Relación entre absorbancia y concentración

ACTIVIDAD1
Materiales: Utilizaremos una disolución de Para-nitrofenol (pNF), que es un compuesto con color
amarillo en medio alcalino, agua (H2O), pipeta de 1ml, 3 cubetas para espectrofotómetro y un
espectrofotómetro.

Ilustración 1cubetas
Ilustración 1Agua y para
pNF Ilustración 2pipeta espectrofotómetro
de 1ml
Ilustración
4Espectrofotómetro
Calibración: Se lleno una cubeta con 3 mL de agua y se introdujo en el espectrofotómetro, se ajustó
la longitud de onda a 405 nm y se pulso el botón “A=0”. Se saco la cubeta y vacío.

Ilustración 1Cubeta
con 3ml de agua

Ilustración 3Espectrofotómetro
calibrado y cubetas vacías

Ilustración 2Espectrofotómetro con

cubeta de agua(3ml) ajustada a una
longitud de 405nm y A=0
Procedimiento: Utilizando el Para-nitrofenol (pNF) y agua, prepara 3 muestras en sendas cubetas,
que contengan distintos volúmenes de pNF y siempre un volumen total de 3 mL. Después se debe
introducir de una en una al espectrofotómetro y anotar sus medidas de absorbancia

Ilustración1 Cubetas con pNF. Cubeta Ilustración 2Cubetas con pNF y

1(1ml) Cubeta2(2ml) Cubeta 3(3ml) Agua, con un volumen de 3ml

Ilustración 1CUBETA 1 Ilustración 2CUBETA2 Ilustración 3CUBETA3

Resultados

Análisis cualitativo La cubeta 1 que contiene mayor cantidad de agua obtuvo el valor de
absorbancia menor, la cubeta 2 al tener más cantidad de pNF y menos cantidad de agua obtuvo el
segundo valor más alto, y la tercera cubeta al tener solo pNF obtuvo el valor mayor de absorbancia.
Análisis cuantitativo Calcula la concentración de pNF en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo
que la concentración en la botella es de 80 µM pNF. Prepara una tabla con los datos y traza una
gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?
 La gráfica muestra un ajuste lineal de los puntos y se puede apreciar que los datos tienen una
tendencia lineal en la que la absorbancia es proporcional a la concentración de pNF
 CUBETA 1
μ moI 1 LP NF 1 mLpNF 1000 mLsol
80 NF
⋅ ⋅ ⋅ =¿
Lp 1000 m LP NF 3 m Lso l 1 Lsol 26,667µM

CUBETA 2
μ moI 1 LP NF 2 mLpNF 1000 mLsol
80 NF
⋅ ⋅ ⋅ =¿
Lp 1000 m LP NF 3 m Lso l 1 Lsol 53,3334µM

CUBETA 3
μ moI 1 LP NF 3 mLpNF 1000 mLsol
80 NF
⋅ ⋅ ⋅ =¿
Lp 1000 m LP NF 3 m Lso l 1 L sol
80µM

ABSORBANCIA
1.8
1.6
f(x) = 0.0200626248288076 x + 0.00499066744694932
1.4 R² = 0.999832271812425
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
20 30 40 50 60 70 80 90

Se mezcla 1 mL de una muestra problema con 2 mL de agua. Calcula la concentración de pNF en la

muestra de partida si el ensayo ha proporcionado un valor A405 = 0.799
Despejando x de la ecuación de la recta:
Y=0.00201x-0.005
Tenemos que x=y+0.005/0.0201
En donde x es la concentración y “y” la absorbancia
X=0.799+0.005/0.0201
X=40µM
Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas
ACTIVIDAD 2
El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir la concentración de
proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del colorante azul de Coomassie (Coomassie
Brilliant Blue G250) a las proteínas modifica el espectro visible de aquél.
Materiales: Se dispone de reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o
isopropanol, y ácido fosfórico. Proteínas disueltas en el reactivo, agua (H2O), pipeta de 1ml, 3
cubetas para espectrofotómetro y un espectrofotómetro.

Calibración: Introduce la primera cubeta (que sólo contiene el reactivo de Bradford) en el

espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa el botón “A=0”. Esta muestra se
denomina el "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color propio del reactivo no se
considere en la determinación de proteínas
Procedimiento: Prepara una cubeta sólo con reactivo de Bradford y otras dos cubetas (o más) con
cantidades diferentes de la disolución de proteína. Añade a todas las cubetas la cantidad de reactivo
necesaria para un volumen total de 3 mL en cada una.

Resultados

Análisis cualitativo: Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbencia.
Comparando entre sí las medidas, ¿observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o
menor concentración de proteínas en la cubeta?
 La dependencia se da por la relación dada por la ley de Beer-Lambert donde se relaciona la
intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad destacado después de que en dicho
medio se produzca absorción.
Análisis cuantitativo: Calcular la concentración de proteínas en la mezcla final de cada cubeta,
sabiendo que la concentración en la botella es de 800 mg/ℓ. Prepara una tabla con los datos y traza
una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?
 Concentración 1=0

Concentracion2=266,7𝑚 𝑔∕𝐿
1 ml ⋅800 mg
L
=266 , 7 m g /L
3 mL
Concentración 3=533,3𝑚 𝑔∕𝐿

