de inmersión en aceite pierde resolución si se usa en seco; en teoría, esto se debe al bajo índice de refracción
del aire. De manera similar, si el índice de refracción del aceite es demasiado alto o demasiado bajo, se pierde mucha resolución. También es
importante el índice de refracción del medio utilizado para montar el cubreobjetos. Uno debe seguir
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las marcas de la lente (consulte Marcas de la lente) en el objetivo para determinar si se debe usar un cubreobjetos. Esto aliviará cualquier
desviación del índice de refracción deseado. También se puede engrasar la lente del condensador para trabajos críticos que exigen un
rendimiento completo del sistema.

Marcas de lentes
La siguiente información está grabada en la mayoría de los objetivos (Figura 14.4):

Aumento, ya sea como un número entero o como una proporción (por ejemplo, 100 o 100: 1)
Longitud del tubo en mm (la distancia desde el plano focal trasero del objetivo hasta la posición de la imagen principal dentro del cuerpo
tubo)
Designaciones de cubreobjetos, que se puede ver después de la longitud del tubo ("0.17" significa que debe usarse un cubreobjetos de
0.17 mm ± 0.01, "0" debe usarse sin cubreobjetos y "-" se puede usar con o sin cubreobjetos sin pérdida de resolución).
Apertura numérica, generalmente debajo o al lado de la marca de aumento (por ejemplo, 1,30). Por ejemplo, una lente podría tener
grabado 170 / 0.17 Pl Apo Oel 100 / 1.32. Esto significa que la lente debe utilizarse con un tubo de 170 mm y un cubreobjetos con un
grosor de 0,17 mm, que es una lente plano (Pl) (campo plano) y un aceite apocromático (Apo) (Oel ) Lente de inmersión (corregida
para tres colores) que aumenta 100 veces y tiene un NA de 1,32 cuando se sumerge en aceite. Otras marcas son el nombre de la
marca, el número de serie de la lente y la distancia focal de la lente en pulgadas o milímetros.

También se pueden ver otras marcas en lentes de microscopios comunes para laboratorios de citogenética. Por ejemplo, HI en una lente
significa inmersión homogénea (en aceite) y WI significa inmersión en agua. Ph seguido de un número significa que la lente se puede
utilizar para contraste de fase; el número se refiere al anillo de fase en el condensador que coincide con el anillo de fase en la lente.
Ultrafluar (Zeiss) significa que la lente está corregida para longitudes de onda UV. Fluotar (Leitz) y Neofluar (Zeiss) significan objetivos de
fluorita. Las lentes que no especifican si son acromáticas o apocromáticas suelen ser acromáticas. Hay demasiados símbolos para poder
hacerles justicia en este capítulo; Se anima al lector a leer el manual de su microscopio en busca de marcas adicionales o características
operativas específicas.

14.1.4 Condensadores

Los condensadores actúan para recoger la luz de la fuente de luz del microscopio y concentrarla en un cono de luz que ilumina la
muestra. Su capacidad para enfocar todo el rango de luz en el objeto para que las ondas de luz actúen de forma independiente funciona
para aumentar el poder de resolución. El diafragma iris del condensador ajusta la apertura de trabajo del condensador a la del objetivo.
Nunca se utiliza para controlar la intensidad de la iluminación y rara vez se debe colocar muy lejos de su posición más alta. La lente del
condensador está marcada con un valor de apertura numérico y también puede estar marcada como acromática o

Figura 14.4 Marcas de lentes. la lente en primer plano es una lente planapocromática con un aumento de 100 × y una apertura numérica de
1,35. Es una lente con corrección infinita que debe usarse con un cubreobjetos de 0,17 de espesor.
 Capítulo 14: Microscopía e imágenes / 693

aplanético. Además, existen diferentes condensadores para cada tipo de iluminación (campo claro, campo oscuro, contraste de fase). Los
condensadores de campo claro generalmente constan de una sección principal y una lente giratoria, ubicada encima o debajo de la sección
principal. Esta lente oscilante corrige el NA del condensador para su uso con menor potencia, porque las lentes de inmersión en aceite requieren
una apertura diferente para llenar la lente de luz. Algunos condensadores están diseñados para usarse con inmersión en aceite (entre el
condensador y la corredera). Esto tiene el efecto de aumentar el NA, pero en la práctica, la diferencia es insignificante excepto en el trabajo
fotográfico más exigente.
El ajuste del tope de apertura del condensador es una consideración importante. El uso de la apertura máxima ofrece la mejor resolución,
pero disminuye el contraste; un compromiso suele ser lo mejor. El mayor contraste se obtiene cerrando completamente el tope de apertura; sin
embargo, esto provoca una disminución en la resolución. Se recordará que la resolución es mejor cuando se hace que los rayos de luz actúen de
forma independiente mediante el uso de una lente de condensador con una apertura numérica igual a la del objetivo. Si el objeto tiene un alto
contraste, la apertura se puede dejar completamente abierta, pero si el contraste es bajo, como con un objeto mal teñido o sin teñir, la apertura
debe cerrarse a pesar de la pérdida de resolución resultante. Con la apertura cerrada por completo, Los cromosomas no teñidos se pueden ver
(sin contraste de fase) para verificar el índice mitótico y de propagación, pero la resolución será demasiado pobre para evaluar la calidad de los
cromosomas. Del mismo modo, con el condensador a poca altura, se pueden ver las preparaciones sin teñir; aunque se mejora el contraste, la
resolución disminuye.

14.1.5 Oculares (u oculares)

La imagen primaria (o virtual) formada por el objetivo dentro del tubo del microscopio se amplía aún más con el ocular u ocular, que se
compone de dos lentes. La lente superior más cercana al ojo del observador se llama lente ocular y la inferior es lente de campo. La
lente de campo es responsable de reducir el ángulo oblicuo de la luz que entra en la lente del ojo para que la lente del ojo no tenga que
ser muy grande. Entre estas dos lentes hay un tope de campo fijo, que se puede observar desenroscando la lente del ojo y mirando
hacia abajo por el ocular. Esta parada de campo está enfocada simultáneamente con el objeto y, como la parada de campo en la base
del microscopio, limita el campo de visión. Los oculares más simples, con dos lentes planoconvexos y un diafragma de campo entre
ellos, se denominan oculares de Huygens. Oculares más complejos, que están especialmente diseñados para su uso con lentes
apocromáticos, se denominan oculares de compensación. (Estos compensan los astigmatismos y las aberraciones cromáticas laterales).
Hay oculares hechos para enfocar en un punto alto para quienes usan anteojos durante la microscopía.

