TEMA 7:LAS TÉCNICAS DE PCR

1. CALIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS

La calidad de los ácidos nucleicos purificados viene determinada por tres parámetros:
● Integridad.
● Pureza.
● Concentración.
Una buena calidad en la obtención de ácidos nucleicos es sin duda clave para conseguir una
adecuada funcionalidad de los mismos en las diferentes técnicas de biología molecular que se
van a aplicar.
En los siguientes apartados analizaremos la forma en que se determinan los parámetros de
calidad de los ácidos nucleicos purificados y comprobaremos que algunas pruebas de control
pueden ser indicativas de su funcionalidad.
1.1. INTEGRIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Una vez finalizado el proceso de purificación, interesa saber si el ácido nucleico mantiene su
tamaño original, o si, por el contrario, se ha fragmentado o degradado durante el proceso. Esto
es, conocer su grado de integridad.
La integridad es el parámetro que determina si un ácido nucleico conserva su tamaño
original.
La mejor manera de valorar la integridad es la electroforesis en gel de agarosa al 0,7%-1,2%
(p/v). Dependiendo del tipo de ácido nucleico que hayamos purificado, el resultado esperado
en la electroforesis varía:
● ADN genómico. En las muestras en las que el ADN haya mantenido su integridad, se
obtendrá una banda única de ADN perfectamente definida en la parte superior del gel.
Si el ADN se fragmenta o degrada, aparecerá una estela fluorescente o smear a lo
largo de la calle de electroforesis, cuya extensión e intensidad dependen del grado de
degradación de la muestra. Este patrón electroforético no es aplicable a las muestras
purificadas a partir de tejido FFPE, puesto que la fijación e inclusión en parafina
provoca la fragmentación del ADN. En este tipo de muestras, por lo tanto, no tiene
sentido valorar la integridad mediante electroforesis, puesto que siempre se observa
un smear.
● ADN plasmídico. Lo ideal es obtener una única banda en la electroforesis,
correspondiente al plásmido con.su estructura nativa. En muchas ocasiones aparece
una banda débil correspondiente al plásmido con una estructura relajada e incluso una
tercera banda correspondiente a dimeros.
● ARN. Es normal que aparezca un ligero smear. debido al ARNm (conjunto de
múltiples moléculas distintas con tamaños diferentes). con dos bandas nítidas,
correspondientes a los ARNr 285 y 18S. En ocasiones se observa una tercera banda,
más débil, correspondiente a los ARNr 5.55 y 5S y a los ARNt.
1.2. PUREZA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Para que los ácidos nucleicos mantengan su funcionalidad en las técnicas de biología
molecular, se requiere un determinado grado de pureza, reduciendo al mínimo los
contaminantes (proteínas, polisacáridos, sales, reactivos usados en la extracción y
purificación).
La pureza de un ácido nucleico es el parámetro que determina la ausencia de posibles
contaminantes.
La medida del grado de pureza se basa en una de las propiedades de los ácidos nucleicos: su
máxima absorbancia a una longitud de onda de 260 m.
Cociente A260/A280
El parámetro que más se utiliza para valorar la pureza es el cociente entre las absorbancias a
260 nm y 280 m (A2c/A280). Esto es debido a que los principales contaminantes de los
ácidos nucleicos (proteínas y derivados fenólicos) tienen un máximo de absorbancia a 280 m.
En consecuencia la relación entre ambas absorbancias da una idea del grado de contaminación
de la muestra.
Para evitar errores, la absorbancia medida debe estar siempre en el rango de medida lineal del
espectrofotómetro. En general, se recomienda que esta medida esté comprendida entre 0,1 y
1,0.
Por esta razón, las medidas se suelen realizar en muestras diluidas en agua destilada o tampón
TE.
Antes de realizar las medidas, se ajusta el cero de absorbancia en el espectrofotómetro con el
diluyente empleado.
Valores del cociente A260/A280 en el ADN y posibles correcciones.
● Se considera que tiene un grado de pureza adecuado cuando el cociente A260/A2so
tiene un valor entre 1,7 y 2.
● Valores de 1,6 e inferiores indican contaminación excesiva de la muestra por
proteínas o fenoles. La contaminación por proteínas se puede solucionar mediante un
tratamiento con proteinasa K. Si la contaminación es por fenoles habitual cuando se
ha utilizado un método de purificación basado en solventes orgánicos hay que repetir
el proceso de purificación con cloroformo/alcohol isoamílico y posterior precipitación
del ADN con isopropanol o etanol.
● Valores superiores a 2,0 indican una concentración elevada de ARN, ya que la
absorbancia del ARN a 260 nm es mayor que la del ADN. La contaminación por
ARN se puede eliminar mediante tratamiento con ARNasas.
Valores del cociente A26o/A280 en el ARN
En el caso del ARN, se considera que tiene un grado de pureza adecuado cuando el cociente
A260/A280 tiene un valor entre 1,8 y 2,1.
Cociente A260/A230
Un parámetro adicional para valorar la calidad de un ácido nucleico es el cociente entre las
absorbancias a 260 nm y 230 nm. Esto es debido a que a 230 nm se detecta la máxima
absorbancia de contaminantes menores, como carbohidratos y sales.
● Se considera que el ácido nucleico es puro cuando el cociente A260/ A230 se
encuentra entre 1,5 y 2,2.
● Un valor inferior a 1,5 puede indicar presencia de contaminantes, por lo que sería
conveniente precipitar y lavar de nuevo el ácido nucleico con etanol, dejarlo secar y
resuspenderlo de nuevo.
