EXTRACCIÓN DE ARN DE PLANTAS DE TOMATE RIÑÓN

OBJETIVO GENERAL
 Extraer RNA procedente de plantas de tomate riñón previamente pulverizado para
realizar su cuantificación y separación por medio de RT-PCR.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extracción de ARN

 Adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado de ARN extraído

MARCO TEÓRICO
Los ácidos nucleicos, el ADN y ARN reciben su nombre del hecho de ser moléculas con
características acídicas (como la carga negativa en soluciones acuosas) y haberse localizado
inicialmente en el núcleo celular, aunque ahora se sabe que también se encuentran en la
mitocondria. Para su estudio los ácidos nucleicos deben aislarse del resto de los
componentes celulares, como lípidos y proteínas, más abundantes que los ácidos nucleicos.
Asimismo, dependiendo del objeto de estudio debe aislarse de preferencia el ADN o ARN;
así, para estudios de niveles de expresión génica se extraerá ARN, mientras que para la
búsqueda de modificaciones o alteraciones génicas, ADN (Salazar & et.al.,2013).

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ARN

Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a
permitir el desarrollo de un método de separación específico para ellas. Estos métodos
deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al
investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de
la molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces
de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión.
En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil
ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes
fases estacionarias ya existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para
la obtención de las condiciones necesarias para la rápida y eficiente separación de
biomoléculas {}.

Existen varios mecanismos que permiten la extracción y purificación de ácidos nucleicos:

 Ultrafiltración
 Bolas magnéticas
 Cromatografía de penetrabilidad
  Cromatografía de intercambio iónico
 Cromatografía de adsorción: esta metodología es la usada en la presente práctica
y se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia
de sales caotrópicas.
Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa
hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del ácido
nucleico en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos
nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa
hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor
del ADN.
Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la
membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y
otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra
durante los pasos de lavado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de
la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración
de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten
recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la
membrana. Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas de
los ácidos nucleicos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de
naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación mediante la
tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se obtiene ácidos
nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como
PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc. (Cultek, 2008).

El Kit para extracción de ARN usado, ha sido diseñado para una eficiente extracción y
purificación de ARN total a partir de cultivos celulares, tejidos animales y vegetales. Se
compone de:

El buffer de lisis que incluye en su composición enzimas líticas y una alta concentración
de agentes caotrópicos (Tris-HCl, EDTA, EGTA, SDS, desoxicolato, TRITON ® X, NP-40
y/o NaCl). Una de las principales características del buffer de lisis es que inactiva de forma
inmediata las RNasas presentes en todo el material biológico, además el buffer de lisis crea
las condiciones idóneas para unión de los ácidos nucleicos a la membrana de la columna. El
lisado obtenido es clarificado mediante su paso por una columna de filtración con el
objetivo de homogeneizar lo y reducir su viscosidad, favoreciendo su paso a través de la
columna de unión de ácidos nucleicos. El ADN presente en la muestra también se unirá
a la membrana de silica; para eliminarlo se incluye un tratamiento con ADNasa
directamente en la columna. El ADN contaminante así como sales, metabolitos y
macro-componentes celulares son eliminados mediante sucesivos lavados de la
columna con dos bufferes de lavado (Wash Buffer I y II). Finalmente, el ARN es eluido
(buffer de elución) de la columna utilizando agua libre de RNasas {Citation}.

Los bufferes incluidos en el kit han sido especialmente formulados y optimizados

para prevenir la degradación del ARN durante el proceso de extracción. Esto permite
que todos los pasos se puedan realizar a temperatura ambiente.

Una vez eluido el ARN debe de tratarse con el máximo cuidado ya que el ARN es
muy sensible a cualquier traza de RNasas contaminantes presentes en el material de
trabajo, huellas de impresión,polvo, etc. Mantenga el ARN congelado a –20°C para
periodos cortos o a –70°C para periodos largos de almacenamiento.

El ARN purificado está listo para su uso en aplicaciones como: transcripción reversa, RT-
PCR, Nothern-blot, arrays, ensayos de protección de la RNasa. Puede utilizarse
directamente como molde en reacciones de transcripción reversa y RT-PCR; para estas
aplicaciones se recomienda utilizar volúmenes pequeños del ARN obtenido, 1-10% del
eluido a partir de 1 x 106 Células o 10 mg de tejido (B&M Labs, S.A., 2014)

ELECCIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN

La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de los estudios en

biología molecular y para las técnicas del ADN recombinante. En la actualidad, se dispone
de múltiples metodologías de extracción, lo que permite que los biólogos moleculares
puedan seleccionar la técnica que más se ajuste a sus necesidades. La elección del método
de extracción suele realizarse en función de los siguientes criterios:

Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena sencilla (ADNss), DNAds,
ARN total, ARN mensajero (ARNm) o ARN ribosomal (ARNr).

Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotes o virus.

Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido (generalmente biopsia), sangre
(leucocitos), expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.

Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído: según el uso que vaya a tener el
ácido nucleico los requerimientos de rendimiento, pureza y tiempo de extracción variarán
acorde a la metodología que se vaya a aplicar, como retrotranscripción, PCR, clonación,
Northern blot, Southern blot, etc. (Salazar & et.al.,2013).

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS UTILIZADOS

Reactivos

 Kid de extracción de ARN: High Puré RNA Tissue Kit by Roche

 Alcohol
  Agua destilada
 20 ug Hojas de Solanum lycopersicum

Materiales

 Micropipetas 1000uL y 200Ul

 Puntas para pipetas
 Tubos cónicos de 1,5 Ml
 Tubos filtro
 Tubos de colección

Equipos

 Vortex
 Centrifuga
 Balanza

PROCEDIMIENTO
1) En un tubo cónico de 1,5ml pesar de 18-25 mg de tejido vegetal pulverizado
2) Adicionar 350 ul de Lysis de Buffer, homogenizar en un vorter a baja velocidad
3) Centrifugar el lisado por 2min a 13000g y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de
1,3 mL.
4) Anadir 200ul de alcohol absoluto al sobrenadante lisado y mezclar bien evitando que se
formen 2 capas.
5) Combine un tubo filtro y un tubo de colección, pipetear toda la muestra en el reservorio
superior
6) Centrifugar por 30 segundos a velocidad máxima 13000g. el tubo filtro debe quedar
seco.
7) Descartar el líquido filtrado, coloque nuevamente el tubo de colección
8) Pipetear 100ul de Dnasa I en el reservorio superior. Incubar por 10 minutos o
temperatura ambiente Anadir 500 ul de Wash Buffer I al tubo filtro, centrifugar por 15
segundos a 8000g. Descartar el líquido y armar nuevamente el tubo de colección con el
tubo filtro.
9) Anadir 500 ul de Wash Buffer II al tubo filtro y centrifugar por 15 segundos a 8000g.
Descartar el líquido y armar nuevamente el tubo de colección con el tubo filtro.
10) Añadir 300ul de Wash Buffer II al filtro y centrifugar por 2 minutos a 13000g.
11) Remover el tubo filtro del tubo de colección. Descartar el tubo de colección y colocar el
tubo filtro en un tubo de 1,5 mL nuevo.
12) Anadir 100 ul de Buffer de Elución al tubo filtro y centrifugar por 1 minuto a 8000g.
13) El tubo contiene el ARN eluido.
14) Conservar el tubo con el ARN a -80 °C para su posterior análisis.

RESULTADOS
6. RESULTADOS:

Mediante el proceso realizado se pudo obtener el ARN total de plantas de tomate riñón, el
cual se lo conservó a -20 grados centígrados, para un posterior análisis.

CONCLUSIONES

 Existen varios métodos efectivos para la extracción de ARN total en plantas pero en
los estudios de interacción las variantes se reducen a unos pocos protocolos
referidos a especies específicas.

 En conclusión, podemos decir que con la realización de esta práctica se cumplió con
los objetivos, también utilizamos una técnica que fue a través de kits para poder
extraer el ARN del tomate riñón (Solanum lycopersicum).

 Conocimos cada función que hace los reactivos al momento de la extracción del
ARN.

 Esta práctica fue un éxito ya que se siguió paso a paso como se debe de extraer el
ARN y más que todo por qué se hizo en presencia de una persona capacitada y que
fue verificando cada uno de los pasos. Al final las muestras que contenían el ARN
se colocaron en refrigeración (-80), esto con la finalidad de evitar desnaturalizado
del mismo.

REFERENCIAS
B&M Labs, S.A. (2014). Speedtools total RNA extraction kit. Recuperado a partir de

http://www.biotools.eu/documentospdf/SpeedtoolsTotalRNAExtractionKit.esp.ed03

.Junio14.pdf

Cultek. (2008). Extracción y purificación de los ácidos nucleicos. UNAM. Recuperado a

partir de

http://www.divulgacion.ccg.unam.mx/files/pdfs/como/Purificacion_extraccion_DN

A-RNA.pdf

Salazar A. & et.al. (2013). Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias

de la salud. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C. V.