UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

FACULTAD DE FARMACIA

MElODOS DE VALORACION
DE A VITAMINA "C"

TESIS DOCTORAL
PRESENTADA POR

MARIA ELBA GRANADOS DE VELASQUEZ

PR E VIA opelON AL TITULO CE

DOCTOR EN QUIMICA y FARMACIA

SAN SALVADOR EL SALVADOR CENTRO AMERICA

JUNIO DE 1972
U N I V E R S IDA D D E E L SALVADOR

RECTOR:

Dr . Rafael Menjívar .

SECRETARIO GENERAL:

Dr . Miguel Angel S~enz Vare la.

FACULTAD DE FARMACIA

DECANO:

Dr . Radl Ar~valo Alvarez .

SECRETARIO:

Dra. Amelia R. de Cort~s .

PRIMER EXAMEN PRI VADO DE DOCTORAMIENTO:

Dra . Rosa Hernández de Díaz.

Dr . Raúl Ar~valo Alvarez.

Dra . Rosa María P . de Rivera .

S2GUNDO EY.AEEN P:lI VADO DE DOCTOP.AHIENTO:

Dr . Jos~ Mauricio Alvar e z C .

Dra. Hilda Mercedes P. de Novoa.

Dr. P edro Jos~ Ros a les C .

JURADO CALIFICADOR DE TESIS:

Dra . Lilian Aguilar de Fernández.

Dra . Gl oria G6mez.

Dra . Carmen Luz Sermeño.

 ~
.J-/C'?
/.
cf
J. .
I C4!(J/-,IQ:

A mis padres:

con profundo amor y agrad e ci-

mi e nto.

A mis h e rma nos:

con mucho c a riño y r e conoci -

miento.

A mi esp o s o e hijos:

con inme n so amor .

A mi f ami l ia , compañe ros y amigos .

Agradecimiento espeoial a la Dra. Hilda Merc~

des Pacheco de Novon, por su sincera colabor~

oi6n en este trabajo.

A la Dra. Vera Alicia F. de Navas, con respeto,

cnriño y admiraci6n.
 I N D ICE

p.

l. I NTRODUCCION . .. .. . . . . . ..... . . . . . . .. . . .... .......

. 1

II. ACI~O ASCORBICO VITAMINA "e" . ... ... . . . . .. . . . . .

III. METODOS FISICO-QUIMICOS ......... . ..... ....... 10

IV • ~ffiTODO MICROBIOLOGICO ...... . . . .. .............. 24

V. ANALISIS POL\R OG~FICO DEL ACIDO ASCO ~ BICO •..•• 61

VI. CONCLUSION:8S • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• 75

VII. BIBLIOGRAFIA . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 77
 I N T R O D U C C ION

El empleo de Vitamina "C", en la industria f'arma-

c~utica y de productos alimenticios, conf'iere una impor-

tancia extraordinaria a su determinaci6n cuantitativa.

Es muy difícil actualmente seleccionar la t~cnica

apropiada para un problema particular, a partir de la -

gran cantidad de informaci6n bibliográfica que existe -

sobre la Vitamina "C" .

El princip al objetivo de este trabajo es f'acili -

tar a los Analistas su elecci6n, respecto al m~todo a -

seguir .
 2-

AeIDO ASeOREIeO VITAMINA "c"

La Vitamina e, o ~ci d o él.Gc6rbico, es 1a vitamina

hidroso1ub 1e necesaria para la prevcnci6n y curaci6n d e la

enf e~med a d _~or Carencia, llamada escorbuto.

La vi tar:lina e, Ge er. . cuentra en to c~a s las c~lulas

ve ge tales viva s, se sintet iza durante la g er~inaci6n de

las se ~ i11 &s y está rela tivaQent e co ~ centrada en 10s 6rga-

nos ve getalss ~e cr € ci~i ent o rápido. S e encuentra as! mi~

mo er: to::::'o s los tej i ¿ oc ani!'!!a1 e s, ::lunque no se al::1ace:;.a en

Jran d es c a~ti¿n~ss y existe en concen tra ciones b aj es e x ceE

t o e n los 6 r~ an os y gl~nL~ l ?s q u e tienen runcio n es endocri

nas, co c o el h!;-a :-_o , cáp sula s suprarrenales, timo e h ip6:fi

sis e ~s e80~cial para la formaci6n ~ e1 c olágeno i~ ter ce1~

lar, por 10 q ue 6Ua~Ga gran re1a ci6n co n las estructuras -

de~tari 2s , la sU 8t~L ci a rund ame nt a 1 d e los ~uesos y las p~

r ~d es ¿ e los c ap i1 ~reo ; e~ el esco~buto, son estos los te-

ji¿ os d efectuocos.

Huestras mejor e s fuentes 'l e suministro son las -

:frut a s frescQs como los cí tricos, fra mbuesas, g rosellas y

las verc ures co n o la lechuga y la colirlor. Aunque l as P.e.

pas no cont ienen €rande s c ant i Qace s ce áci do asc6 r bico,

son una d e nuestras más g r E1.n:::.es :fuentes a caUGa c:e l a s

granees cant i Ca::_e s que se consumen .

La vita!'!!i~a ~, es esencial ~~r a la cur~ ci6n de -

l as :fract~r~s 6s eas , es un :fact or en la resiste~cia co ntra

la ir-fec ci6n, y r educe el ef e cto dé la toxina dift~rica, -

 J-

teniendo también propiedades bactericidas.

El ácido asc6rbico se presenta bajo la forma de

c ristales o polvo cristalino ligeramente amarillento . Es

inodoro y posee sabor ácido, 0 . 05 mg . de ácido asc6rbico

cristalino corresponden a l unidad internacional de Vita-

mina e , (20) .

Solubilidad.

En agua a 25ºC . . ...... . . aprox. JO gr./IOO cc.

En alcohol etílico 95 %a
2.5 ºc . . ....... . . . ...... ... aprox . J gr . /100 cc .
En a lcohol e tílico absolu-
to a 25 2 C • •. ••••. ... ... .• aprox. l gr . /IOO cc .

En eter, cloroformo , benc~

no, eter de petr6leo , acei
tes y grasas ..••. . ...•• .• insoluble

•
Estab i lidad.

La estab ilidad del ácido asc6rbico no e s ilimita

da .

A causa de sus cara cterística s químicas, la molé

cula de Vitamina e, puede oxidarse y descomponerse . Estas

reacciones son provocadas principalmente por la acci6n de

la luz, el calor y el aire , especialmente en presencia de

humedad; por lo que se recomienda guardar e l ácido asc6rbi

c o en recipientes herméticamente cerrados y en lugar fres-

co , seco y al abrigo de la luz . El material se mantendrá

 4-

estable durante mucho tiempo en estas condiciones. A veces

puede producirse despu~s de un almacenamiento prolongado,

una ligera coloraci6n amarilla que no afecta la actividad -

bio16gica del producto.

El efecto desfavorable que sobre la estabilidad

del ácido asc6rbico pueden ejercer condiciones adversas, du

rante la preparaci6n o almacenamiento, se nota particular -

mente en el caso de las soluciones de ~cido asc6rb~co. Por

ejemplo: a pesar de que los metales practicamente no alte -

ran la estabilidad del ácido asc6rbico cristalino seco; ac~

leran en cambio considerablemente la oxidaci6n en soluci6n

acuosa , aún cuando solo se encuentran trazas de los mismos

(especialmente hierro, cobre y manganeso) . El aumento del

pH tambi~n acelera la alteraci6n de color de las soluciones

de Vitamina e, que es bastante rápido en soluciones alcali -

nas . For lo t a nto , como las soluciones para uso porentera1

~an de ser n eutralizadas para reducir al mínimo el dolor r~

sultante de su inyecci6n, debe evitarse cuidadosamente en -

la preparaci6n cualquier exceso al alcalinizar.