Este cociente no es tan específico como el anterior para medir la pureza del ácido nucleico,
sobre todo cuando su concentración es muy baja y se usa un tampón de resuspensión con
sales.
Absorbancia a 320 nm
La absorbancia a una longitud de onda de 320 nm mide la turbidez de la solución, es decir, la
presencia de partículas en suspensión. Aunque no es imprescindible, este valor se debería
restar de las medidas a 260 nm, 280 nm y 230 nm antes de calcular los correspondientes
cocientes.
 1.3. CONCENTRACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
La cantidad de ácido nucleico usada en una reacción es un factor importante en la mayor parte
de las técnicas de biología molecular. Por ello, una vez purificados y resuspendidos hay que
medir la concentración en la solución final antes de su almacenamiento.
La concentración es la cantidad de ácido nucleico por unidad de volumen de solución final.
Los métodos más utilizados para medir la concentración de una solución de ácidos nucleicos
son dos: la absorbancia a 260 m y la fluorescencia.
Absorbancia a 260 nm
Como se ha mencionado antes, los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorbancia a 260
nm.
Según la ley de Lambert-Beer, la absorbancia de una disolución es directamente proporcional
a la concentración del soluto en la disolución y al paso óptico de la cubeta en la que se realiza
la medición. Aplicando esta ley a los ácidos nucleicos, se obtienen las siguientes
equivalencias o factores de conversión cuando se mide la absorbancia a 260 nm en cubetas de
10 mm de paso óptico:
● Una unidad de absorbancia equivale a 50 ng/ul (o 50 pg/ml) de ADNds.
● Una unidad de absorbancia equivale a 33 ng/ul (o 33 pg/ml) de ADNds.
● Una unidad de absorbancia equivale a 40 ng/ul (o 40 ug/ml) de ARN.
Como para el cálculo de los cocientes de pureza, la medida de la absorbancia se realiza sobre
una dilución de la muestra purificada. De hecho, se puede utilizar la misma dilución para
calcular la concentración y los cocientes.
La medida de absorbancia obtenida debe estar incluida en el intervalo de medida lineal del
espectrofotómetro. Si la lectura está por encima del rango lineal, hay que hacer una dilución
mayor de la muestra. El factor de dilución hay que tenerlo en cuenta para calcular la
concentración del ácido nucleico en la solución original.
Además, si se requiere que el cálculo sea lo más exacto posible, hay que corregir el valor de
absorbancia a 260 m, restándole el valor de absorbancia a 320 nm.
Con todo ello, la concentración de una solución de un ácido nucleico se puede calcular con la
siguiente fórmula:
Concentración de ácido nucleico en ng/ul o ug/ml = (A260 - A320) × factor de dilución x
factor de conversión.
La cantidad total de ácido nucleico purificado en ng es igual concentración de la solución en
ng/ul por el volumen de resuspensión en ul.

2. ALMACENAMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS

En biología molecular es muy habitual almacenar alícuotas de muestras de ácidos nucleicos
purificados. dos que pueden tener múltiples finalidades.
En cualquier caso, el sistema de almacenamiento debe cumplir con dos objetivos
fundamentales respecto de las muestras:
● Garantizar su integridad.
● Asegurar su completa trazabilidad.
2.1. CONDICIONES PARA LA INTEGRIDAD DE LAS MUESTRAS
● Se almacenan en frío (de forma habitual):
○ Las muestras de ADN, si se van a utilizar en 4-5 días se pueden almacenar en
nevera a 4 °C. Para tiempos mayores se requiere congelación a -20 °C o
preferiblemente a -80 °C.
 ○ Las muestras de ARN siempre en congelación, a -20 °C para tiempos cortos o
a -80 ° para tiempos largos.

3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (pcr)

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica in vitro de amplificación de
ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN,
partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.
Aunque en un principio la PCR se diseñó para amplificar un único fragmento corto de ADN
presente en una molécula mucho mayor, el desarrollo posterior de la técnica ha permitido
amplificar fragmentos de gran tamaño (hasta 35 kb) y se han desarrollado diferentes variantes
que permiten:
● Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple).
● Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR).
● Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en
una muestra (PCR cuantitativa, PCR a tiempo real).
Las ventajas de las técnicas de PCR y sus variantes sobre otras técnicas utilizadas en biología
molecular son claras:
● Como técnica de amplificación. Respecto a las técnicas de clonación en vectores
mediante tecnología de ADN recombinante suponen un considerable ahorro de
tiempo (la PCR tiene lugar en horas, mientras que la clonación requiere días de
trabajo) y además están completamente automatizadas (la clonación es un proceso
manual)
● Como técnica de detección. Respecto a las técnicas de hibridación, la PCR requiere
una cantidad de muestra mucho menor y, además, permite la cuantificación de
secuencias concretas (PCR en tiempo real).
Actualmente, esta posibilidad de conseguir altos niveles de amplificación en tiempos cortos y
su mayor sensibilidad de detección han convertido a la PCR en la técnica básica de cualquier
laboratorio de biología molecular.
Sus aplicaciones son innumerables en todos los campos de la biología, la medicina e incluso
la paleontología. Algunos ejemplos son:
● El diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades.
● La evolución y respuesta a tratamientos.
● Los estudios de expresión génica.
● Mutagénesis.
● Estudios filogenéticos.
● Genotipado.
● Medicina forense.

4. BASES TEÓRICAS DE LA PCR

La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la
replicación del ADN.
