Cap 2 Traducido

Capitulo 2
Citogenética: una descripción general

helen J. Lawce 1 y Michael G. Brown 2
1 Laboratorio de diagnóstico Knight de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.
2( retirado), Laboratorio de diagnóstico Knight de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.
Los cromosomas han atraído a muchos microscopistas no solo porque estos cuerpos con forma de salchicha representan vehículos de material genético
(y, por lo tanto, son biológicamente importantes), sino también porque son objetos hipnóticamente hermosos.
TC Hsu, Citogenética humana y de mamíferos: una perspectiva histórica, 1979, Springer ‐ Verlag
2.1 Introducción
La citogenética es el estudio de la morfología, estructura, patología, función y comportamiento de los cromosomas. Los cromosomas se estudian
mejor en la metafase mitótica o meiótica, aunque algunos estudios, como los métodos de hibridación in situ por fluorescencia (FISH), pueden
utilizar células en interfase. Los cromosomas en metafase pueden estudiarse en tejidos que se dividen espontáneamente o en células que han
sido estimuladas para dividirse en cultivo. Se pueden encontrar células que se dividen espontáneamente en la médula ósea, los ganglios linfáticos,
los testículos, las vellosidades coriónicas de la placenta, algo de sangre leucémica, un tumor sólido, algo de líquido pleural o ascítico, ascitis fetal o
líquido de higroma quístico y, a menudo, en sangre fetal o neonatal. Las células que se cultivan antes del estudio citogenético incluyen todo lo
anterior (para el estudio de otros componentes que pueden no dividirse espontáneamente), además de linfocitos sanguíneos, líquido amniótico,
piel,
Una vez que se obtienen las células en división, se utilizan agentes de detención mitótica (como Colcemid®, colchicina o Velban) para recolectar las
células en metafase. Luego, las células se procesan (recolectan). Esto generalmente se realiza con suspensiones de células, aunque algunas células se
recolectan "in situ" directamente sobre las células cultivadas en una placa de Petri. Durante el procedimiento de recolección, se usan soluciones hipotónicas
para aumentar el volumen celular, lo que separa los cromosomas, y se usa metanol-ácido acético para fijarlos (preservarlos) para su estudio. Los
portaobjetos se preparan a partir de células fijadas, ya sea en suspensión (colocadas sobre portaobjetos) o in situ, sobre la superficie de crecimiento (las
células fijadas se dejan secar en el matraz, el cubreobjetos o el portaobjetos en el que se cultivaron). De cualquier manera, las células se tiñen con tinciones
apropiadas, se observan y analizan. Las imágenes generadas por computadora ahora se utilizan para ordenar los cromosomas en pares en cariogramas
(Figura 2.1). Los capítulos que siguen describen estos métodos en detalle.
2.2 Historia de la citogenética humana

Las metodologías citogenéticas se han desarrollado gradualmente [1, 2]. La primera observación conocida de cromosomas fue realizada por
Eduard Strasburger en 1875, utilizando material vegetal, y por Walther Flemming en 1879-1889, utilizando material animal. Flemming acuñó los
términos mitosis, cromatina, profase, metafase, anafase y telofase. W. Waldeyer acuñó el término cromosoma en 1888.
Aunque estos trabajadores en Alemania observaron por primera vez los cromosomas humanos hace unos 100 años, los problemas
técnicos hicieron que contar los cromosomas fuera bastante difícil. Painter [3] publicó el número diploide humano en 1923 como 48, y se
creía que este era el número verdadero durante tres décadas. Esto se debió a que los cromosomas eran difíciles de distribuir en la célula
y a que las diferencias entre las constricciones primarias (centrómeros) y las constricciones secundarias (heterocromáticas
El Manual de laboratorio de AGTCytogenetics, Cuarta edición. Editado por Marilyn S. Arsham, Margaret J. Barch y Helen J. Lawce. ©
2017 La Asociación de Tecnólogos Genéticos. Publicado en 2017 por JohnWiley & Sons, Inc.
26 / Capítulo 2: Citogenética: descripción general
Sangre o tuétano
A largo plazo Término corto Separar

cultura cultura cromosomas
Colocar en grupos
INHIBIDOR MITÓTICO Fotografía
en cariotipo celdas deseadas
(colcémido)
Enzimático
dispersión
Contar y analizar
metafases en
microscopio
Diapositiva de la mancha
Centrifugar células
y quitar
medio de crecimiento:
Resuspender
Agregar hipotónico
solución
Centrifugar células
y quitar
hipotónico
Resuspender Suspensión de gota celular

solución en diapositivas y permitir
Lavar con fijador
Secar
2 a 3 veces
suspender celdas
Agregar fijador
Resuspender
Figura 2.1 Esquema de los métodos de preparación de cromosomas. El corte de cromosomas a partir de impresiones ha sido reemplazado en gran
medida por sistemas de cariotipo computarizado. en el paso de "Tinción del portaobjetos", el portaobjetos se puede utilizar para FISh en lugar de
preparaciones de cromosomas en bandas. Los estudios FISh se pueden realizar en células en interfase en casi cualquier etapa, incluso en tejidos
frescos no recolectados (p. Ej., Cortes de tejido fijados con formalina, incluidos en parafina o líquido cefalorraquídeo depositado en portaobjetos y fijado
in situ), o en tejidos fijados y / o células, recolectadas o no. La metafase FISh se puede realizar en células no teñidas de cultivos recolectados, o
secuencialmente después de teñir los cromosomas con métodos de bandas o tinción sólida.
Capítulo 2: Citogenética: una descripción general / 27
CH 3 O
C
NUEVA HAMPSHIRECH 3
O
CH 3 O
CH 3
CH 3 O
O Colcemid
OCH 3
Colchicina
Figura 2.2 Colchicina y Colcemid ®. Colcemid ® es desacetilmetilcolchicina: el grupo acetilo de la colchicina (círculo superior) se reemplaza
por un grupo metilo (círculo inferior).
regiones de los cromosomas 1, 9, 16 y las regiones del tallo de los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22) eran oscuras. Era fácil
interpretar dos cromosomas asociados entre sí como un solo cromosoma y, a la inversa, era difícil estar seguro de que lo que
parecía ser un cromosoma grande no eran, en cambio, dos cromosomas más pequeños asociados. Incluso hoy, con métodos
mucho más sofisticados, todavía puede ser un desafío, sin algo de experiencia, diferenciar entre una translocación y telómeros
estrechamente alineados, o entre un centrómero y una región cromosómica torcida o rota, o una región heterocromática
estirada.
La otra gran dificultad fue obtener células en división para estudiar. No fue hasta que se desarrollaron lo suficiente los métodos de
cultivo de tejidos y células para desarrollar tejido pulmonar fetal que Tjio y Levan [4] pudieron utilizar este material en 1956 para obtener
una visión clara del número de cromosomas por primera vez. Utilizaron colchicina (Figura 2.2) para detener las células en metafase y
luego utilizaron un tratamiento hipotónico [5,6] para hinchar las células a un volumen mucho mayor, de modo que era menos probable
que los cromosomas se apiñaran. Sin embargo, el método utilizado para esparcir los cromosomas en portaobjetos seguía siendo la
preparación de calabaza, en la que se presionaba tejido entre un cubreobjetos y el portaobjetos. Este método requirió fijadores de ácido
acético acuosos fuertes para ablandar los tejidos lo suficiente como para aplastarlos, y creó artefactos de preparación, perdiendo
algunos cromosomas de muchas células. El uso de estas técnicas con fines clínicos también fue muy poco práctico, debido a los
procedimientos invasivos de recolección de tejido. Todavía no era posible cultivar sangre periférica, por lo que los únicos tejidos
disponibles para los estudios cromosómicos eran la médula ósea, las biopsias testiculares y la piel. Cuando Nowell [7] descubrió una
forma de estimular la división de los linfocitos sanguíneos, y Moorehead et al. [8] describió un método para esparcir cromosomas de
linfocitos fijados con alcohol-ácido acético mediante secado al aire, fue posible examinar cromosomas humanos obtenidos por métodos
no invasivos, con muchos menos artefactos técnicos que nunca. Esto, junto con los descubrimientos de las causas cromosómicas del
síndrome de Down, el síndrome de Turner, el síndrome de Klinefelter y el cromosoma Filadelfia en la LMC,
Los cromosomas en metafase se tiñeron originalmente con Giemsa o aceto-orceína, produciendo cromosomas sin bandas ("teñidos
sólidos"), que solo podían agruparse por tamaño y forma, pero no identificarse individualmente, aparte de los cromosomas 1, 3,
9, 16 e Y, si fueran normales. Los métodos de investigación para identificar cromosomas individuales, incluida la autorradiografía, habían tenido
un éxito limitado. Por lo tanto, muchas anomalías pasaron desapercibidas o no pudieron caracterizarse por completo.
En 1968, Caspersson et al. [9] publicó un método de fluorescencia (bandas Q) utilizando tinción de quinacrina mostaza que diferenciaba los pares de cromosomas en
animales y plantas inferiores; Este artículo fue ignorado en gran medida, sin embargo, hasta que el grupo de Caspersson [10] mostró que cada cromosoma humano tenía
un patrón distinto de bandas usando su método. Finalmente, muchas anomalías cromosómicas humanas podrían caracterizarse por los patrones de las regiones claras y
oscuras (bandas), lo que permitió la identificación no solo de cada par, sino también de pequeños segmentos cromosómicos. Los métodos descritos posteriormente
incluyeron las bandas G mucho más populares, que usaban tripsina y Giemsa, que no requerían fluorescencia, así como tinciones inversas (bandas R) y de
heterocromatina constitutiva (bandas C) (Figura 2.3). Siguieron otros métodos, como se discutió en el Capítulo 6. Estas tinciones ampliaron la detección y caracterización
de muchas más anomalías citogenéticas, especialmente para el campo de la oncología, donde el descubrimiento de que reordenamientos cromosómicos específicos se
asociaban con ciertas afecciones neoplásicas condujo a una mejora dramática en las capacidades de diagnóstico y pronóstico de los médicos (ver Capítulo 11). , Análisis
citogenético de enfermedades hematológicas malignas y Capítulo 12, Métodos citogenéticos y hallazgos en tumores sólidos humanos) que lo que podría verse con tinción
sólida. El Capítulo 6, Tinciones cromosómicas, analiza estos y otros procedimientos de tinción. donde el descubrimiento de que reordenamientos cromosómicos
específicos se asociaron con ciertas afecciones neoplásicas condujo a una mejora dramática en las capacidades de diagnóstico y pronóstico de los médicos (consulte el
Capítulo 11, Análisis citogenético de enfermedades hematológicas malignas y el Capítulo 12, Métodos citogenéticos y hallazgos en tumores sólidos humanos) de lo que se
podía ver con tinción sólida. El Capítulo 6, Tinciones cromosómicas, analiza estos y otros procedimientos de tinción. donde el descubrimiento de que reordenamientos cromosómicos específico
Figura 2.3 Comparación de métodos de anillado. un cromosoma humano 1, teñido con (de izquierda a derecha) Giemsa sólido, bandas G de
tripsina, bandas C, bandas Q y bandas r.
Un agua
a un agua tenue
R rojo
G verde
GRAMO
A
A GRAMO a
R
A
GRAMO
R
R
GRAMO
a
a A
R
Figura 2.4 Hibridación fluorescente in situ en células en metafase e interfase. FISh puede usarse en células en metafase o interfase. esta metafase se ha
hibridado con tres sondas con tres fluoróforos de diferentes colores. el telómero del brazo largo del cromosoma 4 está en rojo, el cromosoma 9
centromérico, el ADN alfa-satélite está en agua y el brazo largo del cromosoma 9 está en verde. Tenga en cuenta que las señales se pueden enumerar
en una célula en interfase (derecha), así como en los cromosomas en metafase. el pequeño color aguamarina en el cromosoma del grupo B se debe a
las similitudes entre el satélite alfa DNa entre los cromosomas 4 y 9. Consulte el inserto para ver la representación en color de esta figura.
En 1976, Jorge Yunis [11] revolucionó el campo al demostrar que exposiciones breves a bajas concentraciones de Colcemid®, junto
con métodos de sincronía celular, producirían cromosomas alargados con casi el doble de bandas, denominadas bandas de "alta
resolución", que podrían luego se utilizará para detectar anomalías cromosómicas más pequeñas y sutiles. Microdeleciones, como las
responsables de los síndromes de Prader-Willi [12] y Angelman [13] en el brazo largo del cromosoma 15, los síndromes DiGeorge /
velocardiofacial en el brazo largo del cromosoma 22 [14,15] y el síndrome de Miller-Dieker [16] en el cromosoma unos 17 brazos cortos,
fueron finalmente descubiertos utilizando estos métodos.
En la década de 1980, el diagnóstico prenatal mediante biopsia de vellosidades coriónicas (CVS) estuvo disponible para las parejas que deseaban un diagnóstico más
temprano que el que podría proporcionar la amniocentesis. La CVS podría tener éxito a las 10-12 semanas de gestación, mientras que la amniocentesis se vuelve factible a
las 14+ semanas debido a que hay un volumen inadecuado de líquido presente en edades gestacionales más tempranas. El conocimiento de la citogenética de diversas
neoplasias y la correlación con el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad también se definieron mucho mejor.
También en la década de 1980, el desarrollo de la citogenética molecular envió al campo rápidamente cambiante a otra revolución,
descubriendo por primera vez la naturaleza de los reordenamientos o cambios crípticos, a menudo visibles solo a nivel molecular. Los nuevos
métodos FISH incluían sondas de cromosomas completos (pinturas), sondas de copia única y sondas específicas de centrómero, lo que permite
responder a muchos tipos diferentes de preguntas, a veces en ausencia de células en metafase (consulte la Figura 2.4).
Durante la década de 1990 y principios de la de 2000, las sondas FISH estuvieron disponibles comercialmente para muchas enfermedades
constitucionales y adquiridas diferentes. Se desarrollaron métodos especializados para teñir cada cromosoma con un color diferente, como SKY, M ‐ FISH y
sondas FISH con bandas de color, así como hibridación genómica comparativa (CGH) y paneles para todas las regiones de subtelómeros o todos los
centrómeros. Las sondas que podían detectar deleciones y translocaciones específicas en células cancerosas en interfase se comercializaron en muchas
formas para muchos cánceres diferentes, lo que permite una determinación precisa del diagnóstico de la enfermedad (p. Ej., BCR / ABL1
translocación para diagnosticar leucemia mieloide crónica en determinadas situaciones; pronóstico (p. ej., Cajero automático, TP53, 12 aneuploidía de
centrómero, etc., para evaluar la leucemia linfocítica crónica (o CLL); respuesta al tratamiento (p. ej., ERBB2, también llamado HER2 / neu pruebas de
amplificación genética) para determinar el curso terapéutico de ciertos carcinomas de mama invasivos; estado de enfermedad residual (DR) (p. ej., PML / Recurrencia
del reordenamiento de RARA en la leucemia promielocítica aguda (APL); y éxito del injerto del trasplante (p. ej., utilizando sondas de centrómero X e Y para
detectar la presencia y el porcentaje de células de la médula ósea de donantes del sexo opuesto).
Finalmente, la hibridación genómica comparativa se refinó en pruebas analíticas de microarrays de cromosomas, que incluyen mCGH o aCGH
para arreglos, lo que permite un análisis FISH de alto rendimiento para cientos o miles de genes o secuencias de ADN cromosómico en un solo
ensayo (consulte el Capítulo 18, Tecnología de microarrays genómicos para el laboratorio de citogenética). La Tabla 2.1 muestra un calendario de
hitos seleccionados en la historia de la citogenética. Sin duda, las revoluciones en este campo en rápida evolución seguirán sorprendiéndonos.
2.3 Métodos de citogenética

En este capítulo de descripción general, discutiremos el flujo general de actividades dentro del laboratorio de citogenética, así como las teorías detrás de sus
procesos, es decir, recolección, preparación de portaobjetos, tinción, análisis de cromosomas (Figura 2.1) y reporte de casos, según corresponda. a todos los
especímenes. Los capítulos que siguen discutirán con más profundidad los métodos que se utilizan para procesar tipos de tejidos específicos recibidos por
los laboratorios de citogenética, como sangre, médula ósea, tumores, líquido amniótico, vellosidades coriónicas, piel y productos de la concepción, así como
métodos moleculares (FISH) que pueden interrogar aún más las células obtenidas de estos tejidos.
Los métodos utilizados para estudiar un tejido dependen de qué tejido es y qué cuestiones citogenéticas deben abordarse. Las aberraciones
cromosómicas constitucionales se estudian típicamente en los linfocitos de la sangre, pero también se pueden estudiar otros tejidos de diferentes
capas germinales, como la piel y las gónadas, o el tejido de la placenta, cuando se busca mosaicismo tisular (ver 2.6.2, Mosaicismo). Además,
puede haber ocasiones en las que la sangre no esté disponible (por ejemplo, el paciente ha fallecido), pero la piel u otros tejidos aún son viables.
Las afecciones adquiridas asociadas con neoplasias deben estudiar el sitio de la malignidad, por ejemplo, tumor, ganglio linfático, sitio
metastásico, aspirado de médula ósea, núcleo óseo en caso de punción seca o sangre neoplásica, si corresponde al diagnóstico. Sin embargo,
pueden surgir situaciones en las que se requiera una segunda fuente no neoplásica para determinar si una anomalía cariotípica está relacionada
con la neoplasia o es constitucional. Por ejemplo, la trisomía 21 en la médula ósea de un niño con leucemia puede ser adquirida o constitucional.
Los tejidos que están en suspensión, como el líquido amniótico, la médula ósea y la sangre periférica o del cordón, son más fáciles de cultivar, porque no
requieren dispersión antes de establecerse en cultivo. Sin embargo, los tejidos sólidos, como las vellosidades coriónicas, la piel, los tumores sólidos y los
productos de la concepción, requerirán cierta dispersión enzimática antes de cultivar para obtener los mejores resultados.
2.3.1 Flujo de trabajo
Adquisición de muestras
El primer paso en el análisis citogenético es obtener el tejido correcto en el medio de recolección / anticoagulante correcto en recipientes
apropiados, a la temperatura correcta y de manera oportuna. Algunos tejidos deben recibirse de inmediato, como muchos tumores cerebrales;
otros pueden demorarse de 1 a 3 días, como la muestra de sangre promedio. El tejido de elección depende de si la referencia es por trastornos
constitucionales o adquiridos. Todos los laboratorios deben crear y proporcionar formularios estándar de solicitud de muestras para que los
envíen médicos y laboratorios, de modo que el cliente sepa qué información necesita el laboratorio de citogenética.
Los recipientes de recolección deben ser estériles y, en la mayoría de los casos, deben ser de stock estándar (por ejemplo, jeringas,
recipientes al vacío, tubos de ensayo de vidrio, vasos de recolección de orina) o provistos por el laboratorio de citogenética (placas de
Petri estériles, tubos de centrífuga de plástico con o sin medio de transporte ). Sin embargo, el tecnólogo debe prestar mucha atención a
cualquier patrón de crecimiento subóptimo que afecte a varios pacientes extraídos en condiciones similares, ya que podría haber una
toxicidad inesperada en un lote o tipo de recipiente que esté utilizando el médico o el laboratorio. Muchos tipos de muestras (p. Ej.,
Tejidos sólidos, como vellosidades coriónicas, productos de la concepción, tumores sólidos) deben mantenerse húmedos durante el
transporte mediante el uso de solución salina isotónica o diversos medios de recogida / transporte. Las pequeñas muestras de sangre,
médula ósea u otros fluidos también sobrevivirán mucho mejor en medio,
Cuadro 2.1 Principales descubrimientos y puntos de referencia en citogenética, 1865-2001
Año Investigador Descubrimiento
1865 Gregor Mendel Principios descubiertos de la herencia
1867 Gustav Giemsa Mezcla de tinción inventada de Giemsa
1882 Walther Flemming Mitosis descrita, fijación usada, tinción
1888 heinrich Wilhelm Waldeyer Cromosomas nombrados
1893 Oscar hertwig publicado Cell y Tissu e, el primer libro de texto de citología
1902 Theodor Boveri, Walter Sutton Demostró la presencia de pares (homólogos) informó la presencia
1905 Nettie Stevens del cromosoma Y en los machos teorizó que los cambios
1914 Theodor Boveri cromosómicos podrían causar cáncer Introdujo el método de
1921 John Belling calabaza para la diseminación cromosómica
1922 pintor theophilus publicó que los humanos tienen 48 cromosomas basados en secciones
testiculares
1937 Albert Blakeslee y Colchicina usada para detener metafases

una. G. avery
1941 Frits Zernike microscopio de contraste de fase desarrollado
1951 George Gey línea celular heLa establecida
1952 arthur hughes; Kyoko Makino y Describió el uso de solución hipotónica en citogenética.
Kazuo Nishimura; t. C. hsu
1953 James Watson y Estructura de doble hélice descrita de DNa

Francis Crick
1956 Jo hin tjio y albert Levan estableció el número de cromosomas del hombre en 46 usando colchicina,
0.04–0.004 μ g / ml durante 20 horas e hipotónico en cultivos de pulmón
embrionario de cuatro fetos
1958 Charles e. Vado Primer informe de anomalías cromosómicas en la leucemia
1958 David hungerford informó que el KCl 0.075 M mejora la morfología cromosómica sobre la
solución hipotónica de citrato de sodio
1959 Jerome Lejeune Descubrió un cromosoma 21 adicional en pacientes con síndrome de Down
1959 patricia jacobs y john fuerte Descrito XXY en el síndrome de Klinefelter
1959 Charles e. Vado informó síndrome de 45, X turner
1960 J. a. Böök y Berta Santesson Klaus Triploidía descrita en humanos
1960 patau Trisomía 13 descrita
1960 John edwards Trisomía 18 descrita
1960 Peter Nowell Efecto descrito de la fitohemaglutinina a (pha) en el cultivo de linfocitos
1960 Paul S. Moorhead, Peter Nowell, Hemocultivo descrito y protocolo de recolección utilizando pha, colchicina,
WJ Mellman, DM Battips y hipotónico, fijador de metanol-ácido acético 3: 1, tinción de Giemsa
David hungerford
1960 ISCN Primera conferencia sobre nomenclatura cromosómica (Denver, CO)
1961 Mary Lyon Inactivación descrita de X
1963 Jerome Lejeune Se describe el 5p eliminado en el síndrome de Cri ‐ du ‐ chat Se
1964 patricia Farnes y describe el uso de mitógenos de la hierba carmín

Barbara Barker
1968 Torbjörn Caspersson, L. Zech, Bandas Q descritas en V. Faba, Trillium, y hámster chino
mi. Modest, G. Foley y
U. Wagh
1969 Herbert Lubs Describió por primera vez el X frágil en familias

Cuadro 2.1 ( Continuado)
Año Investigador Descubrimiento
1969 Joseph Gall y Se describió por primera vez la hibridación in situ utilizando sondas radiactivas.
Mary Lou pardue
1969-1970 La amniocentesis se utiliza clínicamente para el diagnóstico citogenético Se
1970 torbjörn Caspersson, describen las primeras bandas Q en humanos

Lore Zech, C. Johansson
1971 ISCN tercer encuentro de nomenclatura de cromosomas humanos (parís,

Francia). Primera reunión para describir las bandas para ISCN
1971 adrian Sumner; S. r. patil; Describió varios métodos de banda G

Maximo Drets y Margery
Shaw; Marina Seabright
1971 Bernard Dutrillaux, bandas R publicadas en EE. UU.

Jerome Lejeune
1973 Janet Rowley Cromosoma ph descrito como en (9; 22), no una deleción de 22q usando
bandas Q
1974 pag. perry y sheldon wolff Tinción de intercambio de cromátidas hermanas descrita con BrdU y
Giemsa
1974 David Cox, Virginia Niewczas‐ Método de recolección in situ descrito

Late, Margaret riffell y John
hamerton
1975 Samuel a. Latt Métodos de bandas de replicación descritos Tinción de
1975 C. Goodpasture y cromosomas con plata descrita con NOr

S. e. florecer
1977 David Peakman, Marilyn Método de recolección in situ de cubreobjetos descrito

Moreton, Barbara Corn,
Arthur Robinson
1979 Jorge Yunis Métodos de bandas G de alta resolución descritos
1980 JG Bauman, J. Wiegant, Primera hibridación in situ con fluoróforos fluorescentes

pag. Borst, pág. van Duijn
1981 pr Langer, aa Waldrop, Sondas marcadas con biotina descritas para la hibridación in situ
Distrito de DC
1981-1984 N. Wake Métodos mejorados para el cultivo de tejidos sólidos mediante disociación de
colagenasa
1982-1983 Z. Kazy; rht Ward; Primeros informes del uso de CVS para el diagnóstico prenatal
B. Brambati y a. Oldrini;
LG Jackson y
JM hahnemann
1986–1988 Daniel pinkel y Joe Gray FISh desarrollado en interfase y metafase
Mediados de los 80 Sistemas de captura / cariotipo automatizados (computarizados)

desarrollados.
1987 Jack Spurbeck Primer método de recolección robótico descrito
1989 hermann ‐ Josef Lüdecke Primera microdisección de cromosomas descrita
1991 una. Kallioniemi, O ‐ p Hibridación genómica comparativa descrita (CGh)
1996 Kallioniemi evelyn Schröck, Cariotipo espectral multicolor descrito
1996 thomas ried affymetrix company Se introdujeron los primeros chips genéticos, también llamados microchips / microarrays.
1999 ICGSe Se estableció el borrador del genoma humano.
2000-2001 Varias empresas Microarrays disponibles comercialmente para análisis citogenético de alta
resolución
Las muestras que se van a cultivar nunca deben congelarse o exponerse a un calor excesivo, ya que se requieren células vivas para el cultivo celular de
preparaciones citogenéticas. La excepción son las células criopreservadas en medios de congelación especiales para mantenerlas viables. La refrigeración es
útil para algunas muestras, especialmente aquellas, como los productos de la concepción, que pueden tener un riesgo de contaminación, pero debido a que
la muestra podría congelarse por accidente a solo unos pocos grados más fría que las temperaturas estándar del refrigerador, y algunos refrigeradores no
están bien controlados. A menudo se recomienda la temperatura ambiente para el almacenamiento y envío de las muestras.
La comunicación entre el laboratorio y el personal de derivación es muy importante cada vez que se envía una muestra clínica, para confirmar
que se cumplen estas variables y requisitos de la muestra, y para obtener un nombre completo del paciente, diagnóstico, motivo de derivación,
fecha de nacimiento, información de facturación. y detalles para la entrega. Muchas decisiones de cultivo, recolección y análisis dependen del
motivo de la derivación y, aunque esto a veces puede ser difícil de obtener, es crucial.
A menos que las agencias reguladoras estatales o federales exijan lo contrario, todas las muestras recibidas por el laboratorio deben tener al
menos dos identificadores. Uno suele ser el nombre del paciente y el otro puede ser la fecha de nacimiento del paciente, el número de historia
clínica y / u otros datos de identificación. Estos identificadores coinciden con la solicitud de pedido. Si llega una muestra sin un nombre de
paciente o un identificador único, muchos laboratorios la rechazan y solicitan otra muestra. Si no se puede obtener otra muestra, el laboratorio
debe mantener registros cuidadosos de las circunstancias y anotar la deficiencia en el informe final. Se debe alertar al remitente sobre muestras
con identificación insuficiente del paciente, y al médico que lo remite, La unidad del hospital o el laboratorio deben proporcionar un formulario de
autorización firmado que verifique y acepte la responsabilidad de la identificación de la muestra antes de que se procese por completo. Sin
embargo, en determinadas situaciones, un rechazo o una demora en el procesamiento puede no ser lo mejor para el paciente (p. Ej., Tumor
cerebral), o cuando la muestra se haya obtenido mediante un procedimiento invasivo o insustituible (p. Ej., Líquido amniótico, médula ósea). , o
tejido tumoral sólido). A menos que su centro indique lo contrario, el laboratorio puede optar por aceptar la muestra para su procesamiento si la
persona que recolecta la muestra puede confirmar irrefutablemente la identificación de la muestra, y la oficina o el laboratorio remitente envía un
formulario de autorización al laboratorio de citogenética. Se deben mantener registros cuidadosos de las circunstancias y se debe anotar la
deficiencia en el informe final.
Las muestras recibidas para pruebas genéticas son ordenadas por el médico; por lo tanto, en la mayoría de los casos, el laboratorio de
citogenética que realiza la prueba no ve al paciente. Esto se convierte en un problema cuando se requieren formularios de consentimiento
informado, especialmente para las pruebas genéticas prenatales. El consentimiento informado confirma que el paciente fue informado no solo del
motivo y lo que se espera del procedimiento propuesto, sino también de los riesgos involucrados, los beneficios proyectados y las alternativas
disponibles. El médico generalmente es quien explica la prueba al paciente, y el paciente debe firmar el formulario de consentimiento informado
antes de realizar el procedimiento; sin embargo, no siempre se envía una copia de este consentimiento firmado al laboratorio de citogenética. Si
el formulario lo prepara el médico, también puede no incluir información pertinente a la prueba específica que está realizando la citogenética; por
lo tanto, es importante que los directores de laboratorio, junto con el personal legal de la institución, revisen el contenido de todos los formularios
de consentimiento informado para sus pruebas específicas a fin de garantizar que se haya cubierto la información adecuada y que se mantenga
una copia para referencia en el laboratorio. Si no se envía una copia del formulario firmado al laboratorio con la muestra ni se envía por fax al
solicitar la prueba, el personal del laboratorio debe idear algún método mediante el cual el médico pueda indicar que se firmó un consentimiento
informado para ese procedimiento en particular, y que, en el caso de que el laboratorio requiera una copia del formulario para verificación (por
ejemplo, inspección de laboratorio), el médico proporcionará la copia o imagen escaneada del documento dentro de un tiempo especificado. Si el
resultado de una prueba enviada para el análisis de cromosomas constitucionales es anormal o cuestionable, en el informe final se debe
recomendar la asesoría genética prenatal o posnatal, para ayudar a los pacientes a comprender sus opciones y responder cualquier pregunta que
puedan tener. . Las situaciones neoplásicas generalmente son manejadas por el oncólogo, pero también pueden derivar a los pacientes para
asesoramiento genético si fuera útil para el paciente.
Registro de muestras
Una vez que la muestra se ha recibido correctamente, se debe registrar en el registro del laboratorio, ya sea en forma de libro o en computadora,
y se le debe asignar un número de acceso único, generalmente consecutivo. El formato del número de acceso es diseñado por la gerencia del
laboratorio para cumplir con todas las pautas reglamentarias y estatales. Algunas instituciones incorporan letras que indican el tipo de muestra y
un prefijo numérico para indicar el año, por ejemplo, BM ‐ 15‐001531 podría indicar la muestra de médula ósea 1531a recibida en 2015. El registro
o la hoja de trabajo del sistema debe tener al menos el número de acceso del laboratorio y dos identificadores de paciente, por ejemplo, nombre
del paciente, nombre del médico, fecha de nacimiento, tipo de muestra y fecha de recepción en el laboratorio. Todo el papeleo y los contenedores
de muestras deben revisarse dos veces para asegurarse de que cada uno se haya registrado y etiquetado correctamente. La fecha de recepción
debe compararse con la fecha de servicio o la fecha en que se adquirió la muestra. Se debe registrar la hora del día en que se recibió la muestra,
ya que puede explicar cómo se cultivaron y recolectaron posteriormente las muestras, y puede ayudar a diferenciar entre varias muestras de un
paciente, etc. Cualquier retraso inusual en la recepción de la muestra y otras variables, como el estado de la muestra , o cualquier otra
observación que pueda comprometer la viabilidad de la muestra.
Una vez que se registra la muestra, se debe asignar un cronograma de cultivo y recolección de acuerdo con el tipo de muestra y la
urgencia de los resultados, así como el día de la semana y la hora del día en que se recibe en el laboratorio. Las muestras que se dividen
espontáneamente, como la médula ósea o los tumores sólidos, pueden prepararse para una recolección directa (sin cultivar) y también
pueden cultivarse durante uno o más días. Otras muestras pueden requerir cultivo durante varios días a una semana o dos para
estimular el crecimiento, algunas con mitógenos (p. Ej., Linfocitos sanguíneos), algunas después de la dispersión mecánica (picado con
tijeras o bisturís o forzando el tejido a través de una malla, como en el caso de tumores sólidos y ganglios linfáticos) o desagregación
enzimática con colagenasa y / o tripsina (p. ej., tejidos sólidos, tumores, vellosidades coriónicas) (consulte los capítulos individuales para
obtener más detalles).
Una vez que la muestra se ha cultivado y está lista para procesar para el análisis citogenético, se realiza un protocolo de recolección específico para el tipo de muestra
y el método de cultivo (por ejemplo, recolección in situ versus recolección en suspensión).
2.3.2 Métodos de cultivo
Con la excepción de algunos tipos de muestras, como las muestras FISH de interfase STAT en células recolectadas directamente, será necesario un período
de cultivo antes de que se pueda recolectar la muestra. Este período varía de un día a varias semanas, según el tipo de muestra. Por ejemplo, las células de la
médula ósea se cultivarían de 0 a 5 días, mientras que los fibroblastos de la piel necesitarían de 1 a 3 semanas para crecer lo suficiente como para ser
recolectados. Otras condiciones, como el tamaño de la muestra, la viabilidad y la urgencia del resultado, también pueden afectar la duración del cultivo. La
duración adecuada del cultivo puede ser fundamental para obtener los resultados, porque las líneas de células tumorales anormales pueden perderse con el
tiempo o, como ocurre con algunas médulas óseas, pueden aparecer solo después de unos días en cultivo. El cultivo se realiza mediante estrictas técnicas
asépticas, porque los microbios provocarán fallos en el cultivo.
Hay dos categorías generales de cultivo de tejidos:
1. Cultivos en suspensión, como médula ósea y sangre, y algunos tipos de tumores, como algunos neuroblastomas y la mayoría de
linfomas, que están suspendidos en medio de crecimiento y no se adhieren al vaso de cultivo; y
2. Cultivos de monocapa adheridos o cultivos dependientes de anclaje, como amniocitos, fibroblastos cutáneos, etc., que requieren adherencia a
una superficie de cultivo para crecer.
Estos dos patrones de crecimiento a menudo se denominan cultivos a corto y largo plazo, pero estas categorías son menos distintas ahora que los cultivos "a
largo plazo" a menudo se recolectan en 2 a 3 días (cultivos adheridos a tumores sólidos) a 6 a 7 días ( amniocitos in situ). Los ganglios linfáticos y los tumores
sólidos se pueden configurar tanto en suspensión como en cultivos adjuntos para afecciones específicas, como con un diagnóstico diferencial de linfoma
frente a sarcoma, o cuando el tipo de tumor requiere ambos tipos de cultivo (p. Ej., Neuroblastoma u otros tumores de células azules redondas ). Estos
cultivos se pueden incubar en un sistema abierto o cerrado. Los cultivos abiertos pueden intercambiar gases con la atmósfera que los rodea. Los sistemas
cerrados están sellados herméticamente y no intercambian gases con la atmósfera. Los sistemas cerrados tienen menos posibilidades de que la
contaminación microbiana ingrese al cultivo, pero los sistemas abiertos permiten que el cultivo libere subproductos del metabolismo en fase gaseosa, que
pueden ser tóxicos para las células. Los cultivos abiertos son ventajosos para los métodos de cultivo y recolección in situ, en los que los cultivos se cultivan y
cosechan en cubreobjetos o portaobjetos que se insertan en placas de Petri o matraces comerciales para portaobjetos (Figura 2.5).
El pH de los cultivos, como se indica mediante un tampón de bicarbonato en el medio, se puede mantener mediante
1. permitiendo el CO 2 y otros metabolitos de las células cultivadas para ajustar el pH del cultivo (sistema cerrado);
2. gasear el matraz o tubo de cultivo de un recipiente con la mezcla de gases deseada y cerrarlo herméticamente para evitar intercambios de gases
(sistema cerrado); o
3. Proporcionar a la incubadora un flujo constante y controlado de los gases deseados de los tanques de gas externos (sistema abierto).
Los sistemas cerrados a menudo se colocan en incubadoras con un flujo de gas controlado como respaldo contra fugas en el matraz. El gas habitual
mezclas son 5% CO 2 en el aire ambiente, que se compone de aproximadamente un 15-18% de oxígeno o un 5% de CO 2 en 2–5% O 2 con el
resto (93–95%) de N inerte 2. El 5% de CO 2 ajusta el medio de cultivo a pH 7,25-7,40 a través del tampón en el medio, y la baja‐
fórmula de oxígeno del 2–5% O 2 Se ha demostrado que la mezcla aumenta la tasa de crecimiento de muchos tipos de células.
Algunos cultivos celulares se cultivan sin oxígeno y pueden gasearse solo con nitrógeno. Un ejemplo son las líneas celulares transformadas.
de pacientes con anemia de Fanconi, que son sensibles a la presencia de oxígeno y pueden no crecer en su presencia. Medios de comunicación
con sistemas tampón distintos del CO 2 - equilibrio de bicarbonato también están disponibles, por ejemplo, tampón HEPES. Este tipo
de tampón es útil para transportar células o tejidos al laboratorio cuando el CO 2 el componente no está disponible y los medios estándar perderían
el pH. Los cultivos de células humanas derivados de tejido humano se cultivan mejor a la temperatura corporal fisiológica
de 37 a 37,5 ° C, ya que las curvas de crecimiento descienden bruscamente por encima de los 38 ° C, lo que a menudo provoca la muerte celular. Las incubadoras deben
tener alarmas para alertar al personal sobre temperaturas extremas y registros de temperatura mínima-máxima para monitorear las fluctuaciones diarias (consulte el
Capítulo 20, Temas seleccionados sobre seguridad, mantenimiento de equipos y cumplimiento para el laboratorio de citogenética).
Figura 2.5 artículos de plástico para cultivo de tejidos. Los materiales plásticos de cultivo de tejidos habituales utilizados por los métodos de cultivo citogenético
incluyen el matraz t-75 (a) y el matraz t-25 (f), que son apropiados para el cultivo de cultivos adheridos o en suspensión, al igual que el portaobjetos de cámara (c) y las
placas de Petri (b ,D). la placa de Petri más pequeña (d) también viene con un cubreobjetos en el interior para cultivo y recolección in situ. El tubo de centrífuga cónico
de 15 ml (e) se usa para cultivar (en cultivo) y recolectar sangre, médula ósea y otros cultivos en suspensión, y para recolectar células adheridas que se han puesto en
suspensión para una recolección.
Cuadro 2.2 medios de cultivo de tejidos comúnmente utilizados para citogenética
Medio Tipo de cultura Comentarios
rpMI 1640 Sangre, médula ósea, cultivo de tumores sólidos Desarrollado para linfocitos, pero se ha utilizado para todas
las aplicaciones.
rpMI 1603 Sangre, médula ósea Yunis recomendó este medio para la profase; Difícil de
encontrar
MeM o águila todo Medio mínimo esencial

