Separación de Sustancias Orgánicas por Cromatografía de Pape (Laboratorio en casa) 2020 I

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Juan Ernesto Almeira O., PhD

1. Introducción

La cromatografía es una técnica de separación basada en el principio de retención selectiva, que permite separar los distintos
componentes de una mezcla facilitando su identificación y cuantificación. El nombre de la técnica se debe al botánico ruso
Mikhail Semenovich Tswett, quien usó columnas de vidrio rellenas de carbonato de calcio para separar pigmentos vegetales.
Las técnicas cromatográficas son muy variadas, sin embargo, en todo el fenómeno de separación ocurre al hacer pasar una
fase móvil fluida (gas, líquido o fluido supercrítico), que arrastra a la mezcla, a través de una fase estacionaria constituida por
un sólido finamente dividido o un líquido fijado en un sólido. En este proceso los componentes de la mezcla interaccionan de
diversa manera con la fase estacionaria y debido a esto atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades, por lo cual se
van separando.

Figura 1a. Cromatografía de Figura 1b. Cromatografía de Figura 1c. Cromatografía de fríjol,
algunos fármacos fosfolípidos limón

De acuerdo con cómo esté dispuesta la fase estacionaria las técnicas cromatográficas se pueden dividir en:

Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:
cromatografía en papel y cromatografía en capa fina.

Cromatografía en columna: la fase estacionaria se sitúa dentro de un tubo o columna. Según el tipo de fluido empleado como
fase móvil se distinguen: cromatografía de líquidos, cromatografía de gases, cromatografía de fluidos supercríticos.

La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya es sencilla de
implementar y no requiere de equipamiento sofisticado. En esta técnica la fase estacionaria está constituida simplemente por
una tira o circulo de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de una solución de la
muestra y evaporando el disolvente luego de cada aplicación. Luego el disolvente o mezcla de disolventes empleada como
fase móvil (eluente o eluyente) se hace ascender por capilaridad. Para esto se coloca una porción del papel en contacto con la
fase móvil dentro de un recipiente que la contiene (cámara de desarrollo). Después de unos minutos, cuando el disolvente
deja de ascender o ha llegado al borde extremo del papel, se retira el papel y seca. Es importante que la cámara de desarrollo
permanezca bien tapada durante el proceso de ascenso capilar de la fase móvil (desarrollo cromatográfico), pues de lo
contrario no se alcanza el equilibrio necesario entre el líquido (fase móvil) y el vapor del líquido. Si el disolvente elegido fue
adecuado y las sustancias tienen color propio se deberán ver manchas de distinto color separadas a lo largo del papel. Cuando
los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. La cromatografía es un sistema de
separación dinámica, porque continuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las fases
móvil y estacionaria. El proceso de separación se produce a causa de las interacciones entre los componentes de la mezcla
con la fase móvil y la fase estacionaria; lo cual causa la distribución de los componentes de la mezcla entre las dos fases. A
este proceso se le denomina partición de los componentes. Las interacciones mencionadas pueden tener su origen en dos
fenómenos:

La adsorción: que es un fenómeno de interacción superficial por el cual átomos, iones o moléculas son retenidas en la
superficie de un material. Puede ser de dos tipos: a) Fisisorción, debida a fuerzas atractivas débiles, generalmente fuerzas de
Van der Waals; es la forma más simple de adsorción. b) La quimisorción ocurre cuando se forma un enlace químico

La absorción: es un fenómeno de retención que incluye la penetración de una especie química en todo el volumen del
material por lo cual se la considera como un fenómeno másico y no superficial. Un ejemplo de absorción es la disolución de
una especie en un disolvente.

Principales parámetros cromatográficos:

Coeficiente de partición o de reparto de un componente (K): Se define como el cociente entre la

concentración de componente presente en la fase estacionaria y la concentración de componente

presente en la fase móvil.

Frente del eluyente: máximo recorrido de la fase móvil

Frente del analito: máximo recorrido del analito; entendiéndose por analito cada uno de los componentes
individuales de la mezcla.

Relación de recorridos o frentes (Rf): Cociente entre el frente de cada analito y el frente del eluente.

2. Objetivos de la práctica

El objetivo general de la práctica es conocer los parámetros y conceptos fundamentales de las técnicas cromatográficas y su
aplicación para la separación de mezclas de sustancias orgánicas provenientes de plantas. Los objetivos específicos incluyen:

a. El aprendizaje de los términos, conceptos y fundamentos de la cromatografía

b. Aprendizaje de las destrezas necesarias para realizar separaciones cromatográficas

c. Realizar la separación e identificación por cromatografía de papel de una mezcla de cationes

d. Identificar las limitaciones y ventajas del uso de reveladores

e. Identificar las interacciones y reacciones de los iones estudiados y su efecto sobre el desarrollo

cromatográfico

f. Predecir en base a los fenómenos observados el comportamiento de otras mezclas de iones

3. Métodos

Equipos:

 Plancha de calentamiento (estufa)

Materiales:

• 2 Capsulas de Petri, vasos de vidrio

• Papel de filtro (papel bond)

• Tijeras

Reactivos:

 Solventes (eluyentes): alcohol metílico, agua.