La técnica fue ideada en 1983 por Kary Mullis. bioquímico norteamericano, cuya idea
original consistió en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro, de manera
que a partir de una única molécula de ADN molde se obtuvieron múltiples copias.
Este diseño repetitivo es la clave de la amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas
en cada ciclo sirven también de molde para sintetizar otras nuevas copias en los ciclos
siguientes, produciéndo un aumento exponencial en el número de copias a cada ciclo de
replicación sucesivo que se realice.
Ahora bien, para conseguir esto hay que solucionar dos problemas:
1. ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el
fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN?
2. ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la
temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde?
La solución al primer problema fue el diseño de cebadores específicos que permiten la
amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN, y la solución al segundo
problema fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables..
4.1. LOS CEBADORES O PRIMERS
Los cebadores (en inglés primers) son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es
complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.
Se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario.de una secuencia adyacente a la
región de interés pero en extremos y cadenas opuestas:
● El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3'-+5' se denomina
cebador F o forward.
● El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5°-3' se denomina cebador R
o reverse.
El sustrato idóneo para la actividad enzimática del ADN polimerasa es una molécula
monocatenaria de ADN (molde) con una pequeña región en doble hélice; a la que se une y
empieza a incorporar nucleótidos con bases complementarias a las de la hebra molde.
En el caso de la PCR, esa pequeña región en doble hélice la proporcionan los cebadores, una
vez que se unen a sus secuencias complementarias en las hebras molde previamente
desnaturalizadas.
Un juego de cebadores, por lo tanto, define y delimita la región diana de una molécula de
ADN que se amplificará y que será la comprendida entre ambos.
Es decir, fijan la especificidad de la reacción haciendo posible la amplificación exclusiva de
un fragmento concreto de ADN de entre una mezcla compleja de moléculas. Por supuesto que
para conseguir este objetivo, su secuencia debe ser única en el ADN que se estudia.
4.2. ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES
Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas de ADN es necesario que el
ADN molde sea monocatenario. Esto hace que cada ciclo de la PCR tenga que comenzar por
una fase de desnaturalización por calor, lo que supone un problema para las ADN polimerasas
convencionales puesto que son termolábiles, es decir, se inactivan a temperaturas elevadas. En
los primeros experimentos para diseñar la técnica, esta dificultad se supera añadiendo enzima
nueva en cada ciclo. lo que la convertía en una técnica costosa, larga, con alto riesgo de
contaminación y difícilmente automatizable.
El hecho que posibilitó el desarrollo espectacular de la PCR en poco tiempo fue el
descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.
Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de
arqueobacterias extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas.
Al igual que las ADN polimerasas bacterianas convencionales, estas enzimas catalizan la
incorporación de nucleótidos en dirección 5'-3' a partir de una pequeña región con doble
hélice utilizando como molde un ADN-monocatenario y en presencia de iones magnesio
(Mg+2), pero tienen dos características diferenciales que las hacen idóneas para su uso en
PCR:
 ● Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70
°c y 75 C. Esto permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas
relativamente elevadas, fijando unas condiciones de alta rigurosidad lo cual maximiza
la especificidad de la reacción.
● Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de
incubación a 95 °C (por encima de los 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no
se va a inactivar durante las fases de desnaturalización del ADN.
Tipos de ADN polimerasas termoestables
Las ADN polimerasas termoestables se pueden clasificar en función de sus capacidades
enzimáticas secundarias. Estas pueden ser:
● Actividad exonucleasa 5' 3', pero sin actividad exonucleasa 3' 5'. Además de la
actividad polimerasa tienen actividad exonucleasa 5' 3', pero carecen de actividad
exonucleasa 3' 5'. Esto hace que no sean capaces de corregir errores (eliminar
nucleótidos mal incorporados). Es el caso de la Taq ADN polimerasa que tiene una.
tasa de error de aproximadamente 1 por cada 100000 nucleótidos incorporados.
● Actividad exonucleasa 5' 3' y actividad exonucleasa 3'-5'. Son enzimas con
actividad correctora, va que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo (con
una base nitrogenada no complementaria de la correspondiente en el ADN molde), lo
eliminan y continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto.
La tasa de error de estas enzimas es mucho. menor, del orden de 1 por cada millón de
nucleótidos incorporados, lo que las hace espe cialmente útiles para aplicaciones de
PCR que requieren alta fidelidad de replicación, tales como amplificación de
secuencias para análisis de mutaciones por secuenciación o para estudios de
expresión.
● Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen
capacidad para utilizar ARA como molde, es decir, presentan actividad transcriptasa
inversa en presencia de iones manganeso (Mn 2+), por lo que pueden utilizarse para
sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.
4.3. EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR
Como ya se ha mencionado, la PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de
replicación. Cada ciclo consta de tres fases:
I. Desnaturalización del ADN molde.
II. Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
III. Extensión de los cebadores.
El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada
fragmento de ADN-molde presente en la mezcla de reacción.
Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el siguiente ciclo.
FASE I. Desnaturalización
La desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura suficientemente
elevada para garantizar la desnaturalización completa del ADN molde, sin prolongarse
excesivamente para evitar la inactivación de la ADN polimerasa Por ejemplo, la Taq ADN
polimerasa pierde actividad cuando es sometida a 95 °C por un tiempo prolongado de más de
40 minutos. Normalmente la fase de desnaturalización se realiza a 94-95 °C
durante 15-30 segundos.
