TEMA 1.

3: Técnicas de PCR
PCR:

Bases:

La reacción de PCR necesita de una serie de elementos claves:

- ADN molde o template

- TAQ polimerasa o enzima que lleva a cabo la reacción, que requiere la presencia de
magnesio (buffer Mg2+) como cofactor. Esta enzima fue extraída de una bacteria termófila, por
lo que es capaz de tolerar incluso 72ºC.
- dNTP
- Primers u oligonucleótidos sentidos
- Primers u oligonucleótidos antisentidos

NOTA: por lo general se suele probar con varios gradientes de Mg 2+ y con varios rangos de
temperatura. A una determinada concentración de Mg 2+ y a una temperatura elevada la TAQ
polimerasa funciona de manera óptima, es decir, se une a los oligonucleótidos o primers para
polimerizar. Así mismo, los oligonucleótidos se unen al ADN de manera más efectiva según estos
parámetros (concentración de magnesio y temperatura).

Funcionamiento: en principio se somete el ADN molde o template a una temperatura alta que lo
desnaturalice. Luego, bajamos la temperatura porque los oligonucleótidos o primers solo aparean
con sus cadenas complementarias de ADN (annealing) en un rango de temperatura óptima. Una
vez que se produce el annealing, damos subimos la temperatura hasta alcanzar la actividad óptima
de la TAQ polimerasa, para que lleve a cabo la polimerización. En la primera ronda, la TAQ
polimerasa polimeriza durante todo el tiempo que señalemos, por lo que copia un fragmento de
ADN de mayor tamaño que el que requerimos. En las siguientes rondas, se van seleccionando los
tamaños que necesitábamos amplificar.

NOTA: la temperatura de melting (Tm) hace referencia a la temperatura de fusión de los

oligonucleótidos, por lo que debe estar por encima de la temperatura a la que se produce el
annealing.

Esquema temporal de una reacción de PCR:

*Etapa previa: consiste en llevar la reacción a una temperatura de 95ºC durante 9 minutos. Solo es
necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

1. Desnaturalización del ADN molde: para que las dos cadenas que forman el ADN se
separen la reacción se lleva a 95ºC durante 60 segundos.

2. Hibridación: los oligonucleótidos aparean con sus cadenas complementarias y para ello
bajamos la temperatura a unos 55ºC durante 50 segundos.

3. Elongación (polimerización): la TAQ polimerasa se activa y para ello se fija la temperatura

a 72ºC durante 180 segundos.

*Repetimos estos tres pasos normalmente en 30 ciclos para ir amplificando el ADN. Las
temperaturas y, especialmente los tiempos son orientativos, pues varían para adecuarse cada
muestra concreta. Asimismo, los ciclos que se suelen dar no son siempre 30, sino que variarán
según la cantidad de ADN que tenga nuestra muestra y la fatiga térmica de la TAQ polimerasa. De
esta forma, si tenemos muy poco ADN hacer 40 ciclos no es una exageración.

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NOTA: la temperatura que más varia es la de hibridación o annealing de los oligonucleótidos; el
resto de temperaturas suelen estar bastante estandarizadas (como la de la TAQ polimerasa que es
fija).

*Etapa final: para asegurarnos que lo que no se ha amplificado lo haga, se mantiene la reacción a
unos 72ºC durante 4 minutos. Cuando nos marchamos del laboratorio, solemos someter la reacción
a 4ºC para que el ADN sea muy difícil de degradar.

TAQ Polimerasa:

NOTA: a través de la mutagénesis mejoramos las TAQ polimerasas obteniendo otras nuevas.

Aunque existe un catálogo muy amplio de TAQ polimerasas, podemos dividirlas en dos grandes
familias:

 ADN polimerasas estándares (TAQ): para procesos que no requieren mucha fidelidad. Ej.:
en el genotipado de un ratón, el cambio de un nucleótido por otro diferente (provocado por
la equivocación de la enzima) no tiene tanta importancia.