Estas indicaciones son tambi~n aplicables en gene-

ral a los comprimidos de Vitamina e. Las dificultades que

presenta la elaboraci6n de los comprimidos pueden vencerse

se se toman las medidas de precauc i 6n recomendadas .

Es muy impo rtante que la Vitamina e, que vaya a -

usarse , sea p u ra y de buena calidad . El ácido asc6rbico -

triturado permite la obtenci6n de una mezcla homog6nea con

los otros ingredientes, evit a nto además que los cristales-

......J
 5-

de Vitamina C, lleguen a la superficie de los comprimidos .

Los cristales y esquirlas que lleguen a la superf!

cie constituyen un factor causante de manchas en los mismos.

No se han de usar aparatos de cobre ya que este me

tal, actua ndo como catalizador, destruye la Vitamina C.

Con el fin de evitar que los comprimidos se peguen

a los punzones , durante la compresi6n , hay que lubricar

bien el granulad o. El talco que se emp l ea para este fin, -

debe estar libre de hierro porque su reacci6n con el ácido

asc6rbico daría lugar a manchas coloreadas sobre los compr!

midos,

El equipo para la elaborac i6n de comprimidos ha de

ser d e acero inoxidable, de niquelo perfectamente esmalta-

do ~ También es necesario emplear matrices y punzones crom~

dos . El ácido asc6rbico tiend e a producir alteraciones de

color en contacto con glucosa o Esta reacci6n es una de las

cau sas principales de la a1teraci6n de color de carácter no

enzimático observada en muchos productos alimenticios . Los

ácidos aceleran la hidr6lisis y por esta causa suelen ocu -

rrir alteracione s de color al Gncontrarse el ácido asc6rb i-

c o en pres e ncia d e azúcar.

Ajuste de pH.

Una alcaliniza ci6n loc al pro ducida durante el pro -

 6-

ceso de ajuste de pH , aún cuando sea fugaz , puede causar -

una provocada alteración del color de la solución . El al -

cali a emplear es e l bi carbon~to de sodio, de pureza para

análisis libre de metales pesados y de calcio .

El bicarbonato de sodio evita alcalinizaciones -

loc a les peligrosas durante l a adi ció n por ser una base re -

lativ~mente d~bil , de constante de disociación baja , por -

otra parte reacciona con el ácido ascórbico desprendiendo

anhídrido carbónico, lo que aumenta la protección . La me -

jor manera de agregar e l álcali es en forma de una solu --

ción acuosa conc entrada .

Se agita vigorosamente mediante un agitador me -

c ánico o haciendo pasar una corri ente de C O 2 , a trav~s ~

de la solución de Vitamina C. El pH referido para las so -

luciones parenterales de ácido ascórbico es de 6 . 5 a 7 . 0 .

A este p H , e l ácido asc órbico se encuentra en su mayor paE

te en forma de sal sódica.

Pro t ecc i ón del Oxígeno .

Huy que hacer todo lo posible para evitar la -

oxidaci ó n de l ácido ascórbico , de eliminarse todo el oxíge

no contenido en e l agua destilada libre de pirógenos emple~

da para la solución . La mejor manera de l l evarlo a cabo -

es hacer pasar durante 10 minutos , por 1 0 menos, una co-- -

rr i ente de gas C O 2 a trav~s del agua antes de agregar el .·

ácido as c órb ico. De esta manera se satura el solvente con

 7-

el gas inerte eliminando el oxígeno disuelto , La 5uperfi -

ci e de l líquido tambi~n debe estar oonstantemente cubierto

durante la composici6n , filtraci6n y envase de la soluci6n

terminada por una a tm6sfera de e o 2 o d e nitrógeno purifi-

ca do . Ha de desplazarse e l aire de las amp ollas antes del

cierre p o r medio de l e o 2.

En las soluciones de Vitamina e, unicam6nte se us~

rán ingr edientes c ontro lad o s analíticamente, libres de met~

les pesad o s y de Co . En l as fabric a ciones han de usarse

aparatos de v i drio, esmaltados en vidrio o cromados .

Prot e cci6n de la Luz.

En todas l as circunstancias es necesario proteger

l as soluciones de ácido asc6rbico de l a luz solar directa ,

o de fu erte luz artificial . Las botellas en las que se al-

macena l~ soluci6n se envolverán en tela o en papel negro -

opaco , l as ampol l as llenadas se guardarán en recipientes

que no deje entrar la luz .

Tanto las ampollas de vidrio incoloro como los de

vidrio de color caramelo son utilizables . Los primeros ofre

cen ~eno s posibilidades de contaminación por 10 metales pes~

dos , lo s de vidrio de color caramelo, por su parte , protegen

la solución de la luz diurna . Si se desea puede empl earse -

para las soluciones de ácido as c6rbico, frascos ampollas con

ci erre do g oma ; sin embargo , su período de estabilidad es 11

mitado deb ido a l a permeabilidad al oxígeno de la goma, aún-
 8-

de la mejor calidad.

Al ll e var y cerrar las ampollas de Vitamina e, se

tropieza a veces con grandes dificultades. Si en el cuello

de l a ampoll a que da un resto de la sOluci6n, ~ste se c arbo -

niza al ce rrar la ampolla a la llama .

Por e sta c a us a han d e llevarse las ampollas con -

mucho c ui d ado i ~p i d i end o que puedan adherirse al cuello go -

titas d e la soluci6n.

Las ampoll a s se esterili z arán al calor por ejem

plo: JO minutos a lOOQe., o por otro m ~todo admiti do . Sea

cual fuere e l m~todo ap l icado e s import a nte que el tiempo -

durante e l cual se s one ta l a solución de Vitamina e, al ca-

lor , sea 10 más re d ucido posible, pues la descomposici6n es

causada más por l~ pro longada exposici6n al c a lor que por -

el c alor mismo , (1-16).

Aplicaciones de l Análisis de Vitaminas.

El conocimiento ce la d istribüci6n y abund a ncia

de l a s vitaminas e n to d o tipo de materiales y origenes ha

constituido uno d e los principa les problemas desde que se -

inició l a i nves ti ga ció n s o b re es t os compuestos. Por ello

se ha prest ado siempr e lliia gran a tenci6n a los m~tod o s para

su detección y análisis . El mayor inter~s se c e ntraba en -

las t~cnicas para determinar vitamin as en productos natura-

l e s, ya que la sínt e sis de la vitamina, la preparaci6n de -

 9-

mezclas concentradas y su análisis c ompleto se ha realizado

en las últimas d~cadas . Pero el inter~s actual acerca de la

deter~inaci6n de vitaminas en pro~uctos n~turales no ha de -

cr ec ido y puede afirmarse que no disminuirá en el futuro . El

análisis cuantit at ivo d e vitaminas es particularmente útil -

en la de t erminaci6n d e los requerimientos nutritivos humanos

y animales . E l desa rrollo d e procedimientos prácticos para

el análisis de vitaminas en muestras bio16gicas , por ejemplo

en sangre y orina o en les 6rganos de animales d e experimen-

taci6n tiene una especial importancia en medic ina. F inalmen

t e , el emp leo progres ivo de vitamin8 s sint~ticas en farmacia

y en las industri ls d e la al i me nt a ci6n humana y animal, ha

proporcionndo un est ímulo to d aví a mayor al pe rf e ccionamiento

y amplia aplicaci6n de los métodos p 3ra la determinaci6n de

vit amina s en los l aborator ios analíticos d e los Centros Uni -

v ers i tar ios , i ndus triales , cone rciales y estatales .