 Tejidos vegetales (hojas cáscaras): bolsitas de té para infusión, café molido, hojas de diferentes plantas, cáscaras
de diferentes plantas.
  Solución de yodo.

Sustancias: escoja 2 tejidos vegetales para su experiencia, por ejemplo: hojas de fríjol, hojas de apio y té negro (de infusión).

Preparación de soluciones: pique finamente los tejidos vegetales. Para la preparación de la infusión en agua sumerja el tejido
en agua a 100°C tape el recipiente y deje reposar hasta que la infusión alcance temperatura ambiente. Para la reparación de
infusión en alcohol agregue el tejido picado a un recipiente con alcohol y deje reaccionar hasta que el alcohol tome color (0.5
h aproximadamente). Será necesario preparar 20 ml de cada una de las soluciones.

La relación tejido/disolvente puede ser 1/10 aproximadamente, dependiendo de la coloración que se logre. No se recomienda
la solución quede muy concentrada.

A continuación, corte tiras de papel de 0.5 cm y 20 cm de largo.

En un recipiente de vidrio vierta un poco de alguna de las soluciones de tejido vegetal y disponga una tira de papel que
apenas toque el líquido. Tape y deje que se equilibren (temperatura y presión de vapor) a temperatura ambiente. Es necesario
esperar unas horas para que el eluyente ascienda y se desarrolle la separación. Si la separación no es evidente es posible que
deba cambiar la concentración de la solución preparada.

Una vez terminada la separación es necesario retirar la tira de papel y dejar que se seque completamente: entonces los colores
serán más evidentes.

Si los colores sobre la tira no son muy visibles puede añadir unas gotas de solución de yodo (Isodine o Iodopovidona,
Dioxidín) al extracto antes de iniciar la elución. Esta es una técnica que funcionará solo con algunos tejidos.

Deben obtenerse 9 separaciones en total según la Tabla 1. Se hace la cromatografía de cada tejido en alcohol y en agua y
también mezclando la solución de alcohol y agua de cada tejido. Para la combinación de soluciones de agua y alcohol puede
usar una relación 1/1.

Tabla 1. Eluyentes para cromatografía

Tejido A Tejido B Tegido A+B
Alcohol x x x
Agua x x x
Alcohol + Agua x x x

Se toma nota de las características de las manchas observadas, y se miden las distancias recorridas por el frente del eluyente y
cada una de las manchas.

Figura 2a. Montaje para cromatografía en casa Figura 2b. Esquema cromatografía de papel

Tome nota de sus observaciones y de las distancias recorridas por las manchas reveladas. Calcule las relaciones de frente
correspondiente a cada catión y asiente los valores de distancia y Rf en una tabla diseñadas para tal fin. A partir de las
observaciones decida cuál de los dos eluyentes produce la mejor separación.
4. Resultados

Presente sus resultados con fotos, gráficas y tablas. Es importante que los autores aparezcan en algunas fotos.

Figura 3. Ejemplo de cromatografía de varios tejidos (apio, té, café, garbanzo, colorante comestible)

Figura 4. Detalle separación de apio-agua (arriba), cúrcuma-alcohol (abajo)

5. Análisis

Basándose en los fundamentos generales de la cromatografía, y específicamente en los fundamentos de la cromatografía en

papel, explique sus resultados.

Explique las posibles razones de las diferencias de recorrido de las sustancias. Explique las diferencias observadas en los
recorridos. Explique en qué consiste el revelado y las reacciones involucradas en cada uno de los procedimientos de revelado.

Busque en la literatura los componentes principales de cada uno de los tejidos e intente identificar algunos de estos.

Compare sus resultados con la literatura y comente sobre la diferencias y similitudes encontradas.

6. Referencias

Olga Pérez de Márquez, Guía de Análisis Químico Cualitativo, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes.

David Abott y R. S. Andrews, “Introducción a la Cromatografía”, traducción de Miguel Fernández Braña, Colección Exedra,
Editorial Alhambra, S.A. 1966, Madrid, España.

7. Forma de entrega
Cada grupo de trabajo cargará su informe en la fecha indicada en la plataforma Teams.

Anexo