 ADN polimerasas muy fieles en su síntesis (PFU, PWO): la polimerasa se puede

equivocar, pero en este caso la tasa de error vemos que tiene un orden de magnitud
menor que en el caso de la TAQ polimerasa. Ej.: si queremos amplificar un fragmento para
clonarlo, es muy importante no acumular mutaciones, de ahí que empleemos las PFU
polimerasas. En este caso la tasa de error es menor, es decir, la polimerasa se “equivoca”
menos porque posee actividad exonucleasa 3’5’ o de corrección de errores. Sin
embargo, estas polimerasas tienen una desventaja, pues son enzimas de baja
procesividad que generan un bajo rendimiento de la PCR (obtenemos bandas con menor
cantidad de ADN).

NOTA: el uso de una u otra polimerasa depende de la aplicación que le vamos a dar a la enzima en
cuestión, según su tasa de error (propiedad característica de cada enzima).

*Polimerasas hot start: son las TAQ polimerasas de mayor calidad, la razón de ello es que nos las
venden inactivas, es decir, con anticuerpos que bloquean los distintos epítopos de esta proteína.
Reciben este nombre porque para que comiencen a funcionar requieren una previa activación
mediante un “hot start”, esto es, el aumento de la temperatura durante un pequeño periodo de
tiempo. La TAQ polimerasa es termófila, por lo que no se desnaturaliza, sino que son los
anticuerpos los que se desnaturalizan y se separan de la TAQ polimerasa. En este momento, la
enzima pasa a realizar su función.

NOTA: en las otras TAQ polimerasas cuando las añadimos pueden realizar ciertas
polimerizaciones previamente a la PCR, mientras que con esta técnica conseguimos activar a la
TAQ polimerasa como si se tratase de un “interruptor”.

Problemas en el diseño de oligonucleótidos:

El ADN molde a temperatura ambiente no está desnaturalizado, sino que se encuentra formando
una doble hélice, y es muy estable (requiere de mucha temperatura para que se desnaturalice); sin
embargo, los oligonucleótidos forman cadenas simples de pequeño tamaño. Si usásemos una TAQ
polimerasa (que no sea hot sart) en un principio no funciona mucho porque se está alcanzando su
temperatura óptima. De esta forma realiza pequeñas polimerizaciones, pudiendo si los
oligonucleótidos hibridan entre ellos formar dímeros de primers. Esto supone un problema para la
PCR, pues al formar dímeros estamos “secuestrando” nucleótidos y enlenteciendo la reacción. De
esta forma con el uso de polimerasas hot start, la reacción solo tiene lugar cuando se
desnaturalizan y se liberan los anticuerpos, haciendo que disminuyan los dímeros de primers.

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Hay programas de selección de oligonucleótidos para que estos no hibriden entre ellos y formen
dímeros de primers. Una forma de evitarlo es haciendo que los nucleótidos de los primers no sean
complementarios, pero en ocasiones estamos obligados a no cambiar una determinada secuencia,
como en el caso de un proceso de clonación.

Tenemos dos posibilidades:

- Si hay apareamientos entre dos oligonucleótidos, con la polimerización hacia ambos

extremos se forman los dímeros de primers.

- Si hay apareamientos entre regiones de un mismo oligonucleótido, con la polimerización

se formaría una especie de lazo o bucle.

En ambos casos cuando los oligonucleótidos se desnaturalicen y queden abiertos, su extremo 3’

(fundamental para que se una al ADN molde) deja de ser complementario con el ADN molde y no
se une al mismo.

Para modificar los oligonucleótidos hay que hacerlo en el extremo 5’, poniendo por ejemplo dianas
de restricción para EcoRI y Bamh2. Hay enzimas de restricción que se unen y cortan aunque el
extremo sea romo; las demás requieren de nucleótidos extras. Así en este último caso, en el
extremo 5’ colocamos una secuencia específica para que la enzima corte y varios nucleótidos
extras para que los oligonucleótidos tengan una temperatura de melting (Tm) similar.