MeM
MeM alfa todo enriquecido; disponible con ribonucleósidos,
desoxirribonucleósidos
DMe todo Águila modificada de Dulbecco
jamón F10 todo medio enriquecido con colorante rojo bajo en fenol
jamón F12 todo medio enriquecido con colorante rojo bajo en fenol
Medio 199 o X frágil (históricamente), profase Bajo ácido fólico

tC199
Chang Originalmente un medio prenatal con factores de También se puede utilizar para pOC, cultivos de células tumorales
crecimiento; ahora disponible específicamente para
amnio, médula ósea y hemocultivos
amnioMaX amnio, CVS Puede utilizarse para pOC, cultivos de células tumorales y
5a de McCoy todo muy enriquecido; bueno para el medio de transporte
MarrowMaX Médula ósea, sangre de dobladillo / onc listo para usar, completamente suplementado con suero, un medio
condicionado del estroma humano, antibióticos y l ‐Glutamina
Hay decenas de medios de cultivo de tejidos disponibles. Los medios más utilizados se enumeran en la Tabla 2.2. El medio basal se complementa con
suero para proteínas y factores de crecimiento. La mayoría de los laboratorios prefieren el suero fetal bovino. El suero de ternero recién nacido es más
barato, pero puede ser tóxico; El suero de ternero recién nacido sin calostro es menos costoso y puede ser tan eficaz como el suero bovino fetal. La
concentración de suero en el medio completo varía de 2% a 20%, con más suero produciendo un crecimiento más rápido en algunos casos.
Sin embargo, algunas células son sensibles a la presencia de suero bovino fetal y es posible que no se dividan tan bien con concentraciones altas
(p. Ej., Cultivos de neuroblastoma, linfocitos) y otras pueden llegar con suero (p. Ej., Muestras de sangre) y es posible que no requieran
concentración de suero en el medio de cultivo tan alta como lo hacen otros tipos de muestras. Otros suplementos de medios incluyen antibióticos,
l ‐ glutamina y adiciones opcionales, como selenio, insulina y medio acondicionado para tumores de células gigantes (consulte los capítulos
específicos para conocer los métodos de cultivo). Una vez suplementado, el medio se denomina medio completo.
Los cultivos que son valiosos o que pueden ser necesarios para uso futuro pueden congelarse en medio con dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol al 5-10%
para prevenir la formación de cristales de hielo y mantenerse en nitrógeno líquido hasta el momento en que se necesiten.
2.3.3 Cosecha
Una vez que las células crecen espontáneamente o en cultivo, deben procesarse (recolectarse) para obtener metafases para el estudio. La
recolección de células para análisis citogenético es un procedimiento escalonado que puede realizarse y a menudo se logra mediante
instrumentación automatizada. Sin embargo, el éxito de la preparación final dependerá del ingenio y la habilidad del tecnólogo. Controlar y
solucionar problemas y variables inevitables, como la densidad celular (demasiado alta o demasiado baja), bajo índice mitótico, mala calidad
cromosómica relacionada con la enfermedad, tipos de células inusuales y cambios ambientales a menudo requiere pensamiento, imaginación e
inventiva.
Las tres características constantes del protocolo de recolección en metafase son la detención mitótica, generalmente con Colcemid®;
tratamiento hipotónico, generalmente con soluciones de KCl, citrato de sodio o combinaciones de estas sales; y fijación, generalmente con una
solución de metanol-ácido acético 3: 1. Sin embargo, existen varias otras opciones variables, que dependerían del tipo de cultivo que se esté
recolectando o del tipo de resultados más deseados.
2.3.4 Eliminación de células adheridas y pasos de centrifugación
Después de la detención mitótica y justo antes del uso de los pasos hipotónico y fijador, un paso opcional para las células adheridas
destinadas a una cosecha en suspensión es la eliminación de las células mitóticas por métodos mecánicos (golpear los frascos con
fuerza en la mesa o raspar con un policía de goma) o por métodos enzimáticos. Esto último se logra comúnmente con soluciones de
tripsina y / o EDTA. Esta eliminación mecánica / enzimática solo sería necesaria para las células que crecen adheridas a la superficie del
matraz o plato. Una ventaja de la eliminación mecánica es que las células mitóticas se desprenden antes que las células que no se
dividen, y tales métodos enriquecen la cosecha de células en metafase dejando atrás las células en interfase. De cualquier manera, el
cultivo se puede volver a alimentar y volver a incubar para un estudio adicional, siempre que el agente de detención mitótico utilizado
sea reversible. Colchicina, por ejemplo,
Otro paso variable es la centrifugación, que se emplea durante las cosechas de cultivos en suspensión para cambiar de una solución a la siguiente. Cada
solución, como el medio de cultivo, la solución hipotónica y el fijador, se elimina después de la centrifugación. Por el contrario, la recolección in situ se logra
agregando las soluciones de recolección (hipotónicas y fijadoras) a las células que crecen en cubreobjetos o portaobjetos dentro de placas de Petri o en
portaobjetos de cámara, y dado que las células se mantienen en su lugar mediante anclaje a la superficie de crecimiento, no hay centrifugación entre pasos
es necesario. Algunos laboratorios han modificado el método de recolección in situ para trabajar con cultivos en suspensión de médula ósea en placas de
Petri, porque las células generalmente se depositan en el fondo de la placa; si el pipeteo se realiza con cuidado, las células no se alteran.
La centrifugación nunca se completa y varias células permanecen en el sobrenadante o se pierden debido al daño de las fuerzas de cizallamiento entre
las células o con las paredes del tubo de centrífuga. Es por eso que el número de pasos de centrifugación debe mantenerse al mínimo. También es la razón
por la que el método de recolección in situ puede producir más metafases que los cultivos similares de las recolecciones en suspensión. La velocidad, o
revoluciones por minuto (RPM), de centrifugación requerida para que se recuperen la mayoría de las células depende del radio del brazo de la centrífuga.
Una centrífuga con 10 pulg. El radio produce densidades más altas a 1000 RPM que una centrífuga con una centrífuga de 6 pulg. brazo tendría el mismo
número de revoluciones, porque el radio más grande viaja más lejos (más rápido) por revolución. La ecuación para calcular la gravedad de una centrífuga
dada a una velocidad dada en revoluciones por minuto es
gramo1,118 10 5 RS
dónde g = fuerza centrífuga relativa (gravedades), R = radio de rotación en centímetros (distancia desde el centro de rotación hasta el centro del cucharón), y S
= velocidad de rotación (RPM).
Por lo tanto, las gravedades que experimentará una célula a 1000 RPM en una centrífuga con 4 pulgadas. (10 cm) de radio es de aproximadamente 110, y las
gravedades que experimentaría la misma celda en una centrífuga con una centrífuga de 6 pulg. (15 cm) de radio a 1000 RPM es de aproximadamente 170. Esto puede ser
importante cuando se utiliza una nueva centrífuga con un diseño diferente, ya que la diferencia en la gravedad (fuerza centrífuga) puede marcar una diferencia en el
rendimiento, ya sea por una migración incompleta a la pellet (demasiado lento) o por rotura debido a fuerzas de cizallamiento (demasiado rápido).
De los pasos de recolección, el que generalmente se considera el más importante es la solución hipotónica porque afecta la extensión, el ancho y la
separación de las cromátidas y, en la sangre y la médula ósea, la eliminación de los glóbulos rojos. Sin embargo, la diseminación cromosómica y la
morfología también están controladas por la concentración de Colcemid® en un alto grado [17]. Muchos de los llamados problemas hipotónicos en la
propagación celular son en realidad problemas de Colcemid® (Figura 2.6). La densidad del cultivo celular y las variables de fabricación de portaobjetos,
incluida la calidad del portaobjetos de vidrio, también son igualmente importantes para la propagación y pueden ser responsables de los problemas de
propagación. Las permutaciones de todos los pasos afectan la calidad del producto final.
(a) (B)
(C) (D)
Figura 2.6 Colcemid ® efecto de la concentración sobre la calidad de los cromosomas sanguíneos. los siguientes ejemplos muestran células sanguíneas
representativas de un Colcemid ® Experimento usando varias concentraciones de Colcemid ® por 30 minutos. (a) Sin Colcemid ® adicional. El índice mitótico
fue muy bajo, porque no se acumularon mitosis. Los cromosomas en metafase están doblados y los cromosomas no pueden extenderse debido al efecto
del huso; (b) 0,02 μg / ml de Colcemid ®. El índice mitótico en el portaobjetos fue mejor, es evidente una menor flexión de los cromosomas y la
propagación mejora debido al envenenamiento del huso; (c) 0,05 μg / ml de Colcemid ®. Los cromosomas muestran una mejor distribución y son rectos,
pero comienzan a acortarse y muestran menos bandas; (d) 0,1 μg / ml de Colcemid ®. El índice mitótico fue muy alto (no se muestra) porque hay suficiente
Colcemid ® moléculas para envenenar todos los microtúbulos de los husos de todas las células del cultivo. además, los cromosomas están bien
diseminados y tienen pocos cromosomas cruzados. sin embargo, los cromosomas están muy contraídos y muchas anomalías pequeñas, como las
deleciones de prader-Willi y DiGeorge, no serían detectables a este nivel de banda.
2.3.5 Paro mitótico: Colcemid ®

El primer paso en la mayoría de los procedimientos de recolección es detener las células en la etapa mitótica requerida para el análisis citogenético estándar: metafase. El
efecto del supresor mitótico Colcemid® más comúnmente utilizado es prevenir la formación del aparato de fibras del huso, que normalmente tiraría de las cromátidas
hermanas hacia polos opuestos para su incorporación en las dos células hijas. Colcemid® también provoca condensación cromosómica, proceso que se acentúa al
aumentar el tiempo de exposición y la concentración. Los laboratorios de citogenética modernos se esfuerzan por obtener cromosomas de longitud media a muy larga
para aumentar la posibilidad de detectar pequeños reordenamientos, por lo que la dosis y la exposición a Colcemid® a menudo se reducen al mínimo. Sin embargo, La
comprensión de los efectos de Colcemid® puede permitir al tecnólogo variar la dosis y el tiempo de exposición y aún así maximizar la calidad y cantidad de células
mitóticas en la cosecha, según el cultivo y el tipo de cosecha, el tipo de estudio deseado y otras variables. . Los efectos de condensación que ocurren con exposiciones más
prolongadas parecen ser mayores con ciertos tipos de células, como sangre, médula ósea y CVS, que con otros (amniocitos, tumores sólidos), y pueden estar al menos
parcialmente relacionados con el tiempo del ciclo celular y Estado de enfermedad. Además, algunos tipos de células son más sensibles a la concentración de Colcemid®
que otros. Para muchos cultivos adheridos, las células de crecimiento más lento parecen tolerar tiempos de Colcemid® más largos. Este efecto de condensación de
Colcemid® se mitiga con el uso de agentes anticontracción, como el bromuro de etidio (EB), 5 ‐ bromo ‐ 2 el tipo de estudio deseado y otras variables. Los efectos de
condensación que ocurren con exposiciones más prolongadas parecen ser mayores con ciertos tipos de células, como sangre, médula ósea y CVS, que con otros
(amniocitos, tumores sólidos), y pueden estar relacionados, al menos en parte, con el tiempo del ciclo celular y Estado de enfermedad. Además, algunos tipos de células
son más sensibles a la concentración de Colcemid® que otros. Para muchos cultivos adheridos, las células de crecimiento más lento parecen tolerar tiempos de Colcemid® más largos. Este efec
El efecto de contracción dependiente de la dosis de Colcemid® es bien conocido [17-19], pero el aumento de la dosis de Colcemid® también aumenta
drásticamente el índice mitótico, endereza los cromosomas, afila los bordes de las cromátidas y aumenta la propagación de los cromosomas a medida que
los libera del aparato mitótico [ 17-21] (ver Figura 2.6). Los experimentos en nuestro laboratorio sugieren que a medida que la concentración de Colcemid®
aumenta de0.01 μ g / mL hasta 0,1 μ g / mL, existe un efecto de fusión de la banda G, de modo que los cromosomas con una apariencia larga no tienen tantas
subbandas como las que se ven en la misma longitud física con dosis más bajas. Consulte la Tabla 2.3 para conocer las concentraciones de Colcemid® en
varias dosis.
La concentración óptima para cada tipo de tejido debe probarse para cada laboratorio, y Colcemid® debe agregarse con una micropipeta a
volúmenes conocidos de medio en el cultivo para controlar estrictamente la concentración. La concentración se puede aumentar en presencia de
EB u otros agentes anticontracción (ver 2.3.9, Métodos anticontracción cromosómica más adelante). De hecho, la EB hace que los cromosomas se
propaguen pobremente [22], y los experimentos en nuestro laboratorio llevaron a la conclusión de que la propagación mejora dramáticamente
usando 0.05 μ g / mL de Colcemid® con EB superior al observado con 0.02 μ g / mL de Colcemid® con EB (ver Figura 2.7) en cultivos tumorales.
Colcemid® es un análogo sintético de la colchicina, un alcaloide derivado del azafrán de otoño (ver Figura 2.2). Algunos laboratorios todavía
prefieren la colchicina, que es más tóxica y, por lo tanto, puede retardar la velocidad del ciclo celular y producir cromosomas más largos. Algunos
cultivos pueden dejar de dividirse y no producir metafases debido al efecto tóxico de la colchicina, aunque esto no es común. Si se sospecha que
un cultivo no es tan mitótico como debería ser cuando se recolecta con colchicina, es posible que Colcemid® sea una mejor opción. Velban (sulfato
de vinblastina) también se usa para algunos o todos los tejidos en algunos laboratorios de citogenética, y es un buen sustituto en cultivos
tumorales y otras muestras difíciles cuando Colcemid® parece ineficaz.
A menudo, la detención mitótica se atribuye a la contracción de los cromosomas, pero pueden estar involucrados otros factores. En los cultivos de
sangre y médula ósea, la inoculación excesiva puede dar lugar a una reducción del medio y un aumento de los subproductos metabólicos que provocan una
contracción cromosómica irreversible. Las variables de fabricación de portaobjetos, como las suspensiones de células que están demasiado concentradas o
contienen demasiados desechos, dan como resultado metafases abarrotadas que parecen más contraídas que las células de los portaobjetos hechos a partir
de suspensiones más diluidas del mismo sedimento. En nuestra experiencia, las muestras de pacientes comprometidos, como leucémicos, pacientes tratados
con fármacos y pacientes de cuidados intensivos neonatales, siempre pueden parecer contraídos a pesar de nuestros mejores esfuerzos. El tecnólogo
experimentado aprende a utilizar todas las herramientas disponibles para garantizar los mejores resultados posibles, y Colcemid® es uno de los más
importantes.
2.3.6 Tratamiento hipotónico
El segundo paso importante en la recolección de células es el tratamiento con una solución salina hipotónica para aumentar el volumen celular (Figura 2.8) de
modo que los cromosomas tengan el espacio adecuado para extenderse durante la preparación del portaobjetos. Dado que la membrana celular es
semipermeable, el agua entra o sale lentamente de la célula por ósmosis, lo que iguala la concentración en ambos lados de la membrana. Por lo tanto, si la
concentración de la solución en el exterior de la célula es mayor que en el interior (hipertónica), la célula perderá agua y se encogerá. Alternativamente, si la
concentración fuera de la célula es menor que dentro de la célula (hipotónica), absorberá agua y se hinchará. Las soluciones hipotónicas funcionan de esta
manera, creando un gradiente de concentración a través de la membrana citoplasmática, de modo que el agua ingresa por ósmosis, aunque también puede
estar involucrado el transporte activo [19]. Si se envenena la bomba de potasio, las células no se hinchan [19]. En la tabla 2.4 se enumeran varias soluciones
hipotónicas y sus usos.
(a) (B)
(C)
Figura 2.7 Colcemid ® y el efecto de la concentración de bromuro de etidio (eB) sobre las células de melanoma. células representativas de un
experimento con células de melanoma. (a) cosechado con 0.02 μ g / ml de Colcemid ® y sin eB. (b) cosechado con 0.02 μ g / mL de Colcemid ® y 5 μ g / mL de
eB. Los cromosomas son más largos que sin eB, pero tienden a agruparse y cruzarse entre sí. (c) cosechado con 0.05 μ g / mL de Colcemid ® y 5 μ g / mL de
eB. esta concentración de Colcemid ® mitiga el efecto de agrupamiento de eB y revela una mejor resolución de banda para cromosomas anormales que
sin eB.
El precalentamiento de la solución hipotónica a 37 ° C puede aumentar la eficacia al acelerar el transporte de agua a través de la membrana celular y
posiblemente al ablandar la membrana citoplasmática, que tiene un componente lipídico, lo que le confiere una mayor capacidad de estiramiento. El tipo de
sales utilizadas en el hipotónico puede afectar el ancho y, a veces, la longitud de las cromátidas. El citrato de sodio, por ejemplo, a menudo produce
cromátidas más anchas que el KCl, y el hipotónico de Ohnuki suele producir cromátidas más largas que el KCl.
Muchos tipos de células son sensibles al tratamiento hipotónico, por ejemplo, los tumores sólidos o la leucemia linfocítica aguda (LLA de la médula ósea),
algunos se dañan fácilmente con el tratamiento excesivo y otros son resistentes a la hinchazón. En nuestras manos, los mejores resultados se obtienen
cuando el volumen hipotónico y el tiempo de tratamiento se mantienen en el nivel efectivo más bajo. Creemos que la mayoría de las células parecen
responder bien en los primeros 10 a 20 minutos de exposición. Problemas debidos a grandes volúmenes de solución hipotónica (excluyendo in situ
Cuadro 2.3 Colcemid ® concentraciones
μ g / mL Microlitros para agregar (por cultivo de 5 ml) Equivalentes de jeringa (aguja 25G)
0,05 5 ½ gota
0,02 10 1 gota
0,05 25 2 ½ gotas
0,1 50 5 gotas
0,2 100 10 gotas
(a) (B)
(C) (D)
Figura 2.8 acción hipotónica sobre las células tumorales en KCl 0,075 M. (a) Dentro de los 3 minutos posteriores a la adición de la solución hipotónica, las células no
han comenzado a hincharse. (b) a los 10 minutos de duración hipotónica, las células duplican su volumen y la membrana se estira pero sigue siendo fuerte. (c, d)
después de 30 minutos y 45 minutos de hipotonía, respectivamente, las células han comenzado a perder integridad y colapsar bajo el peso del cubreobjetos. se ha
abierto un agujero en esta celda (d) y el contenido citoplásmico está saliendo. Si se tratara de una célula en metafase, con la envoltura nuclear desmontada, algunos
de los cromosomas podrían filtrarse por el orificio, lo que provocaría hipodiploidía o un índice mitótico reducido.
cosechas) pueden incluir la pérdida de células mitóticas debido a una mayor fragilidad durante la centrifugación, así como una migración incompleta al
sedimento. Las exposiciones prolongadas a hipotónicos pueden causar áreas débiles en la membrana citoplasmática (ver Figura 2.8) que, si estallan en
cualquier punto, permitirán que escapen algunos o todos los cromosomas. Esto puede conducir a un índice mitótico (falso) bajo, cromosomas dispersos,
metafases parciales o células “implosionadas” apretadas. Holmquist y Motara [19] informan que después de un largo período de incubación hipotónica, las
células vuelven a su tamaño original.
Cuadro 2.4 Fórmulas para soluciones hipotónicas
Solución Fórmula Tipo de cosecha habitual
KCl 0,075 M (0,56%) a 5,59 g / L todo

0,4% de KCl 4g/L Células neoplásicas para una mayor
propagación.
ChS (0.4% KCl con 3 g de KCl + 4,8 g de hepeS + 0,2 g de eGta / L, pH 7,4 Solución hipotónica para el cáncer
eGta y hepeS)
THC B 9 partes de KCl 0,075 M, 1 parte de tripsina-eDta al 0,25%, Células neoplásicas: tripsina / hipotónica /
0,08 μ g / ml de Colcemid ® Colcemid ® para aumentar la difusión,
la morfología
Citrato de sodio C
0,7% 7g/L todos los tipos de células adheridas,

especialmente amniocitos
0,8% 8g/L
1,0% 10 g / L
Citrato de sodio y Muchas combinaciones de varias concentraciones amniocitos, fibroblastos

Mezclas de KCl de KCl, citrato de sodio, suero diluido o medio
Diluir BSS de Hanks 1 parte de madejas: 3 a 6 partes de agua destilada 1 tipos de células adjuntas
Diluir suero (ternero, parte de suero: 3 a 6 partes de agua destilada tipos de células adjuntas
fetal bovino)
Hipotónico de Ohnuki 4,1 g de KCl en 1 L de agua + 2,33 g de NaNO 3 en 500 mL

agua + 0,9 g Ch 3 COONa D ( NaC 2 h 3 O 2) en 200 ml de agua o
5 ml de nitrato de sodio 55 mM, 2 ml de 55 mM
acetato de sodio, 10 ml de cloruro de potasio 55 mM
Muchos métodos requieren la adición de unas gotas a varios mililitros de fijador al hipotónico al final del período de incubación. El método de
recolección in situ requiere este paso "prefijo" para ayudar a evitar que las células mitóticas se desprendan durante la adición de la primera
fijación. Esta prefijación inicia el proceso de endurecimiento de las células y preservación de los cromosomas, y hace que las células sean más
resistentes al daño por centrifugación y al choque del fijador puro. También fomenta la lisis de los glóbulos rojos presentes y, dado que las células
lisadas no migran al sedimento, el resultado es una preparación celular más limpia después de la centrifugación. Sin embargo, los glóbulos rojos
nucleados, como se encuentran en algunas muestras de sangre (p. Ej., Sangre de recién nacido), así como la sangre de vertebrados inferiores
(aves, reptiles y peces), no se lisan en forma hipotónica o fijador.
2.3.7 Fijación
La tercera característica constante de la recolección de cromosomas es la fijación de las células. Este proceso elimina el agua de las
células, matándolas y preservándolas, endureciendo las membranas y la cromatina y preparando los cromosomas para el procedimiento
de anillado. Los patrones de bandas no son posibles en los cromosomas fijados con formalina, pero el metanol-ácido acético 3: 1 más
suave cambia menos la estructura de la cromatina, o de una manera diferente, lo que permite la formación de bandas posteriores. El
primer fijador puede crear turbulencias al principio cuando se agrega a la solución hipotónica remanente. Durante este período de
turbulencia, el fijador generalmente se agrega lentamente, o las células en metafase pueden perderse por rotura. Luego, el fijador se
agrega más rápidamente. Es importante mezclar suave pero completamente el sedimento celular en suspensión para evitar la
aglomeración celular irreversible. Una vez en el primer fijador,
Después de la primera fijación, las células se pueden dejar reposar durante algún tiempo para permitir que se endurezcan antes de
manipulaciones adicionales. El fijador frío puede mejorar la morfología cromosómica y muchos protocolos requieren de 1 a 24 horas para el
primer fijador y / o la fijación final en el refrigerador o congelador. Una vez que las células están en el primer fijador, pueden almacenarse durante
días o semanas o más antes de que se hagan los portaobjetos. La composición del fijador de metanol-ácido acético cambiará con el tiempo, al
principio se volverá más ácida y eventualmente se contaminará con acetatos a medida que se produce una reacción entre el ácido y el metanol;
esta es la razón por la que tantos protocolos requieren un fijador recién hecho. El fijador también absorbe agua del aire, lo que disminuye sus
propiedades fijas. Este deterioro del fijador también se produce en los sedimentos celulares almacenados.
disminuye el deterioro del fijador y las células se conservan mejor durante períodos más prolongados. El Laboratorio de Citogenética de Mayo
Clinic puede utilizar sedimentos de células muy viejas (hasta 8 años) de médula ósea y hemocultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA) que
se mantuvieron en un congelador a -70 ° C en un criotubo de 1,8 ml.
Ciertos tipos de tubos de plástico se descomponen con un fijador y los subproductos pueden arruinar las células. La experiencia de nuestro
laboratorio y de otros laboratorios es que los tubos de poliestireno comienzan a romperse a los pocos días de la exposición al fijador, mientras
que los tubos de polipropileno parecen resistir bien el fijador.
Para las cosechas de tipo suspensión, la primera fijación puede ser el paso final de la cosecha antes de centrifugar las células y hacer los portaobjetos, si
los sedimentos son pequeños, limpios y sin glóbulos rojos (p. Ej., Amniocitos, tumores sólidos). Se requieren pasos de fijación adicionales para que los
gránulos grandes o contaminados con glóbulos rojos (RBC) eliminen los detritos que interferirían con la preparación de los portaobjetos y las bandas. Las
células con componentes de glóbulos rojos generalmente se lavan con dos cambios adicionales de fijador antes de preparar los portaobjetos.
Cuando se hacen los portaobjetos, si las células no se diseminan bien, también pueden ser útiles pasos de fijación adicionales, especialmente si todavía hay un tinte
marrón en el sobrenadante debido a los glóbulos rojos restantes que no se lisaron completamente.
2.3.8 Cosecha in situ