FASE II. Hibridación
La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing, en la terminología inglesa) se
realiza habitualmente a una temperatura de entre 50 °C y 65 °C. El valor concreto depende de
la T. de los cebadores y suele estar comprendido en el rango 5 °C.
● Temperaturas de hibridación más elevadas que la lm de los cebadores implican
mayor rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad (menor hibridación
inespecífica de los cebadores y disminución de la cantidad de productos no deseados).
El inconveniente es un rendimiento menor.
● Temperaturas de hibridación más bajas que la lm de los cebadores se pueden
traducir en un mavor rendimiento de la hibridación, ya que los cebadores hibridan
más eficientemente. El inconveniente es la posible aparición de productos no
deseados por hibridación inespecífica de los cebadores.
En cualquier caso, la temperatura óptima de bi-bridación de los cebadores debe fijarse de
forma experimental para cada pareja de cebadores. El tiempo estándar de la fase de
hibridación oscila entre 30 y 60 segundos.
FASE III. Extensión
La extensión o elongación de los cebadores por la
ADN polimerasa copiando la hebra molde se realiza a la temperatura óptima de
polimerización de la enzima empleada, que en el caso de la Tag polimerasa es de 72°C
El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de polimerización de la
enzima y la longitud del fragmento que se va a amplificar. La Taq polimerasa, por ejemplo,
tiene una velocidad de polimerización de alrededor de 60 nucleótidos/ segundo. Para esta
enzima, se recomiendan tiempos de extensión de entre 30 y 45 segundos para amplificar
fragmentos menores de 1 kb, un minuto para fragmentos de entre 1 y 1,5 kb y dos minutos
para fragmentos de entre 1,5 y 3 kb. Para enzimas con actividad correctora hay que considerar
tiempos de extensión más prolongados, aproximadamente de dos minutos para fragmentos de
1 kb.
4.4. PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN DE LA PCR
Tras un número n de repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de
productos de amplificación, unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy
diferentes.
Para entender cómo se obtienen estos productos, vamos a estudiar qué ocurre en los primeros
ciclos de PCR a partir de una única molécula de ADN molde nativa.
Primer ciclo de PCR
● Fase de desnaturalización inicial. Se separan las dos cadenas de la molécula de
ADN nativa, que vamos a denominar N+ y N-.
● Fase de hibridación. Cada cebador se une a su secuencia diana.
● Fase de extensión. Se sintetizan dos nuevas cadenas de ADN., que incluyen el
fragmento que queremos amplificar pero que tienen una longitud muy superior,
puesto que la ADN polimerasa continúa replicando la hebra molde hasta que se inicia
la fase de desnaturalización del segundo ciclo. Vamos a denominar a estas dos
cadenas nuevas /+ e /-.
Al finalizar el primer ciclo, estas dos nuevas cadenas están formando doble hélice con las
regiones complementarias del ADN molde: N+//- y N-/l+.
Estas moléculas son productos intermedios largos no deseados de la PCR.
Resultado final 1.° ciclo; 2 productos no deseados (2 x 1) y O productos deseados.
 Segundo ciclo de PCR
● Fase de desnaturalización. Se disocian todas las estructuras en doble hélice,
obteniéndo se cuatro cadenas de ADN que pueden actuar como molde: N+, N-, /+ e/-.
● Fases de hibridación y extensión. Se habrán sintetizado cuatro nuevas cadenas de
ADN, que formarán doble hélice con las hebras que han actuado de molde: N+/1-,
N-//+, /+/A- e -/A+.
Las cadenas que se sintetizan utilizando las hebras / como molde (A+ y A-) corresponden
exactamente al fragmento que queremos amplificar. Las moléculas /+/A- e I-/A+ son también
productos intermedios no deseados.
Resultado final 2.° ciclo: 4 productos no deseados (2 x 2)y Q productos deseados.
Tercer ciclo de PCR
● Fase de desnaturalización. Se obtienen 8 hebras molde: N+, N-, 2 1+, 2 1-, A+ y A-.
● Fases de hibridación y extensión. Las 8 hebras molde darán lugar a 8 heterodúplex al
finalizar el ciclo: N+/1-, N-/l+, 2 /+/A-, 2 /-/A+, 2 A+/A-.
Las moléculas A+/A- son los productos deseados, que coinciden con el fragmento que
queremos amplificar y recibenel nombre de amplicones.
Resultado final 3° ciclo: 6 productos no deseados (2 x 3) y 2 amplicones.
Cuarto ciclo de PCR y siguientes
● Fase de desnaturalización. Se usarán como molde 16 hebras: N+, N-, 31t, 3 l-, 4 A+
y 4 A-.
● Fases de hibridación y extensión. Las 16 hebras dan lugar a 16 heterodúplex: N+//-,
N-/lt, 31+/A-, 31-/A+, 8 A+/A-.
Resultado final 4° ciclo: 8 productos no deseados (2 x 4) y 8 amplicones
En los siguientes ciclos los resultados finales serán los siguientes:
● Resultado final 5° ciclo: 10 productos no deseados (2 × 5) y 22 amplicones.
● Resultado final 6° ciclo: 12 productos no deseados (2 × 6) y 52 amplicones.
● Resultado final 7° ciclo: 14 productos no deseados (2 × 7) y 114 amplicones.
Y así sucesivamente, de manera que, en cada ciclo, el número de productos no deseados
aumenta aritméticamente, mientras que el número de amplicones aumenta exponencialmente.
Al finalizar la PCR, tras n ciclos de amplificación:
● El número de productos no deseados será 2n (70 para 35 ciclos de amplificación).