Aquellos con ciertos defectos oculares deben usar anteojos mientras usan el microscopio. Zeiss [3, 4] recomienda una prueba simple
para determinar si el microscopista debe usar sus anteojos durante la microscopía: la persona debe observar un objeto con los anteojos
sostenidos con el brazo extendido mientras gira la lente de los anteojos alrededor de su centro. Si la forma del objeto no cambia,
entonces no se necesitan anteojos correctivos para microscopía; el ocular compensará el defecto. Sin embargo, si la longitud y el ancho
del objeto parecen cambiar durante la rotación, los anteojos tienen lentes tóricos y el usuario debe usarlos mientras usa el microscopio.
Todos los oculares tienen un punto de mira, o un lugar donde convergen los rayos de luz, y el ojo debe colocarse en este punto. El punto
de vista se puede determinar sosteniendo un trozo de papel blanco sobre el ocular y moviéndolo hacia arriba y hacia abajo; aparecerá
un círculo de luz blanca en el papel. Se volverá más pequeño y luego más grande a medida que se mueve el papel. La posición en la que
el círculo aparece más pequeño es el punto de vista. Si el microscopista es astigmático, debe usar anteojos para la fotomicrografía,
porque este defecto visual no puede corregirse con el microscopio.

Los oculares vienen en varios aumentos, pero los que se ven con mayor frecuencia en los laboratorios de citogenética son los de 8 ×, 10 × y
12,5 × versiones. El aumento total del objeto se determina multiplicando el aumento del ocular y el objetivo. Por
ejemplo, un objetivo de 100 × y un ocular de 10 × amplían el objeto 1000 veces. Algunos microscopios tienen otro
sistema de lentes que amplía aún más el objeto, llamado cambiador de aumento optovar o factor de tubo; el
número en él (por ejemplo, 1.0, 1.25, 1.6, 2.0) también debe multiplicarse por el aumento total. Para evitar un
aumento vacío, recuerde que el aumento total del objeto no debe exceder 1000 veces el NA del objetivo que se
está utilizando. Por ejemplo, para una lente de inmersión en aceite (100 ×) con una apertura numérica de 1,25, no
se deben utilizar oculares que lleven el aumento a más de 1250 (es decir, oculares con un aumento superior a
12,5 ×),
Las marcas que se encuentran en los oculares incluyen aumento (8 ×, 12,5 ×, etc.); C, K o comp (oculares de compensación para objetivos de campo
plano); un símbolo que aparece como un par de anteojos (que significa oculares de alto punto que están diseñados para usuarios de anteojos, pero que
pueden ser utilizados por cualquier persona); pl (campo plano); W (campo amplio - muy útil cuando se escanean portaobjetos con un índice mitótico bajo); y
el número del campo de visión (el diámetro del campo visible). En el pasado, los oculares se corrigieron para detectar aberraciones en los objetivos, por lo
que era importante utilizar oculares y objetivos del mismo fabricante. Las excepciones a esta regla son las lentes con corrección infinita que ahora están
disponibles.
694 / Capítulo 14: Microscopía e imágenes

14.1.6 Sistema homogéneo

Además de las lentes del objetivo, el condensador y los sistemas oculares, el sistema de portaobjetos, medio de montaje, cubreobjetos y líquido de inmersión
que a menudo se pasa por alto debe considerarse parte del sistema de lentes. Como ya se ha señalado, la refracción y la reflexión de la luz ocurren cuando
los rayos pasan de un medio denso a uno menos denso, limitando efectivamente el NA de una lente. Porque NA = norte pecado u, y debido a que el seno de
un ángulo no puede exceder 1, el máximo NA posible es igual a norte, el índice de refracción del medio de inmersión. Para el aceite de madera de cedro, esto
es 1,515, para el agua 1,33 y para el aire 1,0; por lo tanto, si se usa una lente de inmersión en aceite en el aire o en el fluido de inmersión incorrecto, su NA no
es completamente utilizable y su resolución y claridad se ven afectadas. Por lo general, se debe usar el aceite de inmersión recomendado por la compañía de
microscopios para usar con lentes particulares. Debe tener un índice de refracción de 1,515 a 1,520. El índice de refracción del medio de montaje oscila entre
1,44 y 1,515. La razón por la que este índice es a veces más bajo que el del vidrio es que los tejidos seccionados tienden a desaparecer en los medios con un
índice cercano al suyo, que suele ser de 1,530-1,540. Sin embargo, los cromosomas teñidos, a diferencia de los tejidos, son lo suficientemente densos como
para que el medio de montaje pueda estar más cerca del vidrio.

14.1.7 Etapas mecánicas

La etapa mecánica es una necesidad para el trabajo citogenético. Sujeta la muestra y la mueve con suavidad, horizontal o verticalmente, lo que
permite una búsqueda sistemática sobre la diapositiva en busca de metafases. La etapa mecánica debe tener marcas graduadas para que una
metafase determinada pueda reubicarse y posiblemente volver a fotografiarse o analizarse. Una platina giratoria puede ser útil en fotografía si la
cámara está estacionaria, porque la metafase puede colocarse mejor para adaptarse al formato de película rectangular. Si la cámara se puede
girar, se logra el mismo fin.
Las escalas vernier suelen estar presentes en las etapas mecánicas y se leen de la siguiente manera: Si el cero en la escala vernier coincide con
una marca en la escala de la etapa, lea el número entero indicado. Sin embargo, si el cero se encuentra entre dos marcas en la escala del
escenario, lea el siguiente número entero más bajo y lea las décimas determinando qué lectura en el nonio es opuesta a una división en la escala
del escenario.
Algunas plataformas son extraíbles y la báscula no debe moverse cuando se quita la plataforma, como cuando se limpia por un profesional.
Esto hará que los registros antiguos a escala de nonio sean inútiles para encontrar celdas. Algunos verniers de microscopio son ajustables, y los
microscopios recién comprados pueden calibrarse para leer lo mismo que otros en el laboratorio.

14.1.8 Microscopía práctica

El microscopio generalmente se coloca sobre una mesa, preferiblemente independiente de otras encimeras, a una altura conveniente para que el usuario
pueda sentarse en una silla y ver cómodamente a través de los oculares. Esto significa que el microscopista no se esfuerza por mantener una postura erguida
ni se encorva sobre el endoscopio. La altura del microscopio se puede ajustar colocando almohadillas de goma debajo de la base del endoscopio o
agregando soportes especiales hechos con el propósito de reducir la vibración. (Estos soportes a menudo se enumeran en los catálogos generales de
suministros de laboratorio en la sección de básculas de pesaje). La silla también debe ser ajustable para diferentes alturas.

La habitación en la que se guarda el microscopio debe estar lo más libre posible de polvo y vibraciones. Las ventanas que se abren al exterior
del edificio son una fuente de polvo; el microscopio necesitará menos limpieza si está en una habitación sin ventanas que se abran. La habitación
debe estar bien iluminada; sin embargo, la luz debe ser ajustable con un interruptor (preferiblemente con un reóstato) cerca del microscopio para
trabajos fluorescentes y fotografía crítica. Si es posible, la sala del microscopio no debe usarse para la preparación de cromosomas, porque el
ácido acético glacial es corrosivo y arruinará las lentes y las partes metálicas del microscopio.
Para evitar rayar la lente del objetivo de gran aumento, enfoque la imagen de la diapositiva a baja potencia antes de cambiar.