 10-

METonos FISICO-QUIMICOS

En los últimos veint e años las técnicas QUIMICAS

y FISICO -QUIMICAS han ido reemplazando sucesivamente a

los métodos bio16gicos en la investigaci6n de rutina, es-

pecialmente en la industria farmacéutica. Son métodos

más rápidos y baratos que los bio16gicos y en general,

sus límites de error son mucho más pequeños . Sin embargo,

debido a la escasa especificidad que poseen normalmente -

los métodos químicos y físicos de ben emplearse con cier -

tas reservas. Por e jemplo, cuando se analizan materiales

de composici6n desconocida es convenient e determinar la -

vitamina que interesa no solo por un método químico o fí-

sico -químic o , sino por dos o más métodos, o bien compro -

bar los resultados, si es posible, mediante los exámenes

bio16gicos y microbio16g i cos corres pond i entes . Cuando se

emplean técnicas volumétric as y 6 pticas (fotométricas) ,

es particularme nte import an t e confirmar la exactitud de -

los resultados obtenidos mediante otros procedimientos an

tes de decidir su empleo en el análisis sistemático , (19).

Vitamina "C'I - Acido Asc6rbico - Vitamina Antiescorbática.

~ OH 10H
C _ _ _ _..o;..C F6rmu1a Mole cular :

JO: el 1= ° Peso Molecular: 1 76.13

! /
H c/
 11-

Consideraciones Gen e rales.

Los m6todos clásicos para el análisis de Vitamina

"C" se basan en su fuerte poder reductor que permite su de-

termina ci6n por volumetría oxidimétrica. El m6todo de IIJ -

Tillmans" , e n e l cual la vitamina se valora con 2,6~diclor~

fenolindofenol, es el más utilizado desde hace muchos años

para la valoración de l a Vitamina "C". Este colorante es -

azul al Gstado s61ido y en soluci6n neutra o alcalina; la -

soluci6n en medio ácido es de coloraci6n ros~da y se reduce

al derivado leuco incoloro.

o O O oI!:'
11 1I 1I
C Cl C el Cl

-:tr
.,..C l
C
I I
C
1
= :L
H
IJ _ OH
I
C
C

-~
O +

11
)

H - C
,=
C ~+
I
N NH
I
HO - C .. H
I
C H 0H
I
,
I
HO - C - H

C H 0H
I

2 2

I
OH OH

El ácido asc6rbico se oxida ácido dehidroasc6rbi -

co. Gracias a la intensidad de la coloración, la valoración

con 2,6, diclorofenol-indofenol se emplea principalmente pa-

ra el aná lisis de vitamina "C" en piensos y alimentos tales

como frutos y zumos, y en materiales bio16gicos (Orina por -

ejemplo), (16 - 20).

 12-

Factores Interferente~ .

El análisis de la Vitamina "e" por volumetría oxi-

d i mét r ica es específica únicamente cuando se emplean solucio

nes de ácido as c 6rbico puro . Si existen en la soluc i 6n otras

sustancias reductoras además del ácido a sc6rbico se consume

una mayor canti dad d e la soluci6n columétrica y el contenido

aparente en Vitamina "e" es mucho mayor del real . Aunque la

interf e r enc i a debida a esta causa puede preverse y, en algu-

ncs casos , eliminarse adoptando l a s precauciones adecuadas,

como en el caso de las preparaciones farmacéutic as , no suce-

de lo mismo cuando se trabaja con productos naturales . Los

compuest os o rgánicos con grupos - SH (Por ejemplo G1utati6n) ,

sust anc i as reductoras y otros derivados que pueden formarse

durante la ca1efacci6n de los alimentos o materiales a ensa -

ya r (Por ejemplo Zumo , vegetal es , mermelada , cons e rvas vege-

tales, vege tal es desecados) así como el bi6xido de azufre

que se añade a los mostos no fermentados , pueden todos ellos

interferir l a v alora ci6n de la Vitamina "e" , en productos n~

turales por el p rocedimi ent o mencionado . Además , es fr e cuen

te qu e una pequefia proporci6n de Vitamina "e" se hal le en

los productos n nt ura1 es al e stado de ácido de ácidodehidroas

c6rbic o . Este compuesto está dotado ta mb ié n de actividad an

tiescorbútica, pero no reacciona con el 2,6 diclorofeno1 - in-

dofeno1 y no puede valorarse, por t anto , si no se convi erte

previamente en ácido as c6 rbi co .

Por todas es tas razones, se han r eal izado múltiples

intentos para mo d ificar el análisis del ácido asc6rb ico total

mediant e l a v a lorac i6n con 2,6 dic10rofeno1 - indofenol , de t a l

 13-

modo se c onsiguiera determinar exclusivamente el contenido

en Vitamina "C" . Se han sugerido un gran número de métodos

para aislar e l ácido asc6rb i co de las otras sustancias re- -

ductoras interferentes . La mayoría de estos procedimientos

han sido concebidos para la determinaci6n de la Vitamina "C"

en mater i ales n a turales concretos y no son de aplicaci6n ge

neral . Cuanto más complej a sea la muestra o menor el cont~

nido en ácido asc6rbico , mayor es el peligro de pérdidas du

rante los tratamientos de purificaci6n .

Otros Métodos para el Análisis de Vitamina "C" .

El método de STROHECKER HEIMANN y MATT, ha demos -

trado ser muy adecuado para el análisis de Vi tamina "c" en

alimentos. El ácido asc6rbico se i dentifica y aisla median

te cromatogra fía sobre papel antes de proceder a su va10ra -

ci6n oxidimétri ca .

Existen otros métodos muy sensibles que , si bien

no son tan específicos como el de STROHECKER , HEIMANN y

HATT , son sin embargo , más ap ropiados que los métodos c1áei

cos que emplean dic10rofeno1indo feno1 . Consideramos oport~

no destacar el análisis fotométrico con 2 - nitroani1ina-dia-

zoada (MOER) y con 2 , 4 dinitrofenil - hidrazina (RDE Y KUE---

THER) . Estos pro c edimientos son también apropiados para la

d ete rmina ci6n de Vitamina "C ", en alimentos especialmente -

en zumos colorados, que son muy difíciles de valora r cua ndo

se emplea dic10rofeno1 - indof eno l .

 14-

Métodos .

Los sigui e ntes métodos son de gran ap~icaci6n prác -

tica para l a valora ción de Vit amina "C" .

lo . Valora ción con cloramina - "T" 0 . 1 N (sólo para -

preparados farma c éuticos que no cont engan otras

sustancias oxidabl e s) .

20 . Va loraci6n con solución de 2,6- diclorofenol - in-

dofenol prepa rada a p a rtir de comprimidos de es

te producto ( ap ropiada para determinaciones

aproximadas e n la preparación de zumos vegeta -

l e s; ap licab le a l control de producción de zu

mos. Si e mpre qu e no se requi e ra una gran exac -

titud) .

J o . Valora ción c on solución de 2,6 diclorofenol - in-

dofenol pr evi o a islami e nto d e l ácido ascórbico

por cromat o graf í a sobre pap e l , según STROHECKER

HEIHANN y MATT por ejemplo e n alimentos) .

40. Valorac ión del ácido ns c6rbico en presencia de

ácido sulfuroso . En vinos con solución de yodo

(KIELHOFER y AUNANN) .

50 . Det e r mina ción fotométrica con 2 nitronnilina

di az oada, según MOHR ( e n nlime ntos y muestras

biológicas) .