PCR en tiempo real: ¿Cuantitativa?

La PCR cuantitativa o en tiempo real implica que, en vez de tener que esperar a que terminen
todos los ciclos, podemos seguir en tiempo real lo que sucede en cada uno de los tubos de la
reacción. Esto se consigue con un aparato que mide la fluorescencia de las moléculas de ADN que
se van sintetizando y nos lo va mostrando en una gráfica. Esta historia de ir siguiendo la reacción
de la muestra en tiempo real a partir de su fluorescencia, es lo que nos permite usarla como una
técnica cuantitativa.

Vemos un experimento en el que se hacen 96 replicados de la misma reacción de PCR: al

principio, cada tubo se comporta de una manera; después, la fluorescencia es la misma en
todos; finalmente, se observa una gran dispersión, es decir, tenemos valores diferentes de
fluorescencia para cada uno de los tubos. Esto sólo ocurre a partir de un de un determinado
momento (ciclo nº 20), a partir del cual además empieza a aumentar la fluorescencia de manera
exponencial. Esto no quiere decir que no hay amplificación antes de los 20 ciclos, sino que
nuestro aparato tiene un límite a partir del cual detecta tales amplificaciones. Al final, observamos
como la fluorescencia deja de ser exponencial.

Si no conociéramos el hecho de que hemos usado 96 replicados diferentes, al observar bandas

más finas y más gruesas, pensaríamos que las más gruesas tienen más cantidad de ADN. Pues
como colocamos un agente intercalante responsable de la fluorescencia, esta fluorescencia es
proporcional a la cantidad de ADN.

Sin embargo, la PCR no es una técnica cuantitativa: el estado final de los tubos no tiene por qué
reflejar el estado inicial. Razón de ello es que al final de la PCR, la TAQ polimerasa no es igual de
eficaz que al principio, pues no desempeña un funcionamiento óptimo porque existe un
agotamiento de sus sustratos, se han roto enlaces, hemos cambiado la temperatura… Es decir, a
modo de conclusión la PCR no es cuantitativa porque varía su eficacia a lo largo del proceso, y no
nos podemos creer e resultado final.

NOTA: Realizamos tantos ciclos (40 ciclos) porque el aparato solo nos registra la amplificación a
partir de ciclo número 20, es decir, cuando la reacción se vuelve exponencial.

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Justo en el punto en el que nuestro aparato detecta la fluorescencia (situación donde la
amplificación es exponencial), es el momento idóneo para empezar a cuantificar las moléculas de
ADN hay de manera relativa (también se podría realizar una cuantificación absoluta) y compararlo
con el ADN de partida.

En principio tenemos tres tubos con una cantidad de ADN desconocida, por lo que efectuamos su
PCR cuantitativa. Al comienzo en ninguna de las tres muestras se detecta fluorescencia, pero de
repente en la muestra 1 empieza a aumentar su fluorescencia. Siguen transcurriendo ciclos, y se
empieza a detectar la fluorescencia de la muestra 2. Y así sucesivamente hasta que empezamos a
detectar el aumento de fluorescencia en todas las muestras (1, 2 y 3).

Dicho todo esto, podemos establecer un parámetro llamado valor CT, que es el ciclo a partir del
cual empezamos a ver la fluorescencia. Calculamos dicho valor para cada muestra, y en función de
los ciclos de diferencia entre una muestra y la siguiente, podemos saber cuánta cantidad de ADN
hay más en un tubo que en otro. Una diferencia de un ciclo entre dos muestras, equivale a una
diferencia del doble de ADN, pues en un ciclo de PCR se duplica el ADN. Para asumir este hecho,
la eficacia de la reacción exponencial debe de ser del 100%, pero esto en la vida real casi nunca
sucede por lo que hay que calcular la eficacia de los oligonucleótidos para poder corregir el error
matemáticamente.