● El número de amplicones se aproximará a N2 (> 10 para 35 ciclos de amplificación).
Aunque el rendimiento de la técnica nunca es del 100%, es evidente que la reacción en cadena
de la polimerasa permite obtener millones de copias de cada molécula molde. presente en la
muestra original.

5. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR, en la que se
amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso
de amplificación a tiempo final.
5.1. LA MEZCLA DE REACCIÓN
La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el
medio de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada.
Consiste en un tampón adecuado que contiene disueltos todos los reactivos necesarios para la
replicación del ADN.
El tampón aporta el pHL y la concentración salina adecuados para la óptima actividad de la
ADN polimerasa con un máximo de fidelidad.
Suelen ser tampones a base de Tris con clöruro potásico (KCl), a un pH de entre 8,3 y 9,0.
Normalmente, el tampón de reacción adecuado se suministra en forma concentrada (2x, 5x o
10x)
conjuntamente con la ADN polimerasa. Los reactivos que se disuelven en el tampón son
principalmente: cloruro magnésico, desoxinucleótidos, trifosfato, cebadores, ADN polimerasa
y ADN molde. En ocasiones, en función del resultado obtenido, pueden ser necesarios otros
aditivos o potenciadores para optimizar la PCR.
Cloruro magnésico
Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor para
desarrollar su actividad. Estos iones se aportan a la mezcla de reacción en forma de cloruro
magnésico (MgCI).
● La ausencia o una concentración excesivamente baja de Mg2+ libre en la mezcla de
reacción determina la inactividad de la ADN polimerasa.
● Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la
replicación.
Desoxinucleótidos trifosfato
La mezcla de reacción debe contener los cuatro desoxinucleótidos que componen las
moléculas de ADN en forma de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para que la ADN
polimerasa pueda usarlos como sustrato para incorporarlos a las cadenas en crecimiento.
Los cuatro dNTPs deben estar presentes en la misma concentración, pues en caso contrario
disminuye la fidelidad de la enzima. Se suministran concentrados en una concentración total
10 mM (2,5 mM de cada dNTP).
La concentración final estándar en la mezcla de reacción de cada dNTP es 200 uM.
Cebadores
Como se ha mencionado anteriormente, los cebadores son claves para realizar una
amplificación específica con éxito. La concentración final de cada cebador en la mezcla de
reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental para cada pareja.
Como referencia, concentraciones finales de entre 200 y 400 M de cada cebador suelen dar
buenos resultados.
ADN polimerasa
La ADN polimerasa es el otro reactivo clave para realizar una PCR con éxito. La elección de
una u otra ADN polimerasa dependerá de la fidelidad requerida en la amplificación, de la
longitud del fragmento que se va a amplificar y, en ocasiones, de la secuencia que se va a
amplificar.
Habitualmente, las ADN polimerasas se suministran concentradas en soluciones con un 50%
de glicerol y los fabricantes indican su concentración óptima de trabajo, que suele oscilar
entre 1 y 2,5 unidades para un volumen de reacción final de 50 ul.
ADN molde
El ADN molde es un componente imprescindible de la mezcla de reacción, ya que contiene el
fragmento de interés que se quiere amplificar.
Normalmente se utiliza ADN purificado.
Para que la PCR se desarrolle de manera óptima, hay que tener en cuenta tanto la calidad
como la cantidad del ADN molde.
● Calidad del ADN molde. En condiciones ideales, el ADN molde para PCR debe
cumplir los siguientes criterios de calidad:
○ Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado
ni fragmentado y sin mellas.
 ○ Cociente A260/A280 entre 1.7 v 2.0, lo que garantiza que no está
contaminado con proteínas.
○ Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por
inactivación de la ADN polimerasa, bien por secuestro del Mg2+ libre.
● Cantidad de ADN molde. La cantidad idónea para obtener los mejores resultados en
una PCR dependerá de la complejidad del ADN que se estudia. Como referencia,
cuando se trabaja con ADN plasmídico se obtienen buenos resultados con cantidades
de 0,1-1 ng y con ADN genómico bacteriano suelen ser suficientes cantidades de
entre 1 y 10 ng. En el caso del ADN genómico humano, cantidades de entre 100 y
300 ng suelen dar buenos resultados. No es aconsejable sobrepasar los 10 ng de
ADN/ul de mezcla de reacción, o lo que es lo mismo, los 500 ng de ADN molde para
un volumen de reacción final de 50 pl.
5.2. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
La preparación de las muestras requiere ajustar el volumen de la reacción, elaborar la mezcla
«master» y establecer los controles positivo y negativo.
Ajuste del volumen de reacción
Al diseñar una PCR, hay que decidir el volumen final de mezcla de reacción en el que se
llevará a cabo la reacción. Normalmente este volumen es de 25 o 50 ul.
Una vez fijado este parámetro (como todos los componentes de la mezcla de reacción,
incluido el tampón, se suministran concentrados), hay que calcular los volúmenes de cada
reactivo que se añadirá a la mezcla dependiendo de la concentración final que queramos
obtener. La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada compos gente y el volumen
final de mezcla de reacción se completa con agua estéril grado PCR.
Mezcla «máster»
Como las reacciones de PCR se realizan en volúmenes muy pequeños y los componentes se
suministran concentrados, las cantidades que se van a pipetear de cada uno de ellos son muy
pequeñas (entre 0,5 y 5 pl), por lo que la posibilidad de introducir errores de pipeteo es
elevada.