14.1.9 Limpieza del microscopio

El microscopio debe almacenarse bajo una cubierta antipolvo de algún tipo cuando no esté en uso, porque el polvo puede entrar en las
partes del microscopio o mezclarse con el lubricante usado en el escenario y el mecanismo de la rejilla del condensador, lo que requerirá
una costosa limpieza profesional. El polvo no suele causar problemas con los objetivos a menos que entre en ellos; siempre deben
almacenarse en los tubos de plástico especiales suministrados por el fabricante. Si se deja un orificio vacío en el revólver portaobjetivos,
debe cubrirse con un tapón, que también está disponible del fabricante. El ocular debe mantenerse libre de polvo y grasa para una
visualización más cómoda, y el diafragma de campo debe mantenerse limpio porque la apertura se muestra en el campo de visión y
estará enfocada junto con el objeto. El polvo en las otras partes del microscopio no afecta directamente la calidad de la imagen, pero el
microscopio debe limpiarse regularmente como una cuestión de rutina. El espacio de trabajo alrededor del microscopio debe
mantenerse limpio con un paño humedecido con agua destilada o alcohol para evitar que se levante el polvo mientras se limpia.
 Capítulo 14: Microscopía e imágenes / 695

Los objetivos de limpieza generalmente no se recomiendan a menos que se cubran con una película o huellas dactilares. Un mal trabajo de
limpieza suele ser peor que no limpiar en absoluto. La suciedad en el objetivo provocará un grave deterioro de la imagen; La limpieza debe
realizarse con un poco de papel para lentes humedecido, si es necesario, con un limpiador de lentes comercial o con aliento humano. Use la
menor cantidad de solvente posible y evite otros solventes como el alcohol, porque el cemento que sostiene la lente en su lugar está sujeto a
daños. Utilice una lupa (como la lente del objetivo al revés) para examinar la superficie de la lente. No frote con fuerza una lente con pañuelos que
no estén diseñados para lentes; aunque se sientan blandos, aún pueden rascarse. Nunca frote una lente seca con suciedad porque la suciedad
puede rayar la lente.
Los oculares se pueden limpiar de manera similar y necesitan atención constante para mantenerlos libres de aceites naturales de los ojos. Cuando sea
necesario ubicar suciedad en el campo de visión, el mejor método es el siguiente: gire los oculares. Si la suciedad gira, limpie los oculares. Del mismo modo,
gire los filtros en el diafragma de campo. Si la suciedad gira, limpie los filtros y el vidrio sobre el diafragma de campo. A continuación, mueva el condensador
hacia arriba y hacia abajo. Si la suciedad entra y sale de la vista, limpie las lentes del condensador. Si las manchas no se pueden eliminar con la limpieza,
desenfoque el condensador ligeramente para evitar ver las manchas en el campo de visión. La iluminación Köhler menos que perfecta es preferible a ver un
punto constantemente. Algunas manchas (por ejemplo, sangre y glicerina) pueden no ser solubles en los agentes de limpieza habituales, en cuyo caso un
poco de agua destilada (no agua del grifo, que puede contener sales o ácidos dañinos). Además, asegúrese de mover la corredera para asegurarse de que no
haya suciedad en la preparación. Si la suciedad no está en los filtros o el vidrio que cubre el diafragma de campo, los oculares, el condensador o el
portaobjetos, puede estar dentro del microscopio, en cuyo caso se debe buscar ayuda profesional.
Nunca intente limpiar el interior del tubo del microscopio u otras partes que requieran desmontar el microscopio. Nunca limpie el interior de
un ocular u objetivo. Los microscopios de laboratorio deben limpiarse y revisarse por un profesional una vez al año o al menos cada dos años.

14.2 Microscopía de campo claro

14.2.1 Iluminación Köhler

La mejor manera de ver o fotografiar objetos con luz transmitida por campo claro es con la iluminación Köhler, que satisface la necesidad de
obtener la mejor calidad de imagen y la más alta resolución [1]. Proporciona una distribución uniforme de la luz a través del campo de visión y
hace que el objeto actúe como un objeto autoluminoso al generar imágenes de la fuente de luz en el condensador. Los siguientes son los pasos
para una iluminación adecuada (Figura 14.5):

1. Centre y enfoque la bombilla de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si se hace correctamente, no debería ser necesario volver a hacerlo hasta que
se reemplace la bombilla. En algunos microscopios puede ser necesario quitar un filtro de vidrio esmerilado de la parte delantera de la bombilla para
enfocar el filamento. Algunos microscopios tienen pantallas de enfoque abatibles para facilitar su uso en el centrado de la lámpara para una iluminación
2. uniforme. Concéntrese en la muestra con un objetivo de baja potencia. Cierre completamente el diafragma de campo y eleve el condensador hasta que
sus bordes estén enfocados. Si la imagen del diafragma de campo parece descentrada, corríjala con los dos tornillos del condensador. De lo contrario,
puede resultar muy difícil centrar la luz en una potencia alta.
3. Cambie a inmersión en aceite y vuelva a enfocar el objeto. (Se asume que el objeto debe verse en inmersión en aceite. La iluminación de Köhler también
se puede usar con poca potencia). El objeto debe permanecer enfocado de manera nítida durante el ajuste de la luz. Cierre el diafragma de campo hacia
abajo nuevamente hasta que sus bordes sean visibles y enfoque los bordes lo más claramente posible moviendo el condensador hacia arriba y hacia
abajo. Puede haber bordes de colores en los bordes del diafragma; la franja verde / azul permitirá la mejor resolución. Centre la luz con los tornillos
centrales como en el paso 2. Este paso es importante para fotografías con una exposición uniforme. Cuando el condensador esté a la altura correcta,
4. abra el diafragma de campo hasta que sus bordes simplemente desaparezcan. Esto proporciona la mejor configuración para evitar el deslumbramiento.

5. Establezca el tope de apertura. Esto se puede hacer de dos maneras: Primero, puede quitar un ocular y ajustar el diafragma de apertura de
modo que se cubra de 2/3 a 3/4 del área circular iluminada (que representa la apertura del objetivo). Esto se ajusta para obtener el máximo
contraste sin sacrificar la resolución; si el diafragma se deja abierto, puede producirse una mala calidad de imagen. En segundo lugar, puede
configurar el diafragma de iris visualmente. Con los cromosomas, ya hay bastante contraste debido a las propiedades de tinción de los
cromosomas. Establecer el tope de apertura cerrándolo hasta que los cromosomas parezcan tener el contraste suficiente sin sacrificar la
resolución puede ser preferible al primer método. Una vez realizados los pasos 1 y 2, solo es necesario repetir los pasos 3, 4 y 5 para cada
cambio de lente o para cada nueva fotografía que se va a tomar.

14.2.2 Filtros
Para observar y obtener imágenes de los cromosomas teñidos con Giemsa, se recomienda un filtro verde; esto aumenta el contraste y mejora la
grabación de la mancha en películas pancromáticas. Hay varios tipos de filtros verdes. Aparte de los filtros verdes ordinarios de Wratten, otros
filtros útiles son los filtros de banda de interferencia de 546 nm y los filtros de barrera, que se utilizan para microscopía de fluorescencia, como los
filtros de 530 nm o 500 nm. Estos pueden usarse solos o en combinación.
696 / Capítulo 14: Microscopía e imágenes

(a) (B)

(C) (D)

Figura 14.5 Centrado de fuente de luz para iluminación Köhler. (a) el diafragma de campo debe estar cerrado y el condensador debe estar (b) enfocado,
(c) centrado y (d) abierto justo después del campo de visión. Cortesía de patricia Mouchrani.