Ej.: en una muestra la fluorescencia comienza en el ciclo 10, y en otra en el ciclo 11, por lo que la
muestra cuya fluorescencia comienza a detectarse antes (ciclo más bajo10) es la que más
ADN tiene.

Eficacia de la reacción:

𝑿𝒏 = 𝑿𝟎 (𝟏 + 𝑬)𝒏

Si la eficacia de la reacción fuese del 100% (es decir del 1), cosa que como sabemos es
complicado, en cada ciclo de PCR se duplicaría la cantidad de ADN target.

𝑿𝒏 = 𝑿𝟎 (𝟐)𝒏

La eficacia depende de forma crucial de la calidad de la TAQ polimerasa, pues el número de

ciclos para los que la TAQ se comporta con eficacia 1 es muy variable. Además, también varía
según la concentración de oligonucleótidos que pongamos, así como su diseño. Si
conociéramos la eficacia de los oligonucleótidos podríamos matemáticamente corregir el error.
Como podemos observar intervienen muchos factores, que no siempre podemos controlar y hay
que asumirlos como parte de los errores experimentales.

En la vida real no hacemos un solo cultivo y cogemos varias muestras del mismo, pues podría
suceder algo extraño en todas esas muestras. Sino que realizamos varios replicados de los
experimentos, es decir, hacemos varios cultivos y cogemos varias muestras de cada uno de ellos
para que si sucede algo extraño en algún cultivo tendremos los otros.

NOTA: Hay gente que comprueba la eficacia de la reacción. Para ello cogen una de las muestras y
le hacen diluciones. Si cogemos una cantidad de ADN y la diluimos a la mitad, tendría que haber
una diferencia de CT de un ciclo si la eficacia de la reacción es del 100%. Si la eficacia de la
reacción no fuera del 100%, obtendríamos una recta con una determinada pendiente
correspondiente con la eficacia, que podríamos sustituir en la fórmula para ver la cantidad de AND
que tenemos.

*Fluorocromos intercalantes: SYBRGreen

La PCR en tiempo real requiere de un agente intercalante llamado SYBRGreen, que cuando está
unido al surco mayor del ADN de doble cadena emite fluorescencia. Así la cantidad de ADN es

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proporcional a la cantidad de moléculas de SYBRGreen que se unen al mismo, y por tanto a la
fluorescencia que emiten.

La concentración de este agente intercalante es crítica, por lo que si usamos más del debido, se
inhibe la amplificación del ADN porque se modifica la fidelidad de la TAQ polimerasa.

El problema del SYBRGreen es que no tienen especificidad de secuencia, sino que se va a unir
a cualquier ADN de doble cadena y va a emitir fluorescencia. El ADN de doble cadena también
puede corresponder a los dímeros de primers (que se formaron en un momento concreto y captan
el agente alquilante), por lo que son necesarios los análisis de curvas de fusión para descartar esta
opción.

Curva de fusión:

Nos permite hacer un control de calidad para corroborar que el ADN de doble cadena
corresponde al producto de nuestra PCR. Así, tras terminar la PCR se calienta la muestra hasta
desnaturalizarla (las dos hebras de ADN se separan), lo que provoca una caída de la fluorescencia.
Con ello podemos detectar la Tm, es decir, la temperatura a la cual la mitad de las moléculas han
sufrido una desnaturalización y han perdido la fluorescencia.

Si mediante una manipulación matemática, calculamos la derivada de la fluorescencia con respecto

a la temperatura y lo representamos frente a la temperatura, podemos observar mejor la Tm:

 Cuando aparece un único “pico” no ha habido contaminación, pues se corresponde con la

Tm del producto de PCR específico que queríamos.

 Cuando aparece más de un “pico” sabemos que ha habido de alguna u otra forma
contaminación por dímeros de primers, pues su Tm es menor. En este caso la
fluorescencia no procede única y exclusivamente del producto de ADN específico de PCR
que nos interesa, por lo que descartamos el experimento.