Además, como normalmente se realizan múltiples reacciones simultáneamente, los posibles
errores cometidos en cada tubo son distintos, por lo que las distintas PCR se realizarán en
condiciones diferentes. Para evitar este problema y conseguir que la composición de la mezcla
de reacción sea homogénea para todas las pruebas que se realicen simultáneamente, es
preferible preparar una única mezcla de reacción, denominada mezcla más. ter (master mix en
inglés), que incluya todos los componentes, excepto el ADN molde.
La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una
reacción por el número de muestras que se van a procesar simultáneamente + 1 -es mejor que
sobre y no que falte mezcla para el último tubo, teniendo en cuenta que en el número de
muestras hay que incluir los controles positivo y negativo de la técnica.
Una vez completada la mezcla máster, se reparte la cantidad adecuada a cada tubo de reacción
y se añaden los respectivos ADN molde.
Control positivo y control negativo
Además de las muestras problema en las que tendrá lugar la reacción PCR, en cada tanda se
prepara un control positivo y un control negativo de la técnica:
● Control positivo. Es un tubo con mezcla máster al que se añade ADN molde control
que contiene el fragmento que se quiere amplificar.
 ● Control negativo o blanco. Es un tubo con mezcla máster en el que se sustituye el
ADN molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de manera que no habrá
ADN presente en la reacción.
Una vez que las muestras y los controles ya están preparados, se llevan al termocidador para
iniciar la PCR.
5.3. PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOR
El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR.
Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para
que se desarrollen de forma automatizada.
La programación del termociclador para amplificar un fragmento de ADN mediante una PCR
estándar incluye tres etapas principales, que terminan con una. incubación final para el
mantenimiento de los productos de la reacción hasta su retirada de la máquina:
1. Desnaturalización inicial. Es la etapa que inicia la reacción de PCR. Consiste en
calentar la mezcla de reacción a 94-95 °C durante varios minutos para asegurar la
completa desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en
la mezcla de reacción.
2. Ciclos de replicación. Para esta etapa se programan:
a. Las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del
ciclo básico de PCR: desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión.
b. El número de veces que se va a repetir el ciclo, es decir, el número de ciclos
de replicación.
El número de ciclos de replicación va a depender del número inicial de copias del
fragmento que se quiere amplificar en la muestra en estudio.
Cuanto más abundante sea el fragmento que se va a amplificar, menor número de
ciclos de replicación serán necesarios para acumular una cantidad suficiente de
amplicones. Típicamente, el número de ciclos oscila entre 25 y 35 aunque para
moldes escasos o problemáticos se pueden aumentar hasta 40. Por encima de 40
ciclos aumenta considerablemente la probabilidad de que aparezcan productos no
deseados inespecíficos y la ADN polimerasa pierde actividad por el tiempo
acumulado a
temperaturas de desnaturalización.
3. Extensión final. Es la etapa que finaliza la reacción de PCR. Consiste en una
incubación única a la temperatura óptima de polimerización de la ADN polimerasa
durante 5-10 minutos, para asegurarnos de que todos los productos de PCR están
completos y en forma de doble hélice.
4. Mantenimiento. La programación del termociclador finaliza siempre con una última
incubación a 4 °C sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren
del termociclador, anulando la actividad de la enzima.
5.4. ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
Una vez finalizada la reacción de PCR se recuperan las distintas muestras amplificadas del
termociclador y se analiza el resultado (detección de los
productos amplificados) mediante una electroforesis en gel, normalmente agarosa 0,5-2,0%,
junto con un marcador de tamaños.
La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado
correctamente.
La observación de varias bandas de distintos tamaños. maños indica la presencia de productos
de amplificación no deseados. Esto es debido a que durante la PCR se han amplificado
inespecíficamente fragmentos de ADN distintos de la diana específica, por lo que habrá que
repetir la reacción variando la programación del termociclador o la composición de la mezcla
de reacción hasta conseguir un resultado específico.
Resultado positivo
Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda
específica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra que se
estudia y garantizar por tanto un resultado positivo. Pero si existieran problemas de
contaminación en la mezcla máster.
Por eso, en cada tanda de PCR se procesa simultáneamente un control negativo o blanco, en el
que el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR. En el gel de la electroforesis, la calle.
correspondiente al blanco debe aparecer limpia, sin bandas, Si en el blanco se detecta alguna
banda, ello indicaría contaminación de algún reactivo, pipeta que se hayan usado en la
técnica, lo que invalida los resultados de la tanda.
Resultado negativo
La ausencia de banda específica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no
contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado sería negativo.
Pero, realmente, esta no es condición suficiente para afirmar que el resultado es negativo,
puesto que algún reactivo empleado puede no funcionar correctamente o la muestra puede
contener inhibidores de la PCR.
El control positivo de la técnica, que se procesa simultáneamente con las muestras, sirve para
validar la mezcla de reacción. Si todos los reactivos funcionan bien en el control positivo se
observará la banda específica. En caso contrario hay algún problema en la mezcla máster y se
invalida la tanda.
Para descartar la presencia de inhibidores en una muestra hay que realizar un control positivo
de la muestra, consistente en una nueva PCR en la que se amplifica un gen control presente en
la muestra.
Si este control se amplifica bien, se confirma que la muestra es negativa para la secuencia que
se estudio inicialmente. Si el control positivo de la muestra no se amplifica, la muestra no es
apta para PCR.