Cox y col. [23] describió el método de recolección in situ en 1974 utilizando colonias de líquido amniótico que se cultivaron y recolectaron en
placas de Petri. Se quitaron los lados del plato y la superficie de crecimiento celular se pegó a un portaobjetos para microscopía. Peakman y col.
[24] modificó este método para hacer crecer células en cubreobjetos dentro de placas de Petri. De esta manera, los cubreobjetos se recogen in
situ ("en su lugar") en las placas, y se retiran y se colocan en portaobjetos para microscopía. Desarrollaron el método para hacer frente a la
contaminación de células maternales, pero el método se hizo muy popular debido al tiempo de respuesta mejorado y las ventajas del análisis
clonal.
Las ventajas de recolectar células en la superficie de crecimiento (generalmente en un cubreobjetos en una placa de Petri o en un matraz de portaobjetos especial
con tapa extraíble) incluyen lo siguiente:
1. Las cosechas se pueden realizar días antes que con las cosechas en suspensión, lo que mejora los tiempos de respuesta.
2. Los cultivos pueden crecer mejor en la superficie del vidrio que en los artículos de plástico. Esto a veces es cierto para las muestras prenatales y tumorales;
sin embargo, algunas muestras (p. ej., muestras de líquido amniótico muy sanguinolentas) pueden preferir un ambiente de matraz porque diluye los
glóbulos rojos y mejora el contacto de los amniocitos con el material de cultivo.
3. Se puede realizar un análisis clonal para descartar el pseudo-mosaicismo y el artefacto cultural. Hay de uno a tres
amniocitos viables por mililitro de líquido amniótico, con células generalmente menos viables disponibles a medida que la
gestación avanza más allá de las 25 semanas. Cada amniocito tiende a desarrollar una sola colonia, por lo que las
aberraciones cromosómicas que se limitan a una parte de la colonia deben haber ocurrido después de la formación de la
colonia. Por tanto, estas células son artefactos de cultivo espurios y, en la mayoría de los casos, pueden descartarse. Las
aberraciones que ocurren en toda la colonia pueden, por otro lado, representar un verdadero mosaicismo, especialmente si
múltiples colonias de múltiples culturas independientes muestran la misma anomalía de toda la colonia. El análisis clonal
aplica estas ideas para formar reglas para el estudio de cultivos cosechados in situ,
4. La morfología de la colonia parental está disponible para su correlación con los cariotipos. Esto puede ser especialmente útil en estudios de tumores sólidos, para
distinguir colonias de células estromales fibroblásticas (células normales) de colonias tumorales con morfología inusual. Dado que normalmente se encuentran
5. dentro de los utensilios de cultivo con tapas extraíbles, las cosechas in situ pueden automatizarse [25] (véase 2.3.13, Dispositivos de recolección automáticos y
cámaras de preparación de portaobjetos / cámaras de secado).
Normalmente, las cosechas in situ se realizan en cultivos adheridos, ya que el mecanismo que aspira los fluidos de la cosecha eliminaría las células
suspendidas con los materiales desechados. Sin embargo, el laboratorio de Mayo Clinic tiene éxito con un método de recolección automatizado
incluso con cultivos en suspensión de médula ósea, ya que las células deseadas se depositan en el fondo. Aproximadamente el 10-20% de las
células de la médula ósea se extraen durante la recolección, pero las metafases no se pierden de forma selectiva. Los experimentos en ese
laboratorio sugieren que se recuperan significativamente más metafases de médula ósea con las cosechas in situ que en suspensión porque las
frágiles metafases se pierden en los pasos de centrifugación.
Los inconvenientes del sistema in situ incluyen los siguientes:
1. A veces es difícil obtener cultivos adjuntos a densidades óptimas en un momento conveniente. Es posible que las células en metafase en el centro de las
colonias no se propaguen bien, por lo que es importante tener células mitóticas redondeadas alrededor de la periferia de las colonias. A menudo hay
una ventana de 2 días en la duración del cultivo donde las condiciones son óptimas. Sin embargo, es importante no recolectar todos los cultivos el
mismo día para el control de calidad.
2. El cubreobjetos es delicado y se puede romper o dejar caer boca abajo, raspando las células.
3. Puede haber una mayor probabilidad de mezclar cultivos porque los cubreobjetos en sí no suelen estar etiquetados. Muchos protocolos requieren
etiquetar la parte inferior de la placa de Petri porque la parte superior se puede cambiar. Algunos laboratorios han podido etiquetar el cubreobjetos con
una punta de diamante u otro rotulador. Los matraces de portaobjetos (matraces) se etiquetan más fácilmente que los cubreobjetos, y se pueden
etiquetar tanto en la parte superior del matraz de plástico como en la etiqueta del fondo, que se convertirá en el portaobjetos del microscopio cuando se
complete la cosecha y se retire la parte superior.
4. La calidad de la metafase está limitada por el procedimiento: solo se puede hacer un intento por cultivo para extender las células y optimizar la
morfología cromosómica. A menudo, no se dispone de un cultivo de respaldo para un cubreobjetos específico si la recolección o las maniobras de
esparcimiento no tienen éxito. La mayoría de los laboratorios tienen un mecanismo para un cultivo en suspensión de respaldo en caso de necesidad de
FISH, recuentos adicionales, etc., utilizando células de la superficie de la placa de Petri que quedan después de retirar el cubreobjetos o un cultivo en
matraz separado en el mismo lugar. tiempo como los platos.
5. Las placas de Petri pequeñas pueden secarse más rápido que los matraces en situaciones de baja humedad.
Si el crecimiento es demasiado denso al verificar la cosecha, algunos cubreobjetos de cultivo se pueden tripsinizar o raspar para que haya suficiente superficie para un
nuevo crecimiento, y luego se pueden alimentar con medio fresco. Si el tiempo lo permite, el cultivo puede descansar antes de ser inoculado con un inhibidor mitótico
durante la noche para recolectarlo a la mañana siguiente, o dejarlo en cultivo hasta la mañana siguiente, cuando luego se evaluará para su recolección. Debido a que las
colonias se han interrumpido y las células levantadas podrían haberse replantado en una ubicación secundaria, el cultivo resultante se puede usar para el recuento de
células, como en el método del matraz, pero no para el recuento de colonias.
Para cultivos de bajo crecimiento o en riesgo, es importante verificar el crecimiento de colonias alrededor de la periferia interna del plato, fuera de la
superficie del cubreobjetos, antes de agregar Colcemid®. Si hay algún crecimiento de colonia fuera del cubreobjetos que no sea una extensión de una
colonia en el borde del cubreobjetos, el cubreobjetos se puede quitar con cuidado a una nueva placa de Petri para la recolección. Las colonias que crecen del
cubreobjetos en el recipiente original se pueden tripsinizar y replantar en un nuevo cubreobjetos o matraz, y se pueden utilizar como respaldo para los
recuentos, si es necesario. Aunque estas células ya no se pueden agregar al recuento de colonias, el número de colonias que estaban presentes antes de la
tripsinización aún debe anotarse en la hoja de trabajo de la muestra.
La configuración de rutina de un cultivo en matraz de respaldo (in situ o en matraz) es una buena política, tanto como póliza de seguro contra problemas de cosecha
como para otros usos, como envío para análisis de ADN, congelación de células en nitrógeno líquido, etc.
Los pasos de la cosecha in situ incluyen:
1. Adición e incubación de Colcemid® u otra solución de detención mitótica.

2. (a) (Opcional) Eliminación de la mitad del medio de cultivo y adición de un volumen igual de solución hipotónica, y / o (b) Eliminación
de todo el medio de cultivo. Adición de solución hipotónica por un período de tiempo.
3. Por lo general, se agrega una cantidad de fijador (frío o temperatura ambiente) igual al hipotónico durante una breve incubación para ayudar a adherir
las células mitóticas al portaobjetos o cubreobjetos.
4. Eliminación de la solución hipotónica y adición (generalmente lenta) del primer fijador, que se deja reposar durante unos minutos o más para
endurecer y adherir las metafases.
5. De uno a tres cambios adicionales de fijador para eliminar toda el agua posible. Luego, las células se pueden dejar en fijador hasta que sea
conveniente secarlas para preparar los cromosomas.
6. Después de la cosecha, se montan cubreobjetos (con la muestra hacia arriba o hacia abajo) y se etiqueta el portaobjetos. El cubreobjetos puede montarse con las
células hacia abajo (entre el portaobjetos y el cubreobjetos) o con las células hacia arriba (de modo que no sea necesario retirar el cubreobjetos para la tinción
secuencial de las células).
Los pasos críticos para los métodos de recolección in situ son:
1. Tratamiento delicado de cultivos y, a menudo, adición suave de hipotónico y primer fijador para retener las células mitóticas
débilmente adheridas y para evitar que el índice mitótico bajo falso se desprenda, pierda o mueva las células debido al desalojo y
reinserción en otro lugar, lejos del padre. colonia.
2. Consistencia en la cantidad de líquido que queda en el cultivo antes de agregar la siguiente solución. Si se deja mucho medio de
cultivo, el hipotónico es menos efectivo. Grandes cantidades de hipotónico residual hacen que la primera fijación sea menos eficaz
para eliminar el agua. En el paso de secado final (equivalente a hacer un portaobjetos), es esencial eliminar todo el fijador para evitar
que las ondas de fijador secante desalojen las células o las rompan.
El secado celular se discutirá más adelante en este capítulo.

Se puede utilizar un método de recolección in situ modificado para recolectar cantidades muy pequeñas de células de muestras no cultivadas para
estudios FISH. Por ejemplo, los lavados de vejiga que se utilizarán para la interfase FISH pueden concentrarse por centrifugación, colocarse en un
portaobjetos de vidrio en una pequeña gota de líquido, como medio o solución salina, y recolectarse en el portaobjetos drenando la gota de medio,
reemplazándolo con gota de hipotónico, incubando durante unos minutos, agregando fijador, drenando el exceso de líquido y fijando las células
nuevamente. Muchas de las células permanecen en el portaobjetos si el líquido se drena con cuidado. Ciertos tipos de células (p. Ej., Líquido cefalorraquídeo)
también se pueden preparar para FISH en interfase de manera similar, omitiendo el paso hipotónico y pretratando las preparaciones en portaobjetos con
proteasa como pepsina para eliminar la proteína del citoplasma.
2.3.9 Métodos de anticontracción cromosómica
A medida que los cromosomas avanzan a través de las etapas de interfase y profase mitótica hacia la metafase, se condensan a partir de
estructuras largas en forma de cuerdas en cuerpos cada vez más cortos. A medida que se condensan, los patrones de bandas se fusionan, las
subbandas se fusionan en bandas y las bandas principales se fusionan (ver Figura 2.9). Esto sirve para empaquetar la cromatina en pequeñas
unidades ordenadas para su distribución a las dos células hijas, donde vuelven al estado descondensado lo antes posible. La mayoría de las
funciones metabólicas tienen lugar en interfase.
A principios de la década de 1970, el análisis citogenético generalmente se realizaba en cromosomas de metafase media que contenían 300 o
400 bandas por conjunto haploide. En 1976, Yunis informó sobre la primera de varias técnicas para obtener cromosomas alargados con 500-2000
bandas por conjunto haploide [11]. La técnica implicó aumentar la proporción de células de profase tardía y metafase temprana sincronizando las
células con un bloqueo de ametopterina (metotrexato) durante la síntesis, seguido de una liberación de timidina y concentraciones de Colcemid®
mucho más bajas de lo que había sido tradicional hasta ese momento. Las células liberadas en sincronía pueden pasar de la etapa S del ciclo
celular a la metafase temprana, cuando se recolectan.
Esta técnica condujo al descubrimiento de varios síndromes de deleción de cromosomas muy pequeños [12-16,26-29] y fue útil para
definir la naturaleza exacta y los puntos de corte de otras aberraciones cromosómicas. Las técnicas desarrolladas posteriormente con
diferentes sustancias químicas de sincronía y anticontractantes intercaladores de ADN también se utilizaron para mejorar el índice
mitótico, la morfología cromosómica y la calidad de las bandas en todas las etapas de la metafase para sangre, médula ósea, cultivo de
tumores sólidos, líquido amniótico y cultivos de CVS. Yunis et al. [30,31] y algunos otros han utilizado las técnicas para encontrar nuevas
anomalías cromosómicas en muestras leucémicas de médula ósea y otras neoplasias humanas [32,33]. Varios autores introdujeron
variaciones del método de sincronía [31,34-37], y aditivos químicos para prevenir la contracción cromosómica, utilizados solos o en
combinación con sincronía, fueron desarrollados [34,37-44]. En consecuencia, se desarrollaron técnicas para todo tipo de muestras
utilizando exposiciones más breves a concentraciones más bajas de soluciones de detención de la mitosis. La mayoría de los
laboratorios ofrecen ahora prometafase, profase o ambos tipos de análisis de cromosomas para hemocultivos. Esto produjo familiaridad
y apreciación por los cromosomas largos con patrones de bandas más intrincadamente detallados y resultó en una tendencia hacia el
uso de cromosomas más largos en todos los estudios citogenéticos.
Hay dos formas principales de utilizar metodologías de anticontracción cromosómica: para obtener un estudio regular de alta calidad (p. Ej.,
Médula ósea, líquido amniótico y cultivos tumorales) o para obtener cromosomas profase y prometafase (Prader – Willi, Angelman, DiGeorge,
Miller– Síndromes de Dieker) (Figura 2.10a, b). Nuestro laboratorio también ha utilizado un método de sincronía para enriquecer cultivos de
tumores sólidos en busca de células anormales.
Para estudios de profase y prometafase enfocados, donde el médico está cuestionando regiones cromosómicas específicas, el tiempo
requerido para completar el estudio no es mucho más largo que para un estudio regular, si la calidad de la preparación es buena. A menudo, sin
embargo, el estudio no está enfocado, y cada par de cromosomas debe examinarse en homólogos no cruzados ni ocultos. Es mejor analizar
algunas células relativamente más cortas porque algunas inversiones y deleciones pueden presentarse mejor en los cromosomas más cortos
(Figura 2.11).
La calidad de los cromosomas muy largos depende de buenos métodos de tinción y preparación de diapositivas y de fotografías o imágenes
óptimas. Los problemas técnicos más comunes son problemas de creación de diapositivas, sobreripsinización, tinción excesiva, imagen poco
nítida, iluminación de Köhler deficiente (consulte el Capítulo 14, Iluminación de Köhler), uso de papel o película fotográfica de contraste incorrecto
o problemas de imágenes por computadora.
Figura 2.9 Formando bandas en metafase. Cromosoma 11 con bandas G en varios niveles de banda para ilustrar cómo las bandas de profase y
prometafase (derecha) se fusionan para formar bandas de metafase (izquierda).
(a) Paciente 1 Paciente 2
(B)
Figura 2.10 dos usos de los productos químicos anticontracción. (a) para detectar microdeleciones y otras pequeñas aberraciones: se utilizaron dos pacientes con
prader-Willi (deleción del cromosoma 15). Paciente 1 (par de la mano izquierda): La resolución a nivel de banda no es lo suficientemente alta para determinar la
presencia o el alcance de la deleción del cromosoma 15. Paciente 1 (par de la mano derecha): Los cromosomas 15 del mismo paciente están en un nivel de banda
suficientemente alto para determinar la presencia de una deleción en la banda 15q11.2. Paciente 2: esta deleción es de la banda 15q11.2 a través de la banda proximal
q13 (llamada q13.1). Nota: los cromosomas eliminados para ambos pacientes se colocan a la derecha. Ambas deleciones se confirmaron con FISh. (b) se utiliza un
segundo uso de productos químicos anticontracción para obtener una preparación de mayor calidad en muestras que normalmente son deficientes, como médula
ósea y muestras tumorales. esta médula ósea anormal se extrajo con bromuro de etidio y muestra una calidad mejorada.
(a)
(B)
Figura 2.11 ventajas de los cromosomas cortos. Los cromosomas relativamente cortos también son útiles en determinadas situaciones. (a) una inversión
pericéntrica de este cromosoma 6 (izquierda) en el nivel de la banda 700 es difícil de visualizar porque el centrómero no está fuertemente contraído; mientras que
en el nivel de la banda 550 (derecha), es mucho más fácil de visualizar. (b) El síndrome de Smith Magenis es causado por una pequeña deleción en el brazo corto
proximal del cromosoma 17. En niveles de banda más altos (izquierda), la anomalía parece ser más sutil que en niveles más cortos (derecha). esta supresión se
confirmó con FISh.
Existen varios métodos para determinar cuántas bandas por conjunto haploide (BPHS) contiene una célula [45-50]. Sin embargo, el recuento
de bandas sigue siendo bastante subjetivo y no proporciona información sobre qué tan nítidos son los patrones, cuántos cromosomas
superpuestos y doblados están presentes o si la célula muestra las anomalías en cuestión. La mayoría de los laboratorios informan el nivel de
banda de los cariotipos en el informe final, lo cual es muy importante porque da una idea del grado en que el estudio respondió a las preguntas
del médico remitente. Los cromosomas en metafase tardía se encuentran en el nivel <400 BPHS, la metafase media es 400-549 BPHS, la metafase
temprana es 550-699 BPHS, la prometafase tardía es aproximadamente 700-849 BPHS, la prometafase temprana es aproximadamente 850-999
BPHS y la profase está en o más de 1000 BPHS [47] (Figura 2.12). Normalmente, en nuestro laboratorio, neoplásicos
(a) (B)
(C) (D)
Figura 2.12 Células en metafase en varios niveles de bandas. (a) alrededor de 400–550 bandas por conjunto haploide (BphS). esta longitud es aceptable para ciertos
tipos de estudios, como las neoplasias. (b) alrededor de 550 a 700 BphS. este es un nivel con el que la mayoría de las personas se sienten cómodas para analizar
células en el microscopio, y la mayoría de las anomalías serán evidentes en esta etapa. (c, d) 700–850 BphS es generalmente adecuado para microdeleciones mayores
de 3 ~ 5 Mb y otras pequeñas aberraciones.
Cuadro 2.5 Agentes químicos utilizados para producir sincronía celular.
Agente de bloqueo S Agente de liberación
ametopterina (metotrexato), 10 –7 M, 16-18 horas a timidina, 10 –5 M, 5-6 horas a

(MW = 454,4) (MW = 242,2), o BrdU, 12 μ g / mL, 5,5 horas B
5 ‐ fluorodesoxiuridina (FdUrD o FUdr) timidina

0,1 μ M (médula ósea) C 3,3 × 10 –3 METRO C
3,3 × 10 –7 M, 16-18 horas D 3,3 × 10 –5 M, 5 horas D

(MW = 246,2) (MW = 242,2), o
BrdU en cuanto a ametopterina
exceso de timidina 2 ‐ desoxicitidina, 10 μ M, 4 horas 15 min f MW = 227,2) o

300 μ g / mL BrdU 50 μ g / mL, 5-8 horas mi,
16-18 horas mi O simplemente enjuague y
alimente O no enjuague ni suelte I
Exceso de BrdU timidina, 0.3 g / mL, 6-7 horas O simplemente

enjuague y alimente 6 horas C
10 μ g / mL, 15 a 17 horas gramo
200 μ g / mL, 15 a 17 horas h
a De la referencia 11; B referencia 40; C referencia 52; D referencia 52; mi referencia 53; F referencia 37; gramo referencia 41; h referencia 35; I referencia 56.
las muestras se encuentran en el rango de metafase tardía a media, el líquido amniótico y los cultivos de fibroblastos se encuentran en el rango de metafase
temprana a prometafase, y las muestras de sangre varían desde la metafase temprana hasta la prometafase temprana. Esta variabilidad refleja la calidad que
cada tipo de tejido es capaz de alcanzar como resultado de las características cromosómicas intrínsecas en varios tipos de células [17]. Los cultivos de
tumores y CVS, por ejemplo, a menudo parecen tener cromosomas cortos en las condiciones más ideales. Si la resolución no es satisfactoria, puede ser
necesario repetir el cultivo y el análisis.
Hay dos métodos básicos para obtener cromosomas en prometafase y profase: (i) sincronía celular y (ii) aditivos para prevenir la contracción.
Pueden combinarse en otras permutaciones de sincronía y métodos aditivos que pueden ser sinérgicos. En teoría, el método de sincronía
funciona deteniendo las células en síntesis, recolectando una gran población de células listas para comenzar a dividirse juntas. Cuando las células
llegan juntas a una etapa temprana de la metafase, se recolectan y se colocan en portaobjetos. Al cronometrar adecuadamente el período de
liberación, se puede obtener una gran cantidad de células tempranas en metafase y profase.
Los productos químicos utilizados para bloquear la síntesis incluyen ametopterina (metotrexato), 5 ‐ fluorodesoxiuridina (abreviado FdU,
FUdR o FdUrd), 5 ‐ bromo ‐ 2 ′ Exceso de desoxiuridina (abreviado como BrdU, BUdR o BrdUrd) o exceso de timidina. Estos productos químicos se
agregan a las células en crecimiento exponencial (p. Ej., Hemocultivos estimulados de 2 a 3 días, médula ósea el primer o segundo día de cultivo, o
cultivos de monocapa jóvenes primarios o subcultivados tempranos). El bloque se libera con timidina (formetotrexato o bloques tipo exceso de
BrdU), BrdU (para metotrexato) o 2 ‐ desoxicitidina (para exceso de timidina) (Tabla 2.5). Drouin y col. [51] informan que el tiempo de liberación es
aproximadamente 30 minutos más largo para BrdU que para timidina.
2.3.10 Mecanismo de acción de las sustancias químicas sincronizadas
La ametopterina (metotrexato) interrumpe la vía de las purinas al inhibir la dihidrofolato reductasa, que interrumpe la
vía de las purinas. El tetrahidrofolato, la forma activa del ácido fólico, es una coenzima que transporta grupos de un
carbono para reacciones de transferencia, como la síntesis de aminoácidos, purinas y timidina. Esto incluye la
conversión de dUMP en dTMP mediante timidilato sintetasa. La eliminación de ametopterina y la adición de timidina
permiten la síntesis de dTMP a través de una timidina quinasa en la vía de rescate. La 5 ‐ fluorodesoxiuridina también se
usa para sincronizar las células y tiene un efecto similar al de la ametopterina, actuando como antagonista de la
timidilato sintetasa. La timidina libera bloques de células FdU de la misma manera que libera bloques de ametopterina.
Webber y Garson [52] informan sobre el uso de FdU para sincronizar cultivos de médula ósea, y Gibas et al.
BrdU, un análogo de la timidina, también se puede utilizar para liberar células de bloques de tipo ametopterina. Producirá un mayor número
de bandas, porque también inhibe la condensación cromosómica [43], y puede utilizarse para producir bandas cromosómicas inversas RBA en la
preparación [35,54]. Sin embargo, Yunis [33] informa que el uso de BrdU como agente liberador puede seleccionar contra algunas células
cancerosas y en altas concentraciones (> 10 μ g / mL) puede producir un estiramiento diferencial de los cromosomas, lo que conduce a
discrepancias de homólogos de artefactos. Numerosos otros métodos producen sincronía [51] (ver Tabla 2.4).
El exceso de timidina inhibe la síntesis de ADN por efectos de retroalimentación sobre la síntesis de otros precursores de nucleótidos.
El exceso de timidina inhibe la síntesis de ADN por efectos de retroalimentación sobre la síntesis de otros precursores de nucleótidos. Estos bloques pueden liberarse
lavando las células y volviendo a cultivar con medio ordinario, añadiendo el nucleósido 2-desoxicitidina [52] o lavando e incubando en BrdU. La ventaja de este último
método es que no requiere productos químicos tóxicos. El método que Sutherland informó para inducir el cromosoma X frágil con un exceso de timidina y sin liberación
[55] también se ha adaptado para obtener cromosomas más largos [56]. El exceso de BrdU probablemente funcione como un exceso de su análogo, la timidina. Debido a
que el bloqueo no está completo, algunos laboratorios utilizan el método de alta timidina sin paso de liberación, y las cosechas posteriores pueden tener índices mitóticos
reducidos pero cromosomas largos. También, la liberación del bloque lavando el exceso de BrdU e incubando en medio normal puede producir bandas G y bandas R en la
misma preparación con los métodos de tinción con naranja de acridina o FPG (fluorescencia más Giemsa) [35]. Eichenbaum y Krumins [41] utilizan esta técnica para
cultivos de líquido amniótico. La sincronía fría también se ha utilizado para preparaciones de sangre y médula ósea [57]. Yu y col. [58] utilizan una sincronía fría para las
preparaciones CVS de 24 horas. Sha y col. [36] utilizan un método de bloqueo S de un solo paso para el diagnóstico prenatal en cultivos de líquido amniótico utilizando una
exposición de 3 horas antes de la cosecha a altas concentraciones de BrdU, timidina y Colcemid® (200 La sincronía fría también se ha utilizado para preparaciones de
sangre y médula ósea [57]. Yu y col. [58] utilizan una sincronía fría para las preparaciones de CVS de 24 horas. Sha y col. [36] utilizan un método de bloqueo en S de un solo
paso para el diagnóstico prenatal en cultivos de líquido amniótico utilizando una exposición de 3 horas antes de la cosecha a altas concentraciones de BrdU, timidina y Colcemid® (200 La sincro
El momento del bloqueo suele ser de 16 a 20 horas. Es posible que menos tiempo no produzca suficientes células bloqueadas, y más tiempo
puede causar la muerte celular debido a la ausencia prolongada de timina [59]. Al final del bloque S, el procedimiento anterior consistía en
centrifugar y lavar las células en medio y luego volver a cultivar las células en medio suplementado con agentes que facilitarían la liberación, como
la timidina. No consideramos críticos los pasos de lavado, y Barnes y Maltby [60] informan de una observación similar. Lew [61] informa sobre un
método de liberación para células bloqueadas con ametopterina en el que simplemente se agrega timidina a los cultivos bloqueados. Este es el
método de liberación de timidina que utiliza nuestro laboratorio. Webber y Garson [52] informan que el lavado después de la sincronía FdU es
innecesario. Wheater y Roberts [37] informan que un bloqueo de timidina puede liberarse mediante la simple adición de 2 ‐ desoxicitidina, sin
lavar Creen que los pasos de lavado pueden afectar negativamente el índice mitótico y la longitud del cromosoma. Es importante que el medio
utilizado para volver a cultivar células sanguíneas no tenga fitohemaglutinina porque el PHA es innecesario en este punto del cultivo y puede
provocar la aglutinación de los glóbulos rojos.
Tenga en cuenta que las células se detienen en cualquier punto en el que se detuvieron en el período de síntesis de 6 a 9
horas. Holmquist y Motara [19] informan que el bloqueo parece ocurrir en el límite entre los períodos de síntesis cromosómica
de replicación temprana y tardía, mientras que Camargo y Cervenka [62] y Richardson et al. [63] informa que el arresto ocurre
en la etapa tardía G / G2. Drouin y col. [51] informan que el metotrexato, la alta concentración de timidina y la FdU pueden
causar acumulación de células tanto en la interfase G1 / S como en la transición R / G (punto en el que las bandas R positivas
detienen la replicación y comienzan las bandas G positivas replicación, alrededor de la mitad a dos tercios del camino a través
de la fase S). Cuando son liberados, deben pasar por el resto de ese período S y luego continuar por el período G2, que toma
otras 2 a 5 horas.
Las concentraciones altas de timidina no evitan la entrada en la fase S, pero inhiben la síntesis de ADN y prolongan el período de la fase S. Los diferentes
tipos de células tienen tiempos S y G2 completamente diferentes, por lo que las células tumorales sólidas requerirán tiempos de liberación diferentes
(generalmente más largos) que los hemocultivos. Para los hemocultivos en nuestro laboratorio, usamos un tiempo de liberación de 4.5 horas, que es más
corto que el que usamos hace varios años con una incubadora más fría (37 ° C versus 37.5 ° C). El tiempo de liberación de los hemocultivos varía de 4,5 horas
a 5 horas y 10 minutos [64]. En nuestro laboratorio, los cultivos de tumores sólidos se liberan durante 6 a 7 horas, y se agrega Colcemid® durante las 2 a 4
horas finales. Morris y Fitzgerald [65] informan que las médulas leucémicas tienen ciclos celulares diferentes a los de las muestras hematológicas normales y
que los tiempos de liberación de estas médulas pueden ser específicos de la enfermedad y del paciente. Webber y Garson [52] recomiendan un tiempo de
liberación de 7-8 horas para cultivos de médula leucémica, y Gibas et al. [53] utilizan un tiempo de liberación de 7 horas para muestras CVS sincronizadas con
FdU. Barnes y Maltby [60] sugieren que las variables de cultivo, como el tipo de suero, pueden afectar el tiempo del ciclo celular.
Hay informes de sincronía de cultivos de tumores sólidos [33,65] y cultivos de 24 horas de CVS [53], pero la sincronía está infrautilizada para
muchos cultivos de tipo monocapa. Hemos visto en nuestro laboratorio dos tumores del estroma testicular con anomalías clonales encontradas
solo en cultivos sincronizados. El hallazgo de clones anormales sólo en cultivos sincronizados también ha sido cierto en nuestro laboratorio para
otros tumores; el método de sincronía revela clones anormales que no son tan comunes o no están presentes en otras cosechas. Puede haber
cierta periodicidad anormal en las células anormales, o la sincronía puede simplemente enriquecer el cultivo en busca de células anormales al
recolectarlas toda la noche durante el bloqueo.
Una desventaja de las técnicas de sincronía es el hecho de que los cultivos que se recolectarán el lunes deben sincronizarse el domingo por la tarde o la
noche, cuando muchos laboratorios clínicos no están abiertos. Al variar los tiempos de preparación de los hemocultivos y de médula ósea y los períodos de
cultivo de sangre (72 a 96 horas), la mayoría de los tecnólogos pueden acomodar muestras sincronizadas en el horario de trabajo. Los hemocultivos pueden
almacenarse en el refrigerador oa temperatura ambiente durante un día o más antes de cultivarlos. Las muestras de tumor de médula ósea o en suspensión
se almacenan mejor en medio de cultivo en el refrigerador hasta el día anterior a la recolección y luego se cultivan durante la noche con ametopterina u otro
agente de sincronía. Nuestro laboratorio cuenta con un tecnólogo de guardia durante el fin de semana, y una de las funciones del tecnólogo es agregar
ametopterina el domingo a los cultivos que requieren sincronización.
Yunis [33] y Webber y Garson [52] sugieren que para obtener mejores resultados, las células de la médula ósea deben incubarse durante 3-8
horas antes de la adición de ametopterina para que las células toleren mejor el agente bloqueante. Sin embargo, esto no siempre es práctico,
y no siempre seguimos esta práctica para las muestras de médula ósea recibidas al final del día; simplemente se ponen en cultura y se sincronizan
inmediatamente. Sugerimos realizar un cultivo no sincronizado para todas las muestras. Esto asegura resultados y controles frente a problemas
técnicos imprevistos, y es especialmente importante en cultivos de médula ósea porque tienden a variar ampliamente en el ciclo celular y en su
respuesta a agentes citotóxicos.
La vida útil de las soluciones madre de ametopterina y timidina, según nuestra experiencia, parece ser casi indefinida a
temperaturas de refrigeración. Deben usarse guantes con todos los productos químicos anticontracción, porque todos interactúan con
el ADN y pueden ser peligrosos.
2.3.11 Aditivos para prevenir la contracción cromosómica
Numerosos agentes químicos se unen o se intercalan en el ADN o la cromatina y, cuando se agregan durante períodos antes de la
fijación, son capaces de prevenir la contracción cromosómica normal durante la metafase [35,36,38,40,42,66-72,74,75]. Algunos de estos
agentes muestran preferencia por ciertas áreas del cromosoma. BrdU y 5-azacitidina se unen preferentemente a áreas ricas en G-C, y
Hoechst 33258, DAPI y distamicina A muestran preferencia por regiones ricas en A-T. Estos productos químicos inhiben la contracción de
forma diferencial en lugar de alargar el cromosoma de forma homogénea [42].
La actinomicina D (dactomicina), la naranja de acridina y el bromuro de etidio parecen unirse uniformemente y prevenir la contracción de los
cromosomas de manera homogénea, aunque Schollmayer et al. [54] encontró condensación diferencial usando naranja de acridina. Dado que los
cultivos a largo plazo se consideran más difíciles de sincronizar, se han desarrollado técnicas de bromuro de etidio y actinomicina D para alargar
los cromosomas de fibroblastos [39], derrames pleurales [73] y cultivos de líquido amniótico [76]. Algunos de estos agentes reducen el índice
mitótico, pero esta desventaja puede compensarse con un aumento de la calidad de la metafase. Los agentes pueden agregarse al cultivo antes o
en el momento de la adición del inhibidor mitótico o durante el período hipotónico (tabla 2.6). También se ha demostrado que la 9 ‐ aminoacridina
intercala la cromatina y produce cromosomas más largos que el tratamiento con bromuro de etidio [75].
Cuadro 2.6 Aditivos químicos utilizados para producir cromosomas alargados.
Árbitro. No. Autor Tipo de tejido Sustancias químicas utilizadas Concentración Exposición Paro mitótico
tiempo
74 Dewald pleural aMD a 5 μ g / mL 1 hora Ultima hora

y cena derrames
43 Yunis J. B Linfocitos aMD 5 μ g / mL 1 ho más Colcemid ®, últimos 10 min
42 Yu y col. humano aMD 2 μ g / mL 1 hora Velban 0.01 2 g / mL,

fibroblastos última h
40 Ikeuchi t. Linfocitos eB C 10 μ g / mL 2,5 h Colcemid ®, ultima hora
76 hoo y col. amniocitos eB 5 μ g / mL 4,5 h Colcemid ®, 0,6 μ g / mL,