Sondas específicas:

Una manera de resolver la falta de especificidad de secuencia de SYBRGremm es el uso de

sondas fluorescentes específicas de nuestro producto. Así podemos asegurar que la fluorescencia
es emitida por el producto de PCR específico que queríamos y no de los dímeros de primers.

Existen dos tipos de sondas:

1. Sondas TaqMan:

En los tubos además de los sustratos de la PCR añadimos una sonda TaqMan, que hibrida
específicamente con alguna parte en medio del fragmento de ADN que queremos amplificar. Esta
sonda es una secuencia específica que cuenta con un fluoróforo (F) en el extremo 5’ y una
modificación llamada quencher (Q) en el extremo 3’. Cuando el fluoróforo se encuentra cercano al
quencher tiene lugar un fenómeno conocido como quenching FRET: el fluoróforo transfiere la
energía al quencher y éste disipa dicha energía en forma de fluorescencia; no nos interesa medirla
porque se encuentra a una mayor longitud de onda. Si quitásemos el quencher, el fluoróforo
emitiría fluorescencia a la longitud de onda que le corresponde.

Imagen: tenemos dos oligonucleótidos y en medio una sonda TaqMan que hibridan a una
secuencia concreta de ADN. A medida que comienza la amplificación, la TAQ polimerasa degrada
la sonda por el extremo 5’ correspondiente al fluoróforo, pues ésta cuenta con actividad
exonucleasa 5’3’. De esta forma se libera el fluoróforo, que deja de estar cercano al quencher y
emite la fluorescencia a una longitud de onda adecuada.

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La fluorescencia que se genera es proporcional a la cantidad de producto de PCR. Además
tenemos cierta garantía de que estamos amplificando nuestro producto de PCR y no otro producto,
porque se requieren tres hibridaciones específicas (de los dos primers y de la sonda) para que se
dé. De hecho, sería mucha casualidad que existieran otras moléculas similares a nuestra molécula
de interés con las que la sonda y los dos primer pudiesen hibridar.

2. Molecular Beacons:

Son sondas peculiares porque tienen forma de horquilla, cuya especificidad la da el bucle.
Además, cuenta con dos partes ricas en seis bases (hexámero) de guanina y citosina que de forma
complementaria hibridan entre ellas mediante puentes de hidrógeno, formando así un brazo muy
estable.

El diseño de esta sonda es diferente con respecto a la sonda TaqMan, pero el principio es el
mismo, pues cuenta con un fluoróforo y un quencher. En este caso, cuando el fluoróforo está en
contacto con el quencher generan un quenching colisional: el fluoróforo transfiere la energía al
quencher, que la disipa en forma de calor (en lugar de fluorescencia).

Durante la reacción de PCR al desnaturalizar el ADN, también desnaturalizamos la sonda

molecular Beacons que queda abierta. Posteriormente, bajamos la temperatura hasta que sea
óptima para que se produzca el annealing, se unen los oligonucleótidos y la sonda también podría
aparear a la región complementaria de ADN. Cuando la sonda hibrida, sus dos extremos se
encuentran separados, por lo que el fluoróforo emite una fluorescencia proporcional al producto de
PCR especifico.

Si proseguimos con los pasos de la PCR, elevamos la temperatura hasta los 72ºC para que se
produzca la polimerización. A esta temperatura no de degrada la sonda, pues su Tm se encuentra
diseñada para que se separe del ADN y vuelva a su conformación más estable (conformación de
horquilla o cerrada). De esta manera conseguimos que la sonda no esté unida durante la fase de
polimerización y no se degrade, porque de ser así se emitiría fluorescencia tanto durante la fase de
annealing como durante la fase de polimerización, y la sonda unida no sería proporcional a la
cantidad de producto.

El diseño de las sondas molecular Beacons es más complicado, pues no solo hay que diseñar la
secuencia del bucle (la secuencia del brazo es constante) para que se dé la hibridación, sino que
hay que conseguir que la Tm sea parecida a la de los oligonucleótidos para que la PCR sea
efectiva. Como es un proceso muy difícil, hoy en día existen programas que analizan tu secuencia
de ADN y diseñan las sondas más adecuadas.