2 ml ⋅800 mg
L
=533 , 3 m g/ L
3 mL
En la gráfica se observa un comportamiento lineal, donde la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración. El R cuadrado de “0.9996” nos indica que hay relación lineal entre
los tres valores informaron.
Para la determinación de una muestra problema que se encuentra dentro de los parámetros de la
curva de calibración se puede usar la expresión derivada de la formulación recta: y= y +0,002
0,0007
Donde “X” corresponde a un valor de concentración en mg/L y “Y” a la absorbancia respuesta de la
medida de una muestra problema

0.4

0.35 f(x) = 0.000686294291688113 x + 0.0019881888831699

R² = 0.999645887174097
0.3

0.25
Absorvancia

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 100 200 300 400 500 600
Concentracion

Se mezcla 1 mL de una muestra problema con reactivo de Bradford, para un volumen total de 3 mL.
Calcula la concentración de proteínas en la muestra de partida si el ensayo ha proporcionado un
valor A595 = 0.247
Usando la fórmula de la recta antes encontrada y despejando “x” y tomando “y” como la absorbencia
respuesta: 0.247, tenemos que:
0.247+0,002
x=
0,0007

x=355.71mg/L
ACTIVIDAD 2ª
El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir la concentración de
proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del colorante azul de Coomassie (Coomassie
Brilliant Blue G250) a las proteínas modifica el espectro visible de aquél.
Materiales: Se dispone de reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o
isopropanol, y ácido fosfórico. Proteínas disueltas en el reactivo, agua (H2O), pipeta de 1ml, 3
cubetas para espectrofotómetro y un espectrofotómetro.

Calibración: Introducir la primera cubeta (que sólo contiene reactivo Bradford) en el

espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsar el botón “A=0”. Esta muestra se
denomina "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color propio del reactivo no se
considere en la determinación de proteínas
Procedimiento: Todas las cubetas deben contener 1 mL del reactivo de Bradford concentrado y un
volumen total de 3 mℓ. En la primera cubeta no se pondrá proteína, mientras que otras dos cubetas
llevarán cantidades diferentes de la disolución de proteína. Usa agua para completar el volumen

Resultados

Análisis cualitativo: Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbencia.
Comparando entre sí las medidas, ¿observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o
menor concentración de proteínas en la cubeta?
 La dependencia se da por la ley de Beer donde relaciona la absorbancia con intensidad de luz
que se encuentra presente al pasar la luz por la muestra.
Análisis cuantitativo de: Calcular la concentración de proteínas en la mezcla final de cada cubeta,
sabiendo que la concentración en la botella es de 800 mg/ℓ. Prepara una tabla con los datos y traza
una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?
 Concentración 1=0

Concentracion2=266,7𝑚 𝑔∕𝐿
1 ml ⋅800 mg
L
=266 , 7 m g /L
3 mL
Concentración 3=533,3𝑚 𝑔∕𝐿

2 ml ⋅800 mg
L
=533 , 3 m g/ L
3 mL

0.4

0.3

0.2

0.1 f(x) = 0.000530558186483339 x − 0.14214884972889

R² = 0.248147981177001
0
0 100 200 300 400 500 600
-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

En la gráfica se observa un comportamiento lineal, donde la absorbancia es directamente

proporcional a la concentración. El R se encuentra cerca de 0.2481 por lo tanto el resultado es fiable
afirmando que hay una relación lineal de los tres valores obtenidos
Espectro de absorción de la hemoglobina
El color rojo de la hemoglobina se debe a que absorbe radiación visible, aunque también presenta
picos de absorción en y cerca de la región ultravioleta.
Procedimiento: Usando agua y la disolución de hemoglobina, prepara distintas diluciones y analiza
su espectro UV-VIS completo. Para ello, llena una cubeta con hemoglobina y en las otras dos
cubetas prepara sendas mezclas diferentes de hemoglobina con agua. Todas las cubetas deben
tener un volumen total de 3 mℓ. Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una
que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner encada cubeta

Medida: A continuación, introduce al espectrofotómetro las cubetas, de una en una, y pulsa el botón
para registrar el espectro entre 200 y 800 nm. Pulsa en el icono de cámara de fotos y copia la
imagen resultante para poderlas comparar todas al terminar el experimento.
Análisis cualitativo de resultados: Compara los 3 espectros. ¿Qué efecto se observa al diluir la
hemoglobina de partida? ¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción máxima? Describe lo que
observas.
 Los efectos es la disminución en la Absorbencia de la muestra y esto se debe a la
proporcionalidad de la concentración. Cuando se cambia el máximo de absorbancia se
comienza a disminuir la absorbancia en cada lectura entre más se aleje del máximo
2ª medida: Observando el espectro, anota dos longitudes de onda (de la región visible, no
ultravioleta) en las que haya un pico (un máximo local de absorción). A continuación, mide y anota la
absorbancia de las 3 cubetas a cada una de esas dos longitudes de onda. Representa tus resultados
en una gráfica, considerando que la concentración de partida de hemoglobina (en la botella) es de
200 mg/L

Análisis cuantitativo de resultados: ¿Cómo puedes describir las conclusiones de lo observado?

¿Cuál de las longitudes de onda sería útil para determinar la concentración de muestras problema de
hemoglobina?
 La Longitud de Onda adecuada seria 420nm ya que se presenta el máximo de absorbencia
como se aprecia en los espectros obtenidos, en la gráfica. Encontramos una mayor linealidad
de la ecuación de la recta