última hora y media
68 Linfocitos de Latos ‐ Bielenska eB 2,5 × 10 –5 METRO 2h Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,

y hameister B aMD (MW = 394,3) 2h 7 min
aMD + eB 2 μ g / mL 2h Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,
hoechst 33258 2 μ g / mL; 2,5 × 10 –5 METRO 2h 7 min
hoechst 33258 + 60 μ g / mL 2h Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,
aMD 60 μ g / mL; 2h 7 min
hoechst 33258 + 2 μ g / ml de eB 2h Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,
60 μ g / mL; 2,5 × 10 –5 METRO 7 min
hoechst 33258 + 60 μ g / mL; 2,5 × 10 –5 METRO; eB Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,
+ aMD 2 μ g / mL 7 min
Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,
7 min
Colcemid ®, 0,7 μ g / mL,
7 min
a actinomicina D.
B Se utiliza en combinación con una técnica de sincronía celular de ametopterina / timidina o BrdU.
C bromuro de etidio.
2.3.12 Combinación de sincronía y aditivos para cromosomas más largos

Se han desarrollado varios métodos exitosos para el alargamiento cromosómico usando una combinación de aditivos químicos sincronizados y
anti-contracción. Yunis [33,40] informó el uso de bloqueos de ametopterina seguido de liberación con timidina o BrdU y agrega agentes de
prefijación, como naranja de acridina o actinomicina D, a cultivos de células tumorales y sangre periférica. La liberación de BrdU con 1 hora o más
de inhibición de actinomicina D (AMD) produjo hasta 2000 BPHS [43], y Yunis plantea la hipótesis de un efecto sinérgico entre BrdU y AMD sobre el
alargamiento. Con esta técnica se informa poca o ninguna disminución del índice mitótico, ninguna contracción diferencial y pocas roturas
cromosómicas. Yunis prefiere una alta concentración de BrdU [40] para lograr más bandas y recomienda una liberación un poco más prolongada
(5,5 horas). Quizás con el uso de técnicas de combinación, los tiempos de liberación son menos críticos debido a la acción anticondensación de los
agentes añadidos. Latos ‐ Bielenska y Hameister [74] utilizan con éxito varias técnicas de combinación (sincronía más BrdU, Hoechst 33258,
bromuro de etidio y DMAE) en un laboratorio clínico. Recomiendan utilizar varias técnicas para cada paciente para tener en cuenta las variables de
respuesta del paciente. Nuestro laboratorio utiliza una combinación de sincronía de ametopterina y bromuro de etidio en cultivos de sangre
periférica de forma rutinaria con gran éxito.
Otros métodos para mejorar el alargamiento y la calidad de los cromosomas son manipulaciones de recolección, como soluciones hipotónicas especiales
(p. Ej., Solución hipotónica de Ohnuki y solución hipotónica para el cáncer; Tabla 2.4), tiempo y concentración reducidos de Colcemid® para reducir la
coalescencia de la banda y fijadores fríos o con mayor contenido de alcohol .
2.3.13 Dispositivos de recolección automáticos y cámaras de preparación de portaobjetos / cámaras de secado
La gran carga de trabajo de los laboratorios de citogenética modernos hizo que la automatización de los pasos de recolección y preparación de portaobjetos
[25] fuera importante. Además de ahorrar tiempo, también contribuyen a la consistencia de las preparaciones citogenéticas. Hay varias máquinas
recolectoras automáticas disponibles y varios gabinetes de secado de portaobjetos que controlan la humedad y la temperatura del aire para optimizar las
condiciones para cada tipo de muestra.
2.4 Creación de diapositivas
Una vez que las células se han fijado bien en metanol-ácido acético 3: 1, se dejan caer sobre portaobjetos de vidrio y se secan en condiciones
específicas para una óptima morfología y diseminación cromosómica.
Aunque la mayoría de las variables para una buena elaboración de diapositivas se comprenden bien, todavía hay un aspecto artesanal en el
procedimiento, lo que hace imposible verbalizar todas las habilidades necesarias. Uno simplemente debe practicar hasta que se domine la parte intuitiva de
la habilidad, y siempre habrá algunos tecnólogos con una mejor percepción de la misma. Los laboratorios pueden encontrar cámaras de secado de
portaobjetos útiles y rentables, ya que permiten que las condiciones ambientales se ajusten a requisitos específicos. Mientras tanto, la elaboración manual de
diapositivas con ajustes para las condiciones ambientales, sean las que sean, sigue siendo una habilidad necesaria en muchos laboratorios, y la comprensión
de la elaboración manual de diapositivas es la base para hacer diapositivas en cualquier circunstancia.
2.4.1 Historia de la creación de diapositivas
En los primeros días de la creación de diapositivas, antes de los métodos de anillado, estábamos mucho menos limitados en nuestros métodos para
conseguir que los cromosomas se extendieran, porque los cromosomas no anillados siempre se tiñían bien. En la década de 1950 y principios de la de 1960,
los cromosomas se diseminaron aplastando las células (Belling, 1921, utilizando material vegetal) [77] entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Si se hizo con
un tinte como aceto-orceína, se obtuvo una preparación temporal de montaje en húmedo. Alternativamente, las células podrían aplastarse en ácido acético
acuoso al 50% o 60%, y luego quitarse el cubreobjetos. El portaobjetos resultante podría teñirse con Giemsa. Sin embargo, parte del material se adhirió al
cubreobjetos, e incluso los métodos elaborados ideados para hacer frente a este problema, como congelar los portaobjetos en un bloque de hielo seco o
hundir el aplastado, los portaobjetos cubiertos con metanol helado seco antes de quitar el cubreobjetos con una cuchilla de afeitar [78], no siempre fueron
útiles. Las metafases parciales eran la regla. El método de la calabaza todavía se usaba para tejidos intactos (por ejemplo, preparaciones directas de tumores
sólidos) a fines de la década de 1960. Perdió el favor porque los fijadores acuosos de ácido acético que tenían que usarse para ablandar las membranas
celulares impedían los patrones de bandas.
Los métodos de fabricación de portaobjetos con secado al aire que hemos desarrollado hoy en día evolucionaron en dos pasos. La primera fue cuando Rothfels y
Siminovich permitieron accidentalmente que algunos portaobjetos de cultivos de monos recolectados in situ se secaran por evaporación; encontraron que los
cromosomas estaban esparcidos en un solo plano sin fuerza mecánica [79]. Nowell [7], quien describió el uso de PHA para el cultivo de linfocitos, todavía usaba el método
de preparación de portaobjetos en forma de calabaza. Fue Moorhead et al. [8], quien modificó las técnicas de secado al aire de Rothfels y Siminovich para cultivos de
linfocitos para dar el método de fabricación de portaobjetos que todavía usamos cuatro décadas y media después.
El fijador utilizado por los primeros trabajadores era metanol-ácido acético-cloroformo 3: 1: 1 y se conocía como fijador de Carnoy.
Se descubrió que el cloroformo era prescindible para fines citogenéticos y ya no se usaba en fijadores después de la década de 1960. El
ácido metanol-acético tres a uno a veces se denomina fijador de Carnoy modificado, ya que no contiene cloroformo.
Los primeros métodos de secado de portaobjetos implicaban manipulaciones para mejorar la propagación, como preparaciones de células en llamas. Un método
consistía en sumergir los portaobjetos en etanol al 95%, dejar caer la suspensión celular fija sobre el alcohol y pasar el portaobjetos a través del mechero Bunsen o la
llama de alcohol. Otra fue dejar caer los portaobjetos en agua enfriada con hielo seco, retirar el portaobjetos y luego dejar caer las células en el portaobjetos, encender el
fijador en una llama y secar el portaobjetos en una placa calefactora. La idea de flamear es hervir efectivamente la célula para que se extiendan los cromosomas. Algunos
de estos métodos desnaturalizan los cromosomas e impiden la formación de bandas, pero si se hace con mucha suavidad, el flameado sigue siendo un método que se
puede utilizar para ciertos problemas extremos, como la propagación de células tumorales con grandes números de ploidía y citoplasma refractario. Sin embargo, a
principios de la década de 1970, para adaptarse a los nuevos métodos de anillado, la mayoría de los laboratoristas aprendieron a usar métodos de secado al aire en lugar
de flamear. Los portaobjetos se hicieron dejando caer las células fijadas sobre portaobjetos húmedos y dejándolos secar por evaporación.
En este punto del desarrollo de las técnicas de secado al aire, se hizo evidente una variabilidad inexplicable en la propagación de los
cromosomas: en ocasiones, algo salía mal con los portaobjetos, y los cromosomas quizás se extendían bien un día pero no al día siguiente.
JohnMelnyk de City of Hope en Duarte, California, fue uno de los primeros en descubrir la razón. Estaba intentando diseñar una máquina
automática para fabricar portaobjetos y utilizó aire comprimido para soplar aire en las celdas para provocar la evaporación del fijador. Descubrió
que algunos tanques de aire funcionaban mejor que otros y atribuyó el mal resultado al bajo contenido de agua en el aire comprimido de los
tanques que se habían llenado con aire en un día seco. Cuando las células se secan demasiado rápido en presencia del flujo de aire seco, hubo
una relajación insuficiente de la membrana citoplasmática para que los cromosomas se aplanaran y salieran del centro de la célula. El resultado
fue una pila de cromosomas y una membrana arrugada en forma de película sobre ellos. City of Hope está ubicada en un ambiente desértico del
sur de California, y los peores días para hacer toboganes fueron cuando sopló un viento seco del desierto.
Los tecnólogos de principios a mediados de la década de 1970 también estaban descubriendo esta correlación en la fabricación de diapositivas con la
humedad, a menudo desde la otra perspectiva. En las regiones del este, sur y medio oeste del país, la humedad llegó a ser tan alta en ocasiones que las
células se secaron con demasiada lentitud, lo que provocó bandas deficientes, células apretadas, pérdida celular debido a la dispersión de cromosomas y
otras dificultades. En consecuencia, se desarrollaron varios métodos para mejorar los métodos de secado al aire para la fabricación de portaobjetos, y la
mayoría de ellos tratan con la humedad relativa, que está relacionada con la temperatura del aire. (El aire más cálido es capaz de retener más humedad que
el aire frío. Por lo tanto, la humedad relativa no es un porcentaje directo, sino el porcentaje de agua presente en el aire en comparación con lo que el aire a
esa temperatura es capaz de retener).
Estas correlaciones han sido exploradas en experimentos controlados por Spurbeck et al. [80], que midió la propagación celular (volumen celular) en
relación con el aumento de la humedad y las temperaturas, y encontró una correlación positiva entre el aumento de la humedad y la propagación a una
temperatura establecida, hasta un cierto umbral. Más allá de una cierta humedad óptima, las células comienzan a lisarse, derramando los cromosomas y solo
las células pequeñas resistentes (muy extendidas) permanecen intactas. Esto encaja bien con las observaciones realizadas por los tecnólogos en un nivel más
intuitivo. Los autores también informaron que el aire más cálido produce una mayor propagación debido a la capacidad del aire caliente para retener más
humedad. Sin embargo, el aire caliente creado en invierno por los sistemas de calefacción de los edificios expulsará la humedad del aire y, por lo tanto, estas
condiciones de aire cálido generalmente producirán una menor propagación.
2.4.2 Teoría de la elaboración de diapositivas
El secado al aire de las células fijadas en metanol-ácido acético 3: 1 se basa en la teoría de que los cromosomas, que están contenidos en células
que están muy agrandadas y tienen membranas celulares mucho más delgadas que antes de la cosecha, estarán sostenidas por la capa de fijador
en el portaobjetos en los primeros segundos después de la aplicación al portaobjetos. Luego, a medida que el fijador se evapora, la capa de fijador
se vuelve más delgada y el menisco empuja hacia abajo en la parte superior de la célula, agrandando el área de la célula y presionando los
cromosomas en metafase entre las membranas superior e inferior, extendiéndolos (ver Figuras 2.13). y 2.14). Esta relajación física y colapso de la
membrana celular lleva algún tiempo, pero este proceso lento estira los cromosomas, determinando así en cierta medida cuál será el nivel de
bandas [81]. Si el fijador se seca antes de que el citoplasma se haya relajado y las células se hayan extendido, habrá un fondo citoplásmico visible y
las células y los cromosomas serán más gruesos (más oscuros en el microscopio de contraste de fase y después de la tinción), más cortos y, a
menudo, poco esparcidos [ 80]. La cubierta citoplasmática gruesa generalmente evitará una buena tinción o hibridación in situ, y la morfología
cromosómica teñida será insatisfactoria en muchos casos (ver Figura 2.15). Las metafases bien diseminadas también tienen una membrana
citoplasmática intacta sobre las células, pero es muy delgada y requiere tinciones especiales para visualizar, como 0,2% verde rápido [17]. Si el
secado lleva mucho tiempo, la membrana citoplasmática debilitada puede desarrollar agujeros o puede romperse, derramar algunos o todos los
cromosomas y perder la metafase para el análisis o causar pseudohipodiploidía (ver Figura 2.13). En tales preparaciones, no es raro ver células
que también están mal diseminadas. Esto puede deberse al rodamiento de las células en la capa de fijador, que tiene corrientes y otras fuerzas
que provocan el movimiento celular. Una celda que está rodando en el momento del secado final no se ha relajado y parecerá estar muy
extendida [80] (ver Figura 2.13). Esta teoría ha sido desarrollada, explorada y respaldada sistemáticamente por los experimentos de Spurbeck et
al. [80]. El balanceo celular puede explicar las ocasiones en las que ocurre lo contrario: una humedad muy alta a veces puede producir un fondo
citoplasmático que puede aliviarse disminuyendo el tiempo de secado (nuestros tecnólogos llaman a esto un “día atrasado”). Se ha informado que
la baja humedad causa cromosomas dispersos [82], una excepción al paradigma. Concluimos que la creación de diapositivas es un método
empírico.
Tiempo
(B)
(a)
(C) (D)
Tiempo
Figura 2.13 Tiempo de propagación y secado de los cromosomas. Las metafases se propagan en función de la duración del tiempo de secado. esta figura ilustra una
vista lateral donde la parte superior de la solución fijadora está representada por una sola línea y la superficie de deslizamiento está representada por una línea doble.
el tiempo se representa de arriba a abajo. (a) Las metafases que se secan demasiado rápido suelen ser estrechas con muchos cromosomas superpuestos. (b) Las
metafases que se secan a la velocidad óptima (para una vista superior, vea la Figura 2.14) tienen pocas superposiciones y no se rompen. (c) Las metafases que se
secan demasiado lentamente se caracterizan tanto por metafases rotas como (d) por metafases apretadas y “enrolladas”. Cortesía de Jack Spurbeck. reimpreso de
Spurbeck J. Dynamics of cromosome spreading. En: Spurbeck JL, Zinmeister ar, Meyer KJ, Jalal SM. Am J Hum Genet 1996; 387–393, © 1996, John Wiley and Sons, con
autorización.
(a) (B) (C)
Figura 2.14 una célula de amniocitos durante el proceso de secado. Grabe imágenes de un amniocito durante el proceso de secado en las
etapas temprana (a), intermedia (b) y casi óptima (c). Cortesía de Jack Spurbeck. reimpreso de Spurbeck J. Dynamics of cromosome spreading.
En: Spurbeck JL, Zinmeister ar, Meyer KJ, Jalal SM. Am J Hum Genet 1996; 387–393, © 1996, John Wiley and Sons, con autorización.
Figura 2.15 Metafase con bandas G debido a la elaboración deficiente de diapositivas. esta imagen muestra una metafase con bandas G que se seca demasiado
rápido y está encapsulada en la membrana citoplasmática. Los cromosomas no tuvieron tiempo de extenderse por completo y la digestión de la tripsina es desigual
debido a la interferencia de las proteínas en la membrana gruesa sobre los cromosomas.
8
2
8
2
Figura 2.16 Secado diferencial. Un lado de la célula se ha secado a una velocidad óptima y el otro lado se ha secado demasiado rápido, creando una
mayor contracción de los cromosomas en ese lado. Tenga en cuenta, por ejemplo, los dos cromosomas 2 y los dos 8 (flechas).
y habilidad cualitativa, al menos según el nivel actual de comprensión. Puede haber efectos por otros factores ambientales aún desconocidos. La
presión barométrica probablemente no sea uno de estos factores, porque Spurbeck et al. sí probó los efectos de la presión barométrica y no
encontró que fuera una variable importante (en el rango de 29,74 a 30,03 pulgadas de mercurio). Claussen y col. [83] realizó algunos trabajos
sobre el secado de células fijas en portaobjetos en diferentes condiciones atmosféricas, y descubrió que la propagación implica una inflamación
significativa de las células mitóticas inducida por el agua durante la evaporación del fijador del portaobjetos.
Una vez que los cromosomas fijados con metanol y ácido acético se secan en un portaobjetos de vidrio, se adhieren con fuerza hasta que se raspan
físicamente, y la tinción se puede lograr sin perder células de los portaobjetos. No es posible realizar más cambios en la propagación después de que las
células se sequen, aunque Claussen et al. [84] ha descubierto que los cromosomas se pueden estirar con un micromanipulador para exhibir más bandas. Las
células fijadas en otros fijadores, como las células incluidas en parafina fijadas con formalina, no se adhieren al vidrio al secarse, a menos que el vidrio se
trate mediante recubrimiento (p. Ej., Silanización) o que el vidrio esté cargado positivamente. Estas preparaciones se utilizan a menudo para estudios FISH en
interfase.
La longitud de los cromosomas se ve algo afectada por el secado en portaobjetos, como lo demuestran las células que se han secado de manera
diferencial, con varios niveles de bandas en diferentes lados de la célula (ver Figura 2.16). La tinción diferencial suele deberse al secado diferencial.
velocidades en lados opuestos de la celda, y puede ser causado por escombros cercanos, calentamiento desigual, agua que queda en las
proximidades de la celda, aceite en el portaobjetos o líneas dibujadas en el portaobjetos de microscopio creadas en la fabricación del
vidrio, entre otros variables. El secado también puede diferir del interior al exterior de la celda por las mismas razones. Los cromosomas
no teñidos se pueden ver usando un microscopio de contraste de fase, y la mayoría de los protocolos de preparación de diapositivas
requieren una evaluación de la propagación y la propagación de los cromosomas, la morfología y el contraste usando un microscopio de
este tipo, o usando un microscopio óptico ordinario con el condensador ajustado para ver las sombras de las células sin teñir. Los
cromosomas pueden aparecer de gris a negro, dependiendo de las condiciones de secado, y la calidad de las bandas resultante reflejará
el contraste que se observa en las preparaciones sin teñir [85] (Figura 2.17).
El objetivo del fabricante de portaobjetos es obtener preparaciones de portaobjetos de cromosomas que tengan las siguientes características en el microscopio de
fase:
1. Cromosomas principalmente de gris medio a gris oscuro. Los cromosomas de color gris claro producen células sensibles a la tripsina con poco
contraste entre las bandas, y el contraste de fase muy negro puede tener un fondo citoplásmico aumentado y ser resistente a la tripsina,
aunque estas pautas de bandas pueden ser diferentes en algunos laboratorios.
2. Poca dispersión cromosómica (dispersión excesiva, metafases rotas) porque esto puede causar problemas de diagnóstico cuando se sospecha de mosaicismo o
puede enmascarar el mosaicismo verdadero en un porcentaje bajo.
3. Número mínimo de superposiciones de cromosomas, para un recuento y análisis de bandas precisos.

4. Fondo citoplasmático muy delgado o ausente, si es posible, de modo que las bandas G de tripsina sean óptimas (véanse las Figuras 2.12 y 2.14). Densidad celular
5. adecuada en el portaobjetos: muy pocas células en los portaobjetos pueden dar como resultado preparaciones que requieren mucho tiempo para escanear en busca
de metafases. Los portaobjetos que son demasiado densos pueden interferir con la propagación y las bandas G, y las preparaciones FISH de estos portaobjetos
pueden ser difíciles de interpretar debido a las señales de hacinamiento y la confusión en cuanto a qué células se han puntuado en un campo determinado.
6. Cromátidas que están juntas, no separadas. Esto también puede ser una función de Colcemid® y los pasos hipotónicos. Ausencia de residuos, como virutas de vidrio
7. de pipetas o portaobjetos, guante en polvo, diatomeas de los bulbos de pipeta o trozos de tejido de explantes, que interferirán con el secado adecuado de los
portaobjetos.
2.4.3 Variables de creación de diapositivas
Normalmente, en un buen día, se deben poder dejar caer células fijas en un portaobjetos limpio y húmedo en un ángulo de 20 a 30 ° a lo largo sobre una
toalla de papel, escurrir el exceso de agua, tal vez inundar el portaobjetos con un poco de fijador para mejorar Elimine el agua y produzca una superficie de
secado consistente, y seque el portaobjetos plano o en ángulo para obtener una buena preparación. Si esto no funciona, las manipulaciones para mejorar la
propagación y la morfología son numerosas e incluyen las siguientes variables. (Nota: si una cosecha completa produce preparaciones consistentemente de
mala calidad, independientemente del tipo de muestra o las condiciones ambientales, puede haber un problema con las condiciones de cultivo o recolección.
Esto podría incluir un inóculo demasiado grande de células en el cultivo, o hipotónicos o fijadores que se fabricó incorrectamente o se contaminó con algunos
otros productos químicos).
2.4.4 Portaobjetos húmedos versus secos
Algunos laboratorios prefieren dejar caer células fijas en portaobjetos húmedos, lo que facilita la propagación debido a la retracción inmediata del menisco
de agua tan pronto como el alcohol ácido lo golpea. Holmquist y Motara [19] informan que al dejar caer las células en portaobjetos húmedos, la energía de
deshidratación de la fijación se devuelve como un cambio en la energía libre de la mezcla entre el fijador y el agua, que esparce las células. Otros prefieren
usar portaobjetos secos y, en buenas condiciones ambientales, este método debería funcionar [80]. Si se utilizan portaobjetos húmedos, el agua que se retira
debe eliminarse mediante un drenaje inmediato sobre toallas de papel, secando con KimWipes e inundando con fijador. Las manchas de agua residual
provocan irregularidades en el esparcimiento y las manchas debido a variaciones localizadas del tiempo de secado. Para cubreobjetos en platos, Es crucial
secar completamente los bordes del cubreobjetos retirando diligentemente el fijador residual. Esto asegura un medio de secado constante a través del
cubreobjetos y reduce la rotura de células por ondas de fijador de secado.
Los portaobjetos húmedos pueden facilitar aún más el control de la extensión mediante el uso de diferentes temperaturas de recubrimiento de agua para acelerar o
ralentizar el tiempo de secado. Los portaobjetos fríos y húmedos retrasarán el secado, lo que aumentará la extensión, mientras que los portaobjetos húmedos a
temperatura ambiente más alta acelerarán el tiempo de secado. El grosor de la película de agua se puede variar escurriendo el portaobjetos sobre una toalla de papel más
o menos a fondo, y esto puede ayudar a controlar la propagación mediante el uso de una película de agua más gruesa en los días muy secos. Además, las metafases
extremadamente frágiles, como las muestras de médula ósea de leucemia linfocítica aguda, pueden producir más metafases con capas de agua muy delgadas, o incluso
simplemente recubriendo los portaobjetos con la humedad del aliento.
Un método para asegurar la eliminación completa del agua del portaobjetos y el secado uniforme a través del portaobjetos es inundar el portaobjetos con unas
gotas de fijador después de que las células se hayan aplicado a la superficie húmeda. Esto también puede ayudar a la propagación ejerciendo presión sobre la membrana
celular superior para estimular el aplanamiento o la relajación de la membrana para causar una mayor propagación. Algunos laboratoristas usan portaobjetos que han
sido recubiertos con fijador en lugar de agua.

(a) (B)
(C) (D)
(mi) (F)
Figura 2.17 Comparación de la calidad de la banda G. se muestran tres celdas con diferentes imágenes de contraste de fase y su posterior calidad de banda G. (a)
demasiado gris en la imagen de contraste de fase. (b) Las bandas G posteriores también carecen de contraste. (c) demasiado oscuro en el contraste de fase. (d) Las
bandas G posteriores son duras, con alto contraste. (e) Celda oscura media agradable en contraste de fase. (f) La célula subsiguiente muestra buen contraste y
morfología cromosómica.
2.4.5 Ángulo de la diapositiva
Algunos tecnólogos colocan células en portaobjetos horizontales, pero son una minoría. La mayoría de los tecnólogos permiten que la suspensión celular se desplace
después de tocar el portaobjetos, inclinándola a lo largo del eje largo (p. Ej., El extremo de la etiqueta hacia arriba o hacia abajo) o a lo largo del eje corto (p. Ej., Un borde
largo hacia abajo). La propagación puede mejorar cuando las células viajan y ruedan cuando el nivel de fijador se adelgaza primero, aunque esto no está documentado y
no se aplica al secado de portaobjetos de recolección in situ. El efecto de dejar caer las células en los portaobjetos en ángulo a lo largo del eje largo es que el agua y el
fijador drenan desde el extremo superior del portaobjetos hasta el extremo inferior y se acumulan allí; esto puede causar una evaporación más rápida en el extremo
superior y el secado puede ser desigual, tanto entre las células en cada extremo como dentro de las células, dando diferentes respuestas de bandas a la tripsina de una
célula a otra e incluso dentro de una metafase (ver Figura 2.15). Los portaobjetos hechos con un borde largo hacia abajo tienden a ser más uniformes, especialmente si el
ángulo se mantiene entre 20 y 30 °, y las celdas se colocan en el tercio superior del portaobjetos y se les permite moverse hacia abajo. Las gotas de suspensión celular no
deben acumularse en un borde del portaobjetos, sino que deben estar en círculos uniformes de extensión de aproximadamente 20 mm de diámetro y bien centrados en
el eje corto. Los ángulos de inclinación mayores pueden acelerar el proceso de secado en el extremo superior del portaobjetos en comparación con el extremo inferior, lo
que produce un deslizamiento algo irregular e inconsistente. Se puede lograr un secado uniforme inclinando los portaobjetos en un ángulo durante parte del tiempo de
secado y otro para el secado final. Se dice que cambiar el ángulo del portaobjetos y golpear el borde del portaobjetos en la parte superior del banco mejora la
propagación celular para algunos tecnólogos. especialmente si el ángulo se mantiene entre 20 y 30 °, y las celdas se colocan en el tercio superior del portaobjetos y se les permite moverse haci
2.4.6 Humedad y temperatura ambiente

Es importante recordar que la humedad relativa es el porcentaje de humedad realmente en el aire comparado con su máxima saturación potencial a esa
temperatura; por lo tanto, dado que el aire caliente puede retener más humedad que el aire frío, un valor de humedad relativa del 50% significa un contenido
de humedad absoluta mucho más bajo para el aire frío que para el aire caliente. Por lo tanto, los portaobjetos se distribuyen de manera diferente según la
temperatura del aire, dada la misma humedad relativa. Una temperatura ambiente más alta generalmente (pero no siempre) se traduce en una mejor
distribución. Para secar las células de las cosechas in situ, es la humedad la que afecta los resultados sobre todas las demás variables, y los mejores
resultados se obtienen con una humedad de 5 a 10% más alta que la que sería ideal para las cosechas en suspensión. En aire seco, el fijador se evapora
rápidamente, mientras que en aire húmedo, la evaporación ocurre lentamente. Ni la evaporación rápida ni la lenta son ideales, ya que pueden dar como
resultado un contraste de fase deficiente y cromosomas dispersos, dispersos o un fondo citoplasmático visible alrededor de la metafase. El tiempo de secado
debe ser de aproximadamente 30 a 45 segundos, según nuestra experiencia. En climas secos, es necesario ralentizar los tiempos de secado, y en climas
húmedos, acelerarlos. Algunas formas de proporcionar humedad son secar los portaobjetos frente a un humidificador, sobre toallas de papel húmedas o al
vapor en un fregadero. En climas muy húmedos y húmedos, se necesita una técnica que fomente el secado, como el uso de fijador de metanol-ácido acético
6: 1, según lo informado por Yunis et al. [64]. Tenga en cuenta que su trabajo se realizó en Minnesota, donde los veranos húmedos no son infrecuentes.
Algunas áreas del país experimentan cambios climáticos drásticos durante el año, y el tecnólogo debe volverse experto en manejar todo tipo de condiciones.
La situación más difícil es adaptarse a las condiciones climáticas que cambian rápidamente al hacer toboganes. La consistencia es muy difícil en tales
circunstancias y puede ser mejor dejar la elaboración de diapositivas hasta que las condiciones se estabilicen.
La humedad relativa ideal para la fabricación de portaobjetos puede variar debido a las diferencias de temperatura, precisión del higrómetro, técnica y
tipo de muestra. En nuestra experiencia, las recolecciones de cultivos de monocapa adheridos tienden a tener requisitos de humedad más exigentes para un
buen secado que las muestras de sangre y médula ósea, y las muestras recolectadas in situ parecen extenderse mejor a humedades altas (p. Ej., 50-55%) .
Lundsten y Lind [86] sugieren 20 ° C y 45% de humedad, con un rango óptimo entre 40% y 50%. Spurbeck y col. [80] encuentran que 50% de humedad y 25 °
C son los puntos de ajuste óptimos, y reducen la humedad al 35% si la dispersión de cromosomas es un problema. Yu y col. [58] recomiendan 25 segundos de
tiempo de secado para preparaciones de alta resolución. El técnico experimentado generalmente puede saber si la humedad no es óptima simplemente
observando el tiempo de secado del portaobjetos y la imagen de contraste de fase resultante. Los tecnólogos de laboratorio han encontrado formas de lidiar
con las condiciones ambientales que afectan la fabricación de diapositivas. Por ejemplo, los laboratorios en el este y el medio oeste a menudo usan
deshumidificadores en su área de fabricación de portaobjetos para compensar la alta humedad. Los humidificadores también son útiles en muchas partes
del país, especialmente en invierno, cuando el aire se seca mediante sistemas de calefacción. Estos pueden variar desde uno o dos pequeños humidificadores
para habitaciones de bebés disponibles en los grandes almacenes, hasta los grandes humidificadores ultrasónicos comerciales para habitaciones con
controles de humedad (humidistatos) que controlan automáticamente la humedad en habitaciones enteras. Lundsteen y Lind [86] informan del uso de una
“sala climática” especialmente diseñada para la elaboración de diapositivas. Otra forma de compensar es tener un gabinete de deslizamiento, ya que es más
fácil controlar la temperatura y la humedad en un área pequeña que en una habitación grande. Hay gabinetes de fabricación de diapositivas disponibles
comercialmente que son muy populares. En regiones como el noroeste de Estados Unidos, es raro que el aire esté saturado de humedad, como suele ocurrir
en otras partes del país, y el simple hecho de calentar los toboganes y / o aumentar el flujo de aire suele ser suficiente para obtener una buena preparación.
Otras fuentes de humedad son respirar en los portaobjetos como para empañar el vidrio, lo que da un efecto diferente al de soplar para crear un flujo
de aire; mojar una almohadilla de toallas de papel en la que colocar los portaobjetos de secado (un microclima justo encima de la toalla es más húmedo que
el aire ambiente), o si eso no funciona, colocar una tapa de caja de portaobjetos sobre la parte superior del portaobjetos de secado en el toalla húmeda usar
toallas de papel húmedas en un plato caliente; Colocar una estopilla mojada sobre las rejillas de ventilación de una campana para controlar la humedad.
dentro del capó; y colocar toallas de papel húmedas con una placa de Petri invertida sobre cubreobjetos recolectados in situ. Varios laboratorios
recomiendan dejar la parte posterior del portaobjetos húmeda en lugar de secar el exceso de gotas de agua. A veces es útil inundar las gotas de
las células con metanol-ácido acético 6: 1 en lugar de la proporción habitual de 3: 1, y esto acelera la evaporación. A veces, en días muy lluviosos y
húmedos, los portaobjetos pueden verse bien en la microscopía de contraste de fase, pero no tienen buena banda G, carecen de contraste. A
veces, esto se puede curar poniendo los portaobjetos sin teñir en el horno caliente para otra ronda de secado (envejecimiento). Las temperaturas
que afectan los resultados de la preparación de portaobjetos son la del aire ambiente, la de los portaobjetos y el agua con la que se recubren, y la
de la superficie sobre la que se secan (placa caliente versus antebrazo versus mesa de trabajo). Al variar una o más de estas temperaturas,
controlamos la velocidad con la que se produce la evaporación. Por ejemplo, hemos cambiado de fijador a temperatura ambiente y agua de
enjuague de portaobjetos a fijador frío y agua en condiciones muy secas para contrarrestar la rápida evaporación. Secar los cubreobjetos in situ
sobre toallas de papel húmedas con hielo alrededor ha sido una técnica común en muchos laboratorios. Secar los portaobjetos en una habitación
muy fría o muy cálida puede alterar la propagación celular adecuada y la morfología cromosómica, y hacer que las bandas sean subóptimas. Es
importante tener control sobre la temperatura del laboratorio. Hansen [87] recomienda cambiar la temperatura del agua con la que se recubren
los portaobjetos antes de dejar caer las células en los portaobjetos para ayudar a controlar la propagación. Ella usa agua de 20 ° C a 48 ° C y
prefiere 41 ° C a 47 ° C para la mayoría de los portaobjetos.
2.4.7 Proporción de fijador
El alcohol en el fijador es un agente que endurece las células y el ácido acético es un agente suavizante. Al cambiar la proporción de estos dos componentes,
la membrana celular se puede fortalecer o ablandar para lograr una menor o mayor extensión, respectivamente. Por lo tanto, algunos laboratorios pueden
optar por utilizar metanol-ácido acético 2: 1 en lugar de la proporción habitual de 3: 1 para cultivos de médula ósea que son difíciles de diseminar o para
amniocitos recolectados in situ. Alternativamente, podrían poner amniocitos en metanol-ácido acético 6: 1 en los días en que la dispersión es un problema.
Recomendamos un enfoque conservador de mantener el fijador estándar 3: 1 a menos que todo lo demás falle, porque esto produce la calidad de banda
óptima y conserva mejor las células. Podemos variar la proporción del fijador utilizado para inundar el portaobjetos después de que se hayan dejado caer las
células para acelerar el secado, en ocasiones. Múltiples fijaciones pueden fortalecer las membranas celulares, mejorar la morfología de los cromosomas y
eliminar la muestra de restos como los glóbulos rojos lisados. La fijación durante la noche en el refrigerador o el congelador también puede fortalecer las
células y hacer que toleren mejor la preparación de portaobjetos. Los tumores y las muestras de médula ósea difíciles, como TODAS las médulas, a menudo
producen cromosomas más nítidos y de mejor propagación después de la incubación en el congelador.
2.4.8 Calidad y frescura del fijador