Cuando queremos amplificar 60 genes diferentes, diseñar tantas sondas cuesta mucho tiempo y
dinero. Además, en este caso cada reacción de PCR requerirá de unas condiciones de temperatura
específicas según la sonda, por lo que en estos casos para cuantificar el ADN se emplea el agente
alquilante SYBRGreen (método más usado pese a sus inconvenientes).

RT-PCR:

*¿Por qué requerimos conocer la cantidad de ADN inicial mediante PCR cuantitativa?

Se emplea mucho cuando queremos comparar niveles de expresión de genes. Aislamos el

ARNm de las poblaciones que queremos comparar, cogemos una pequeña parte y la
retrotranscribimos a ADN complementario. De esta forma, ya puede cuantificarse por PCR
cuantitativa la cantidad de ADN obtenida. La retrotranscripción tiene que ocurrir de forma similar en
ambas muestras, y además su eficacia también tiene que ser del 100%. Esto último es asumido,
porque controlar la retrotranscripción es muy complicado.

NOTA: en una RT-PCR la muestra de menor valor CT es la de mayor cantidad de ADN

complementario, y con ello mayor ARNm.

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Uso de cebadores:

- Oligo (dT) primer: para retrotranscribir todo el ARN poli A.

- Primer Random Hexamer: oligos de seis nucleótidos con secuencia aleatoria, que son
usados para retrotranscribir todo el ARN, inclusive el poli A. Se ha comprobado que funcionan
muy bien, pues se van “pegando” por todas partes y además, sirven para rellenar huecos.

- Primer de un gen específico: para retrotranscribir una región de ARN que te interesa.

El oligo (dT) primer se puede emplear cuando se encuentra cercano al extremo 3’, pues así tienes
la garantía de que la retrotranscripción llegue a dicho extremo. Si el oligo se encuentra cercano al
extremo 5’ de un gen largo, no tenemos la seguridad de que la retrotranscripción llegue hasta el
final; en este caso usaríamos un primer Random hexamer.

Pero a su vez los primer Random hexamer tienen un problema, pues ante muestras de ARN que
contienen además ADN contaminante, éste también se va a amplificar aumentando aún más la
contaminación. Con el oligo (dT) esto no suele pasar, porque las moléculas de ADN que
contaminan la muestra por lo general carecen de cola poli A.

De todas estas cosas nunca hay garantías (todo depende de la muestra, de la secuencia…), por
ello nos ponemos en la situación más favorable posible buscando para ello siempre oligos que
hibriden con regiones cercanas a la zona que queremos retrotranscribir

Diseño de oligonucleótidos para RT-PCR:

Cuando hay que diseñar oligonucleótidos, es muy interesante hacer un estudio previo de la
estructura genómica del gen que nos interesa. Así conocemos la secuencia del ARNm, y del ADN
genómico con sus intrones y con sus exones; estas secuencias están disponibles en las bases de
datos.

Los oligos necesarios para la RT-PCR es conveniente que hibriden con exones continuos para que
tengamos la garantía de que en medio hay un intrón. En el caso del ARNm los fragmentos están
cerca, pero si hubiese ADN contaminante al hacer la PCR se amplificarían fragmentos muy
grandes (hay intrones en medio). Así podremos ver fácilmente si en nuestros productos hay ADN
contaminante o no, y si esto supone un problema para el desarrollo adecuado del experimento.

En la vida real este producto de ADN contaminante ni si quiera se forma porque estás dando
tiempos de polimerización muy cortos durante la PCR cuantitativa (esta técnica solo busca
contabilizar).

NOTA: cuando tenemos un intrón muy pequeño es mejor no lo encuadrarlo entre los oligos que van
a hibridar, sino que es mejor coger un intrón mayor para ver si por mucho ADN que tengas eres
capaz de verlo.