60 . Det e rmin~ ci6n fotométrica del ácido ascórbico -

total (á c ido a sc6rbico, ácido dehidroascórbico)

por el método de l a di nitrofenilhi d r a zina ( ap li

c ab le a ~ limen t os y muestras bio16gicas).

70 . Análisis de l a Vitamina "c" tot al por purifica -

 15-

c i 6n de la 2,4 dinitrofenil-hidrazona del áci -

do dehidroasc6rbico por por cromatografía en -

c apa fina (en caso de alimentos con alto cante

nido azucarado) .

80 . Valoración polarográf i ca del ácido ascó~b~co ,

(15) .

As c orbigeno.

En los materiales vegetales el ácido asc6rbico se

halla presente, en det e rminada proporci6n , en formas combi-

nadas (Ascorbígeno) . Es probable que esta forma no pueda -

ser empleada directamente por 81 organismo . No se detecta

por los métodos habituales de análisis de Vitamina "e", si

no se hidroliza previamente a ácido asc6rbico (Por ejemplo ,

hirviendo con una solución de ácido oxálico dura nte quince

minutos) .

Anális i s de la Vitamina "e n en Preparaciones Farmacéutic~!

por Valorac i 6n con elorami na "T " 0 . 1 N (Con Yodo 0 . 1 N) .

Reac t i v os .

eloramina-" T" 0 . 1 N: 14,085 gr . de cloramina - TG . R.

se disuelven hasta 100 ml . en agua .

Yodo 0 . 1 N

Soluci 6n de yoduro de z i n c- almid6n G.R .

 16-

Acido clorhidríco min-25 por ciento (d= 1.122-1 ,

124) G.R .

Almid6n soluble G. R .

En el caso de preparaciones líquidas , tales como

inyectables , gotas y jarabes, se p i petea en un erlenmeyer -

de 200 mI . un volumen exactamente medido que cont enga alre -

dedor de 100 a 200 mg . de ácido asc6rbico y se diluye con -

agua hasta 80 mI . aproximadamente . Se añade 1 mI . de ácido

c lorhídrico (d=1 , 122-l . 124) y 5 mI . de la soluci6n de yodu-

r o de zinc - almid6n (indicar), y la mezcla se valora con la

soluci6n de cloramina - T 0.1 N hasta aparici6n de color azul .

También puede valorarse tal como se ha indic ado,

pero empleando soluci6n de yodo 0 . 1 N en lugar de cloramina

T y añadiendo unas gotas de soluc i6n de almid6n al 1 % como

indicadcr .

Un mI . de cloramina T 0 . 1 N (o de yodo 0 . 1 N)

equivale a 8 . 806 mg . de ácido asc6rbico, (6 - 15).

Para soluc ion es c oncentradas de Vitamina "C" solu

ciones inyect a bles c!e Vitamina "C" o extracto de comprimi _

dos que contengan esta vitamina los re a ctivos oxidim~trico8

empleados son la soluci6n de Yodo 0 . 1 N o la soluci6n de

c loramina "T" 0.1 N. Ambas soluciones oxidan cuantitativa-

mente el ácido asc6rbico a dehidroasc6rbico.

La soluci6n de cloramina "T", retiene su título _

mejor que la soluci6n de Yodo . Otras desventajas de la 80-

 17-

luci6n d e yodo con s iste en que la soluci6n d e almid6n, demo

ra la reacci6n con e l ~cido asc6rbico, de t a l modo que la -

volum e tría s e afect a y también e l punto final d e la valora-

ci6n se s e e mplea variamine blua , como indi c ador en lugar -

d e la soluci6n de almid6n se obtiene un punto final de la -

valor a ción con yodo bien d efinido .

Valoración en Materiales Secos .

En el caso de pr e paraciones secas (comprimidos y

grageas) , de be proced e rs e , en p rime r lugar, a pulverizar fi

nam e nte la muestra en un mortero . El polvo obtenido se mez

cla con un poco de agua , e n el mismo mortero y la suspensión

o b tenida s e trasl a d a , con los oport u nos lavados, a un matráz

Erlenm e y e r, emple ando 60 - 8 0 nI . d e agua en tot a l . Se acidi

fic n l a muest ra con 1 mI . de áci d o cl o rhídrico (d= 1 . 122 -

1 . 124) se a g ita vigorosamente y se valora , (15) .

Valo ra ción en Cápsulas .

Las c~psul as que contienen una susp e nsi6n oleosa

de l ~ci d o asc6rbico junto con otras vitaminas ( c ápsulas po -

livitaminic a s) s e a bren a lo largo de la línea de uni ón em-

ple a ndo una cuchilla a propiada (de afeitar) por ejemplo .

Las d os mit ade s obtenidas y su contenido se transfieren cuan

tit a tiva me nt e a un e mbudo de separación , lavando cuidadosa -

me nte l a cuchilla e mp l eada con ét e r de p e tróleo y adicionag

do direct ame nte a l e mbudo de separación los líquidos de la -

 18-

vado . La mezcla se reparte entre las fases acuosa y et~rea.

La capa acuosa se recoge en un matráz Erlenmeyer y la capa -

de ~ter de petróleo se agita otras dos veces con agua . Las

fases acuosas de lavado se combinan con el primer extracto -

acuoso , se acidifica con ácido clorhídrico (1 mI.) y se valo

ra como se ha descrito anteriormente , ( 1 5) .

Presencia de Otras Sustancias .

En general, no importa que la preparación o ex -

tra c to contenga otras vitamina s, además de ácido ascórbico •

Los excipientes habituales, tales como almidón lactosa y tal

co no interfieren con la valoración y no es necesario elimi -

narlos por filtración, en el caso de que sean insolubles . Si

la concentración de vitamina " C" es muy baja es mejor valo -

rar con cloramina - T 0 . 01 N empleando una microbureta .

Valoración de la Vitamina "C" c on Comprimi dos de 2 , 6 - Dicloro

fenol - Indofenol .

Aplicaciones .

Este procedimi e nto de valoración puede emplearse

para determinaciones aproximadas de la concentración de vit~

mina " C" . Dada su sencillez operacional, este método es es -

pecialmente apropiado para los análisis de rutina en la ob -

tención de zumos de frutas . Puede emplearse asi mismo para

determinar vitamina "C" en v egetales y en extractos acuosos

 19-

de alimentos s e cos , siempre que no se requiera una gran preDi

si6n .

Reactivos .

Acido Oxálico G . R .

Comp rimidos de 2, 6- diclorofenol - indof eno1 e6dico

de 1 . 65 mg . (equival e nt e s a 1 mg . de ácido asc6rbico) .

Soluci6n de 2 , 6 diclorofenol - indof eno 1: se disuel

ven cinco comp rimidos d e diclorofenol - indof enol en 20 - )0 mI .

de agua e n un matráz aforado de 50 mI . calentando sobre bañ o

de va por y c on fr ecue nt e agitaci6n rotacional del mat ráz .

Cuando se observa qu e han desaparecido las partículas en su~

pens i6n , se enfr í a la soluci6n a la temperatura ambiente , se

diluye con agua h asta la señal de aforo y se mezcla , 1 mI. -

de e sta s o luci6n equivale a 0 . 1 mg . de ácido asc6rbico .

Et c r Dietílico G . R .

Aci do L (+) - asc6rbic o G . R .

Método.