El metanol-ácido acético hace dos cosas en la célula: a medida que se reduce el pH de la célula, la mayoría de los grupos ácidos como el COO se
convierten en COOH, desnaturalizándolos permanentemente; luego, el fijador deshidrata la célula y reemplaza el agua con metanol, alterando las
proteínas y el ADN [18]. Se requieren células muy secas para una buena distribución. Dado que tanto el metanol como el ácido acético son
higroscópicos (absorben agua del aire), los dos componentes pueden contaminarse con el agua de las botellas de reactivo. La mezcla también
absorbe agua al reposar.
La contaminación del agua en el fijador disminuirá la extensión y la calidad del portaobjetos [17]. Además, ocasionalmente se producen grandes
cantidades de alcohol y ácido acético. Hace algunos años, el fabricante del ácido acético que habíamos usado durante años cambió el material del
revestimiento de plástico de la botella. El ácido se contaminó con este material, volviéndose inútil para fines citogenéticos. Es una buena práctica probar
nuevos lotes en una cosecha pequeña antes de arriesgar una grande.
2.4.9 Altura desde la que se dejan caer las celdas
Aunque un estudio de Lambson et al. [88] no mostró ninguna correlación entre la propagación de los cromosomas y la altura desde la que se caen
las células (entre 0,1 y 0,31 metros), el aumento de la altura se utiliza a veces para aumentar la propagación. Gibas y Jackson [89] especifican el uso
de alturas aumentadas para eliminar las células leucémicas de la médula ósea. Nuestro laboratorio utiliza esto como último recurso en células de
gran ploidía y muy compactadas de tumores sólidos que no se diseminan de ninguna otra manera.
2.4.10 Efectos de absorción
Cuando el portaobjetos se sostiene en el aire durante la caída de las células, la capa de agua y el fijador se acumulan en los bordes del portaobjetos de vidrio.
El agua puede regresar al área de propagación celular y afectar el secado. Colocar el portaobjetos sobre una toalla de papel con el borde largo paralelo al
banco y drenar rápidamente el exceso de líquido puede resolver este problema. El tobogán se puede volver a colocar en posición horizontal y / o el borde
largo opuesto se puede drenar de manera similar sobre la toalla. Esto también parece fomentar la propagación celular debido al efecto de mecha del drenaje
del portaobjetos. El objetivo es una superficie de secado uniforme que conduzca a una velocidad de secado constante que, a su vez, produzca la calidad más
uniforme que se extiende por el portaobjetos.
2.4.11 Flujo de aire
La velocidad de secado de la celda se puede aumentar o disminuir cambiando el flujo de aire sobre el portaobjetos. Esto se puede lograr soplando los portaobjetos,
agitándolos en el aire o usando un ventilador o, como se usa a veces en el método in situ, una bomba de aire para acuarios. La bomba de aire tiene la ventaja adicional de
una capacidad de humidificación, cuando el aire pasa a través de una botella de agua antes de soltarlo sobre los portaobjetos. Las cámaras de secado de portaobjetos
más eficaces utilizan un pequeño ventilador que se puede ajustar para producir varias velocidades de movimiento. Tenga en cuenta el movimiento del aire en el área de
fabricación de toboganes: las personas que pasan rápidamente o las rejillas de ventilación del aire acondicionado pueden ser una fuente de problemas de secado. Una
advertencia al soplar sobre portaobjetos para secarlos: las células de la boca pueden depositarse en el portaobjetos y causar problemas de interpretación con los estudios
FISH en interfase.
2.4.12 Factor de dilución
Un error común en la elaboración de diapositivas es aplicar demasiadas celdas en la diapositiva para que haya muchas metafases entre las que elegir. Las
células apiñadas no se esparcen ni se agrupan tan bien como las células diluidas de manera óptima debido al apiñamiento físico y una cinética de secado
alterada, así como a otros factores, como el ARN extracelular y las proteínas. El apiñamiento de células también ralentiza el tiempo de secado. Si el
esparcimiento es un problema, considere diluir más la muestra.
2.4.13 Limpieza y etiquetado de portaobjetos
Los portaobjetos se pueden utilizar con éxito del paquete del fabricante, dependiendo de qué tan limpios estén [90]; sin embargo, limpiar los portaobjetos
antes de usarlos facilita la uniformidad de esparcimiento y aumenta la calidad de la metafase y la calidad de las bandas (cualquier aceite en el portaobjetos
arruinará el esparcimiento). Nuestro laboratorio limpia los portaobjetos colocándolos en etanol al 95% justo antes de usarlos, frotándolos con un pañuelo de
papel tres o cuatro veces en una dirección y luego sumergiéndolos nuevamente en el alcohol antes de cubrirlos con agua para dejarlos caer. Algunos otros
laboratorios prefieren usar detergentes o combinaciones de detergentes y limpieza con alcohol. Si etiqueta manualmente, asegúrese de usar un lápiz del
número 3 o más duro. Es improductivo limpiar los portaobjetos y luego permitir que los restos de mina de lápiz se desprendan de la etiqueta durante la
tinción y se adhieran a las metafases. Los rotuladores indelebles también se utilizan con éxito y evitan este problema. Muchos laboratorios tienen etiquetas
prefabricadas del LIS para etiquetar portaobjetos; sin embargo, se debe tener precaución, como ocurre con cualquier sistema de preetiquetado, de no
usarlos en el paciente equivocado. Al convertir a etiquetas preimpresas, revíselas para asegurarse de que tanto el pegamento como la tinta de la impresora
sean resistentes a las técnicas de envejecimiento, a los procedimientos de tinción y desengrasado.
2.4.14 Tipo de diapositiva
Es notable lo difícil que puede resultar la creación de diapositivas cuando se cambia el tipo o la marca de las diapositivas, o cuando el fabricante cambia algo
en la producción de diapositivas. Encuentre una marca que contenga una capa uniforme de agua, sin rayas ni gotas, sin hoyos o “líneas de dibujo” del
fabricante en el vidrio, y debería producir diapositivas decentes. A medida que los portaobjetos de vidrio envejecen, se oxidan, comenzando alrededor de los
bordes. Un esparcimiento que difiere de un borde a otro es un signo de un deslizamiento que está oxidado. Los fabricantes están comenzando a poner a
disposición de la comunidad citogenética portaobjetos que se almacenan bajo nitrógeno dentro de paquetes de aluminio para evitar el problema de
oxidación.
2.4.15 Tipo de cultivo y célula
En nuestras manos, hay ciertos tipos de células que se prestan para hacer diapositivas mejor que otros. Todas las cosechas "directas" no
cultivadas (de médula ósea, CVS o tumores sólidos) presentan más dificultades para hacer buenos portaobjetos que sus contrapartes cultivadas.
Las muestras de sangre tienden a ser las más fáciles para obtener buenos portaobjetos, y la médula ósea tiende a ser más difícil, con muestras de
líquido amniótico en el medio. Los cultivos epiteliales son más difíciles que los cultivos de fibroblastos (p. Ej., Ciertos cultivos de líquido amniótico o
de tumores) porque no parecen hincharse tanto en las soluciones hipotónicas.
2.4.16 Técnicas de cultivo y recolección

Variables de cultivo (p. Ej., Hemocultivos micro versus macro, número de células de la médula ósea utilizadas para el inóculo, cultivos de
fibroblastos primarios versus secundarios o subcultivados) y técnicas de recolección (p. Ej., Tipo, cantidad, duración y temperatura de la solución
hipotónica y uso de bromuro de etidio ) puede afectar la calidad y la extensión de las células y puede requerir algunos ajustes en la preparación de
diapositivas. Los cultivos de líquido amniótico primario contienen más células epiteliales muertas que los subcultivos, y estas células pueden
interferir con el secado y contribuir a la dispersión y otros problemas de secado. Los cultivos de sangre o de médula ósea inoculados con
demasiadas células por mililitro de medio nunca se verán tan bien como lo hubieran hecho si el cultivo no hubiera estado abarrotado.
2.4.17 Secado celular in situ
Una vez que el fijador residual se elimina completamente de alrededor de los cubreobjetos o fuera del portaobjetos de la cámara, se realizan las manipulaciones para
ayudar a la propagación de los cromosomas de acuerdo con las condiciones ambientales, si no se dispone de cámaras de secado de portaobjetos comerciales u otras. Si
las condiciones son perfectas, son necesarias pocas manipulaciones. En clima seco, se puede suministrar humedad como para la fabricación de portaobjetos de
suspensión (toallas de papel mojadas debajo de los platos, hielo para retrasar el secado, respirar sobre los portaobjetos / cubreobjetos, vaporizar sobre agua caliente o
humidificador), así como el uso de aire húmedo creado por burbujeo. aire a través de un matraz de agua y luego suavemente sobre el cubreobjetos / portaobjetos.
Si no se ven metafases, la explicación más probable, dada una cultura sana, es la rotura de la metafase, y el siguiente cubreobjetos debe
secarse más rápido. Si hay células presentes pero los cromosomas están encapsulados en membranas citoplásmicas, el siguiente cubreobjetos
debe recibir más humedad y un tiempo de secado más prolongado. Los cubreobjetos con un crecimiento abundante nunca se extenderán tan
bien en el centro de las colonias, ya que las células en interfase evitarán físicamente que se relajen; recoger cubreobjetos con la densidad celular
correcta es casi tan importante como manipular las células durante el secado.
2.4.18 Elaboración de diapositivas para estudios FISH
Varias referencias afirman que los portaobjetos para la hibridación in situ se hibridarán mejor si aparecen grises en lugar de negros en la microscopía de fase. Si bien esto
es cierto, se pueden trabajar con las células más oscuras o más citoplasmáticas. Primero, inundamos el portaobjetos con fijador y lo dejamos secar; este paso aclarará la
mayoría de las células y las hará más planas y más accesibles para la sonda. Los otros pasos previos a la hibridación para tratar las células citoplasmáticas o
tridimensionales son remojarlas durante más tiempo en 2 × SSC antes de realizar la hibridación y / o pretratarlas con un paso de pepsina (consulte el Capítulo 16, sección
16.9.4, Pretratamiento con proteasa para preparaciones de portaobjetos estándar). Las celdas tridimensionales pueden producir una gran profundidad de campo de
señal, lo que requiere mucho enfoque hacia arriba y hacia abajo durante el análisis para detectar todas las señales. Durante la hibridación, las muestras difíciles se pueden
desnaturalizar a temperaturas más altas y durante períodos más prolongados para asegurarse de que el ADN sea completamente monocatenario. De lo contrario, casi
todas las condiciones de fabricación de diapositivas han dado buenos resultados de FISH, en nuestras manos.
2.4.19 Envejecimiento de portaobjetos
Cuando las bandas G se integraron por primera vez en el esquema de laboratorio clínico, un aspecto preocupante del nuevo método fue que solo los portaobjetos que se
habían dejado reposar durante 3 o 4 días eran adecuados para la colocación de bandas. Hasta que envejecieron, los cromosomas resistieron los procedimientos de
anillado, por lo que se alargó el tiempo de respuesta. Después de experimentar, muchos laboratorios descubrieron que calentar las preparaciones de cromosomas de los
portaobjetos en un horno o en una placa caliente durante 12 a 24 horas a 40-60 ° C o 20 minutos a 90-95 ° C solucionaría el problema. y las diapositivas se pueden colocar
con bandas G inmediatamente. Este proceso nunca se ha entendido por completo, pero parece probable que se trate de expulsar el agua. El principal cambio en los
cromosomas causado por el envejecimiento puede ser la oxidación de los grupos de proteínas sulfhidrilo [91]. Se informa que el envejecimiento de los portaobjetos
degrada el ADN cromosómico [92], y esto puede explicar por qué algunos métodos de anillado y metodologías FISH se ven tan afectados por el envejecimiento artificial
por calentamiento de portaobjetos. Todos los métodos de banda G, y muchos otros métodos también, están precedidos por el envejecimiento artificial mediante
portaobjetos de calentamiento o, a veces, microondas. El proceso de envejecimiento es muy importante, ya que proporciona un mejor contraste y nitidez incluso a los
cromosomas con bandas Q, que en realidad no requieren un envejecimiento previo. Debido a que las bandas Q no requieren envejecimiento, las bandas Q secuenciales a
FISH han sido útiles en nuestro laboratorio. También es importante ser constante en los portaobjetos envejecidos (o no envejecidos) para otros métodos, como las bandas
C y G-11, para controlar los tiempos de tratamiento. En nuestra experiencia, los toboganes para FISH pueden estar envejecidos o no. Las señales tienden a ser mucho más
nítidas y discretas para preparaciones envejecidas; sin embargo, el sobreenvejecimiento puede hacer que las señales se atenúen o provocar una falla en la hibridación. Los
portaobjetos que se guardarán durante varias semanas o meses para FISH u otras aplicaciones pueden mantenerse en un ambiente desecado y con deficiencia de
oxígeno (por ejemplo, bajo gas nitrógeno en una bolsa Ziploc o en nitrógeno líquido) a –20 ° C hasta que se necesiten. para evitar que envejezcan de forma natural. Los
portaobjetos que se han horneado durante más de 10 minutos a una temperatura de 90–95 ° C deben rehidratarse antes de usarlos para FISH (consulte el Capítulo 16,
sección 16.9.4, Portaobjetos de envejecimiento y horneado). Es posible arruinar los portaobjetos para las bandas G dejándolos en un horno caliente durante demasiado
tiempo (p. Ej., 90 ° C durante 2 horas). Debido a que las bandas Q no requieren envejecimiento, las bandas Q secuenciales para FISH son útiles en nuestro laboratorio. bajo
gas nitrógeno en una bolsa Ziploc o en nitrógeno líquido) a –20 ° C hasta que se necesiten, para evitar que envejezcan de forma natural. Los portaobjetos que se han horneado durante más de 10 m
2.5 Tinción de cromosomas

Hay tres tinciones capaces de diferenciar todos los cromosomas: bandas G, R y Q (Figura 2.2). La tinción analítica de elección en los Estados Unidos es la
banda G, porque es simple y brinda mucha información detallada. Algunas partes de Europa utilizan bandas R para una tinción primaria, y algunos
citogenetistas prefieren las bandas Q para ciertos tipos de estudios (p. Ej., Neoplasias hematológicas y preparaciones directas de CVS, en las que es difícil
obtener buenas bandas G ) debido a su independencia de las variables previas al tratamiento y la utilidad del cromosoma Y brillante para determinar el sexo.
Sin embargo,
Las bandas Q se están volviendo menos importantes para estas aplicaciones a medida que los laboratorios mejoran los métodos de médula ósea mediante
bandas G, y dado que las preparaciones directas de CVS se están reemplazando en algunos laboratorios con FISH en interfase para la aneuploidía en células
de vellosidades coriónicas no cultivadas. Las variantes de la banda Q también son muy útiles para determinar el origen de los cromosomas (consulte el
Capítulo 6, sección 6.2.1, Importancia clínica de QFQ, y el Capítulo 10, sección 10.3, Tumores de células germinales: UPD e impronta). Esto fue una vez
especialmente útil para determinar si el injerto había tenido lugar en muestras posteriores al trasplante de médula ósea (ahora se usa FISH en interfase en su
lugar, ya que se pueden calificar números mucho más grandes de células), para buscar disomía uniparental de los cromosomas 14 o 15, y para demostrar
isodisomía completa en teratomas, entre otras cosas.
Otras tinciones que pueden usarse en ciertos casos incluyen AgNOR (plata) para teñir tallos acrocéntricos con genes organizadores
nucleolares activos; Bandas C para teñir la heterocromatina genéticamente inerte; G-11 para teñir un subgrupo de heterocromatina y
diferenciar entre, por ejemplo, los cromosomas 19 y 20 o X e Y; Tinción de punto C para distinguir áreas centroméricas; tinción de
endonucleasa (bandas de Alu, etc.) para permitir patrones específicos de heterocromatina; y FISH con varias sondas para descubrir el
origen, la composición y el orden de las unidades cromosómicas y subcromosómicas (consulte el Capítulo 6, Tinciones cromosómicas;
Capítulo 16, Hibridación in situ por fluorescencia). Una vez realizada la tinción, se examinan los portaobjetos y se fotografían las células
en metafase o se obtienen imágenes electrónicas (Capítulo 15, Imágenes por computadora), se analizan los cromosomas (Capítulo 7,
Cromosomas humanos: Identificación y variaciones; Capítulo 9, Anomalías cromosómicas constitucionales; Capítulo 11, sección
11.7.2, metodología citogenética; Capítulo 12, sección 12.2.16, Análisis de cromosomas) e informado (Capítulo 8, ISCN: El lenguaje
universal de la citogenética; Capítulo 23, Sistema de información de laboratorio).
2.6 Microscopía / análisis de cromosomas

Una vez que se han anillado las preparaciones de cromosomas, generalmente con bandas G en la mayoría de los laboratorios, los cromosomas se
analizan bajo un microscopio para detectar aberraciones numéricas y estructurales. El portaobjetos se escanea de manera metódica, campo por
campo, ya sea viajando hacia arriba y hacia abajo o de derecha a izquierda en el portaobjetos utilizando una lente de baja potencia (10-16 ×),
buscando celdas de metafase. Una vez encontrada, cada celda se examina a alta potencia (lente de 60 × o 100 ×, generalmente del tipo de
inmersión en aceite). Después de determinar si la célula es de calidad razonable, se cuenta y, al menos, se analiza parcialmente, buscando
cromosomas sexuales y verificando otros cromosomas de interés, según el motivo de la derivación. Por ejemplo, para una referencia de
La LMC, los 9 y los 22 se controlarían de forma rutinaria para detectar la translocación entre 9 y 22 brazos largos que caracterizan la enfermedad
(consulte el Capítulo 11, sección 11.4.1, Leucemia mielógena crónica). Para una derivación de síndrome de Down, la atención se centrará en
detectar una copia adicional del cromosoma 21 (consulte el Capítulo 9, sección 9.1, Anomalías numéricas). Las coordenadas de la etapa para cada
célula se registran en la hoja de análisis junto con el recuento de cromosomas y cualquier anomalía observada, así como la composición de los
cromosomas sexuales y cualquier otro hallazgo pertinente. A menudo, se registra una notación de la posición de ciertos cromosomas para cada
célula, de modo que pueda ser reidentificada en otro momento o por otro tecnólogo. Por ejemplo, se puede registrar el cromo más cercano a las
posiciones de las 6 y las 12 en punto o las posiciones de las 3 y las 9 en punto; esto suele ser único para todas las células de un estudio. Algunas
células se analizan completamente bajo el microscopio para asegurarse de que cada cromosoma coincida con su par (homólogo) y también para
determinar si todas las bandas están presentes y en el orden correcto. Los tecnólogos experimentados pueden diferenciar todos los cromosomas
por tamaño, forma y patrones de bandas. Los patrones de bandas cromosómicas se aprenden mejor mediante el cariotipo repetido, utilizando un
buen ejemplo de cromosomas en varias longitudes (consulte el Capítulo 7, Cromosomas humanos: identificación y variaciones).
Una célula adecuada suele estar razonablemente bien distribuida y bien agrupada, aunque la calidad puede verse comprometida en varios estados
patológicos; sin embargo, en los análisis de cáncer, pueden ser las células pobres las que demuestren anomalías clonales. Una vez que se encuentra una
celda adecuada, se cuenta mediante uno de varios métodos:
1. Ubicar la celda bajo la lente de aceite de alta potencia de un microscopio y contar de manera sistemática, dividiendo mentalmente la celda en
mitades, cuadrantes u otras subdivisiones, y contando una subdivisión a la vez, continuando hasta completar todas las subdivisiones. . El
conteo se puede hacer de a uno o de dos en dos. Por lo general, las células contadas mediante este método se cuentan para confirmar el
número de cromosomas original.
2. Imprimir una fotografía o imagen capturada de la celda desde un sistema de imágenes y luego marcar la impresión con un bolígrafo o crayón
de marcado para facilitar la precisión.
3. Contar electrónicamente la imagen usando una función de software del sistema de imágenes; esto marca todos los cromosomas con un clic del mouse y
lleva un recuento.
4. Preparar un cariograma a partir de una imagen capturada, ya sea cortando manualmente cada cromosoma de una impresión o utilizando un software
de imágenes para "cortar" electrónicamente el cariograma o para marcar cada cromosoma en una extensión a medida que se analiza en la pantalla. Por
lo general, las células contadas mediante los métodos 1 a 3 se cuentan para confirmar el número de cromosomas original.
5. Para determinar la composición citogenética de la muestra de cada paciente, se cuentan múltiples células, generalmente veinte por caso, (p. Ej., La
mayoría de las referencias citogenéticas de rutina que involucran una anomalía constitucional) y / o se analizan completamente (p. Ej., Todos los casos
neoplásicos). A menudo, las células de más de un cultivo se analizan por motivos de control de calidad, porque a veces las células anormales se limitan a
un determinado cultivo o cultivos. Si una célula tiene más o menos de 46 cromosomas, la célula debe ser analizada para determinar qué sobra o falta, y
esta información, junto con otros datos, como las coordenadas de la etapa del microscopio, se registra en la hoja de análisis o en la hoja de análisis.
Sistema de imágenes / LIS, si el laboratorio no tiene papel.
Las células mejor representativas, normales o anormales, se fotografían o visualizan (consulte el Capítulo 14, sección 14.5, Captura de la imagen microscópica y el Capítulo
15, Imágenes por computadora) y algunas o todas se analizan por completo (p. Ej., Comparando la presencia, posición y tamaño de la banda en cada par homólogo). Esto
se puede lograr haciendo una copia impresa de algunas o todas las células y analizando el resto a ojo bajo el microscopio o desde una imagen de computadora de una
extensión (una célula que no ha sido cortada o cariotipo) o en una impresión. . Para analizar a simple vista, todos los cromosomas se identifican encontrando primero los
homólogos de cada par en una secuencia metódica y luego comparando sus bandas en busca de diferencias. Algunos tecnólogos prefieren recorrer la célula en orden
numérico desde el cromosoma 1-22 y X e Y, y algunos encuentran primero los cromosomas más pequeños o los cromosomas acrocéntricos primero, y luego pasan a los
demás. Dentro de estas cinco imágenes fotografiadas colectivamente, la cobertura debe estar representada al menos una vez por cada par de cromosomas, por ejemplo,
sin regiones superpuestas o poco claras. Algunos protocolos de laboratorio requieren que dos tecnólogos diferentes revisen cada celda o realicen diferentes partes del
estudio como control de calidad. Se recomienda que cualquier cuestión de anomalías se marque para la revisión del director cuando se prepare en un sistema de software
analítico, o se registre en la hoja de análisis y el director o la persona designada las rubrican después de la verificación. sin regiones superpuestas o poco claras. Algunos
protocolos de laboratorio requieren que dos tecnólogos diferentes revisen cada celda o realicen diferentes partes del estudio como control de calidad. Se recomienda que
cualquier cuestión de anomalías se marque para la revisión del director cuando se prepare en un sistema de software analítico, o se registre en la hoja de análisis y el
director o la persona designada las rubrican después de la verificación. sin regiones superpuestas o poco claras. Algunos protocolos de laboratorio requieren que dos tecnólogos diferentes revisen
La mayoría de las pautas requieren la documentación de dos cariogramas de cada clon de línea madre anormal y uno para líneas laterales
anormales y células normales; para casos normales, como mínimo, se preparan un total de dos o tres por caso.
Una vez que se completa el análisis, se diseñará un cariotipo que explicará los hallazgos normales o anormales en un formato de
nomenclatura específico (consulte el Capítulo 8, ISCN: El lenguaje universal de la citogenética). La mayoría de las pautas también requieren un
mínimo de dos cariogramas (representación pictórica a través de la disposición sistemática de pares de cromosomas en orden numérico) por caso
no mosaico. Las muestras encontradas constitucionalmente en mosaico o que muestran evolución clonal neoplásica pueden requerir un
cariograma adicional para representar cada línea celular adicional.
2.6.1 Anomalías cromosómicas