14.2.3 Aceite de inmersión

El aceite adecuado es fundamental para la resolución en microscopía. En general, utilice el aceite suministrado con el microscopio. Una excepción a esto es
cuando el aceite acelera la decoloración de la mancha en los portaobjetos descubiertos. Para abordar esto, muchos laboratorios utilizan los aceites Cargille
tipo A o tipo B o una mezcla de los dos. El tipo A es delgado y tiene una fluorescencia muy baja, lo que lo hace adecuado para trabajos con fluorescencia. El
tipo B es muy espeso y tiene una fluorescencia ligeramente más alta, pero todavía está dentro de los límites razonables para su uso en microscopios
fluorescentes. Al mezclar los dos tipos de aceite se obtiene un aceite de espesor intermedio. Resolve es otro aceite que no induce la decoloración. Tenga en
cuenta que se debe tener cuidado de verificar antes de usar aceites de inmersión producidos antes de mediados de la década de 1970, ya que pueden
contener PCB (bifenilos policlorados), un carcinógeno conocido.

14.2.4 Cubreobjetos

La mayoría de los objetivos utilizados para distancias de trabajo cercanas están marcados con el número 0.17 (ver Figura 14.4). Este número indica
que el cubreobjetos más el medio de montaje debe tener un grosor de 0,17 mm. El cubreobjetos de microscopio n. ° 1 ½ proporciona este rango
apropiado, entre 0,16 y 0,19 mm, por lo que es la opción recomendada con una lente de 0,17. Se puede utilizar un signo menos (-) con o sin
cubreobjetos.
El medio de montaje debe formar la capa más delgada posible. Los laboratorios que prefieren analizar y fotografiar diapositivas sin
cubreobjetos deben verificar que sus objetivos estén diseñados para la mejor resolución sin cubreobjetos.

14.2.5 Diapositivas

Así como el grosor del cubreobjetos es importante desde el punto de vista óptico para el objetivo, también lo es el grosor del portaobjetos para el condensador. Los
condensadores acromáticos de alta NA normalmente requieren portaobjetos de 1 mm más o menos 0,05 de espesor.
 Capítulo 14: Microscopía e imágenes / 697

14.2.6 Ajuste del ocular

Los oculares tienen tres ajustes potenciales para el usuario. Primero, con los pies en el suelo, ajuste la altura de la silla para que sus ojos queden
paralelos a los oculares, sin estirarse ni doblarse innecesariamente. Los microscopios más nuevos ofrecen una característica ergonómica
mediante la cual los oculares se pueden subir o bajar en varios ángulos para adaptarse a la altura del torso del lector en lugar de depender del
ajuste de la silla.
En segundo lugar, ajuste la distancia interpupilar de modo que se observe un campo al mirar con ambos ojos, acercando o
alejando los oculares. Finalmente, si el enfoque no es igualmente nítido en ambos ojos, averigüe qué ocular tiene un ajuste de
enfoque giratorio. Con el otro ocular, enfoque la muestra con la perilla de ajuste fino del microscopio. Una vez que el ocular no
ajustable esté enfocado, vuelva al primer ojo y gire el ajustador giratorio del ocular hasta que la imagen sea nítida. Esto
permitirá el uso de ambos ojos con un esfuerzo mínimo para los análisis de cromosomas.
Para fotografiar, muchos microscopios proporcionan líneas finas, llamadas retículas, en el ocular ajustable, que cuando se alinean
correctamente, aseguran un enfoque adecuado del objeto en el plano de la imagen. Enfoque las líneas del retículo para que la cámara se ajuste a
su ojo. Esto se hace más fácilmente sin una muestra en el escenario.
Los microscopios modernos también tienen muchas opciones ergonómicas que se pueden considerar cuando se considera la compra de un nuevo
microscopio.

14.3 Microscopía de fluorescencia

Muchas técnicas modernas de tinción de cromosomas y detección de sondas aprovechan los fluorocromos, que son tintes que liberan energía en
forma de luz fluorescente cuando son golpeados por luz de longitud de onda corta, como la ultravioleta. Las fuentes de luz utilizadas con
fluorescencia [1, 5] (generalmente una lámpara de vapor de mercurio de alta presión, una lámpara halógena de tungsteno o una lámpara de
xenón) excitan el fluorocromo (o fluoróforo) para producir luz fluorescente en el espectro visible. (La microscopía ultravioleta es diferente de la
microscopía fluorescente y no se considerará aquí). La reacción real es la siguiente: Un átomo de fluorocromo (p. Ej., Quinacrina o naranja de
acridina), cuando es golpeado por un cuanto de luz, sufre un cambio de electrones . Uno o más electrones saltan de una capa de energía a otra de
un nivel de energía más alto, luego regresa al estado fundamental original y emite energía en forma de luz y calor. Debido a que parte de su
energía se pierde en forma de calor, la energía emitida por la luz es menor y tiene una longitud de onda más larga que la luz que la energizó,
haciéndola visible a simple vista. La principal diferencia entre la microscopía estándar y la microscopía de fluorescencia es el sistema de
iluminación; La microscopía de fluorescencia utiliza una fuente de iluminación con longitudes de onda más cortas y un sistema de recepción con
longitudes de onda más largas. Además de la fuente de luz especial, el microscopio fluorescente requiere filtros de excitación y barrera. El filtro de
excitación transmite solo la luz de longitud de onda corta deseada a la muestra para la excitación; el filtro de barrera luego transmite solo la luz
visible deseada para el ojo o la cámara y filtra la luz ultravioleta y la luz azul que restan valor a la imagen. Cada fluorocromo tiene su propia
combinación de excitadores y filtros de barrera para condiciones óptimas de visualización. Consulte la Figura 14.6, que muestra la trayectoria de la
luz y los filtros utilizados en F luorescente I norte s itu h microscopía de hibridación (FISH). Los microscopios de fluorescencia pueden utilizar luz
transmitida o luz incidente [5]. La luz transmitida sigue el mismo camino de luz que la luz del microscopio de campo claro, pero el condensador de
campo claro se reemplaza por un condensador de campo oscuro. Este condensador hace que los rayos de luz golpeen el portaobjetos en un
ángulo tan agudo que iluminen la muestra pero no pasen al objetivo, separando así tanto la luz excitante como la emitida.

La luz incidente, también llamada epi-iluminación o iluminación Ploem, utiliza luz que se origina por encima del objetivo,
pasa a través del objetivo hasta el objeto y excita el fluorocromo; la luz emitida luego rebota a través del objetivo hacia el ojo o
la cámara. La luz excitante no rebota, sino que atraviesa la muestra. Las ventajas de la epi-iluminación son una menor pérdida
de luz (lo que resulta en tiempos de exposición más cortos y mejores fotografías), facilidad de alineación (el condensador se
elimina y, por lo tanto, no tiene que ser reenfocado constantemente) y la capacidad de usar luz transmitida e incidente. luz sin
cambiar condensadores.