Un volumen exactamente medido de l a soluci6n pro -

b l ema de vit amina tIC" que contenga de 0 . 2 a 1 . 0 mg . de ácido

asc6rbico , s e pipetea en un Erlen~e yer de 100 mI . de capa ci -

dad y s e d iluye hasta 20- 30 mI . con a g ua destilada r ec i e nte -

 20-

mente hervida y enf riada rápida me nte. Se añade un poco de -

ácido oxálico y s e agita la 50luci6n~ Acto seguido se proc~

de a su valoraci6n con soluci6n de diclorofenol- indofenol

c ontenida en un microbur eta , hasta que se obtiene coloraci6n

débilmente rosada . El oambio de color suele ser de difícil

o imposible obs e rvación deb ido a la ooloraci6n que pos ee la

soluci6n problema (oomo oourre pre oi samente , en los zumos de

frutas) . En este caso, s e añade 10 mI . de ét er cuando se

prevé que está a punto de alcanzar el punto final de la val~

r a ción . Se ag it a vigoros~mente la muestra, se deja reposar

y se presta atención a la c o l o r a ci6n de la soluci6n etérea •

Si su tonalidad e s violet a ros ada significa que la valoraci6n

ya se ha completado y que se hal l a presente un exceso de d i-

clorofenol - indofene l. En cambio, si la soluc i6n tiene otro

c olor o es inc olo r a , se acidifica un volumen igual de la so -

luci6n prob l em2 con e l ácido oxálic o y se trGta con un volu-

men de l e solución de d iclorofenol-ind of e nol que excede en 1

mI . al emp l e ado anteriorm e nte . La mezcla obtenida se agita

de nuevo con 10 mI . de éter . Si l a coloraci6n de la capa

etérea es ahora violeta-rosácea , e l punto final se halla co~

prendido entre l as dos cifras de valornoión (volúmenes em --

pleados e n los do s en sayos) y puede determinarse con bastan-

t e exact itud proced i endo a la ad ición de volúm en~ s menores -

de la soluci6n de diclorofenol -indo fenol empleando en la se-

gunda val o ración 0 . 5 mI . e n lugar de 1 mI .).

Fr e cue ntem ente , los zumos de frutas contienen pig -

mentos de t o nalidad rojiza (por ejemplo : zumo de grosel la) O

amar ill enta (por ejemplo: zumo de naranja) que son solubles

d e ét e r y dificultan l a detección del exceso d e diclorofeno l-

 CE lH~'\L

21.-

indofenol en la c apa etérea. En estos casos, 1.a va1.oraci6n

puede facilitarse extrayendo con éter un volumen considera-

ble de la soluoi6n problema, en un embudo de decantaci6n. A

continuación, se valoran con diclorofenol - indofenol diver

sas porcione s de la capa acuosa .

Solución Test i go .

Otra forma de eliminar la interferencia producida

por la presenc i a de pigmentos cons i ste en realizar simultá-

neamente un experimento en blanc o (prueba testigo) . Se di-

l uye con agua , de la forma habitua1. , la misma cantidad de -

so1.uci6n problema que se emplea en la determinaci6n princi-

pal se acidifica con ácido oxálico y se añade un volumen de

la soluc i 6n de diclorofenol-indofenol que equivalga , aproxi

madamente , a la vitamina C , presente . Se adiciona un poco

de ácido asc6rbico, y la mezcla se extrae con 10 mI . de éter .

Se r epite la determinación principal y el punto final de la

valoraci6n se compara c on la coloraci6n de la capa etérea -

obtenida en la p rueba testigo , hasta igualar1.a totalmente .

Si e s muy baja la concentraci6n en ácido asc6rbi -

c o de la soluci6n problema es preferible emplear una solu -

ción más diluida de diclor o fenol -indofenol (por ejemp1.o: la

solución que resu1.ta al disolver un comprimido en 50 ml . de

agua) • En e ste caso 1 ml . de la soluci6n de diclorofenol -

indofenol equiva l e a 0 . 02 mg . de ácido asc6rbico en la so1.u

ci6n problema .
 22-

Cuando existen dificult ades para det e ctar la va -

riación desde l a solución incolora ( o colorac i ón muy d~bil

e 1& soluci6n p rob~ ema ) h asta ~ a tona~i da d ro~ada , es más

fácil , con fr8cuenciJ emp~ear la valoración inversa ; se valo

ra una ca~ticad fija de l a solución diclorofenol -indofeno l ,

c o n la solución prob l e ma o con la dilución a p ro p iaca do la

misma . Este procedimiento es ventajoso únic ame nte cuando -

l a solución p robl ema e s tan débilme nt e color eada que no se

precisa e xtra e r con ~ter el e xc e so de colorante . Por ejem-

plo: se d i sue lv e una tableta d i clorofenol - ind ofenol (equiva

l e nte 1 mg . de ácido as c ó rbico) en 20 ml . de agua que c o n ten

gan a l rededor de 0 .1 % de ácido oxálico , e n un Erlenmeyer de

100 m~ . y se v a lora . La s o luc i ón problema o l a d ilución co -

rrüspondi e nt e de l a misma con tenida e n la bur eta se ac i difi -

c a as imis mo con ácido oxálico .

Comprob a c i ón de los Compr i midos de Dic lorofenol- Indofenol .

Debe comprobars e periódicamente e l po de r oxidante

de los comprimi dos de diclorofenol -indofeno l , que s e c onser-

va durante a lgún tiempo e n el laboratorio . Si disuelve un -

comprimido e n v einte mililitro s de agua (20 mI . ) se a ci d i f i-

ca con ácido oxálico y se valora con una s o lución de c al i bra

ción recientemente pr epara da que cont e nga una cantidad exac -

tamente pesada de ácido ascórbico (es muy eonve ni e n t e emple -

ar por e j emp lo 1 mg . X 20 ml . ) .

Los e rror es anal í ticos debido s al bajo título de -

los c omp rimidos pUE'den e vit arse de la forma siguiente : se

 23-

añade a la s oluci6n problema un exceso do diclorofenol-indo

fenol (por ejemplo :" 20 mI . de una soluc i 6n de cinco compri-

midos de diclorofonol -indof enol en 100 mI . de agua) y el e~

ceso de diclorofenol - ind of e nol se v a lora con una soluci6n -

de ácido aso6rbico de conc8ntrnci6n conocida . En un exper i

mento en blanc o o t8stigo , se determina e l volum en d e la s o

luci6n de ácido asc6rbico que equi v ale a 20 mI . de la solu-

ci6n de diclorofeno l - indofeno l . Si l a concentraci6n de la

soluci6n Patr6 n tie ácido asc6rbico empleada es de 0 . 0 5 Mcg .

X mI . la concentr~ci6n e n vit Rm ina C, de la muestrR proble -

ma e s: (Vb - Vs) X 0 . 05 = mg . de ácido asc6rbico en el volu

men emp l Gado do la soluc i 6n prob 1 8ma .

Donde Vb = volume n de l~ soluci6n de ácido asc6r -

b ico consumi da on l a v a lora ci6n t est i -

go y

Vs = volumen de l a soluci6n de ácido as c 6rbico --

utilizado Gn la valor a ci6n de l a mues -

tra e

Si e l cont e n i do e n ácido as c6rbico de ln muestra

es bajo , deb e e ~p l e a rse una s oluci6n de calibraci6n de áci -

do 2.sc 6 rbico ?n r qlel ar~e nte dilu í da ( po r e j emp lo: una solu -

ci6n que cont ~ nga 0 . 0 1 mg . de ~cido as c6rbico por ml . ) , ( 1 8 . )

 24-

METODO MIeROBIOLOGIeO

Valoraci6n Volum~trica de l a Vitamina "e" despu~s del Aisla -

mi e nto de ln misma por eromatogra~ía sobre Papel .