6. MODALIDADES DE PCR ESTÁNDAR
La PCR estándar se utiliza mayoritariamente con fines diagnósticos, amplificando secuencias
menores de 3,5 kb, para lo que las condiciones descritas hasta ahora para PCR estándar suelen
dar buenos resultados.
Sin embargo, el intento de minimizar la genera. ción de productos no deseados o la necesidad
de amplificar fragmentos de gran tamaño o con gran fidelidad para otras aplicaciones ha
derivado en el desarrollo de variantes o modalidades de la PCR estándar adaptadas a cada
necesidad, como la PCR con inicio en caliente, PCR de grandes trag-mentos y PCR de alta
fidelidad.
6.1. PCR CON INICIO EN CALIENTE
En el periodo de preparación de la mezcla de reacción, su transporte al termociclador y
durante la rampa ascendente de la temperatura hasta alcanzar por primera vez la temperatura
de desnaturalización, se pueden generar productos de amplificación no deseados.
Para evitar la aparición de productos de amplificación no deseados, relacionada
principalmente con la naturaleza de los cebadores, se ideó la PCR con inicio en caliente (Hot
Start PCR, en inglés).
Por lo tanto, la PCR con inicio en caliente se basa en evitar la actividad de la enzima a bajas
temperaturas, lo que se puede lograr con varias estrategias:
● Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. Es la forma más sencilla.
Se prepara la mezcla de reacción sin la ADN polimerasa, se dispensa en los tubos y
estos se colocan en el termociclador. Puesto en marcha, se añade la enzima
individualmente a cada tubo una vez que la temperatura del termociclador esté por
encima de los 65 °C. Esta metodología resulta engorrosa y aumenta el riesgo de
contaminación.
● Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla. Consiste
en mantener la enzima aislada del resto de componentes de la mezcla hasta que se
alcance una temperatura elevada.
El aislamiento se consigue, por ejemplo, incluyendo la ADN polimerasa en el interior
de esferas de cera, de manera que cuando se alcanzan temperaturas elevadas en la
desnaturalización inicial, al fundirse la cera, la enzima se libera a la mezcla de
reacción.
● Suministrando la ADN polimerasa inactiva. Esto se consigue bloqueando con un
anticuerpo específico, o bien, modificando químicamente mediante unión termolábil a
un grupo bloqueante. En cualquier caso, al alcanzar la temperatura de
desnaturalización inicial la enzima recobra su actividad, bien por desnaturalización
del anticuerpo bloqueante, bien por ruptura de la unión termolábil al grupo químico al
que estaba unida.
6.2. PCR DE GRANDES FRAGMENTOS
El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir. drásticamente cuando se amplifican
fragmentos mayores de 5 kb. La explicación es la acumulación de productos truncados, más
cortos que el amplicón específico y que, por lo tanto, no pueden ser usados como molde en
los siguientes ciclos. Estos productos truncados se producen probablemente por la
incorporación de nucleótidos erróneos que ralentizan o detienen directamente la
polimerización.
La PCR de grandes fragmentos es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el
rendimiento cuando se amplifican fragmentos de entre 5 y 35 kb.
El diseño de estas PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación
del termociclador.
La mezcla de reacción
Las variaciones de composición en la mezcla de reacción respecto a las que se han visto en la
PCR convencional son:
● Mezcla de ADN polimerasas. Es la modificación más importante. Consiste en la
utilización de una mezcla de dos ADN polimerasas termoestables:
○ Una mayoritaria (elevada concentración) sin actividad correctora.
○ Otra minoritaria (baja concentración) con potente actividad correctora
actividad exonucleasa 3'-5').
De esta forma, cuando la ADN polimerasa mayoritaria incorpora un nucleótido
erróneo y detiene la polimerización (lo que originaría un. producto truncado), la ADN
polimerasa con actividad correctora puede eliminar el nucleótido erróneo y continuar
la polimerización.
● Uso de aditivos. En la mezcla de reacción se suelen incluir aditivos como:
○ El glicerol, que estabiliza las ADN polimerasas.
○ El DMSO, que favorece la desnaturalización.
● Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción. Experimentalmente,
se ha demostrado que concentraciones más bajas de potasio favorecen la eficiencia de
la amplificación de fragmentos largos.
La programación del termociclador
Es evidente que para polimerizar con éxito fragmentos de gran tamaño en el momento de
programar el termociclador hay que aumentar considerablemente el tiempo de extensión en
cada ciclo. Dependiendo de la longitud del fragmento que se va a amplificar se pueden
programar tiempos de extensión de hasta 25 minutos. Por el contrario, los tiempos de
desnaturalización se acortan (2-10 segundos) para minimizar la inactivación de taq
polimerasas.
6.3. PCR DE ALTA FIDELIDAD
Para algunas aplicaciones a las que van a ser destinados los productos de PCR, como
expresión genética o clonación, se requiere una PCR de alta fidelidad.
Las PCR de alta fidelidad son PCR realizadas b en condiciones especiales para evitar
introducir en los amplicones mutaciones puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos.
En estos casos conviene realizar variaciones en las condiciones estándar de la composición de
la mezcla de reacción. Estas son:
● Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora.
● Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima, ajustando:
○ El pH de la mezcla de reacción. Algunas enzimas presentan mayor fidelidad a
pH más bajo del habitual y otras a pH más alto.
○ La concentración de Mg. Un exceso suele disminuir la fidelidad de las
polimerasas.
7. OTRAS TÉCNICAS DE PCR
7.1. PCR ANIDADA
La PCR anidada o nested-PCR (en inglés), consiste en la realización de dos reacciones PCR
acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de
amplificación de la primera.
Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es
bajo (poca cantidad de producto amplificado) o para aumentar la especificidad en los casos en
que no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados con una PCR estándar.
Los cebadores usados en ambas PCR son distintos:
● En la primera PCR se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que
incluye la región de interés. Se denominan cebadores externos.
● En la segunda PCR se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el
interior del fragmento, amplificado en la primera PCR. Se denominan cebadores
internos.
La muestra que se tiene que amplificar en la 2a PCR es el producto de reacción de la 1ª PCR.
de manera que los amplicones producidos en la 1a PCR se utilizan como ADN molde en la 2ª
PCR para reamplificar la región de interés que está contenida en su secuencia.
7.2. PCR MÚLTIPLE
La PCR múltiple o Multiplex PCR (en inglés) consiste en la amplificación de varias
secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR.
Se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una
región diferente. Estas parejas de cebadores tienen que cumplir varios requisitos
● La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser
similar, puesto que al usarse un único programa de termociclador, todos los cebadores
deben unirse al ADN molde con la misma eficiencia a la temperatura programada
para la fase de hibridación.
● Los amplicones generados por cada pareja de cebadores tienen que tener un tamaño
suficientemente diferente para poder separarse en la electroforesis y visualizarse
como bandas individuales.
● Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros
u oligómeros.
La aplicación más sencilla de la PCR múltiple es la incorporación de un control positivo
interno en una reacción de detección.
El control positivo interno consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de
cebadores diseñados para amplificar una secuencia control que tiene que estar presente en el
ADN molde problema.
De esta manera, los resultados negativos se confirman directamente en una única PCR, sin
necesidad de realizar una PCR adicional de control positivo de la muestra. Tres resultados
serían posible:
● Positivo. Se observan dos bandas en la electroforesis: la específica de la secuencia
que se está estudiando y la del control positivo.
● Negativo. Se visualiza solo la banda del control positivo
● PCR no válida. No se observa ninguna banda lo cual indica que la muestra contiene
inhibidores de la PCR.
 7.3. PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT-PCR)
La PCR con transcripción inversa o RT-Pa 64 (del inglés Reverse Transcription-PCR),
permite amplificar y analizar moléculas de ARNm.
Dado que las ADN polimerasas termoestables un lizan ADN como molde, para amplificar
ARN e diante PCR es necesario realizar:
1. Un paso previo de síntesis de ADN mediara una retrotranscriptasa (RT) o
transcriptasa inversa.
2. Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADN como
molde y lo amplifica.
Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo.
Estrategias para la transcripción del ARN molde
Las RT, al igual que las ADN polimerasas, necesitan cebadores que formen una pequeña
región de doble hélice en el ARN molde para poder sintetizar el ADNc. En el caso de la
RT-PCR, a partir de Un ARN purificado, se pueden seguir tres estrategias diferentes:
● Una estrategia similar al random priming para marcar sondas, utilizando como
cebadores un mezcla de hexanucleoridos, que hibridan al azar en múltiples posiciones
de todas las moléculas de ARN presentes en la muestra. Con esta estrategia se
transcribe todo el ARN de la muestra a ADNc.
● Usar como cebador un oligo-dT, que hibridaron con las colas poli-A de los ARNm
presentes en la muestra. Con esta estrategia se transcriben a ADN todas las moléculas
de ARNm presentes en la muestra.
● Usar un cebador específico de una secuencia determinada, más concretamente, uno de
los cebadores que se va a utilizar en la PCR posterior. Con esta estrategia se
transcribe a ADNc, exclusivamente un fragmento de ARN que contiene la secuencia
que queremos amplificar.

8. PCR A TIEMPO REAL

La PCR estándar y sus variantes, al igual que los otros tipos de PCR estudiados hasta ahora sé
consideran reacciones a punto final. Es decir, el resultado de la reacción no se conoce hasta
que no termina y se analizan sus productos mediante electroforesis.
En la PCR a tiempo real, en cambio, se monitoriza el proceso de amplificación mediante el
empleo de productos fluorescentes, de manera que la delección de los amplicones se realiza
ciclo a ciclo.
La PCR a tiempo real se realiza en un termociclador a tiempo real, que, además de las
funciones típicas de un termociclador convencional, incorpora un lector de fluorescencia, de
manera que puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier
momento de la PCR.
Las ventajas de la PCR a tiempo real sobre la PCR a punto final son evidentes:
● Mavor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, ya que
el resultado se puede obtener incluso antes de que termine la PCR.
● Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es
más objetiva y sensible que la tinción con bromuro de etidio de un gel de
electroforesis.
● Minimiza los problemas de contaminación,ya que tanto la amplificación como la
detección se realizan en el mismo tubo cerrado.
● Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, la
PCR a tiempo real permite la cuantificación, tanto de los amplicones producidos,
como de ADN diana inicial presente en la muestra.
Para entender bien el funcionamiento de la PCR a tiempo real, en este apartado nos vamos a
detener en el estudio de la cinética de la amplificación y los sistemas fluorescentes de
detección de amplicones, lo cual nos permitirá estudiar sus aplicaciones más importantes.
8.1. SISTEMAS FLUORESCENTES DE DETECCIÓN DE AMPLICONES
Los sistemas de detección independientes de secuencia se basan en el empleo de agentes
fluorescentes intercalantes.
Los agentes fluorescentes intercalantes son sustancias fluorescentes que aumentan su emisión
de fluorescencia cuando se intercalan en el ADN de doble hélice.