Cada cromosoma está compuesto por dos cromátidas unidas en la constricción primaria, que generalmente se llama centrómero. Las secciones del cromosoma a cada
lado del centrómero se llaman brazos. Los cromosomas humanos se clasifican morfológicamente según la posición relativa del centrómero. En cualquier propagación en
metafase de los cromosomas humanos, algunos cromosomas tienen su centrómero en el medio, algunos lo tienen en un extremo y otros lo tienen en algún lugar entre
estos dos puntos. La terminología de los cromosomas refleja estas diferencias. Los cromosomas se describen como metacéntricos (centrómero en el medio),
submetacéntricos (centrómero un poco alejado del medio de modo que un brazo es definitivamente más largo que el otro), acrocéntricos (centrómero cerca de un
extremo) o telocéntrico (centrómero justo en el extremo ) (consulte la Figura 2.18 y el Capítulo 7, sección
7.2, Descripción de las formas de los cromosomas humanos). No hay cromosomas verdaderamente telocéntricos en el cariotipo humano normal, aunque
algunos reordenamientos tumorales pueden parecer telocéntricos. En el sistema internacional de nomenclatura de cromosomas humanos, los brazos cortos
se denominan brazos p (de petit) y los brazos largos se denominan brazos q [32].
Cada cromosoma en metafase debe tener un centrómero para unirse al aparato de fibras del huso durante la división celular. Los
cromosomas que no tienen centrómeros tienden a perderse de las células hijas porque se quedan atrás en la anafase y son excluidos del núcleo
reformado en la telofase. La excepción a la regla es la formación de pequeños cromosomas de “doble minuto” (dmin) que se encuentran en
algunos tumores. Estos dmin son comúnmente el sitio de amplificación de genes y pueden tener un mecanismo para su inclusión en células hijas.
Algunos cromosomas también tienen una constricción secundaria, llamada tallo (stk), que es una porción delgada y variable que no se tiñe de
manera muy oscura con la tinción de Giemsa. Los tallos aparecen con frecuencia en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos,
conectando los satélites (pequeñas perillas de cromatina que generalmente se encuentran en los extremos de los brazos cortos de los
acrocéntricos) al centrómero. Estas constricciones secundarias en los cromosomas acrocéntricos ("D" y "G", ver Figura 2.18) son sitios de síntesis
de ARN ribosómico en el núcleo en interfase y se denominan regiones organizadoras del nucleolo (NOR). En ocasiones, se observan constricciones
secundarias en otros cromosomas, como el cromosoma 9, justo debajo del centrómero. En las fotografías, las constricciones secundarias pueden
confundirse con huecos porque son muy delgadas y pálidas; Sin embargo, pueden verse a través del microscopio y, por lo tanto, pueden
diferenciarse de los verdaderos huecos. Los huecos en los cromosomas pueden deberse a roturas cromosómicas, como en la anemia de Fanconi,
o sitios frágiles, como el síndrome del X frágil [93]. El número normal de cromosomas humanos es 46. norte complemento, que resulta de la
fertilización de un óvulo haploide, con 23 cromosomas (el humano ' norte '
Telocéntrico
Satélite
Secundario
Acrocéntrico
constricción
(tallo)
Submetacéntrico
Metacéntrico
Acéntrico
Dicéntrico
Figura 2.18 Formas cromosómicas. el tamaño y la forma de un cromosoma es una parte integral de la identificación de un cromosoma, junto con su
patrón de bandas (no se muestra).
número), o por un espermatozoide haploide, los cuales se denominan gametos (consulte el Capítulo 1, sección 1.2.4, Meiosis). Este número puede
variar debido a una serie de errores en la división celular, es decir, durante la meiosis, la fertilización o la mitosis. Si el error ocurre meióticamente,
puede resultar en aneuploidía (células distintas de diploide), o si el error se debe a un error de fertilización (p. Ej., Conjuntos adicionales de
cromosomas de un segundo espermatozoide o del cuerpo polar del óvulo) , puede conducir a errores de ploidía, como triploidía (69 cromosomas)
o tetraploidía (92 cromosomas). Si el error surge post-cigoto durante la división mitótica, puede conducir al mosaicismo o la presencia de más de
un clon en el cigoto (ver más adelante). Tales hallazgos se llamarían constitucionales, es decir, presentes en la estructura hereditaria básica del
sujeto. Alternativamente, una célula de la médula ósea de un adulto puede sufrir una no disyunción del cromosoma 8, lo que da lugar a un clon
con trisomía 8 y enfermedad hematológica (véase el capítulo 11). Este hallazgo se llamaría una anomalía adquirida, ya que no es innato y
representa un nuevo cambio en la composición genética de ese clon de células. Las anomalías adquiridas están presentes solo en las células
neoplásicas, pero no en las células normales no enfermas, por lo que a menudo estos estudios requieren una atención extrema para encontrar las
células anormales.
Durante el recuento de células, un tecnólogo experimentado también puede detectar muchos reordenamientos cromosómicos estructurales.
Se dice que un cromosoma al que le falta material se elimina para esa porción. Si un segmento se repite, se denomina duplicación. Un cromosoma
también puede exhibir un intercambio de material con otro cromosoma (llamado translocación), que puede estar equilibrado o desequilibrado. En
una translocación equilibrada no se pierden ni se ganan segmentos cromosómicos. Una translocación desequilibrada implica la pérdida o
ganancia de uno o más segmentos cromosómicos que resultan en monosomías o trisomías parciales, respectivamente. Esto puede implicar, en un
estudio de cromosomas no neoplásicos, una translocación, inversión u otra reordenación balanceada parental a partir de la cual el cromosoma
desequilibrado se deriva por segregación errónea meiótica. Una localización trans desequilibrada adquirida en una neoplasia es, por otro lado,
generalmente causada por un evento mitótico en las células malignas. A veces, se debe realizar un cariotipo en un hemocultivo estimulado de un
paciente con cáncer para determinar el origen de una anomalía observada en el cáncer, si todas las células examinadas en el estudio muestran el
mismo cariotipo anormal.
A veces, una translocación equilibrada en un individuo puede formar configuraciones meióticas inusuales al prepararse para la disyunción en
los gametos. Puede ocurrir un fenómeno llamado disyunción meiótica 3: 1, con un reparto desigual de los cromosomas de translocación a medida
que la célula se divide. Esto puede resultar en una descendencia con aneuploidía y translocaciones desequilibradas, y también puede conducir a
un estado llamado disomía uniparental, en el que ambos homólogos de un par de cromosomas provienen del mismo progenitor y no hay
contribución del otro progenitor. Por ejemplo, una translocación que involucre los cromosomas 1 y 15 en uno de los padres podría
no se separan de modo que la célula hija subsiguiente adquiere los cromosomas 15 normales y translocados. Cuando los dos gametos
se fusionan, uno de los ahora tres cromosomas 15 se perderá como resultado del retraso de la anafase (pérdida de una cromátida en la
anafase porque no está unida a huso y, por lo tanto, no es atraído hacia el polo), un fenómeno conocido como rescate de trisomía (ver
Capítulo 10, sección 10.2.2, Disomías uniparentales de cromosomas completos). Si el cromosoma perdido era del segundo compañero,
el embrión adquirirá dos cromosomas 15 del mismo padre y, por lo tanto, tendrá una disomía uniparental para el cromosoma 15.
Dependiendo de qué padre provienen los dos cromosomas 15, la descendencia tendrá Prader– Síndrome de Willi o Angelman (consulte
el capítulo 10, sección 10.2.1, Síndromes cromosómicos).
Otro tipo de translocación que se observa comúnmente en los estudios constitucionales es la fusión de
dos cromosomas acrocéntricos que conducen a un cromosoma biamado denominado translocación
robertsoniana, como resultado del descubrimiento de tales translocaciones en los saltamontes por el Dr.
WRB Robertson en 1916. Más de uno por cada mil niños nacidos vivos se lleva a cabo una translocación de
este tipo, y puede ser equilibrada o desequilibrada. Algunos niños con síndrome de Down tienen
reordenamientos robertsonianos del cromosoma 21 adicional con participación de uno de los otros
cromosomas acrocéntricos (nota: el número de cromosomas sería 46, aunque el material genético esté
desequilibrado). Estos pueden heredarse de uno de los padres que puede llevar la forma equilibrada de la
translocación robertsoniana.
Algunas translocaciones ocurren en grupos dentro de secuencias específicas, como ocurre con la translocación familiar entre el brazo corto del
cromosoma 11 y el brazo largo del cromosoma 22 en las bandas 11q23.3 y 22q11.2. Ésta es la translocación que ocurre con más frecuencia en las anomalías
constitucionales, y los puntos de ruptura ocurren en secuencias palindrómicas largas ricas en AT (secuencias con bases de imágenes especulares que se
enredan sobre sí mismas). No se sabe por qué las secuencias palindrómicas son propensas a la translocación.
Otros tipos de desequilibrio incluyen duplicaciones y deleciones causadas por una alineación inusual de cromosomas cuando hay una
inversión presente. Una inversión puede involucrar el centrómero del cromosoma (inversión pericéntrica) o no (paracéntrica). Durante la meiosis,
para que el cromosoma empareje toda su longitud gen con gen, el cromosoma invertido tiene que hacer una configuración de bucle dentro de
una forma de gusano pulgada adoptada por el homólogo (capítulo 9, figuras 9.17 y 9.18). Esto puede resultar en gametos desequilibrados (ver
Capítulo 9, sección 9.2.4, Inversiones), con duplicaciones y eliminaciones (o deficiencias) particulares. Los portadores de inversiones tienen un
mayor riesgo de abortos espontáneos y descendencia desequilibrada debido a este error meiótico.
El desequilibrio citogenético también puede surgir de cromosomas adicionales no identificables por ningún patrón de
bandas definitivo. Estos se denominan cromosomas marcadores. A veces, un marcador se puede caracterizar con FISH y
métodos de tinción especiales para que se componga de múltiples cromosomas mezclados, o pueden ser una pequeña parte de
un cromosoma con bandas insuficientes para ser reconocibles. Los cromosomas pueden formar estructuras de anillo y estas
pueden formarse a partir de un solo cromosoma o de varios cromosomas. Pueden ser constitucionales o adquiridos en el
cáncer. Pueden representar un solo homo logue en un cariotipo euploide o pueden ser supernumerarios. Los anillos a menudo
aparecen en diferentes formas en diferentes células del paciente debido al intercambio de cromátidas hermanas (ver Capítulo 6,
sección 6.3, Intercambios de cromátidas hermanas y Capítulo 13, Síndromes de inestabilidad cromosómica).
La aneuploidía también puede deberse a un artefacto técnico de la preparación (a menudo denominado "pérdida aleatoria de cromosomas").
Los pequeños cromosomas se pierden comúnmente debido a un pequeño desgarro en la membrana citoplasmática a través del cual pueden
escapar, ya sea durante la recolección o durante la preparación de portaobjetos. Uno de estos cromosomas escapados también puede
desplazarse a una metafase vecina durante el secado del portaobjetos. Las reglas para distinguir entre artefacto técnico y mosaicismo verdadero,
tal como lo define el Comité Internacional Permanente de Nomenclatura Cromosómica en el libro ISCN [94], es tener en cuenta estas ganancias y
pérdidas aleatorias, y el mosaicismo verdadero requiere la presencia de dos o más células con un cromosoma extra específico para ser llamado
significativo ("clonal"), y tres o más células con un cromosoma faltante para ser considerado clonal.
2.6.2 Mosaicismo
El mosaicismo generalmente surge después de la fertilización, a través de una segregación inexacta de los cromosomas en la
mitosis. Cuando esto ocurre, diferentes linajes celulares (por lo tanto, cariotipos) que se han originado a partir de un solo cigoto
estarán presentes en diferentes células o tejidos dentro de ese individuo, como el hallazgo de algunos. células en una muestra
con 45 cromosomas y solo un cromosoma X, y las células restantes con 46 cromosomas y dos cromosomas X, como se observa
en individuos con síndrome de Turner en mosaico. Otros ejemplos de síndromes en mosaico documentados incluyen el
síndrome de Pallister-Killian, el mosaicismo por trisomía 20 y el mosaicismo placentario confinado (véase el capítulo 5, sección
5.6.2, Mosaicismo placentario confinado y disomía uniparental). Un tipo de mosaicismo mucho menos común, llamado
quimerismo, es el resultado de dos embriones (cigotos) que se fusionan en uno,
Si se encuentran dos o más líneas celulares cromosómicamente distintas, se puede informar si se observan al menos dos cromosomas con la
misma anomalía estructural o cromosoma adicional, o si se observan al menos tres células con pérdida del mismo cromosoma [94]. El cultivo in
vitro puede provocar un error mitótico (artefacto cultural); por lo tanto, encontrar la anomalía idéntica en una (s) cultura (s) independiente (es) se
vuelve fundamental para interpretar el mosaicismo (ver el Capítulo 4 para una discusión de las culturas primarias). Cuando se sospecha
mosaicismo pero no se encuentra, o se encuentra pero no cumple con los estándares notificables, otra fuente de muestra, por ejemplo, piel,
mucosa bucal u otro tejido, o el uso de FISH, puede ayudar a confirmar o descartar su presencia.
Se han postulado dos mecanismos para dar cuenta de los errores de segregación, como se muestra en la Figura 2.19. La no
disyunción es la falla de las dos cromátidas para separarse en el centrómero en la metafase, lo que hace que ambas cromátidas vayan a
la misma célula hija, lo que lleva a una célula hiperdiploide (más del número diploide correcto) y una célula hipodiploide (menos del
número diploide correcto). ) célula. El retraso anafásico, el segundo mecanismo de errores de segregación, es la pérdida de una
cromátida en la anafase debido a la falta de su unión al huso, por lo que no se atrae hacia el polo. Esto causa una célula hija hipodiploide
y una normal.
El nivel de mosaicismo entre los diversos tejidos de un organismo depende de la etapa de desarrollo en la que ocurrió el error de división (Figura 2.20). Si
se produce una división errónea en la primera división celular después de la fertilización, es posible que todos los tejidos del cuerpo se vean afectados, con
líneas de mosaico del 50% cada una, asumiendo la misma supervivencia y actividad mitótica. Si la división errónea se produce después de que se hayan
establecido los tres tipos de células (ectodermo, mesodermo y endodermo), las células anormales podrían localizarse en un tipo de célula (p. Ej., Solo
fibroblastos de la piel); si ocurre aún más tarde, podrían aparecer anomalías en un solo órgano del cuerpo (p. ej., vejiga). El efecto fenotípico podría depender
del porcentaje y la ubicación de las células anormales presentes en el cuerpo. Por lo tanto, Es importante tener en cuenta que puede ser necesario el análisis
de una fuente de tejido diferente en los estudios prenatales (p. ej., sangre periumbilical, cultivo de orina) para encontrar ciertos estados de mosaico, o que a
veces tejidos extrafetales, como placenta o las membranas fetales mostrarán una línea anormal (mosaicismo placentario confinado, que puede provocar
retraso del crecimiento), mientras que el feto es cariotípicamente normal (véase el capítulo 5, sección 5.6.2, mosaicismo placentario confinado y disomía
uniparental). Vea la Figura 2.21. 6.2, mosaicismo placentario confinado y disomía uniparental). Vea la Figura 2.21. 6.2, mosaicismo placentario confinado y
disomía uniparental). Vea la Figura 2.21.
(a)
(B)
(C)
(D)
Figura 2.19 Separación normal y anormal de cromátidas en la mitosis. (a) Cromosomas en la placa de metafase entre centriolos. (b)
Disyunción normal en anafase: un cromosoma en cada centríolo. (c) No disyunción en anafase: dos cromátidas viajan a un centríolo, lo que
da como resultado una célula con un cromosoma extra y una célula con un cromosoma faltante. (d) retardo de anafase: una cromátida no se
une al huso y, por lo general, se excluye de los núcleos y se pierde en ambas células hijas.
(a) (B) (C)

46 47 45
46 47 46
46 47 47
46 46 46
46 45 46
46 45 46
46 45 46
Figura 2.20 el desarrollo del mosaicismo en el cigoto temprano. (a) División celular normal. (b) Segregación desequilibrada en el primer evento mitótico causado
por no disyunción. esto da como resultado líneas celulares con 45, 46 y 47 cromosomas y, a menudo, está presente en todos los tipos de tejidos examinados. (c)
Segregación desequilibrada en el segundo evento mitótico causado por no disyunción. esto también da como resultado líneas celulares con 45, 46 y 47
cromosomas; sin embargo, si los tejidos han comenzado a formarse en capas germinales separadas, una o más de las líneas celulares anormales podrían limitarse
a un solo tipo de tejido, como la piel, que se deriva de la capa de células germinales particular involucrada.
Célula fertilizada
Tejido extraembrionario
Placenta (corion, amnios) Embrión
Ectodermo Endodermo Mesodermo
Epidermis Canal alimenticio Huesos

Sistema nervioso central Pulmones Cartílago
Ojos Hígado Músculo
Páncreas Dermis
Tracto urinario
Corazón
Sangre y vasos sanguíneos
Sistema reproductivo
Figura 2.21 Genealogía de los órganos del cuerpo. Para verificar el mosaicismo, se deben examinar tejidos de diferentes grupos. Tenga en cuenta,
por ejemplo, que la sangre es de origen mesodérmico y la piel es ectodérmica.
Las directrices de la Asociación de Citogenética Clínica del Reino Unido [95] describen una definición de tres niveles para interpretar
el mosaicismo, de Hsu y Benn [96], cuando se encuentra al menos una célula anormal en estudios prenatales:
Nivel I, cuando se encuentra una única metafase aberrante dentro de una sola colonia, por lo demás normal, o en una sola cosecha de cultivo en
suspensión.
Capítulo 2: Citogenética: una descripción general / sesenta y cinco
Nivel II, cuando una anomalía se limita a un solo recipiente de cultivo, ya sea que incluya una colonia completa o se observen
cromosomas aberrantes entre las células normales de un matraz monocapa.
Nivel III, o mosaicismo verdadero, cuando la anomalía se ha documentado en dos o más vasos de cultivo independientes.
Consulte el Capítulo 5, sección 5.4.8, Mosaicismo, para conocer las acciones que se deben tomar y los factores a considerar al resolver una posible situación de mosaico
prenatal.
No hay forma de eliminar totalmente la posibilidad de mosaicismo en el paciente en estudio, porque no todos los tipos celulares están presentes en la muestra en
estudio. La muestra es representativa de las células del cuerpo del que procede, y no representativa de otros tejidos del individuo. Sin embargo, es posible contar
suficientes células para eliminar ciertos niveles de mosaicismo dentro de esa fuente de tejido. Las tablas de Hook [97] se aplican a los estudios de linfocitos y los estudios
de Clausen et al. [98] y Cheung et al. [99] se calculan para líquidos amnióticos. En cada estudio, el análisis estadístico se basa en el supuesto de que la muestra obtenida es
verdaderamente aleatoria (aunque probablemente no lo sea) y que todas las células crecen a la misma velocidad y se comportan igual en el matraz de cultivo in vitro (que
probablemente no lo sea). cierto tampoco). Estas tablas son muy útiles como guía para evaluar los niveles de confianza del mosaicismo, porque muestran el porcentaje de
mosaicismo excluido y los niveles de confianza que pueden aceptarse si un número específico de celdas tienen recuentos idénticos (tenga en cuenta que los "recuentos"
pueden denotar análisis también para buscar mosaicos estructurales). El recuento recomendado de 20 células idénticas en una muestra de paciente significa que se
puede excluir un mosaicismo superior al 14% con un nivel de confianza del 95%. Para descartar un mosaicismo superior al 10% para el mismo nivel de confianza es
necesario contar 30 celdas idénticas en una muestra. Aumentar los recuentos a 50 celdas idénticas solo mejorará la tasa de detección al 6%, con el mismo nivel de
confianza; por tanto, la pequeña mejora puede no justificar las 20 células adicionales contadas. Por otro lado, Si hay suficiente evidencia clínica para justificar la
investigación del mosaicismo de bajo nivel, puede ser necesario examinar un mayor número de células u obtener una muestra de una fuente de tejido diferente,
especialmente cuando el diagnóstico clínico sugiere fuertemente un síndrome que no es encontrado al estudiar 20 metafases de un cultivo de linfocitos. También se
pueden justificar células adicionales para un estudio de cáncer o para la investigación de sitios frágiles o síndromes de rotura; sin embargo, incluso una sola célula
neoplásica anormal puede notificarse si esa aberración se informó previamente en una muestra anterior de ese paciente [94]. especialmente cuando el diagnóstico clínico
sugiere fuertemente un síndrome que no se encuentra al estudiar 20 metafases de un cultivo de linfocitos. También se pueden justificar células adicionales para un
estudio de cáncer o para la investigación de sitios frágiles o síndromes de rotura; sin embargo, puede notificarse incluso una sola célula neoplásica anormal si esa
aberración se informó previamente en una muestra anterior de ese paciente [94]. especialmente cuando el diagnóstico clínico sugiere fuertemente un síndrome que no se encuentra al estudiar
Debido a que la incubación a largo plazo puede aumentar el riesgo de artefactos culturales, encontrar una célula anormal en el material
prenatal requiere sus propios criterios para diferenciar el mosaicismo verdadero de los cambios artefactos esporádicos (pseudomosaicismo). Por
ejemplo, cada linaje celular debe observarse en más de un cultivo primario independiente; por lo tanto, cada colonia en todos los cultivos
primarios, excepto la que tenía la anormalidad, sería revisada hasta que una segunda colonia pueda validar el hallazgo. Si solo se observó en ese
cultivo original, pero el hallazgo se correlaciona con los hallazgos clínicos, puede ser necesario realizar pruebas alternativas (p. Ej., FISH, matriz o
amniocentesis de seguimiento). Los hallazgos anormales en el tejido prenatal también podrían provenir de tejidos extrafetales, como la placenta o
las membranas (mosaicismo placentario confinado), mientras que el feto es normal. En particular, se ha informado de una copia adicional del
cromosoma 2 o del cromosoma 7 como un artefacto de los cultivos prenatales y por lo general no tiene importancia clínica (ver Capítulo 5, sección
5.6.2, Mosaicismo placentario confinado y disomía uniparental). Vea la Figura 2.21. Estas situaciones se han discutido ampliamente en la literatura
[100-112]. (Véase también el Capítulo 5, Diagnóstico cromosómico prenatal). Si no se encuentran más células (o colonias, en el caso del análisis de
cultivo in situ) de un cultivo independiente idénticas a la célula anormal (o colonia) ya anotada, entonces generalmente se puede suponer que la
célula aberrante es un artefacto y mosaicismo de más del 10% se puede excluir a un nivel de confianza del 95%. Si se encuentran otras células con
la misma aberración en una segunda fuente de cultivo independiente, es posible que haya un mosaicismo de bajo nivel y se debe informar.
particularmente si el cariotipo de la línea menor representa una condición clínicamente descrita y los hallazgos clínicos son consistentes con ese
hallazgo citogenético. Es importante estar al día con las nuevas pautas para interpretar el mosaicismo que se publican de vez en cuando.
Otro método para detectar mosaicismo es utilizar la hibridación in situ de fluorescencia en interfase (FISH), si hay sondas disponibles
para la detección en interfase de la anomalía. FISH se puede utilizar para ampliar el número de células puntuadas para una anomalía
determinada y para investigar tejidos alternativos con diferentes orígenes de la capa de células germinales, como el tejido epitelial en la
piel o los frotis bucales. Es importante saber primero cómo se comportan las células en metafase del paciente con la sonda utilizada, ya
que las sondas de ADN satélite alfa pueden tener patrones variantes en algunos individuos, con señales adicionales o incluso señales
ausentes en las células normales (ver Capítulo 16). Microarray CGHanalysis también proporciona análisis para delinear anomalías
estructurales, comparación de anomalías heredadas entre padres e hijos,
2.6.3 Rotura de cromosomas

Los cromosomas cultivados pueden exhibir naturalmente lagunas y roturas en las cromátidas como resultado de artefactos culturales. Las
lesiones varían desde un espacio de tinción donde se produjo la ruptura hasta el desplazamiento completo del fragmento cromosómico muy
alejado del cromosoma. Estas brechas y roturas pueden provocar reordenamientos cromosómicos, incluidas translocaciones, inversiones y
formaciones cromosómicas en anillo. Existen afecciones autosómicas recesivas que predisponen a los individuos a roturas cromosómicas y
formaciones radiales (Capítulo 13, Figura 13.2) y, en consecuencia, al cáncer. Los ejemplos incluyen el síndrome de Bloom, la anemia de Fanconi y
la ataxia telangiectasia (véase el capítulo 13, Síndromes de inestabilidad cromosómica).
Algunas regiones del genoma que tienen secuencias de ADN repetitivas pueden presentar brechas cromosómicas y roturas en puntos de
ruptura específicos en el cariotipo conocidos como sitios frágiles. Un ejemplo de un sitio frágil es el frágil Xq27.3 que causa el fenotipo del
síndrome de Martin Bell (X frágil). La prueba para esta afección fue un estudio de rotura citogenética hasta el advenimiento de una prueba de ADN
para el ADN repetido que ahora es el estándar de atención para diagnosticar el X frágil tanto en los portadores como en los individuos afectados.
Es importante documentar las roturas y los huecos en los estudios de cromosomas porque puede haber una causa clínica.
2.6.4 Cariotipo de una célula
El sustantivo cariotipo originalmente significaba solo un diseño ordenado de los cromosomas de una sola célula, pero con el tiempo el
significado se expandió para incluir la descripción escrita de la célula recortada porque los dos se consideraron descripciones de la
misma cosa. Sin embargo, en el 2005 Sistema internacional de nomenclatura citogenética ( ISCN), para distinguir entre las dos ideas, la
disposición cromosómica pasó a llamarse cariograma, y la descripción escrita, así como la composición cromosómica del individuo, se
conocieron como cariotipo. El verbo para hacer el cariograma no está descrito por el ISCN, y dado que "cariograma" no resuena,
continuaremos usando el verbo "cariotipo" como el acto de ordenar los cromosomas para la comparación analítica. Aquí discutiremos
los principios utilizados en la elaboración de un cariograma pictórico. Consulte el Capítulo 8 para conocer el uso de la nomenclatura
ISCN para describir el cariotipo por escrito.
El cariograma es una disposición ordenada de cromosomas (46 en humanos, 44 autosomas dispuestos en pares, uno de
cada padre y dos cromosomas sexuales) de acuerdo con las convenciones internacionales [112]. Los cromosomas pueden
cortarse de una impresión fotográfica y disponerse en un formulario preimpreso con áreas marcadas para cada cromosoma y
su grupo o pueden ordenarse digitalmente mediante software analítico citogenético. Si se cortan manualmente, los
cromosomas se pueden sujetar a la forma pegándolos, pegándolos con cinta adhesiva o usando tejido de montaje fotográfico
seco y calor. En la mayoría de los laboratorios clínicos, sin embargo, los métodos manuales han sido reemplazados por sistemas
de software de imágenes digitales que pueden organizar automáticamente imágenes de cromosomas en un formato de
cariograma, con la guía del operador mediante comandos del mouse y del teclado.
Los cromosomas se clasificaron originalmente por tamaño y morfología en siete grupos, A-G, por la
Conferencia de Denver de 1961 [113] (Figura 2.18). Con el advenimiento de las bandas, los 22 pares de autosomas
(cromosomas no sexuales), numerados del 1 al 22, se volvieron identificables individualmente. Los cromosomas
sexuales se denominaron X e Y. Aunque no se les asignó un número, se asignaron a grupos según su tamaño; el
cromosoma X al grupo C y el cromosoma Y al grupo G. Cuando los cromosomas no están agrupados (consulte el
Capítulo 6, sección 6.1.5, Métodos de tinción convencionales (sólidos)), pueden asignarse a grupos, pero no todos
pueden identificarse individualmente. Cuando están agrupados con los métodos de bandas G, Q o R, cada
cromosoma puede identificarse positivamente tanto por número como por grupo.
Los cromosomas siempre están dispuestos en el cariograma con los brazos cortos hacia arriba. Los grupos están ordenados alfabéticamente.
Los cromosomas sexuales pueden colocarse juntos al final o separarse en sus grupos; de cualquier forma es aceptable.
Los cromosomas más grandes están en el grupo A (dos de cada uno de los números 1, 2 y 3). Los cromosomas 1 y 3 son cromosomas
metacéntricos, siendo 1 mayor que 3, y los cromosomas número 2 son ligeramente submetacéntricos.
El grupo B consta de dos pares de cromosomas que son grandes y sorprendentemente submetacéntricos; los brazos cortos alrededor de un
cuarto de la longitud de los brazos largos. Sin tratamiento de bandas, no se pueden identificar individualmente. Están numerados 4 y 5.
El grupo C contiene la mayoría de los cromosomas y es el grupo más difícil de cariotipo tanto en extensiones con bandas como sin bandas.
Los cromosomas son de tamaño mediano y todos submetacéntricos; están numerados del 6 al 12. El cromosoma X también pertenece a este
grupo. En el estado sin bandas, estos cromosomas no se pueden identificar individualmente, por lo que están ordenados aproximadamente en
orden decreciente de tamaño: los 6 son los más grandes, y los 7 y la X son los siguientes más grandes. Los cromosomas X y 7 tienen
aproximadamente el mismo tamaño, pero el X es más metacéntrico que el 7. Los 11 son los más metacéntricos y los 9 son de tamaño variable
dependiendo de la longitud de la región heterocromática justo debajo del centrómero. Los 8, 10 y 12 tienen los brazos cortos más cortos, y los 12
son los más submetacéntricos.
El grupo D consta de tres pares de cromosomas acrocéntricos de tamaño mediano, numerados 13, 14 y 15. En la extensión sin bandas, todos los D se
parecen. Los brazos pequeños y cortos con satélites son a menudo visibles y varían mucho en tamaño e intensidad de tinción.
El grupo E consta de tres pares de cromosomas que tienen aproximadamente la misma longitud que los cromosomas del grupo D, pero
tienen brazos cortos claramente definidos. Los 16 son metacéntricos y los 17 y 18 son submetacéntricos. Los de 18 tienen los brazos cortos más
cortos de este grupo.
El grupo F contiene dos pares de pequeños cromosomas metacéntricos, 19 y 20, que no pueden distinguirse individualmente sin
tratamiento de bandas.
El grupo G contiene dos pares de autosomas, números y 22, y el cromosoma sexual Y. Los 21 y 22 son pequeños acrocéntricos que
con frecuencia tienen brazos cortos con satélites, similares a los D. El cromosoma Y puede ser muy similar a los otros G, aunque no tiene
satélites y puede tener brazos cortos más definidos. También puede variar de tamaño y en ocasiones es más grande que el 18, aunque
sus brazos cortos son siempre pequeños.
La mujer normal tiene dos cromosomas X y ningún cromosoma Y, por lo que la extensión sin bandas tiene 16 cromosomas del
grupo C y solo cuatro cromosomas del grupo G. El hombre normal, con solo un cromosoma X, tiene solo 15 cromosomas del grupo C
pero tiene cinco cromosomas del grupo G debido a la presencia del Y.
Una nota sobre los satélites: otros cromosomas (autosomas, el cromosoma Y) pueden adquirir satélites como una variante normal
(véase el capítulo 9). Además, los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos pueden adquirir la región Yqh sin afectar el fenotipo, y
pueden verse tanto en mujeres como en hombres.
2.6.5 Cariogramas en bandas
El cariotipo de cromosomas en bandas sigue los mismos principios descritos para los cromosomas sin bandas, pero utiliza la información
adicional proporcionada por el patrón de bandas para identificar cada cromosoma por número. Debido a que el número de la banda depende del
alargamiento del cromosoma, las descripciones de las bandas varían para un cromosoma dado y son difíciles de verbalizar. El capítulo 7,
Cromosomas humanos: identificación y variaciones, muestra los cromosomas con bandas G en varias longitudes.
2.6.6 Número de bandas haploides y niveles de bandas
El nivel de banda es un término que representa el número total de bandas contables en un conjunto haploide de autosomas más los cromosomas sexuales.
El nivel de banda que puede obtenerse mediante los diversos procedimientos de bandas depende del grado de condensación del cromosoma mitótico
logrado por la célula cuando se cosechó. Es deseable apuntar al mayor nivel de resolución de banda posible. Las bandas de referencia que fueron las
primeras que se demostraron en los cromosomas en metafase representaron un nivel de banda de aproximadamente 250 bandas por conjunto haploide. En
esta etapa de la metafase tardía, todos los cromosomas pueden identificarse individualmente, pero incluso las anomalías bastante grandes son invisibles. El
esquema de la Conferencia de París [114] representa los cromosomas en el nivel de 400 bandas; esto se obtiene de los cromosomas en una etapa
ligeramente anterior de la metafase.
Un nivel de banda de 550 (ver Figura 2.12) proporciona una resolución suficientemente alta para la detección de muchas reordenaciones
pequeñas sin que sea prohibitivamente difícil de analizar. Este nivel corresponde a la profase o prometafase, cuando se pueden demostrar
muchas bandas pequeñas y distintas que luego se condensarán para formar las conocidas bandas de referencia (ver Tabla 2.7). Las muestras de
sangre y líquido amniótico pueden obtener esta longitud, pero la médula ósea suele ser más corta. Se pueden obtener niveles de bandas de hasta
850-900 bandas por conjunto haploide utilizando hemocultivos estimulados, y las células del líquido amniótico también son capaces de producir
bandas de gran longitud ocasionalmente. Estos niveles de banda muy altos se utilizan para definir anomalías muy pequeñas. Sin embargo, para
detectar ciertas anomalías como las inversiones pericéntricas, puede ser más evidente en células más cortas,
Hay varios métodos para determinar la longitud de banda de una celda determinada [45–50]. Un método, desarrollado en el Laboratorio de Citogenética del Hospital
General de Vancouver [49], utiliza las bandas G oscuras de cinco cromosomas diferentes, contando todas las bandas excepto el centrómero en X y 10, 11p, 12q y 1p31 –
p32. El total obtenido está relacionado con los niveles de bandas haploides, de 350 a 850. El número de bandas contadas representa aproximadamente el 7% del recuento
total de haploides a niveles de bandas de 500 y superiores, y un poco menos a niveles de bandas inferiores. La suma de las bandas en estos segmentos en los esquemas
ISCN es la siguiente: 18 bandas en el nivel de 350 bandas, 21 bandas en 400, 40 bandas en 550 y 60 bandas en 850. Contando
Cuadro 2.7 Comparación de bandas en cuatro cromosomas en dos niveles de bandas diferentes
Cromosoma Aproximadamente 400 550–600 Nivel de banda
7q 2 bandas oscuras cada una de las dos bandas oscuras principales se divide en 2 oscuras y 1 clara
10q 3 bandas oscuras (la superior o la banda oscura proximal se divide en 2 oscuras y 1 clara; también aparece 1
proximal es la más oscura) banda oscura en la siguiente banda de luz distal, 10q22
11p 2 bandas oscuras, las 2 bandas oscuras se separan y aparece una delgada banda oscura,
muy juntas cerca de la terminal
Xp 1 banda oscura grande la 1 banda oscura se divide en 2 bandas oscuras con 1 banda clara entre
ellas; la banda oscura distal es la más grande
p = brazo corto; q = brazo largo.

las bandas reales en los cromosomas de una extensión, el total obtenido podría ser intermedio a las cuatro pautas, en cuyo caso se puede hacer
una extrapolación. Alternativamente, ciertas bandas pueden usarse como referencia para evaluar la celda completa, ya que se dividen en bandas
adicionales en niveles de banda específicos [50]. Muchas pautas de laboratorio requieren una evaluación de la banda y, a menudo, el nivel de
banda de la celda de mejor calidad se informa en el informe final. El College of American Pathologists (CAP) requiere el informe de la resolución de
la banda en el informe final para los estudios no neoplásicos.
Muchas muestras de pacientes mostrarán variaciones en las regiones de ciertos cromosomas, como regiones heterocromáticas aumentadas
o disminuidas, variación en el tamaño de brazos cortos, tallos y satélites de cromosomas acrocéntricos, etc. Estas variables, o heteromorfismos,
que generalmente no tienen efectos fenotípicos, se tratan en detalle en el Capítulo 7, Cromosomas humanos: identificación y variaciones.
2.6.7 El estudio citogenético completo