El ácido asc6rbico se separa de otras sustancias -

reductoras acompañant es mediante cromatogra~ía sobre papel .

Se recorta la mancha correspondiente al ácido asc6rbico, se

extrae l a p i eza de papel con soluci6n de agua - ácido oxálico

y el ácido asc6rbico aislado de esta manera se valora con di

cloro ~enol -i ndo~enol 0 . 001 N. Para determinaci6n del conte-

nido total en vitamina "e" se reduce con ácido sul~hídrico ,

antes de la valoraci6n , el 1cido dehidroasc6rbico que puede

hallarse presente . Este m~todo es espe cí~ico para la vitami

na "e" y por t~nto es particularmente adecuado para su valo-

raci 6n e n alimentos y otros productos que contienen una can-

tidad desconocida di~ícilmente determinable de sustancias re

ductoras int er ~erentes . Pueden detectarse cantidades del or

d en de 2 - 3 Mcg . de ácido asc6rbico . La cantidad más pequeña

que puede determina rse cuantitativamente mediante este pro c~

dimiento e s de alrededor d e quince Mcg ., (15) .

Crom atogra~ í a e n Capa Fina .

El ácido asc6rbico tambi~n puede separarse de sus-

tancias reductoras interferente por cromatografía sobre pla-

cas de silica-ge l. Si se emplea agua como disolvente de de-

sarrollo el valor de Rf del ácido asc6rbico , es de 0 . 96.

Cua ndo se emp l ea metanol como líquido de desarrollo el ácido

dehidroasc6rbico puede separarse perfectamente del ácido as-

 25-

c6rb ico , ccn unos valores de Rf , ap roximados de 0 . 85 y 0 . 7

rGspGct iv ~mc nt e . Sin embargo, la expe ri encia adquirida ha~

ta l a fecha h · demostrado que e l m~todo de cromat ograf ía en

capa fina no es ?p r opiado pa r a e l anális is cuantitativo de -

bido a que s e pierde una c ~nt i dad muy apreciable de ácido -

a sc6rbico en l a croma toplaca .

React ~vos.

Acido L (+) - Asc6rbico G . R .

Acido oxálico G . R .

Soluci6 n e áci do oxálico al 1 %, 10 g . de ácido

oxálico G. 2 . se d isuelven e n agua h ast a 1 000 ml .

Acetato s 6 d ico anhí dro G . 2 .

Dias taza con una capaci dad sa c a rificante (f ormadQ

ra de ma lto sa) de 1:250, como mínimo .

Papel de filtro Schl e iche r & Schull Nº 2043.

1 butanol 2r? cromatografí a .

Ci a nuro potásico G . R .

Di so lvc ntG par a cr oma to g r a fí a sobre pape l: se di -

s uelven 2 g~ de áci60 oxálico e n 60 mI . de agua . La solu -

ci6n s e agita con cua rent a mI . de butanol .

 26-

Una vez separada las dos capas la fase inferior

(acuosa) se elimina. Se añade en la capa superior (orgánica)

algunos gránulos (1-2 mg.) de cianuro potásico y el líquido -

obtenido se emplea como disolvente para el desarrollo cromato

gráfico.

Heptamolibdato am6nico G. R.

Soluci6n de hidr6xido am6nico al 1 %, 40 mI . de la

soluci6n de amoníaco mino 25 % (d= 0 . 910) G. R . se diluye con

agua hasta un litro.

Soluci6n madre de citrato: 21.014 g. de ácido c{tri

co se disuelven en agua en un matráz aforado de 1000 mI. se

añade 200 mI . de hidr6xido s6dico 1 N Y la soluci6n se diluye

hasta la s eña l de aforo con agua , Tamp6n ácido clorhídrico-el

trato s6dico pH 3 . 8: se mezcla 51 . 9 mI . de la soluci6n madre -

de citrato con 48 . 1 mI . de ácido clorhídrico 0 . 1 N. React ivo

para e l revelado (r eacci6n coloreada) 150 g . de Heptamolibdato

am6nico se disuelven hast~ un litro en soluci6n dehidr6xido

am6nico al 1 %.

Ant es de su empleo, se mezclan 3 mI. de esta solu -

ci6n con 2 mI . de tamp6n ácido clorhídrico citrato s6dico pH -

3.8 y tres gotas de ácido sulfúrico 95-97 % (densidad = 1 . 84)

G. R.

Soluci6n de 2.6 diclorofenol-indofenol 0 . 001 N. :145

mg, de 2 . 6 diclorofenol-indofenol G . R. se disuelven en 50 o

100 mI . de agua a 50 grados c ent ígrados.

 27-

La solución se e nfrí a y diluye hasta 1000 ml. en

un matráz aforado . S e determina s u f a ctor e mpl eando una so -

lución r c ci v nt ~me n te prepa r ada de áci do ascórbico .

Pape l i nd ic~dor espe cial pR . 0.5- 5 . 0 -.

M ~ t o do de E xtr~ cción .

Las muestras se c ~s se extra e n c on la solución de -

áci do oxá l ic o al 1 %. Las que co ntenga n agua se d isgr egan -

en un homogeniz ador me cánic o adicionando solución de á cido -

oxálico Ql 1 %o ác ido oxá lic o sólido ( en una pr oporción de

a lrededor de l 0.1 1, en pes o , de l a mu e stra de par ti da ) . De

estG modo se co nsigu e la extrac ción s i multánea de l material

problema . S egón l a c o nc e ntr Rció n de áci do as córbico que se

prev ea c ont i ene l a mu es tra , se expr im e una c a nti dad mayor o

menor ~el homogenado obtenido (por e j emp lo: a tr av~s de un -

p a ño de l ino ) o se d iluy e c o n agua en un matráz aforado has -

t e un volumen con cido y , fi na l me nte , se filtra o c entrifuga .

LQ solu ción tran sparente obt e nida qu e s € aplicará a l papel -

cr o~lntogr ~ico , debe contene r al ededo r e 15 - 40 mg . de áci -

d o as có rbico en u n volurr.:er: '-e 20 - 60 mI .

Para v a l orélr la vitamina "C" en patatas c o ci das ,

se a p l ~s t an y mezc l an Q~OS 300 g . ce pRt~tas to davía c a li en-

t es . La ~asa obte ni d~ se c o loc a e n un mez clador me cánico,

 28-

se añade un poco de ácido oxálico y 3 g . de diastasa y la -

mezcla se homogeniza durante un minuto, haciendo pasar una

corriente de nitr6geno . La adici6n de diastasa produce una

fuerte degradaci6n del material , que puede exprimirse des ~

pués de dejar reposar la mezcla durante quince mintuos . Los

zumos obtenidos se centrifugan y se emplean directamente pa

ra la cromatografía sobre papel, (15).

Cromatografía Sobre Papel.

Se aplica el procedimiento de desarrollo descende~

te. Se sitúan en la línea de base 20-60 mI. del extracto

oxálico preparado tal como s e ha descrito . Puesto que la -

cromatografía sobre papel se emplea normalmente con fines -

cuantitativos , debe emplearse una jeringuilla micrométrica

(por ejemplo: j eringuilla micrométr ica "AGLA" BURROUGHS & -

Co . Londres Inglaterra) para aplicar las soluciones proble -

ma al papel cromatográfico .