14.3.1 Fuentes de luz para fluorescencia

Hay varias fuentes de luz para microscopía de fluorescencia. Estos pueden o no emitir luz ultravioleta verdadera; muchas sustancias se excitarán
igual de bien con radiación azul o verde. La luz ultravioleta está en el rango de 300 a 400 nm. Un nm es 0,001 mm o 10 –9 metro. La luz violeta
comienza a 400 nm y se encuentra en el extremo inferior del espectro visible. A medida que las longitudes de onda se alargan, la luz aparece azul,
verde, amarilla, naranja y roja (700 nm); por encima del rojo, que es el extremo superior del espectro visible, está la luz infrarroja. La tinción de
quinacrina tiene su mayor fluorescencia en el rango de 460 a 500 nm, por lo que se usa luz azul, en lugar de ultravioleta, para excitar la
quinacrina.
Las fuentes de luz más comúnmente utilizadas para la fluorescencia son las lámparas halógenas de tungsteno, vapor de mercurio y xenón de
alto vataje [1]. Cada uno de estos viene en diferentes potencias; algunos usan corriente alterna (CA) y otros usan corriente continua (CC). Aquellos
que usan DC tienden a tener una vida más larga. La siguiente es una lista de fuentes de luz fluorescente disponibles: Xenón
698 / Capítulo 14: Microscopía e imágenes

5
4

Figura 14.6 Microscopía de hibridación de fluorescencia in situ: paso de luz y filtros. (1) DNa de una célula en un portaobjetos que se ha hibridado con
una sonda. la hebra roja de DNa es la del paciente y la hebra verde es la sonda que se ha unido a secuencias que coinciden con las suyas. el fluoróforo
verde está marcado directamente en la sonda. (2) Juegos de filtros (área encuadrada) utilizados para detectar sondas mediante microscopía de
fluorescencia. (3) filtro excitador: la luz de espectro completo se reduce a la luz de una longitud de onda definida que excita específicamente el
fluoróforo de la sonda. (4) Luz de espectro completo emitida por una lámpara de microscopio. (5) El espejo dicroico refleja una longitud de onda
definida (excitación) en la muestra. (6) Filtro de barrera: reduce la luz emitida a una longitud de onda definida que se puede detectar. reproducido con
permiso de ZytoVision Gmbh, Bremerhaven, Alemania.

XBO 75, 150 y 450 W; Mercury HBO 50, 100 y 200; y tungsteno halógeno de 12 V, 100 W. La lámpara de mercurio de 100 vatios es la fuente de luz
habitual para la microscopía de fluorescencia. También está disponible la lámpara de mercurio de 50 vatios. Aunque estas fuentes de luz son
fuertes en la región ultravioleta, el desvanecimiento resultante puede ralentizarse mediante un espejo de reflexión del calor. También se puede
utilizar la bombilla halógena de tungsteno, que es estándar para la luz transmitida. Las fuentes de luz de xenón ahora son raras y algunos las
consideran obsoletas.
Un desarrollo relativamente reciente en las fuentes de luz para fluorescencia es la disponibilidad de una fuente de luz precentrada de 120
vatios con un campo de visión uniformemente iluminado. Se anuncia que tienen entre 1500 y 2000 horas de vida y emiten menos calor.
 Capítulo 14: Microscopía e imágenes / 699

que otros tipos de bombillas. Aunque son costosos, su calidad mejorada y su larga vida útil pueden justificar el costo en algunos laboratorios. La mayoría de
los principales fabricantes de microscopios ofrecen su versión de esta lámpara.
Un problema común con las bombillas fluorescentes es el parpadeo; esto generalmente se debe a una combustión insuficiente la primera vez que se
enciende la bombilla. Las bombillas nuevas deben quemarse un mínimo de 2 horas. Cuando coloque una nueva bombilla en el microscopio, limpie la
corrosión de los contactos y mantenga la bombilla escrupulosamente limpia. Nunca toque la bombilla con los dedos; la bombilla se puede limpiar con alcohol
si parece tener grasa. Las lámparas fluorescentes están sometidas a alta presión y deben tratarse con precaución. Los derrames de mercurio deben limpiarse
inmediatamente de acuerdo con los protocolos de seguridad del laboratorio.

14.3.2 Filtros para fluorescencia

El éxito de la microscopía de fluorescencia y la fotografía depende de la elección adecuada de los filtros [1, 5]. La elección del filtro excitador y del
filtro de barrera depende de las longitudes de onda necesarias para hacer que la mancha en particular tenga fluorescencia (longitud de onda de
excitación) y de la longitud de onda emitida por la mancha. Por ejemplo, la quinacrina se excita mejor para emitir fluorescencia en longitudes de
onda entre 460 nm y 500 nm y emite una luz de color amarillo verdoso entre 500 nm y 550 nm. Entonces, para la excitación, se debe usar un filtro
que pase todas las longitudes de onda entre 460 nm y 500 nm o longitudes de onda específicas dentro del rango (un filtro de paso de banda). La
luz emitida por la muestra se puede separar de la luz de excitación de onda corta no deseada mediante un filtro de barrera que pasa en el rango
amarillo verdoso (510–550 nm) pero corta completamente toda la radiación por debajo de 500 nm. La naranja de acridina requiere excitación a
500 nm y emite a 530 nm. Hoechst se excita a 365 nm y emite a 480 nm.
Los filtros se describen por sus curvas de transmisión, que muestran qué partes del espectro se absorben o se absorben parcialmente. Los filtros de
banda ancha, como el VG9 (Zeiss), transmiten grandes porciones del espectro [5]. Los filtros de paso de banda están diseñados para cortar longitudes de
onda por encima y por debajo de una longitud de onda determinada, como el filtro de interferencia para 546 nm. Los filtros de paso de onda corta (filtros de
corte) permiten que pasen las longitudes de onda por debajo de cierto punto, pero cortan por completo todo lo que esté más arriba. Del mismo modo, un
filtro de paso de longitud de onda larga (también un filtro de corte) emite longitudes de onda por encima de un cierto punto y corta completamente todo lo
que está debajo de él. Los filtros de paso de banda se utilizan más comúnmente como filtros de excitación y los filtros de paso de onda larga se utilizan para
las barreras. Los filtros de paso de banda triples permiten la visualización simultánea de tres longitudes de onda diferentes,

La epifluorescencia requiere un tercer tipo de filtro, el reflector dicroico, además de los filtros de excitación y barrera. El reflector dicroico
(también llamado divisor de haz cromático, reflector o divisor de haz dicromático) es un espejo de interferencia, similar al filtro de interferencia en
el sentido de que refleja la mayor parte de un rango espectral dado y transmite casi por completo otros. Este reflector se encuentra por encima de
la lente, donde refleja la luz deseada hacia la muestra y permite que las longitudes de onda no deseadas pasen a través de él sin reflejarse.