Existen pautas para los componentes del estudio citogenético completo, que son seguidas por la mayoría de los laboratorios. Estas
incluyen las directrices del Colegio Americano de Genética Médica (ACMG) [115], el Colegio de Patólogos Americanos (CAP) [116] y la
Asociación Citogenética Europea (ECA) y otras directrices dirigidas por países [117]; Además, es posible que también existan estándares
específicos del estado o del país. Estas pautas se actualizan periódicamente y pueden imprimirse desde los sitios web de las
organizaciones mencionadas anteriormente (consulte el Capítulo 25, sección 25.2.7, Acreditación y pautas). Las directrices especificarán
cuántas células en metafase se examinarán, fotografiarán o fotografiarán, analizarán o cariotipo, y cuántas células en interfase para
FISH se examinarán y se formarán imágenes.
Para la mayoría de los estudios constitucionales, contar 20 células y encontrarlas idénticas es suficiente para proporcionar el diagnóstico
citogenético. Sin embargo, puede ser necesario examinar un mayor número de células (ver 2.6.2, Mosaicismo) u obtener más células de una
muestra de una fuente de tejido diferente si el diagnóstico clínico sugiere fuertemente un síndrome que puede no detectarse mediante el estudio
20 metafases de un cultivo de linfocitos (p. Ej., Hipomelanosis de Ito, síndrome de Pallister-Killian). Los estudios de predisposición del cáncer a la
presencia de sitios frágiles y roturas también pueden requerir el análisis de un número aún mayor de células para obtener estadísticas
significativas.
Para muchas muestras, la calidad de las extensiones elegidas para el análisis debe ser la mejor que se pueda encontrar en la diapositiva. La
principal excepción a esta regla es la citogenética del cáncer, en la que las células anormales a veces son de peor calidad que las células normales
y pueden ser no diploides (p. Ej., Casi tetraploides o casi haploides). Por esta razón, algunos laboratorios documentan de forma rutinaria la calidad
de un estudio durante el análisis: por ejemplo, excelente para untar con bandas claras y nítidas y sin superposiciones; bien
para extensiones en las que se pueden identificar todos los cromosomas, aunque existen algunas superposiciones; y justa para extensiones que pueden
analizarse pero no son adecuadas para la captura y el cariotipo.
Las excepciones a la regla de informar mosaicismo prenatal en colonias múltiples incluyen la aparición de una colonia con un cromosoma 2 o
un cromosoma 7 adicional, los cuales han sido reportados como un artefacto de cultivos prenatales y generalmente se considera que no tienen
importancia clínica. Sin embargo, incluso una sola célula aberrante en una muestra de médula ósea podría representar una línea neoplásica y
podría ser necesario informarla, si es relevante para el cuadro clínico [94]. El director del laboratorio puede optar por informar una sola célula
aberrante si parece relevante, teniendo en cuenta los hallazgos clínicos o el historial del paciente.
2.6.8 Cariogramas, cariotipos y el informe final

Después de analizar microscópicamente un caso, se obtienen imágenes de células en metafase representativas, ya sea con un sistema fotográfico
o digital. El director del laboratorio establecerá la cantidad de imágenes que se realizarán, pero las pautas generalmente incluyen
recomendaciones mínimas. Las impresiones de extensiones de cromosomas que no están cariotipadas permiten a los tecnólogos verificar sus
análisis. Algunos laboratorios, en particular los que se dedican al cáncer, fotografían hasta 30 extensiones consecutivas para su posterior análisis.
Todos los materiales fotográficos, tanto negativos como impresos, deben estar claramente identificados con el nombre del paciente y el número de
caso, y se debe llevar un cuidadoso registro del trabajo fotográfico, ya sea en un archivo especial o en el archivo de cada paciente, siguiendo los protocolos
establecidos para cada caso. laboratorio. Un sistema de identificación para almacenar imágenes digitales generalmente se programa en el sistema de
imágenes por computadora, o se puede agregar durante el análisis.
El informe final debe prepararse tan pronto como se complete el estudio, y las copias deben enviarse a los médicos de referencia pertinentes, los
departamentos de registros del hospital o los sistemas informáticos de información del laboratorio / hospital. El informe debe incluir (según las pautas de
ACMG / CAP) el nombre del paciente y la fecha de nacimiento, el número de identificación, como el número de registro médico y el número de encuentro de
la prueba, el número de acceso al laboratorio, el médico remitente, la prueba solicitada y realizada, la indicación clínica del estudio y el código ICD10 si
conocida, fuente de la muestra (líquido amniótico, sangre, etc.), fecha de servicio, fecha de recepción, tipo de cultivo y número de vasos examinados, número
de células y colonias examinadas, número de análisis y cariogramas preparados, tinciones utilizadas,
calidad, nivel de banda, cariotipo, resultados citogenéticos, interpretación, recomendaciones, fechas del informe preliminar y final y
firma del Director. Los resultados se expresan utilizando ISCN (la versión actual), así como en una interpretación verbal, que puede
correlacionar los hallazgos con la presentación clínica y puede comentar recomendaciones para el asesoramiento genético o estudios
citogenéticos u otros estudios adicionales del paciente o la familia de el paciente.
2.6.9 Fuentes de error en el análisis y la presentación de informes
Es extremadamente importante evitar errores en los estudios genéticos, porque la información de pronóstico, diagnóstico y resultados, las decisiones de
tratamiento y, a menudo, la vida y la muerte de un paciente pueden depender de la precisión. Debido a que casi todas las etapas de un estudio citogenético
involucran subjetividad y experiencia individual por parte del citogenetista, es importante estar consciente de algunas fuentes potenciales de errores.
Pueden ocurrir errores en varias etapas, desde la recolección de muestras hasta la interpretación real del cariotipo. Los estuches se pueden
mezclar durante el cultivo, la recolección, la preparación de diapositivas, la selección de diapositivas o hojas de registro en el microscopio, la
impresión de la película y el cariotipo. Cada caso debe estar debidamente etiquetado durante todo el procedimiento citogenético, preferiblemente
con el nombre del paciente y un número de identificación (p. Ej., Número de acceso, código de barras, número de historia clínica, etc.). Las pautas
de CAP requieren dos identificadores únicos separados en cada muestra. También es útil trabajar en una atmósfera libre de distracciones y
manejar cada caso por separado al preparar cultivos, hacer portaobjetos, realizar microscopía, imprimir, agregar sondas a los portaobjetos y
cariotipo. Se debe tener sumo cuidado para evitar la contaminación cruzada de las muestras durante la recolección y la preparación de
portaobjetos. A veces puede ser necesario repetir el trabajo con otros cultivos o nuevas muestras para aclarar los resultados discrepantes.
El crecimiento deficiente de los cultivos y las bandas deficientes también presentan las mayores fuentes de error potencial para el tecnólogo.
Los cultivos que producen pocas metafases de mala calidad, como extensiones compactas y células con muchos cromosomas superpuestos o
restos de fondo, pueden dar como resultado un análisis microscópico incorrecto porque el técnico puede no detectar mosaicismo,
translocaciones, cromosomas en anillo o marcadores u otros muy pequeños. anomalías cromosómicas. Si el técnico no está satisfecho, se deben
preparar nuevos portaobjetos, realizar un cultivo repetido o solicitar una muestra repetida. Sigue siendo tan importante como siempre obtener la
resolución de bandas de la más alta calidad posible, porque aunque las tecnologías de microarrays están mejorando y cada vez están más
disponibles, no cubren todo el genoma, no detectan reordenamientos equilibrados, y no se ofrecerá a todos los pacientes. Las bandas de mala
calidad también pueden ser una fuente de error al evitar la detección de translocaciones, duplicaciones, eliminaciones u otras anomalías
estructurales. Si el técnico tiene alguna duda, se deben preparar nuevos portaobjetos, repetir una cosecha en un cultivo o solicitar una muestra
repetida.
El patrón de bandas de cada cromosoma debe examinarse de cerca en cada estudio, y cada par de
cromosomas debe compararse banda por banda al menos una vez para asegurarse de que no existan
diferencias entre los cromosomas homólogos. Si se observa un patrón inusual, se deben emplear todos los
medios necesarios, incluidos procedimientos suplementarios de bandas o moleculares, para descartar o
confirmar cualquier anomalía. La preparación de más de un cariotipo ayuda a garantizar que todos los
cromosomas puedan visualizarse sin cruces u otra obstrucción de la claridad. Si todavía hay regiones de
algunos cromosomas que no están claras, examine más células en los portaobjetos en el microscopio o en
las impresiones. Algunos hallazgos inusuales pueden deberse a variaciones en la elaboración y tinción de
las diapositivas, limitaciones del sistema de reproducción de imágenes,
Algunas anomalías, denominadas "crípticas", no son fácilmente detectables mediante el análisis del cariotipo.
Por ejemplo, si las bandas de telómeros ligeros de dos cromosomas no homólogos diferentes se intercambian,
ninguna de ellas se verá muy diferente al estado normal. Se han diseñado sondas específicas de subtelómero
para investigar tales reordenamientos (consulte el Capítulo 16, sección 16.3.1, Sondas específicas de
subtelómero). Otro ejemplo se ve en la leucemia mielógena crónica, donde la translocación diagnóstica entre los
brazos largos de los cromosomas 9 y 22 puede estar oscurecida por la participación de un tercer cromosoma o
puede presentarse como un pequeño reordenamiento de inserción que no incluye una translocación de todos los
segmentos distales. del 9 y 22. BCR y ABL1 genes.
Finalmente, es valioso obtener otra opinión. La consulta con otros tecnólogos o laboratorios puede resultar invaluable en muchos
casos.
2.7 Manual de procedimientos de laboratorio
Todos los métodos utilizados en el laboratorio de citogenética deben actualizarse periódicamente y estar disponibles para todo el personal de laboratorio
que trabaja con ellos. Pueden estar en una carpeta de hojas sueltas o en un sistema basado en computadora. El sistema basado en computadora, si se
encuentra en un disco común de una intranet institucional, es más fácil de mantener actualizado para todos. Si un método basado en papel
se utiliza el sistema, cuando se crean versiones más nuevas y actualizadas, todas las copias de los métodos antiguos deben archivarse con la fecha en que se
suspendió el método para que todo el personal utilice las mismas pautas para cada método. El personal debe revisar todos los métodos anualmente, o
siempre que se realicen cambios, para asegurarse de que sean correctos y de que se estén utilizando los métodos correctos. Es una buena práctica que todo
el personal revise todos los métodos al menos una vez al año para asegurarse de que se estén utilizando los métodos correctos y actuales. El director del
laboratorio y el jefe de departamento, si corresponde, también son responsables de revisar los métodos semestralmente o cuando se realiza algún cambio.
Las partes esenciales de un protocolo de laboratorio son:
Título: El título debe tener un nombre que represente el procedimiento de manera única, junto con una identificación de archivo para una fácil
recuperación. El nombre del autor o autores del procedimiento, así como el director del laboratorio y la institución, también podrían incluirse
en esta sección inicial.
Objetivo: Qué hace el método, para qué se utiliza o cómo se relaciona con la atención del paciente.
Principio: Cómo funciona el método. Esto es importante para solucionar problemas.
Materiales / Suministros: Qué necesita estar presente en el laboratorio para poder realizar el método; información de pedido, como proveedor, tamaño o
volumen de reactivo en stock junto con su número de catálogo; cómo formular y almacenar las soluciones reactivas; si se requieren condiciones de
seguridad específicas en su manipulación; y cuáles son los tiempos de caducidad después de que un reactivo de reserva se ha descongelado o abierto, y
para las soluciones que se han preparado a partir de ese reactivo.
Método: Esto debe incluir cualquier advertencia de seguridad específica para el uso de cualquier reactivo, así como los pasos que se utilizan para
completar el procedimiento. Consejos: A veces, los procedimientos no siempre son sencillos y puede haber variables o limitaciones específicas
que, cuando ocurren, pueden tener sugerencias de solución de problemas para manejar estos casos. Estos se pueden agregar dentro del
procedimiento o después de la sección Método. Referencias y Lecturas adicionales: Las referencias bibliográficas se colocarán al final de la
sección Método.
Firmas de aprobación: Antes de que cualquier procedimiento pueda ponerse en producción, se deben documentar las aprobaciones del director
del laboratorio y / o el jefe de departamento, que incluirían la fecha, sus nombres claramente escritos a máquina o impresos, seguidos de sus
firmas. Las firmas deben ser verificables. Este proceso se repite para cada cambio y para las revisiones anuales de rutina. Todo el personal de
laboratorio responsable de realizar cualquier procedimiento también debe documentar que revisó todos los procedimientos y cualquier
cambio posterior a un procedimiento, en la implementación inicial y anualmente a partir de entonces, incluso si no se han implementado
cambios.
El laboratorio también debe mantener un registro de las políticas. Estos pueden incluir las sondas utilizadas para varios paneles, tiempos de respuesta,
pautas para una longitud de banda aceptable para estudios de prometafase, etc. Estos también son revisados anualmente o semestralmente por los
tecnólogos y el director del laboratorio y / o el jefe de departamento.
Este capítulo, aunque detallado, es un vistazo simplificado al funcionamiento de un laboratorio de citogenética tal como existía cuando se
escribió este libro. La citogenética es un campo en constante cambio y es importante seguir aprendiendo de la literatura y establecer contactos
con otros en las reuniones y siempre que podamos. Hay pocas escuelas que enseñan esta ciencia de laboratorio necesaria, por lo que es nuestro
deber transmitir nuestra experiencia y conocimiento a otros, y su deber es hacer lo mismo.
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marzo de 2007 http://www.nature.com/ejhg/journal/v15/n5/full/5201809a.htm
Protocolos aportados
IMPORTANTE: Ningún protocolo incluido en este manual debe usarse para pruebas clínicas a menos que el laboratorio que realiza el procedimiento haya validado
adecuadamente que la prueba funciona como se espera y proporciona resultados precisos y adecuados. Cada laboratorio también debe consultar la SDS del fabricante
para conocer las instrucciones de manipulación, advertencias de seguridad, eliminación y requisitos de etiquetado de todos los productos químicos utilizados en el
laboratorio.
Protocolo 2.1 Elaboración de diapositivas
Contribuido por Oregon Health & Science Center, Knight Diagnostic Laboratories, Clinical Cytogenetics Laboratory
Principio
Una buena banda cromosómica depende de la preparación adecuada de los portaobjetos. El propósito de este procedimiento es obtener un número
adecuado de metafases / portaobjetos con la morfología adecuada. Las variables que afectan la preparación incluyen la humedad relativa, la temperatura
ambiente, el tiempo de secado y el número de células / portaobjetos. Los cromosomas que son demasiado planos no producen bandas nítidas; los
cromosomas que están demasiado elevados aparecen demasiado oscuros y tienen una apariencia de halo bajo la microcopia de fase. Estas celdas oscuras
con frecuencia dan como resultado bandas deficientes y desiguales. La imagen de contraste de fase perfecta es aquella que es nítida e incluso sin citoplasma
visible.
Advertencia de seguridad
Todas las muestras de tejido deben manipularse como biopeligrosas, siguiendo las precauciones universales. Utilice la campana de flujo laminar para todos los pasos
hasta el centrifugado de la cosecha. Use una bata de laboratorio y guantes protectores para todos los pasos a través de la preparación de diapositivas. Evite los derrames
y el contacto de cualquier material biológico con la piel o las membranas mucosas. Limpie los derrames inmediatamente con Sanimaster 4 (recién hecho semanalmente) o
etanol al 70%. Cubra los cortes con vendas protectoras incluso cuando use guantes. Deseche las pipetas Pasteur en un recipiente para objetos punzantes. Lávese bien las
manos después de quitarse los guantes.
II. Materiales
1. Suspensión de células cromosómicas
Diluya la suspensión granulada con fijador nuevo para lograr una dilución celular que sea lo suficientemente delgada como para permitir la propagación adecuada
de los cromosomas, pero lo suficientemente espesa para encontrar figuras mitóticas fácilmente (suspensión turbia pero no lechosa). Portaobjetos de vidrio flotado
2. con extremo pintado para etiquetar

3. Pipeta Pasteur y bulbos
4. Microscopio de fase con material de transferencia
5. de lentes de 16 ×, como KimWipes
6. Higrómetro y termómetro para determinar la humedad y temperatura ambiente Bandeja con
7. toallas de papel húmedas para condiciones secas
III. Método
El siguiente es un ejemplo de un método de preparación de portaobjetos para una muestra promedio limpia en un día con 40% de humedad relativa y una
temperatura de 72 ° F (22 ° C).
1. Saque los portaobjetos de vidrio de la caja y colóquelos en un frasco Coplin que contenga etanol al 95%.
2. Retire uno de los portaobjetos del etanol y limpie la superficie superior del portaobjetos con un KimWipe, con dos o tres golpes
fuertes para limpiar los residuos de fabricación.
3. Vuelva a sumergir el portaobjetos en el etanol y luego en un vaso de precipitados con agua destilada limpia. Sumérjalo en el agua de 8 a 10 veces, o agítelo
hasta que la capa de agua sea uniforme y desaparezcan los signos de la mezcla de alcohol y agua.
4. Sostenga el portaobjetos horizontalmente y asegúrese de que la capa de agua sea uniforme. Luego coloque el borde largo del portaobjetos sobre una toalla absorbente
para drenar el exceso de agua.
5. Aspire suavemente un poco de la suspensión de células fijadas en una pipeta Pasteur y, sosteniendo el portaobjetos en un ángulo de 20 a 30 ° sobre la toalla y
comenzando por el extremo no marcado, deje caer de 2 a 4 gotas de suspensión de células desde aproximadamente 1/4 pulg. .desde la superficie de la diapositiva.
Las gotas no deben fluir por el tobogán, sino que deben formar patrones redondos. Escurre el portaobjetos sobre una toalla de papel.
6. Deje caer de 4 a 6 gotas de fijador a través del portaobjetos, superponiendo las gotas.
7. Escurra el portaobjetos sobre una toalla de papel o con una KimWipe.
8. Etiquete la diapositiva con la información del paciente, el número de diapositiva y la fecha.
9. Cuando el portaobjetos se haya secado hasta que aparezcan los colores del arco iris en la superficie, caliente el portaobjetos en el dorso de la mano o el muslo durante
unos segundos.
IV. Notas
Variaciones técnicas para diferentes entornos:
1. Para condiciones en las que la humedad es muy alta (45% o más), intente secar el portaobjetos continuamente en la mano, pierna (muslo) o
placa calefactora (temperatura 35–40 ° C).
2. Para condiciones en las que la humedad es muy baja (30% o menos), coloque el portaobjetos sobre una pila de toallas de papel empapadas en agua y déjelo hasta que
esté completamente seco.
3. La fabricación de portaobjetos en otras condiciones puede requerir combinaciones de ambientes de secado que solo pueden descubrirse mediante la
experimentación. Por ejemplo, use una capa muy fina de agua en los días muy húmedos o más espesa en los días muy secos. Drene el portaobjetos
después de agregar cada gota de suspensión en días húmedos y limpie el portaobjetos varias veces en días muy húmedos antes de calentar. No limpie la
parte posterior del portaobjetos antes de colocar toallas de papel húmedas en días muy secos.
4. Verifique en un microscopio de fase. Si las células son grises o los cromosomas están dispersos, caliente más tiempo. Si las células son muy oscuras y muestran un
citoplasma visible, reduzca o elimine el calentamiento.
Protocolo 2.2 Elaboración de diapositivas
Colaborador anónimo
Principio
Aunque la elaboración de portaobjetos es el paso final del procedimiento de recolección, un técnico debe tener la capacidad de solucionar problemas y
personalizar un procedimiento para obtener resultados óptimos.
II. Materiales
1. Metanol
Almacene en un gabinete inflamable cerrado y seguro, separado de ácidos, otras sustancias reactivas y del contacto humano. Nunca levante la botella por la tapa.
Transporte en un soporte de seguridad de goma. Etiquete todos los recipientes que contienen este reactivo. Utilice una ventilación de humos y un equipo de
protección personal adecuados cuando manipule el reactivo. La eliminación debe realizarse de acuerdo con el control ambiental federal, estatal y local para
materiales inflamables.
2. Ácido acético glacial

Almacene en un lugar fresco, seco y bien ventilado lejos de materiales incompatibles. Nunca levante la botella por la tapa. Etiquete todos los recipientes que
contienen reactivo. Transporte en un soporte de seguridad de goma. Etiquete todos los recipientes que contienen reactivo. La eliminación debe realizarse de acuerdo
con las regulaciones de control ambiental locales, estatales y federales. Utilice una ventilación de humos y un equipo de protección personal adecuados cuando
manipule el reactivo.
3. Fijador de Carnoy modificado

Mezcle 1 parte de ácido acético con 3 partes de metanol. Conservar a 20 ° C. Prepare fresco todos los días, según sea necesario. Advertencia: Utilice una ventilación de
humos y un equipo de protección personal adecuados cuando manipule el reactivo. Si la propagación es un problema en regiones o climas secos, consulte la Nota 1.
4. Bandeja de tinción Wheaton para 20 portaobjetos, Science Products # 900200, Fisher Scientific # 08‐812.
5. Portaobjetos de microscopio
6. Agua destilada estéril
Toboganes de limpieza
Primero se inspeccionan visualmente los portaobjetos; Cualquier portaobjetos que tenga incluso un defecto dudoso debe desecharse en el contenedor de objetos
punzantes. Con el lado de la etiqueta áspera en la misma dirección, los portaobjetos se colocan en diagonal en un recipiente de portaobjetos de vidrio, con el frente y
la parte posterior de los portaobjetos expuestos libremente al reactivo limpiador. Llene el plato con fijador (ver Nota 2) para que los portaobjetos estén
completamente sumergidos y déjelo reposar durante 15 minutos. El fijador se decanta cuidadosamente y los portaobjetos se enjuagan dos veces en agua destilada estéril.
Se agrega agua destilada estéril fresca para que los portaobjetos queden completamente sumergidos y el recipiente se almacena en el
refrigerador. Caducidad: 3 meses. NOTA: El fijador debe desecharse en un recipiente colector para la recogida de material inflamable.
7. Placa calefactora a 40 ° C y 60 ° C
8. Cubreobjetos 24 × 50 mm
9. Sellador (usar debajo de la campana de humos)
10. Pinzas para sacar los portaobjetos limpios de la bandeja de tinción
11. Toallas de papel (para drenaje)
III. Método
La fabricación de portaobjetos se realiza en un entorno humidificado y con temperatura controlada (consulte la Nota 3). Nunca deje más de un
tubo de centrífuga descubierto a la vez. No deje caer más de una caja a la vez.
1. Las células deberían haber tenido al menos tres cambios de fijador de 10 ml y deberían haber tenido su centrifugación final (1000 RPM durante 10 minutos) para que
las células estén en un sedimento, listas para la preparación de portaobjetos.
2. Dependiendo del tamaño y condición del sedimento celular, retire el fijador hasta un volumen igual al sedimento celular. Resuspenda el gránulo
suavemente pero asegurándose de que todo el material se haya liberado en suspensión.
3. Pruebe la superficie del portaobjetos quitando un portaobjetos del soporte de agua y colocando una solución nueva por su superficie. Si el fijador no
fluye recto y suavemente, por ejemplo, se abrocha en los bolsillos, deseche el portaobjetos y pruebe con otro. Si el problema persiste, pruebe con otro
contenedor de portaobjetos y / o cambie los reactivos fijadores. Si el problema persiste, pruebe con un lote de portaobjetos o un fabricante diferente
(consulte la Nota 4).
4. Si se requiere FISH y se desea un portaobjetos más concentrado, primero haga el portaobjetos FISH y luego diluya el sedimento para el análisis
citogenético de rutina.
5. Las etiquetas de los portaobjetos deben tener al menos dos identificadores de paciente, incluido el nombre del paciente y el número de acceso al laboratorio, el
número de vaso, el número de portaobjetos, las iniciales del técnico y la fecha de realización.
Hacer diapositivas
6. Método de fabricación de portaobjetos 1: Coloque el portaobjetos húmedo sobre una toalla de papel y deje correr un par de gotas de fijador sobre la superficie del
agua. Resuspenda el sedimento celular, extraiga 0,5 ml de suspensión celular en una pipeta Pasteur y suelte suavemente dos gotas equidistantes sobre un
portaobjetos horizontal. Deje que el portaobjetos permanezca plano durante 1 minuto. No debe secarse. Enrolle suavemente el portaobjetos hasta su borde
horizontal, escurra el exceso, seque, agite una vez y colóquelo en una placa calefactora a 40 ° C hasta que se seque. Verifique bajo microscopía de fase para ver si
las células están lo suficientemente diseminadas y la concentración en metafase es de densidad ideal. Agregue más fijador si las células son demasiado densas y
vuelva a intentarlo. Si el fijador se seca demasiado rápido (antes de un minuto), aumente la humedad o reduzca el tiempo que permanece sobre una toalla de papel
antes de transferirlo a la placa calefactora. Etiqueta e inicial.
7. Método de fabricación de portaobjetos 2: Retire el portaobjetos del recipiente de almacenamiento sin drenar el agua de la superficie. Agregue un par de gotas de
fijador al agua y suelte dos gotas de suspensión celular equidistantes en el portaobjetos mientras inclina lentamente el portaobjetos hasta su borde horizontal.
Mantenga horizontal durante un minuto. El portaobjetos aún no debe estar seco. Secar, soplar suavemente sobre la superficie y colocar sobre una placa calefactora
a 40 ° C hasta que se seque. Compruebe bajo microscopía de fase para la diseminación y morfología. Etiqueta e inicial.
8. Método de fabricación de portaobjetos 3: (a) coloque dos gotas de fijador en el portaobjetos, incline el portaobjetos en un ángulo de 45 ° y pase suavemente 2 o 3
gotas por el centro del portaobjetos. (b) Libere la suspensión celular desde una distancia más alta. Levante la corredera a una posición vertical; sostenga
nuevamente durante un minuto, permitiendo que las células se escurran lentamente por la superficie del portaobjetos. Soplar sobre el portaobjetos, secar la
espalda y colocar en una placa calefactora a 40 ° C hasta que se seque. Compruebe bajo microscopía de fase. Etiqueta e inicial.
Evaluación de la calidad de las diapositivas
9. Si la distancia entre los núcleos es demasiado diluida (sólo ve núcleos dispersos bajo el campo de un microscopio), lleve el sedimento a un volumen de 10
ml con fijador y centrifugue a 800-1000 RPM durante 10 minutos. Retire el sobrenadante, resuspenda en menos fijador y vuelva a colocarlo.
10. Cuando esté completo, resuspenda el sedimento en 5 ml de fijador nuevo, cierre bien y guárdelo en el refrigerador durante 6 meses (ver Nota 5).
11. Envejezca artificialmente los portaobjetos para la colocación de bandas G en una placa calefactora a 60 ° C durante la noche. Para obtener resultados de emergencia,
hornee los portaobjetos a 96 ° C durante 45 minutos.
IV. Notas
1. Puede resultar difícil lograr que los cromosomas se propaguen correctamente en condiciones muy secas o muy húmedas. Puede ser útil reemplazar la
proporción 1: 3 de ácido acético a metanol con una solución de ácido acético-metanol 1: 2 o 1: 1. El proceso de validación debe garantizar que todos los
pasos posteriores no se hayan visto afectados negativamente por el cambio de proporción.
2. FIXATIVE es un reactivo cáustico y requiere una planificación previa en su uso, desde el almacenamiento y la preparación, hasta el uso y el desecho, para evitar
cualquier riesgo potencial para la salud. Sus humos deben controlarse mediante una campana extractora. El plato de tinción lleno de fijador debe permanecer
cerrado y sin tocar mientras se sumergen los portaobjetos. El plato también debe estar debidamente etiquetado de su contenido y peligro. Nunca se debe
transportar un frasco que contenga fijador o sus reactivos sosteniendo solo la parte superior del frasco; Los recipientes grandes de reactivos deben llevarse dentro
de un portabotellas especialmente diseñado para el transporte de alto riesgo [por ejemplo, usamos el portabotellas de goma (rojo), 1 gal / 5 pts, Lab Safety Supply #
3328R]. Una vez completo, el fijador debe desecharse fácilmente con una manipulación mínima y sin riesgo de derrames. Como pueden ocurrir accidentes, Se deben
tomar precauciones para que, en caso de que se produzca un derrame, esté contenido y no presente daños físicos para el usuario. Las direcciones del derrame
deben mostrarse visualmente y / o consultarse fácilmente. En caso de un derrame que no dañe al usuario, siga las pautas de su institución para derrames de
sustancias químicas tóxicas. En caso de derrame sobre el usuario, quítese inmediatamente la ropa potencialmente afectada y sumérjase en la ducha de seguridad
durante 15 minutos. Busque atención médica de inmediato, ya sea que sienta una sensación de ardor después del lavado o no. En caso de derrame sobre el usuario,
quítese inmediatamente la ropa potencialmente afectada y sumérjase en la ducha de seguridad durante 15 minutos. Busque atención médica de inmediato, ya sea
que sienta una sensación de ardor después del lavado o no. En caso de derrame sobre el usuario, quítese inmediatamente la ropa potencialmente afectada y sumérjase en la ducha de segurid
3. Las fluctuaciones en la temperatura y la humedad pueden afectar la propagación de los cromosomas durante el secado de portaobjetos o cubreobjetos. Es posible
que sea necesario ajustar el tiempo hipotónico si los resultados de la preparación de diapositivas son consistentemente menos que óptimos. Los parámetros óptimos
de cosecha en nuestro laboratorio son:
Humedad La temperatura Tiempo hipotónico
40–60% 75–88 ° F (24–31 ° C) 25 min (no estimulado); 10 min (estimulado)
4. La creación de portaobjetos depende en gran medida de la capacidad de los cromosomas en metafase, que se mantienen unidos dentro de una membrana frágil,
para fluir sin obstáculos sobre la superficie del portaobjetos hasta que pueda descansar y extenderse, sin estallar demasiado pronto ("sopa" de cromosomas) o
sujetarse demasiado (cromosoma " Dulce de azúcar"). Cualquier obstrucción que aumente o disminuya la fricción, o cualquier cambio en las condiciones ambientales
(cambios estacionales, humedad, temperatura y flujo de aire) que aumente o disminuya el tiempo de evaporación del fijador, podría afectar la calidad del
portaobjetos. Los parámetros de cultivo y cosecha también pueden afectar la propagación de la metafase.
5. Los vapores de la solución fijadora son corrosivos y eventualmente pueden afectar las partes eléctricas de un refrigerador. Cubrir el tubo con parafilm puede ayudar,
pero todavía no es una solución total. El fijador también es inflamable; por lo tanto, se debe tener cuidado con los sedimentos de células históricamente retenidos. El
almacenamiento de estos gránulos en el congelador puede ayudar a retrasar la degradación del ADN.
Protocolo 2.3 Elaboración de portaobjetos húmedos para análisis cromosómico
Adaptado de una comunicación personal con Laura Adomaitis.
Principio
La fabricación de portaobjetos depende no solo de la calidad de la cosecha, sino también de las condiciones atmosféricas del día y de la
calidad de todos los reactivos y materiales utilizados. El tecnólogo en citogenética debe ser lo suficientemente ingenioso para poder
reconocer ciertos problemas recurrentes y, a través de la comprensión del proceso, poder manejar los imprevistos.
Precauciones de seguridad
El fijador es cáustico e inflamable y, por lo tanto, debe usarse y almacenarse con la ventilación adecuada de humos, con protección total contra
derrames (ver Nota 1, Manejo del fijador).
II. Materiales
Suministros generales
1. Agua embotellada estéril, pipetas

2. Pasteur de vidrio de 1000 ml, 5¼ pulg.
3. Pipetas Pasteur de plástico estériles, portaobjetos
4. de microscopio de 5¼ pulg.
5. Cubreobjetos para microscopio
6. CytoSeal
7. Bandeja / soporte para portaobjetos de vidrio
8. Lectura de humidificador / temperatura y ambiente controlado

9. Placas calientes ajustadas a 40 ° C (para secar), 60 ° C (para envejecer durante la noche) y / o 90-96 ° C si se necesita envejecimiento en el mismo día para casos
STAT)
10. Microscopio de fase