Si la concentración en ácido asc6rbico es muy baja,

de tal modo que deben emp l earse volúmenes mayores de los 60

mI. para que se cromatografíen de 15 a 40 mcg. de ácido as -

c6rbico, es preferible aplicar la soluci6n en banda de 3 a 4

cm. de longitud sobre la línea de partida . Se depositan go-

titas de soluci6n a 10 largo de la banda, a intervalos re~

lares de unos 2 mm . Cuando de este modo, se ha completado

la longitud total indicada, las gotitas se aplican, en una

segunda ronda, comenzando de nuevo por el mismo extrc~lo y

situand61as en los espacios que han quedado vacíos en la

 29-

p rim r a e Cuando s e sigue este p roc ed imi e nto no deben empl~

a rs e volúm0neo mayores de 0 .1 mI . de l a soluci6n p r ob l ema .

Como manc ha de r e fer en ci a se usan 20 mI . de áci d o as c6 rb ico

al 0.1 %( = 20 mc g . de ác ido as c6rbic o ), que se ap lic an -

sobr e l a líno a de D~r ti da a 3 c m., co mo mínimo , del lug ar

donde se ha de os i tado l a soluci6 n p r ob lema , b i e n sea e n

banda o en punt o .

Vitamina " C" Tota l .

Cu ~ ndo se de s ee a na lizar e l c o nt en i do t o t al en vi

tamina "C" , e l ác i d o dehidroa sc6rb ico p res en t e debe reducir

s e previam e nte ~ 1cido a sc6rbico . Se añade acetato só d ic o

c ristalizado a l extract o o xálic o de l a muest r a , h as ta que -

l a so l u ci 6n tenga un pH de 3 . 5 . A c ont inua ci6n, se hace p~

s a r una c orri en te de ác i d sulfhí d ric o durant e quince minu-

t os y se deja r eposar la so luci6n d urante toda la n oche ( o

durante doce horas , c omo mínimo ) a l r e sgua r do de la luz se

ap lic an a línea de part i da , ta l c omo se ha des c rit o a nte

ri o r mont e , ent re 2 0 y 1 00 mI . de l a soluci6n resul tant e .

Si se desea conocer tan to e l contenido e n áci do -

as c6rb ic o como en vitamin8 "C" t o t ".l l, puede n ap lic 8 rs e di -

r ect~mente en el mi smo papel cr orna tográfic o l n s soluc iones

pre para .:ins ~)ara el aná li s i s de ácido as c6rbico (sin reduc -

ci 6n) , vitamina "c" tot ~ l (c on r educ c i6n y la soluci 6n de

referenc i a de ácico n sc6rbico ~l 0 . 1 %. Es aconsejable ap li

c ar l as t r es soluciones él un segundo pape l y de sarr o llar

l os dos crcmntograrnas simultán 2ame nte en l a misma c ámara

cr oma. togr .fic:? .

 )0-

Con el fin de evitar pérdidas por descomposici6n _

cuando l as soluciones se conserven durante mucho tiempo, el

extracto para el análisis de ácido asc~rbico y la soluci6n

de ref e rencia no deben prepararse hasta el día siguiente, -

cuando pueden aplicarse sobre el papel al mismo tiempo que

la muestra preparada para el análisis del contenido total -

en vit amina "C" , (es decir , después del tratamiento con áci

do sulfhíd rico) .

Revelado .

Los cromatogramas se de sarrollan d urante cinco - cin

co y media horas, aproximadamente, empleando la técnica de

desarrollo descendente y los disolventes descritos en el

apar t ado" REACTIVOS" . El pap el se seca en estufa a lOOºC du

rante uno - dos minutos. La banda de r e ~erencia (que contie-

ne el ácido asc6rbico puro) se recorta, se pulveriza con el

reactivo de heptamolibdato y se deseca de nue v o a 100ºC ha~

ta que aparece la mancha azul correspondiente al ácido as -

c 6rbico . Se recorta (n) la zona (s) de papel de la frac

ci6n no pulverizada del croma tograma que corres p onda (n) a

la mancha de ácido asc6rbico detectada en la banda de refe-

rencia revelada. Si exite más de una línea de desarrollo -

en el papel ( por haber aplicado varias muestras simultánea-

me nte) debe prestarse una espe cial atenc i6n para que el área

de l as zonas rec o rtada s sea exactamente igual .

Valoración .

Cada trozo de papel se recorta en trocitos pequeños

que se situán en los respectivos matraces Er l enmeyer de poca

capac i dad , que contienen de 5 a 10 mI . de una solución acuo -

sa de ácido oxálico a l 0 .1 %, aproximadamente .

Se hace pasar una corri ente bastante fuerte de anhi

drído carbónico y los matraces se agitan durante dos -tres mi

nutos para extraer el ácido ascórb ico del papel . Se lava e l

extremo del tubo empleado para el paso de la corriente de

gas c on un poco de la soluci6n acuosa del ácido oxálico a l -

0.1 %y el extracto se valora en el mismo matráz con 2 . 6 - di -

clorofeno l-indofeno 1 0 . 001 N (dis puesto en una microbureta -

de 1 mI . ) hasta alcanzar el punto final (c oloraci6n d~bilmen

te rosada) . Los trocitos de papel permanec en en el matráz -

empleado para l a valoraci6n . Se rec rta un trozo del pape l

emp l eado en la cromatografía , de idéntic o tamaño que los an-

teriores, se extrae t a l como se ha descrito y se valora c on

2 - 6 dic10rofenol - indofeno l 0 . 001 N , con e l fin de estable cer

un Qvalor testigo, que se sustrae de las determinaciones pr~

b1ema y patr6n . El papel empleado para la prueba en bl a nco

no debe contener , desde lu ego , s ust anc i a alguna de la solu -

ción problema (Fi g . J I )

Figura JI va10raci6n de l ácido asc6rbico por cr oma -

tografia sobre pape l (diag rama) .

St o linea de partida .

Rs . banda de referencia (s e recorta y se revela).

 '2-

Rs ARTA
ST
I
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r;:;..
VJ:) }\rr·d,.
¡1"\:· O·.: a Ase

I
I

El o
F i Gur a 31

A ! TI. , TA : cr omo::!. t ogrnr.ms de ácido as c6rbic o .

(A), sol' ci 6n ce r 3 ferencia ( R ) y áci do asc6rbico

total (TA ) . Las z ~n~ s S Q roo 0 rt~n , se eluye n y se v a l a r an .

El: ár ea de ~ry 1 qu e s e rec o rta y v a lara e n c a l i -

dad d e t est i go .

1 mI . de 2 - 6 c'i cl orofe n o l - inc.l ofenol 0 . 001 N . , equ.!

v a l e a 0 . 0 88 mg . do ~ci do as c6rbic o .

Co mo comprobaci6n a~ icional , l a soluci6n de refe -

r enc i n. de ácido a sc6rbic o _ u ede a r lic ;-:-¡ rs e en d os p untos ,

d iatinto s ~e l pap el cr omatog r~fic o . Una de l a s b a n da s se -

p ulverizn y r e v el~ , y l~ otra se e luye y valor~ d el mismo -

m~d0 q u a In rnu as tr ~ , ~mp leán dcne c ~ mo referenci a , (15) .

 33~

Va10raci6n de l Acido Asc6rbico en Presencia de l Acido Sulfu _

roso en Vinos y Mostos .

Consideraciones Generales .

En los últimas años el ácido asc6rbico se viene en

pleando , de forma progresiva , como agente ant i oxidante en mos

tos sin fermentar y vinos espumosos .