14.3.3 Consejos prácticos para la fluorescencia

Hacer algunos ajustes puede mejorar la visibilidad y la intensidad de la fluorescencia.

1. Trabaje en una habitación oscura.

2. Utilice objetivos con una apertura numérica alta (como apocromáticos o neofluares). La intensidad fluorescente aumenta
exponencialmente con el aumento de la apertura numérica.
3. Del mismo modo, utilice oculares de bajo aumento, porque la intensidad fluorescente disminuye exponencialmente con un aumento en el
aumento total.
4. Utilice aceite y medio de montaje adecuados. Debido a que la fluorescencia es una luz emitida en lugar de una luz refractada, el índice
de refracción del medio de montaje y el aceite no es tan crítico como con la microscopía de campo claro. Sin embargo, el grosor total
de estos medios es importante porque la luz emitida débil no penetrará mucho vidrio o líquido. El uso de un diafragma en la lente
5. de inmersión en aceite reducirá el destello.

14.4 Microscopía especializada

14.4.1 Microscopía de contraste de fase

Los objetos delgados, sin teñir o mal teñidos se pueden ver mejor con un sistema llamado microscopía de contraste de fase [1, 2, 6, 7]. Esto se
puede instalar en la mayoría de los microscopios existentes y es de gran valor en el laboratorio de citogenética. Se puede usar en el microscopio
invertido en el laboratorio de cultivo de tejidos para ver los cultivos a medida que crecen y para mirar los portaobjetos a medida que se hacen
para verificar el índice de propagación y mitótico. Phase también es útil para fotografiar objetos muy ligeramente teñidos, como bandas C
sobretratadas y bandas R ligeramente teñidas obtenidas con Giemsa.
700 / Capítulo 14: Microscopía e imágenes

La microscopía de contraste de fase hace uso del hecho de que los objetos transparentes causan un cambio en la fase de la luz transmitida,
dependiendo de las diferencias de grosor, y que estos cambios se pueden convertir en diferencias visibles de intensidad cuando parte de la luz
transmitida tiene su camino óptico modificado. por aproximadamente 1/4 de longitud de onda. El contraste de fase requiere solo un anillo de fase
en el condensador, que se asemeja a un anillo transparente en un inserto de vidrio oscuro, y una placa de fase en la lente del objetivo, un disco de
vidrio que tiene un área en forma de anillo de un espesor diferente al resto del disco (ver Figura 14.7). Las lentes de fase tendrán la marca "PH"
para indicar que contienen el anillo de fase.
El anillo en la lente debe estar alineado para coincidir con el anillo en el condensador; Esto se hace con un telescopio
especial provisto para el ocular (por ejemplo, Olympus) o con un ajuste especial del optovar Zeiss, los cuales se utilizan para
enfocar el anillo y el anillo. Las llaves que encajan en los enchufes del condensador se utilizan para alinearlos. Cada lente de fase
requiere un anillo diferente en el condensador, y la lente generalmente está marcada (por ejemplo, PH 2),

Placa de fase

Fase
objetivo

Muestra

Condensador Anillo

Figura 14.7 Contraste de fase de luz transmitida. La luz pasa a través del diafragma anular (en forma de anillo) en el condensador, formando
un cono de luz hueco que pasa a través de la muestra y a través de la placa de fase en el objetivo hasta el ocular.
 Capítulo 14: Microscopía e imágenes / 701

indicando la posición del anillo apropiado en el condensador. La adición de fase a un microscopio implica la compra de un
condensador especial y una o más lentes de fase.

14.4.2 Microscopio invertido

El microscopio invertido tiene la ventaja de colocar la lente del objetivo debajo del objeto que se va a ver para que los tejidos en una placa de Petri
o en un matraz puedan verse a pesar de la distancia entre las células y la parte superior del recipiente. La lente se enfoca en la parte inferior del
matraz de cultivo en lugar de intentar enfocar a través de la parte superior. (Los matraces cerrados se pueden ver en un microscopio
convencional, sin embargo, invirtiendo el matraz y observando las células directamente a través del fondo. Esto puede secar las células y debe
hacerse solo por períodos cortos de tiempo).
Un microscopio invertido económico es un artículo útil para el laboratorio de citogenética, especialmente si se mantienen cultivos a largo
plazo. Se puede usar un objetivo de baja potencia (3 × a 10 ×) en el microscopio de cultivo de tejidos invertido para escanear cultivos a fin de
determinar la salud y la actividad mitótica y para verificar los portaobjetos sin teñir. (El estudiante puede ver los cromosomas esparcidos en fijador
en un endoscopio invertido sin interferencia del calor de la fuente de luz).

14.5 Captura de la imagen microscópica

La resolución de los detalles en bandas de los cromosomas es el objetivo habitual de las imágenes en citogenética, ya sea que se logre mediante imágenes
fotográficas o digitales. Debido a que la resolución más alta de los objetivos del microscopio es de aproximadamente 0,2 μ m, es necesario emplear el mayor
cuidado en cada detalle de la microscopía y la imagen para producir un cariograma con suficiente detalle en los cromosomas.
Todas las condiciones recomendadas anteriormente son especialmente críticas para grabar la imagen. En particular, los siguientes pasos en
la iluminación de Köhler deben repetirse para cada exposición o captura:

1. Cierre el diafragma de campo y verifique el enfoque y el centrado del condensador de la subplaca.

2. Abra el diafragma de campo hasta que los bordes simplemente desaparezcan de la vista, excepto en las imágenes digitales. Para obtener imágenes digitales, abra

completamente el diafragma de campo. El último paso del proceso de Köhler (contraste) se realiza de forma digital.

Estos dos pasos controlan los destellos, el deslumbramiento y la exposición desigual. Otros elementos importantes son el ajuste correcto del diafragma de la
subplaca (iris), el enfoque correcto de las retículas del ocular, el uso de aceite de inmersión y un medio de montaje cuyo índice de refracción coincida con el
del objetivo, cubreobjetos del grosor adecuado, la longitud adecuada del tubo y lentes adecuados. .
Es necesario un objetivo de inmersión en aceite con la resolución más alta posible para registrar la información detallada que se encuentra en los
cromosomas bien agrupados.

14.5.1 Fotografía de campo claro

Filtros
Los filtros se utilizan en la fotomicrografía de campo claro con dos propósitos: cambiar la temperatura de color de la fuente de luz cuando se usa
una película de color y aumentar el contraste de los cromosomas en bandas cuando se usa una película en blanco y negro. Para la fotomicrografía
en color, compruebe la temperatura de color de la fuente de luz y los filtros adecuados que debe utilizar [1]. Tenga en cuenta que esto no se aplica
a la fotografía en color de cromosomas fluorescentes, porque la muestra emite la luz.
Davidson [8] sugiere un filtro de color amarillo verdoso (560 nm) para las bandas G con tinción promedio y un filtro verde más profundo (510 nm) para
las ligeramente teñidas. Los filtros de interferencia en este rango funcionan bien porque proporcionan una banda de transmisión estrecha, pero también
requieren exposiciones más prolongadas. Para la fotomicrografía de contraste de fase, se recomiendan los filtros KodakWratten números 13, 58 y 61. Todos
son verdes, siendo el número 61 el verde más profundo. Los objetivos de fase suelen ser acromáticos y se corrigen de forma óptima para la luz verde; por lo
tanto, un filtro verde es la mejor opción.