11. Campana extractora de extracción de
12. productos químicos Acceso a lavaojos y
13. ducha Bata de laboratorio de vinilo y guantes
Reactivos
1. Fijador 1: 3: Agregue 1 parte de ácido acético glacial a 3 partes de metanol absoluto. Esta solución debe prepararse periódicamente a lo largo
del día. PRECAUCIÓN: INFLAMABLE, CORROSIVO. Utilice el PPE adecuado y la ventilación adecuada para reducir los vapores cáusticos.
III. Procedimiento
Preparar portaobjetos limpios
1. Inspeccione cada diapositiva para asegurarse de que no haya rayones, rayas o astillas. Deseche los portaobjetos defectuosos en un recipiente para
2. objetos punzantes. Apile los portaobjetos en los insertos de la bandeja de vidrio.
3. Inspeccione el plato de vidrio para asegurarse de que no haya grietas. El plato de vidrio debe poder contener 100 ml de líquido. Coloque el plato dentro de una
bandeja protectora (para controlar derrames accidentales) debajo de la campana de extracción de productos químicos.
4. Agregue 25 ml de ácido acético glacial a 75 ml de metanol y vierta con cuidado en un plato de vidrio. (Ajuste el volumen si el recipiente de vidrio no tiene capacidad
para 100 ml) (consulte la Nota 2, Manejo de derrames).
5. Sumerja lentamente un inserto de la bandeja de diapositivas en el plato de vidrio del fijador. Cubra y deje reposar la bandeja durante 5 minutos. Deje el soporte de
metal unido a la bandeja. Mientras tanto, llene un segundo plato de vidrio con 100 ml de agua embotellada esterilizada y colóquelo junto al plato de fijación.
6. Después de 5 minutos, levante con cuidado el inserto de la bandeja de portaobjetos sobre el fijador, deje que el fijador drene en el plato y coloque la bandeja de
portaobjetos en el segundo plato de vidrio con agua embotellada estéril.
7. Lleve este segundo plato al fregadero, vierta agua mientras deja correr abundante agua y agregue suficiente agua embotellada fresca y estéril para sumergir el
borde superior de los portaobjetos. Etiquete la tapa del plato con el contenido, la fecha de limpieza y las iniciales del preparador y colóquela a 4 ° C hasta que esté
lista para usar. Los portaobjetos se pueden preparar con antelación y almacenar a 4 ° C durante 2 semanas.
8. Continúe el proceso con la segunda bandeja de diapositivas. Sumerja lentamente la siguiente bandeja para portaobjetos en el plato de fijación debajo de la campana
de humos y repita el proceso hasta que todas las bandejas para portaobjetos se hayan limpiado y almacenado.
"Soltar" diapositivas
NOTA: Trabaje con un solo paciente a la vez y mantenga solo un tubo de centrífuga descubierto a la vez. Cambie las pipetas entre los tubos de
centrífuga, incluso en el mismo paciente.
1. Confirme que la humedad sea del 60 al 80% y la temperatura sea de 70 a 85 ° F (21 a 29 ° C) (cuanto más baja sea la temperatura, más alta debe
ser la humedad) en el área donde se van a hacer los portaobjetos.
2. Dependiendo del tamaño del sedimento celular fijo, el sobrenadante se aspira a un nivel de 0,5 ml o en un volumen igual al tamaño del sedimento celular.
La suspensión de células debe ser ligeramente opaca (ver la Nota 3, Cuando los grumos de células son visibles).
3. Confirme que el nombre y el número de acceso en el tubo coincidan con la etiqueta del portaobjetos que se colocará. Etiquetas numéricas con ID de tubo y número de
identificación de portaobjetos único. Por ejemplo, 72T1 y 72T2 serían los dos primeros portaobjetos hechos a partir del cultivo 72T.
4. Retire un portaobjetos frío y húmedo (agua) con unas pinzas y pase unas gotas de fijador a lo largo de su superficie (consulte la Nota 4, Si el fijador no se desliza
uniformemente por el portaobjetos). Limpiar. Deje caer la suspensión de células en portaobjetos húmedos en uno de los siguientes métodos. No apresure el paso de
secado. Deje que el fijador complete su movimiento. Verá aparecer los anillos de Newton (arco iris) a lo largo de la superficie de fijación. Un borde ondulado indica
que la "burbuja" del fijador ha implosionado y las células se están plantando. Coloque el portaobjetos sobre una placa calefactora a 40 ° C hasta que la superficie esté
seca.
5. Etiquete el portaobjetos y compruébelo bajo el microscopio de fase. Si la concentración y el esparcimiento son óptimos, haga un portaobjetos más. Sin
embargo, si se puede mejorar la calidad o la cantidad, cambie lo que deba cambiarse (consulte la Nota 5: Solución de problemas) y vuelva a colocarlo.
Posiciones de caída de diapositivas
método horizontal
Coloque el tobogán en la encimera. Pasa fijador sobre su superficie. Deje caer 2 suspensiones de células equidistantes sobre la mezcla de agua y solución. Después de 30
segundos, drene el fijador residual sobre una toalla de papel y limpie la parte posterior. Mueva el tobogán hacia arriba y hacia abajo una vez y observe los anillos de
Newton (consulte la Nota 6, El arco iris que se desvanece). Tan pronto como aparezcan los bordes ondulados, coloque el portaobjetos sobre la placa calefactora a 40 ° C.
método horizontal inclinado

Incline la corredera sobre su lado largo en un ángulo de 30 °. Pase el fijador suavemente por la superficie. Coloque suavemente 2 gotas en el borde superior del
portaobjetos e incline el portaobjetos a medida que las celdas corren por el ancho corto del portaobjetos. Sople suavemente y observe la superficie. Cuando aparezcan los
anillos de Newton y los volantes de los bordes, colóquelos en una placa calefactora para que se sequen. Sin embargo, si las celdas están apretadas, agite el portaobjetos a
un ritmo lento durante 30 segundos. Si todavía están apretados, golpee suavemente el mostrador dos veces, agite, repita el golpe y agite hasta que el portaobjetos esté seco.
método vertical inclinado

Retire los portaobjetos con agua aún retenida en la superficie del portaobjetos. Coloque un par de gotas de fijador en la superficie e incline el portaobjetos a lo largo en un
ángulo de 30 ° a 60 ° (consulte la Figura 2.22). Agregue la suspensión celular mientras está inclinada, permitiendo que las células corran por la superficie, desde la etiqueta
hasta el borde inferior. Golpee moderadamente en el borde del mostrador, aproximadamente 1 segundo entre golpecitos, hasta que el portaobjetos esté seco. Colocar
sobre una placa calefactora a 40 ° C hasta que esté completamente seco.
IV. Notas
1. Manipulación del fijador: El ácido acético puede provocar quemaduras graves. Aunque el metanol puede neutralizar parte de su toxicidad, sigue siendo un
reactivo que debe usarse con una campana extractora y cualquier contacto debe tratarse de inmediato. No lleve ningún frasco que contenga fijador por
la tapa, ya que se han informado accidentes debido a que la tapa no estaba bien cerrada. Thermo Fisher Scientific SDS para ácido acético proporciona las
siguientes medidas de primeros auxilios para la exposición al ácido acético [1]:
Contacto con los ojos: Enjuagar inmediatamente con abundante agua, también debajo de los párpados, durante al menos 15 minutos. Médico inmediato
se requiere atención.
Figura 2.22 método de deslizamiento vertical inclinado. incline el portaobjetos húmedo y frío en un ángulo de 30 a 60 °, enjuague con fijador y deje dos gotas
de suspensión celular para correr desde la etiqueta hasta el borde inferior. golpee moderadamente en el borde del mostrador, aproximadamente 1 segundo entre golpecitos, hasta que el
portaobjetos esté seco.

Contacto con la piel: Lavar inmediatamente con abundante agua durante al menos 15 minutos. Se requiere atención médica inmediata.
Inhalación: Salga al aire libre. Si la respiración es difícil, proporcione oxigeno. No use la reanimación boca a boca si la víctima ingirió o
inhaló la sustancia; inducir la respiración artificial con un dispositivo médico respiratorio. Se requiere atención médica inmediata.
Ingestión: No inducir el vómito. Llame a un médico o al centro de control de intoxicaciones de inmediato.
2. Manejo de derrames: En caso de un derrame mientras se encuentre debajo de la campana de humos y dentro de la bandeja protectora, succione el derrame en una
jarra de vidrio y deséchelo en un recipiente para desechos químicos líquidos. Si el derrame ocurre de cualquier otra manera incontrolada, marque 'O' para el
Operador y solicite un “Código 100” para alertar a la asistencia del equipo de Limpieza de Emergencia Química. Consulte Medidas de primeros auxilios para obtener
atención inmediata.
3. Cuando los grumos de células son visibles: Permita que los grumos más grandes se asienten (o retírelos a un tubo etiquetado), o tome la suspensión
fijadora de células por encima de las partículas, sin volver a mezclar) para tener una preparación de portaobjetos más limpia.
4. Un escurrimiento de fijador desigual: muchos factores pueden obstruir el ritmo y la expansión de la metafase durante el proceso de fabricación de
portaobjetos. El movimiento del aire causado por el ventilador de la campana de humos, la vibración de la centrífuga en la encimera, la construcción
cercana que retumba los cimientos, pueden afectar el momento crítico cuando la celda colapsa sobre la superficie del vidrio. Por lo tanto, las condiciones
deben ser ideales al realizar diapositivas. A veces, sin embargo, la causa puede no tener nada que ver con el aire o la encimera. A principios de la década
de 2000, un fabricante de portaobjetos de confianza decidió mejorar sus portaobjetos con un producto químico que los hacía más blancos y, para un
laboratorio, les daba un aspecto mucho más limpio. Pero el químico creó cortes submicroscópicos en la superficie del vidrio que causaron estragos en la
comunidad citogenética. Si el fijador no se desliza suavemente por el portaobjetos, las células también pueden tener dificultades para descansar sobre
su superficie. Deseche o vuelva a limpiar el portaobjetos y, si el problema persiste, busque un lote nuevo o un fabricante diferente, preferiblemente uno
que la comunidad de citogenética utilice actualmente con éxito comprobado, y compare los resultados.
5. Solución de problemas
una. Demasiado lleno de gente
■ Diluir y volver a soltar.

B. Muchos núcleos pero muy pocas metafases
■ Demasiada sangre en cultivo; capa leucocitaria insuficiente; demasiado tiempo en concentración hipotónica o incorrecta; mitógeno expirado; Colcemid® no
añadido; cosechado en un intervalo de tiempo inadecuado; las mujeres embarazadas tienen un bajo rendimiento; los niños o pacientes que toman
medicamentos también pueden tener un bajo rendimiento.
C. Demasiado escaso
■ Vuelva a centrifugar y haga más concentrado.
D. Demasiado apretado
■ Verifique la humedad; los portaobjetos se secan demasiado rápido; vuelva a arreglar y vuelva a intentarlo; use portaobjetos tibios (por ejemplo, deje caer la
suspensión de células mientras el portaobjetos está en una placa calefactora a 40 ° C); soplar sobre el portaobjetos mientras aún está húmedo; acorte el
tiempo de espera antes de colocarlo sobre la placa de cocción; pruebe con otro método de diapositivas; diluido; volver a fijar y pipetear agresivamente
antes de dejar caer; fijador de capa 1: 1 o 2: 1 (metanol: ácido acético) en el portaobjetos antes de dejar caer la suspensión celular (esto debería ralentizar el proceso de secado).
mi.Todo lo que obtuve fue sopa de cromosomas

■ Compruebe que la humedad no sea demasiado alta o la temperatura demasiado baja; el fijador se seca demasiado lentamente; demasiado tiempo en
hipotónico; piso seco; prueba un método diferente; no sople sobre el tobogán o la ola.
F. Corto, oscuro y rechoncho

■ Los portaobjetos se secan demasiado rápido; Verifique la humedad / temperatura. Podría ser un problema de cosecha: retire más
sobrenadante antes de agregar hipotónico; dejar más sobrenadante sobre el sedimento antes del primer fijador; ralentizar el proceso de
fijación; reducir tiempo o cantidad en Colcemid®.
Cromosomas constantemente demasiado delgados
gramo.
■ Intente usar hipotónicos de sangre / médula ósea con una proporción de 1: 2 de citrato de sodio / KCl.
h. Citoplasma intrusivo
■ Vuelva a fijar y mezcle bien. Podría ser un problema de cosecha: no hay suficiente tiempo en hipotonía; ralentizar el proceso de fijación.
I. Homólogos desiguales, especialmente en la periferia
■ Reducir la velocidad de la elaboración de diapositivas; retenga la colocación de la diapositiva sobre la placa calefactora hasta que los bordes muestren
crestas. Podría ser un problema de cosecha: ralentice el primer procedimiento de fijación.
j. Cromosomas esponjosos
■ Compruebe los reactivos fijadores; fije el pellet un par de veces más; aumentar el envejecimiento del portaobjetos; disminuir el tiempo de tripsina durante
el anillado; Disminuir la concentración de tinción.
k. Lleno de agujeros
■ Envejecimiento insuficiente; secado insuficiente después de anillar antes de cubrir

■ La temperatura de la placa caliente es demasiado alta (debe ser de 60 ° C durante la noche o de 96 ° C para el proceso de envejecimiento de “horneado
rápido” en 30 a 45 minutos).
El arcoiris que se desvanece
Aunque Robert Hooke describió por primera vez este fenómeno del arco iris en su libro de 1664 Micrognatia, Isaac Newton en 1717 fue el primero
que estudió su formación. La refracción de la luz en diferentes interferencias entre la gota fijadora convexa que descansa sobre la superficie plana
del vidrio crea este efecto de arco iris. A medida que la burbuja fijadora convexa se "aplana", las células se presionan contra la superficie del
portaobjetos de vidrio. Esto proporciona una indicación visual de cuándo colapsa el menisco de fijación. http://en.wikipedia.org/wiki/
Newton's_rings
Referencia
1. Ficha de datos de seguridad de materiales (MSDS) de Thermo Fisher Scientific para ácido acético, CAS # 64‐19‐7. Revisado el 30 de julio de 2010. 2da
rev.
Protocolo 2.4 Creación de diapositivas
Adaptado de la tercera edición del Manual de laboratorio de citogenética AGT, contribución de Brigham and Women's Hospital, Boston,
MA, pág. 51.
Principio
La preparación de portaobjetos se realiza mejor después de que las células hayan estado en fijador a 4 ° C durante la noche. Sin embargo, se pueden lograr buenos
resultados con material recién cosechado.
II. Procedimiento
1. Aspire el sobrenadante restante del último procedimiento de centrifugación. (Si los tubos han estado reposando durante la noche, mezcle y luego
centrifugue los tubos durante 10 minutos a 1200 RPM). Agregue suficiente fijador 3: 1 fresco (metanol-ácido acético) para hacer que la suspensión
celular se vuelva ligeramente turbia. Nota: La cantidad de fijador agregado variará según el tamaño del gránulo.
2. Con un lápiz con punta de diamante, siga los requisitos de su institución para etiquetar los portaobjetos, por ejemplo, el número de caso y el segundo
identificador del paciente, la letra del tubo y el número de portaobjetos. Dependiendo de las condiciones atmosféricas y las características de cada
muestra, la obtención de los mejores resultados puede requerir una variedad de métodos para preparar los portaobjetos antes de dejar caer las células.
Los portaobjetos se pueden sumergir en agua destilada fría; al vapor sobre un baño de agua caliente; empapado de aliento; sumergido en metanol y
dejado secar; o empapado en fijador 6: 1.
3. Resuspenda suavemente el sedimento celular con una pipeta Pasteur. Deje caer de 3 a 6 gotas de suspensión celular en un extremo del portaobjetos y deje que las
gotas se extiendan por la superficie del portaobjetos. Coloque el portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 75 ° C para que se seque.
4. Compruebe la diapositiva para ver la presencia / ausencia de propagación en metafase y el grado de propagación utilizando un objetivo de contraste de
fase. Utilice esta información para ajustar o modificar sus condiciones de creación de diapositivas. Registre la calidad de la preparación en el libro de
Garantía de calidad de la cosecha.
5. Los portaobjetos se pueden teñir con tintes fluorescentes inmediatamente. Para la tinción de Giemsa, es mejor dejar que los portaobjetos se sequen en el calentador
de portaobjetos a 75 ° C durante aproximadamente 2 horas y 15 minutos o hornear durante 1 hora a 90 ° C.
6. Los portaobjetos sin teñir se almacenan en bandejas metálicas por número de caso en archivos de portaobjetos.
Protocolo 2.5 Preparación de portaobjetos
Adaptado de un protocolo de la tercera edición del Manual de laboratorio de citogenética AGT, que fue aportado por la Universidad de
Stanford, Palo Alto, CA, págs. 61–63.
Principio
Las preparaciones de portaobjetos de cromosomas se realizan dejando caer las suspensiones de células recolectadas en un portaobjetos húmedo, llenando
con fijador y secando al aire. Los portaobjetos debidamente preparados producirán figuras mitóticas bien distribuidas y de un contraste, cuando se observan
con microscopía de fase, que permitirán realizar una adecuada banda G y un análisis cromosómico posterior. Existen muchos métodos diferentes para la
preparación de portaobjetos, y el siguiente se presenta como un protocolo que, cuando se aplica consistentemente,
Satisfacer los requisitos anteriores. No tiene la intención de restringir metodológicamente a los técnicos individuales, solo cualitativamente.
Cualquier variación que produzca resultados consistentes con las siguientes pautas de control de calidad es aceptable.
Muestra
Suspensión de células recolectadas de cualquier protocolo de análisis de cromosomas. Las preparaciones de portaobjetos se realizan mejor el mismo día de
la cosecha, principalmente por conveniencia. La preparación de los portaobjetos se puede retrasar uno o más días sin problemas y, en algunos casos, puede
beneficiar (p. Ej., Dificultades para la obtención de médula ósea). La propagación de la metafase en las cosechas que se dejan más de varios días puede ser
problemática.
II. Materiales y equipamiento
1. KimWipes
2. Portaobjetos de microscopio, mate (VWR # 48312‐079)
3. Toallas de papel
4. Metanol absoluto, (JT Baker # 9070‐1) Ácido
5. acético glacial (JT Baker # 9507‐1) Pipeta
6. Pasteur, 5‐3 / 4 (VWR # 14673‐010) Horno,
7. 90 ° C
8. Microscopio de contraste de fase
Preparación de reactivos
9. Fijador de metanol-ácido acético: una parte de ácido acético glacial por tres partes de metanol absoluto. Hazlo fresco.
Control de calidad
El control de calidad es un proceso continuo cada vez que se realizan diapositivas. Cada portaobjetos debe examinarse con microscopía de fase para
determinar si un número suficiente de metafases muestra una extensión y un contraste adecuados. Nunca haga más de dos o tres diapositivas sin controlar
su calidad. Para obtener información específica sobre cómo manipular el proceso para optimizar la propagación y el contraste, consulte Solución de
problemas.
Resultados inaceptables: preparación en la que una preponderancia de metafases tiene una difusión o contraste tan deficiente que impiden el
éxito del análisis y la colocación de bandas G.
III. Procedimiento
1. Guarde los portaobjetos en un frasco Coplin de metanol absoluto. Retire el portaobjetos del metanol y pula con un KimWipe doblado. Sumerja el
portaobjetos en metanol y agítelo en un vaso de precipitados con agua destilada hasta que el metanol se disuelva y una película delgada y uniforme de
agua cubra el portaobjetos.
2. Sosteniendo el extremo del vidrio esmerilado entre el pulgar y el dedo, seque verticalmente el lado largo del portaobjetos en una toalla de papel para eliminar el
exceso de agua. Manteniendo el borde en contacto con la toalla de papel, baje el portaobjetos hasta que forme un ángulo de 30 ° con la mesa, con una película de
agua uniforme hacia arriba.
3. Con una pipeta Pasteur sostenida horizontalmente, de 1 a 2 pulgadas por encima del portaobjetos, coloque 3 gotas de suspensión celular espaciadas uniformemente
sobre el portaobjetos, moviéndose sucesivamente hacia el extremo helado. Las gotas deben golpear el tobogán un tercio del ancho desde la parte superior del
tobogán posicionado horizontalmente y deben estallar y esparcirse uniformemente al golpear el tobogán.
4. Incline la corredera de nuevo a la posición vertical y escúrrala un momento. Bájelo nuevamente a un ángulo de 30 ° y, gota a gota con una pipeta Pasteur, inunde el
portaobjetos con fijador de metanol-ácido acético 3: 1 nuevo, comenzando en la esquina superior y moviéndose hacia el extremo del vidrio esmerilado. Esto
desplazará uniformemente el agua restante y permitirá que el portaobjetos se seque uniformemente.
5. Vuelva a drenar el portaobjetos por un momento, limpie la parte posterior y luego seque al aire el portaobjetos de tal manera que proporcione una
buena morfología y diseminación cromosómica (consulte Solución de problemas).
6. Etiquete el portaobjetos de acuerdo con los requisitos del laboratorio, que pueden incluir el número de laboratorio, el segundo identificador del paciente, la letra de
cultivo, el número secuencial único y la fecha.
7. Envejezca artificialmente el portaobjetos en un horno a 90 ° C durante 30 minutos.

IV. Solución de problemas
La consistencia del procedimiento es esencial al preparar los portaobjetos de cromosomas. Posteriormente, esto permitirá una banda G consistente y
sistemática. Para lograr la consistencia, cada portaobjetos debe monitorearse con microscopía de contraste de fase. Los portaobjetos se examinan en busca
de una buena concentración celular, extensión cromosómica, morfología e índice mitótico.
1. Las buenas preparaciones de cromosomas deben esparcirse adecuadamente para facilitar el recuento y el análisis. Debe evitarse la
sobreexpansión, ya que esto provocará recuentos de cromosomas hipomodales artefactos y dificultades en la fotomicroscopía.
2. Los cromosomas deben aparecer nítidos y oscuros, sin “halos de luz” rodeándolos. Asimismo, no deben aparecer borrosos, pálidos o
"atenuados".
3. El paso más crítico y variable es secar al aire los portaobjetos. Esto debe resolverse para cada sesión, luego cumplirse y monitorearse para cada diapositiva.
En general, los cromosomas mal diseminados con halos se secan demasiado rápido y pueden ralentizarse colocándolos para que se sequen sobre una
toalla de papel húmeda o en un ángulo vertical o empinado, respirando ligeramente sobre el portaobjetos después de la inundación del arreglo o
enfriando el arreglo. Además, en general, los cromosomas pálidos, grises o extendidos se secan demasiado lentamente y pueden corregirse bajando el
ángulo de secado, calentando brevemente el portaobjetos o agitando el portaobjetos antes de dejarlo secar.
4. El secado es muy sensible a la humedad y la temperatura, por lo que variará de un día a otro. Es útil cierta cantidad de imaginación y
experimentación. No obstante, recuerde que la simplicidad de la técnica es deseable y conducirá a resultados más consistentes y,
posteriormente, a una mejor y más fácil colocación de bandas G con tripsina.
5. El calentamiento del tobogán también es importante. Este es un envejecimiento artificial y debe realizarse dentro de los límites establecidos en el procedimiento. El
sobrecalentamiento o el subcalentamiento, ya sea por la variación de la temperatura o el tiempo, provocará una sensibilidad insuficiente o excesiva al pretratamiento
con tripsina durante la colocación de bandas G.
Referencias
1. Comunicación personal con la técnica de Mike Brown, Laboratorio de Citogenética Clínica, Universidad de Ciencias de la Salud de Oregón,
Portland, Oregón
2. Hack M, Lawce H, eds. La Asociación de Tecnólogos Citogenéticos Manual de Laboratorio de Citogenética. San Francisco:
Asociación de Tecnólogos Citogenéticos, 1980.
Protocolo 2.6 Procedimiento de preparación de portaobjetos
Adaptado de un protocolo de la tercera edición del Manual de laboratorio de citogenética AGT, que fue aportado por el Centro Médico
Universitario, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, Ohio, págs. 73–74.
Principio
Se deja caer una suspensión celular homogénea sobre portaobjetos limpiados con detergente o alcohol ácido desde una altura y una dilución tal
que la metafase se propague y los cromosomas mismos se esparzan entre sí sin romper las membranas celulares. Una membrana celular rota
resultará en la dispersión de cromosomas en la superficie del portaobjetos, produciendo metafases que son difíciles e inapropiadas de analizar.
Después de dejar caer la suspensión celular, los portaobjetos se colocan brevemente en una placa calefactora y luego en un horno caliente para
ayudar al proceso de secado. Los portaobjetos se anidan según la técnica que se considere necesaria para el tipo de análisis. La preparación de
portaobjetos es el paso más importante para lograr buenos resultados. Los portaobjetos mal preparados darán como resultado un análisis
deficiente y tedioso.
II. Materiales
1. Fijador
una. Metanol, grado reactivo analítico
B. Ácido acético glacial, grado reactivo analítico
Preparación de la solución de trabajo
1. Mida con una probeta graduada de 100 mL, 75 mL (3 partes de metanol) a 25 mL (1 parte) de ácido acético glacial.
2. Vierta en una botella de 100 ml y tape ligeramente. Etiquetar como "Fix" con advertencia: CORROSIVO / INFLAMABLE.
Prepare el fijador inmediatamente antes de que sea necesario. Mantenga siempre la botella tapada cuando no esté en uso. Deseche diariamente cualquier porción
no utilizada en un recipiente de seguridad, de acuerdo con las Pautas de manejo de sustancias químicas de su institución. Marque la fecha, el tipo y la concentración
del compuesto, la cantidad desechada y las iniciales en la etiqueta adherida a la lata de seguridad.
Control de calidad
1. Verifique microscópicamente el primer portaobjetos que se haya caído, evaluando la calidad y cantidad de las extensiones de metafase presentes.
2. Ajuste la técnica de caída en consecuencia para los siguientes deslizamientos.

3. Revise microscópicamente cada portaobjetos sucesivos que se caigan de ese cultivo. Reajuste la técnica de caída en consecuencia.
4. Compruebe el primer portaobjetos de cada tubo de cultivo restante que se va a dejar caer, y cada portaobjetos sucesivo a partir de entonces, para ver si hay
propagación cromosómica y citoplasma de fondo.
5. Límites de tolerancia: apunte a cromosomas bien diseminados sin citoplasma.
III. Procedimiento
1. Con una pipeta Pasteur, coloque tres gotas de suspensión celular fija de manera uniforme sobre el portaobjetos limpio sumergido en agua destilada a 37 ° C.
2. Los portaobjetos se pueden agitar y / o soplar suavemente para facilitar la propagación de los cromosomas.
3. Coloque sobre toallas de papel húmedas durante 5 a 30 segundos si la humedad es del 40%.
4. Coloque en un calentador de portaobjetos a 65 ° C durante 5 a 30 segundos, según sea necesario.
5. Compruebe el portaobjetos con un microscopio de contraste de fase para determinar la calidad de la suspensión celular, el número de metafases, la calidad de las
metafases y la extensión. Documente en la hoja de preparación de muestras la cantidad y la calidad de las extensiones en metafase presentes en cada tubo de cultivo.
IV. Solución de problemas
1. Deslizamiento demasiado grueso con núcleos y / o figuras mitóticas

una. Diluir con más fijador. Diapositivas
2. demasiado delgadas
una. Girar y quitar un poco del fijador. Fondo

3. citoplasmático y / o escasamente diseminado
una. Aumente la altura desde la que se dejan caer las células de la pipeta al portaobjetos.
B. Use lavados adicionales en fijador.
C. Incrementar la concentración de ácido acético glacial en fijador.
D. Sustituya ácido acético glacial al 50% en fijador.
mi. Use vapor y menos tiempo en el calentador de portaobjetos.
F. Utilice una combinación de los métodos anteriores.

4. Cromosomas dispersos y / o dispersiones rotas
una. Disminuya la altura desde la que se dejan caer las células de la pipeta al portaobjetos.
B. Use más tiempo en el calentador de diapositivas.
C. Use agua más fría y / o portaobjetos congelados.
D. Utilice una combinación de los métodos anteriores.
5. Si nada de lo anterior soluciona el problema, refrigere y deje caer al día siguiente.

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Capitulo 2

Citogenética: una descripción general

2.2 Historia de la citogenética humana

A largo plazo Término corto Separar

Resuspender Suspensión de gota celular

2.3 Métodos de citogenética

2.3.1 Flujo de trabajo

Cuadro 2.1 Principales descubrimientos y puntos de referencia en citogenética, 1865-2001

Año Investigador Descubrimiento

1865 Gregor Mendel Principios descubiertos de la herencia

1867 Gustav Giemsa Mezcla de tinción inventada de Giemsa

1882 Walther Flemming Mitosis descrita, fijación usada, tinción

1888 heinrich Wilhelm Waldeyer Cromosomas nombrados

1914 Theodor Boveri cromosómicos podrían causar cáncer Introdujo el método de

1921 John Belling calabaza para la diseminación cromosómica

1937 Albert Blakeslee y Colchicina usada para detener metafases

1941 Frits Zernike microscopio de contraste de fase desarrollado

1951 George Gey línea celular heLa establecida

1953 James Watson y Estructura de doble hélice descrita de DNa

1958 Charles e. Vado Primer informe de anomalías cromosómicas en la leucemia

1959 patricia jacobs y john fuerte Descrito XXY en el síndrome de Klinefelter

1959 Charles e. Vado informó síndrome de 45, X turner

1960 J. a. Böök y Berta Santesson Klaus Triploidía descrita en humanos

1960 patau Trisomía 13 descrita

1960 John edwards Trisomía 18 descrita

1960 Peter Nowell Efecto descrito de la fitohemaglutinina a (pha) en el cultivo de linfocitos

1960 ISCN Primera conferencia sobre nomenclatura cromosómica (Denver, CO)

1961 Mary Lyon Inactivación descrita de X

1963 Jerome Lejeune Se describe el 5p eliminado en el síndrome de Cri ‐ du ‐ chat Se

1964 patricia Farnes y describe el uso de mitógenos de la hierba carmín

1969 Herbert Lubs Describió por primera vez el X frágil en familias

Cuadro 2.1 ( Continuado)

Año Investigador Descubrimiento

1969-1970 La amniocentesis se utiliza clínicamente para el diagnóstico citogenético Se

1970 torbjörn Caspersson, describen las primeras bandas Q en humanos

1971 ISCN tercer encuentro de nomenclatura de cromosomas humanos (parís,

1971 adrian Sumner; S. r. patil; Describió varios métodos de banda G

1971 Bernard Dutrillaux, bandas R publicadas en EE. UU.

1974 David Cox, Virginia Niewczas‐ Método de recolección in situ descrito

1975 Samuel a. Latt Métodos de bandas de replicación descritos Tinción de

1975 C. Goodpasture y cromosomas con plata descrita con NOr

1977 David Peakman, Marilyn Método de recolección in situ de cubreobjetos descrito

1979 Jorge Yunis Métodos de bandas G de alta resolución descritos

1980 JG Bauman, J. Wiegant, Primera hibridación in situ con fluoróforos fluorescentes

1986–1988 Daniel pinkel y Joe Gray FISh desarrollado en interfase y metafase

Mediados de los 80 Sistemas de captura / cariotipo automatizados (computarizados)

1987 Jack Spurbeck Primer método de recolección robótico descrito

1989 hermann ‐ Josef Lüdecke Primera microdisección de cromosomas descrita

1991 una. Kallioniemi, O ‐ p Hibridación genómica comparativa descrita (CGh)

1996 Kallioniemi evelyn Schröck, Cariotipo espectral multicolor descrito

1999 ICGSe Se estableció el borrador del genoma humano.

y el método de cultivo (por ejemplo, recolección in situ versus recolección en suspensión).

2.3.2 Métodos de cultivo

Cuadro 2.2 medios de cultivo de tejidos comúnmente utilizados para citogenética

Medio Tipo de cultura Comentarios

MeM o águila todo Medio mínimo esencial

DMe todo Águila modificada de Dulbecco

Medio 199 o X frágil (históricamente), profase Bajo ácido fólico

5a de McCoy todo muy enriquecido; bueno para el medio de transporte

2.3.4 Eliminación de células adheridas y pasos de centrifugación