Cámaras
Con una cámara incorporada, solo se necesita una parte trasera de la cámara porque el objetivo del microscopio se convierte en la lente de la
cámara. En cámaras con lentes integrales, la lente debe colocarse en el punto de mira para que enfoque la imagen formada por el objetivo. Esta
distancia es crítica y varía con la cámara y el microscopio. Muchos fabricantes de cámaras fabrican dispositivos adaptativos especiales como
accesorios para que sus cámaras puedan colocarse correctamente. Luego, la cámara se ajusta al infinito utilizando la apertura de diafragma más
grande. El aumento generalmente se reducirá en tales sistemas.
Si la cámara tiene una lente extraíble, se debe quitar la lente y conectar la cámara directamente al microscopio. Esto mejora
la imagen porque no tiene que atravesar tantas superficies antes de alcanzar el plano de la película. Apropiado
702 / Capítulo 14: Microscopía e imágenes

Los divisores de haz, los oculares fotográficos y los telescopios de enfoque auxiliares están disponibles para usar con la cámara adjunta y
brindarán imágenes más nítidas.
Históricamente, la mayoría de los laboratorios de citogenética han utilizado cámaras de 35 mm, integradas en el microscopio o añadidas a él. Se
encuentran disponibles cámaras con fuelles ajustables [1] para aceptar láminas de película de 4 × 5 pulgadas para fotomicrografías de alta calidad. Las
cámaras con fuelle ajustable son capaces de una gama completa de aumentos. Una ventaja adicional del formato 4 × 5 es la capacidad de tomar fotografías
Polaroid, que están inmediatamente disponibles para la documentación e identificación de cromosomas sin la necesidad de un cuarto oscuro o un sistema de
análisis de imágenes. Muchos sistemas de fuelles también permiten la instalación de una cámara de 35 mm. Sin embargo, actualmente la mayoría de las
cámaras utilizadas en citogenética son digitales.

14.5.2 Imágenes digitales

Durante las últimas décadas, la mayoría de los laboratorios han adoptado imágenes por computadora para reemplazar la fotografía de 35 mm y para ayudar
en el cariotipo. Los buscadores de metafase son muy útiles en algunas aplicaciones y la gestión de datos computarizados se utiliza más comúnmente en los
laboratorios que nunca.
La mayoría de los sistemas de análisis de imágenes se basan en las plataformas AppleMacintosh, IBM y UNIX. El software es la principal diferencia entre
los sistemas. Los paquetes de software pueden proporcionar ideogramas y la capacidad de agregar flechas y anotaciones de texto. Puede ser posible el
recuento y análisis de cromosomas, así como la acumulación de datos estadísticos. Para el hardware, la memoria y la capacidad de almacenamiento son
consideraciones importantes. Al elegir los sistemas, los laboratorios suelen considerar la calidad de la imagen, la facilidad de uso y los costos operativos.
Otros factores son las bases de datos de gestión del laboratorio y la compatibilidad con las computadoras existentes. Las ventajas de los sistemas de
imágenes son, por tanto, la eliminación del cuarto oscuro y el consiguiente ahorro de tiempo que puede reducir el tiempo de respuesta.
Para la adquisición de imágenes, un dispositivo sensor (cámara) usa voltaje para formar una imagen analógica en la que el brillo y, a
veces, el color varían continuamente con la posición. Esta imagen analógica es una matriz de elementos de imagen o píxeles. La imagen
se digitaliza mediante un convertidor de analógico a digital para su almacenamiento en la computadora como una imagen en escala de
grises. Las cámaras de video utilizan un tubo de imagen o varios tubos. Otro tipo de cámara utiliza un sensor de estado sólido, como un
dispositivo de carga acoplada, por lo tanto, una cámara CCD. Estos dispositivos pueden acumular una carga a lo largo del tiempo sin una
pérdida significativa cuando se enfrían y, por lo tanto, son útiles para grabar imágenes tenues [9, 10] como señales de sonda
fluorescente. Se pueden usar cámaras a color o se pueden usar pseudocolor para acentuar pequeñas variaciones de brillo.

Una vez que una imagen se digitaliza (se toma, se captura, se toma o se congela), se puede identificar y almacenar en la base de datos, lo que
permitirá que la imagen manipulada se muestre en un monitor o se imprima como una copia impresa. La imagen también se puede almacenar a
largo plazo en un disco óptico.
El procesamiento de imágenes se utiliza para eliminar detalles irrelevantes (reducir el ruido) mediante el filtrado o promediado digital, para restar el
fondo y para mejorar el contraste al distribuir los valores de píxeles en un rango más amplio de sombreado de grises. La nitidez de la imagen a menudo
aumentará el contraste en los bordes mientras se suprime el contraste en el resto de la imagen. Esta nitidez de los bordes o la nitidez de las imágenes
produce un resultado que parece más nítido que el original [12].
En términos prácticos, el uso de imágenes digitales en citogenética requiere un esfuerzo concertado cuando se configura el sistema para garantizar que
se obtengan imágenes que sean al menos tan buenas como los resultados fotográficos. Si no se toman precauciones desde el principio, pueden afianzarse
estándares de calidad más bajos. Dado que las imágenes digitales son capaces de producir representaciones de cromosomas en bandas tan buenas o
mejores que la fotografía, se deben hacer todos los esfuerzos posibles para aprovechar al máximo esta capacidad.
En general, uno debería tripsinizar menos y teñir más claro que para la fotografía para obtener buenos resultados con las imágenes. Se debe tener cuidado para

garantizar que se obtengan imágenes de bandas finas y que no se pierdan las bandas pálidas en los extremos de los cromosomas. Al igual que con la fotografía, un

primer paso esencial es ajustar el microscopio correctamente para obtener la mejor resolución y contraste.

para imaginar una metafase

1. Ajuste la luz para que sea lo más brillante posible, con las áreas más pálidas que se ven en el monitor comenzando a desaparecer; coloque la
luz justo debajo de este punto para obtener la mayor cantidad de luz sin perder detalles. Algunos sistemas dan un histograma en el monitor
para ajustar el nivel de luz.
2. Ajuste la imagen del microscopio a su imagen más nítida en el monitor. Algunos sistemas tienen una representación numérica para ayudar a enfocar
nítidamente la imagen del microscopio.
3. Ajuste la ganancia y la compensación para equilibrar las áreas claras y oscuras de modo que el contraste de la banda sea comparable al que se ve a
4. través del microscopio. Captura la imagen. Identifíquelo y guárdelo como un archivo dentro de un sistema organizado y recuperable en la computadora.
5. Manipule la imagen como desee, por ejemplo, mejore, cariotipo.
6. Si es necesario, imprima la imagen para que reproduzca el detalle con el que se había visto en el monitor.

Para obtener información detallada específica sobre imágenes digitales, consulte el Capítulo 15, Imágenes por computadora.
 Capítulo 14: Microscopía e imágenes / 703

14.5.3 Impresora

Las impresoras son una parte integral de la configuración de imágenes. Es importante que la calidad de la impresora sea suficiente para reproducir en la impresión todos

los detalles de la imagen registrados digitalmente.

14.5.4 Avances modernos en herramientas de microscopía

Buscadores y analizadores de metafase

Los buscadores de metafase han encontrado un hogar permanente en muchos laboratorios de citogenética, no solo por su utilidad en los casos en los que
las metafases son escasas, como en la médula ósea postratamiento o preparaciones directas de muestras de vellosidades coriónicas [13], sino también en la
reducción de los tecnólogos 'tiempo en escanear y fotografiar, especialmente en muestras neoplásicas donde cada célula debe ser analizada. También
permite a los directores revisar tanto la matriz lineal de cromosomas como poder revisar células adicionales desde un sitio remoto si surgiera la necesidad,
sin requerir un microscopio o el portaobjetos del paciente. El análisis cromosómico automatizado, por otro lado, no ha tenido el mismo éxito y aún requiere
que la mente humana identifique con precisión la variación de los cromosomas causada por inconsistencias debidas a grados diferenciales de condensación
o su posición dentro de la célula en el momento en que se corrigió. Algunos sistemas también se han enfrentado al excesivo tamaño de archivo de las
imágenes escaneadas, lo que puede afectar tanto la eficiencia de la computadora como la capacidad de almacenamiento.

Imágenes digitales de sondas FISH

Las imágenes digitales han sido especialmente útiles para registrar señales pálidas que a veces se producen mediante técnicas FISH. El procesamiento de
imágenes puede aumentar el contraste y se pueden utilizar sistemas de filtrado para mejorar la relación señal / ruido.

Cámaras CCD
La tecnología de dispositivo de carga acoplada se utiliza en las cámaras CCD, lo que permite detectar señales no visibles para el microscopista y
utilizar sondas de menos de 2 kb.

Microscopios confocales

Los microscopios de escaneo láser reducen en gran medida la fluorescencia desenfocada y, a menudo, se utilizan para obtener imágenes de estructuras tridimensionales.

Aunque no es tan sensible como la cámara CCD, el microscopio confocal es capaz de captar imágenes de las señales de la sonda bastante bien. Sin embargo, una

limitación está en su uso con fluorocromos, generalmente verde y rojo, que pueden ser excitados por los láseres existentes.

Referencias
1. Delly JG. Fotografía a través del microscopio, 9ª ed. Rochester, Nueva York: Eastman Kodak; 1988.

2. Determan H, Lepusch F. El microscopio y su aplicación. Wetzlar, Alemania: Leitz.

3. Mollring FK. Microscopía desde el principio. Oberkochen, Alemania Occidental: Carl Zeiss; 1981.
4. Kapitza HG. Microscopía desde el principio. Oberkochen, Alemania Occidental: Carl Zeiss; 1994.
5. Holz HM. Datos útiles sobre la microscopía de fluorescencia. Oberkochen, Alemania Occidental: Carl Zeiss; 1975.

6. Eliminación de CFA. Microscopía moderna: teoría y práctica elemental. Londres: Butterworths; 1974.

7. Lawson D. Fotomicrografía. Nueva York: Academic Press; 1972.

8. Davidson NR. Técnicas fotográficas para registrar patrones de bandas cromosómicas. J Med Genet 1973; 10: 122.
9. Green WB. Procesamiento de imágenes digitales: un enfoque de sistemas. Nueva York: Van Nostrand Reinhold; 1989.

10. Russ JC. Microscopía asistida por computadora. Nueva York: Plenum Press; 1991.

11. Lacey AJ. Microscopía óptica en biología: un enfoque práctico. Oxford, Reino Unido: IRL Press; 1989.

12. Piper J, Lundsteen C. Análisis de cromosomas humanos por máquina. TIG 1987; 3: 309–313.

13. Ji L. Segmentación cromosómica completamente automática. Citometría 1995; 17: 196-208.

Capítulo 15

Imágenes por computadora

Christine e. haessig
(jubilado), Laboratorio de Citogenética, Hospital General de Vancouver, Vancouver, BC, Canadá

15.1 Introducción
Con el desarrollo de la tecnología de imágenes en el campo de la citogenética, los sistemas de cariotipo asistido por computadora que producen imágenes
digitalizadas prácticamente han reemplazado a las impresiones fotográficas tradicionales. Los avances tecnológicos en microprocesadores, cámaras de
video, monitores e impresoras contribuyen a una imagen de mayor calidad.
Las imágenes por computadora en términos citogenéticos son el proceso de transformar una imagen en metafase de un microscopio en componentes
digitales para su visualización y manipulación en un monitor. Al aplicar las herramientas de mejora de la computadora (nitidez y contraste), la impresión láser
resultante produce una imagen de alta resolución. Un beneficio de esta tecnología incluye la capacidad de vincular las estaciones de trabajo del microscopio
entre sí a través de la red de área local y los sistemas de captura por satélite. Los tecnólogos pueden digitalizar una imagen desde cualquier microscopio,
almacenarla en una computadora central y luego recuperar y cariotipo la imagen desde cualquier estación de trabajo. Esta capacidad de conexión en red
aumenta la accesibilidad de la caja desde cualquier estación, lo que reduce cualquier efecto de "cuello de botella".
Los sistemas de imágenes por computadora ofrecen varias ventajas sobre la fotografía convencional. El tiempo de respuesta, por ejemplo, se reduce

significativamente ya que los resultados de los pacientes con cariogramas completos se pueden informar más rápidamente. Los costos de impresión son

considerablemente menores con las impresoras láser. El almacenamiento de archivos a largo plazo también se recupera fácilmente de los sistemas de redes informáticos

internos o de los discos que requieren un espacio de almacenamiento mínimo.

15.2 Técnicas para mejorar la calidad de la imagen del cariograma

En cualquier tecnología, pueden surgir problemas y pueden ser necesarios ajustes en el equipo y / o procedimientos para lograr la calidad deseada de
impresiones. Los laboratorios a veces pueden encontrar que sus impresiones están mal contrastadas o se ven "turbias", tienen una resolución disminuida o
pérdida de telómeros y / o satélites. Múltiples factores pueden afectar la calidad de los resultados proporcionados por su sistema de imágenes, y no todos
involucran software de imágenes. La preparación de la metafase, los ajustes del microscopio, la configuración de captura de imágenes y las capacidades de
mejora de la computadora contribuyen a la calidad de las impresiones de metafase y cariograma. Para lograr una mejor calidad de imagen, se discutirán los
siguientes temas:

■ Preparación de la metafase
■ Microscopía
■ Captura de imagen

■ Mejora
■ Contraste avanzado
■ Programación macro.

El Manual de laboratorio de AGTCytogenetics, Cuarta edición. Editado por Marilyn S. Arsham, Margaret J. Barch y Helen J. Lawce. ©
2017 La Asociación de Tecnólogos Genéticos. Publicado en 2017 por JohnWiley & Sons, Inc.