Era de interés, por tanto, poder disponer de un m6

todo sencillo para el análisis de l ácido asc6rbico en presen-

cia de ácido sulforoso libre . La pr incipal dificultad estrib~

en que la v aloración oxidimétrica del ácido nsc6rbico propor -

ciona cifras demasiudo e l evadas en p resencia de ácido sulfuro

so libre . Aunque l os métodos fotométricos son considerable -

mente más específicos , requieren el empleo de aparatos espe

ci a 1es ( por ejemp lo: f o t6metro o c o lorímetro) y poder d is po -

ner de personal técnic o capacitado en el análisis, l o cual ex

c ede , normalmente, de las dotaciones que para fines analíti -

c os existen en las bodegas de vino y mosto sin fermentar. Por

esta r azón , l os p ro ductores de vino precisan un método senci -

llo, tal c omo la val ora ci6n oxi dimétrica.

Kielhofer y Aumann , valoran e l ácido asc6rbico con

yodo 0 . 02 N., reactivo que h a sido ampliamente utilizado para

la determinaci6n vol~nétrica del di6xido de azufre. El acido

sulfuroso se bloquea por adici6n de acetaldehido . De este co

do el volumen d e y odo 0 . 02 N , c onsumi do corresponde a la can-

tidad de ácico ascSrbico y a otras sustancias reductoran.

~?arte del ácido sulfuroso que se encuentran en el vino o mOF

 34-

too El Ilvalor resi d u a l de re d ucción" , c a lcul ado c omo ácido

a scórbic o , e s .::~ e a lr ecle~or d e 10 mg . /li tro pa r a el vino blaE;

co y de 1 5 mg . / l i tro a p r oximadam e nte p ~ra mos t os ce manzana

y uva , v alores que se sustraen de la cifra total obtenida en

l as valoracione s c o n y s i n ad ición de a cet aldehi do .

El m~t od o ha sido mejora do por Schne y der y Ka in,

que han reemplazado el empleo del ace t aldehido volátil (P. -

ebullici6n 21º-22~ C.) por el de aldehido pro p i6nico (p . eb~

llici6n, alrededor de 49 Q C.) d e manejo mucho más sencillo .

Reactivos.

Solución de acetaldehido: se mezcla 1 mI . de a c e -

taldehido recién desti la do con 99 ml . de a g ua . Esta solu --

ción debe prepararse extemp oráneamente . So l u ción de prop i o -

naldeh i do: se mez c lan 1 0 rnl. de a l dehi do p ropi6nico reciente

mente dest ilado con 9 0 mI. de agua .

Aci d o s ulfúric o dil uí do (2N aprox.): se aña de 56 -

mI . de áci do sulfúrico 95 - 97 %( d=1. 84 ) G . R . a 800 mI . de

agua , enfri ando y agitand o.

La solución se d iluye hasta un litro con agua .

Yodo 0 . 02 N : 100 mI . de yodo 0 . 1 N se disuel v e n

hasta 500 mI . c on agua en un mat ráz aforado . Esta so lución-

de yodo aproxima damente 0 . 02 N , se comprueba y normaliza, de

la forma habitual , con solución de t iosulfa to sódico , solu -

 35-

ci6 n de almid6n: 1 g . de almid6n soluble G . ~ . se hierve

con 200 mI . de ~gua . Se añ~den a la soluci 6n, en calidad -

de c ons e rva Qor , unos rng . de yoduro mercúrico .

M~ todo.

S e añaden 5 mI . de l a soluci6 n de acetaldehi d o o 2

ml ~ d l a de al ehido propiónic o a 50 mI . de vino o most o -

dispuGstos cn un matráz Erlenme y e r de 200 mI . de capacidad .

Se mezc l a i ~Dr imien do al m3tráz un li gero movi mient o rot at2

r i o , p8ro , co n el r.in ~c evitar la absor ci6n do oxí geno at -

mosf rico , debe r Ga liznrs e de forma muy suave , sin agitac i6n.

Transcur~i d os ¿ iez minutos , la mezc l a se a cidifica con 2 mI .

de áci do 3ulfúric o d iluído, s e ~ñade 1 mI . de l a soluci6n de

a l mid6n y se proco~e ( la valoración con yodo 0 . 02 N, hasta

que l a colo rac i6n azul pers i s ta durante medio a un mi nuto -

(volurr en e~pl G aio = a mI . ) .

Cálculo .

35 . 2ª - 1 0 = mg . de ácido asc6rbico por litro de -

vino o mosto .

10 = v alor r CG i ~u~l ce reducci 6n en el c as o de l v i

no .

Determinaci6n c'e "S02 Li bre" .

Para dotermi n'1r e l anhí dr i d o sulfuroso libr e , se -

 36-

añaden 2 mI . de ácido sulfúrico diluído y l mI. d~ la solu -

ci6n d e almid6n a otros 50 mI . de vino o mosto, que se valo-

ran con yodo 0 . 02 N, tal como se ha descrito anteriormente -

(volumen empleado = b mI . ).

Cálculo.

12 . 8 (b - a ) - 4 = mg . de S02 , libre por litro de

vino o mosto.

4 = Valor residual de reducci6n en el vino.

Análisi s Fotométrico del Acido Asc6rbico con 2-Nitroanilina-

por el Procedimi ento de "MOHR".

Fundamento .

-- El ácido asc6rbico se convierte en la 2-nitrofenil

hidrazina del ácido oxálico por tratamiento con 2- nitroani-

lina diazoada. En presenci a de un exceso de soluci6n de hi-

dr6xido s6dico este compuesto forma una sal s6dica de color~

ci6n rojiza-violeta. El máximo de absorci6n a 540 mm . se mi

de fotométricamente, (16) .

Sensibilidad .

La sensibilidad y especificidad del método pueden

incrementarse considerablemente extrayendo el producto de

reacci6n de l a soluci6n ácida-con isobutanol y transfiriendo

 37-

l a sa l s6 d i ca de s de l a f a s e i s obutan6lic a a l a a c u os a con s o

l uci6 n de h i dr 6 x i d o s6dic o . Co n es ta mo d ific a ci6n p u eden ana

li zar oe c uant i ta tivame nt e can t i dades muy reducida s ( de l ord en

de 0 . 5 mg . de ác i d o as c6 r bic o por mI . ) , mi e n tr25 q u e si la -

r ca cc i6n se r ea l i z a d ir e ct a me nt e s in ext r a cción se pr e ci sa -

una c onc cnt raci6 n de 10 mg . de ácido a s c 6rb ic o p or mI . co mo

, .
ml n l mo .

Esp e c i fici dad-.

La prcseúc i a de ot r as vit aminas , c ompues tos sulfhi

d ril i cos , á ci do s u lfuroso y otra s su stanc i a s que int erf i e r e n

l a v a l ora ci ón oxi d imétric a , nc i nfluy e cua n d o se p racti c a el

aná li s i s fot o métr ic o con 2 - ni tro3 nilina .

Ap lic a ci ones .

E l mé todo es adccu2 do para e l a n á l i s i s de áci do a s -

córb ic o en fruto s , zumos de f r ut a , a liment o s pre tra t ado s su -

p l ement ados c on ác i do a scórbic o , et c., y en p r eparaci ones f a E

ma c ó utic a s . Alli,que e l pro c edi mie nt o des c r it o p o r MOHR (ex - -

tra cci 6n c o n is obut ano l ) es de ap l i c a ci 6 n gene r a l , p u ede e m -

p l ears c e l mé todo simp lifi cado (sin extra cci6n) c uando l as so

l uci ones o ext r a ctos so n tran s parent e s , inc o l oros o , a lo su-

mo , de t ona li dad d ébilme n te ama rill e nta .

Vit am i na "C " T ota l .

Para e l a n á lis i s de la vi tam i na " r<

v " t ota l (á c i do as -
 )8-

c6rbico + ácido dehidroasc6rbico) el ~cido dehidroasc6rbico

presente debe re ducirse previamente a ~cido as c6rbico con .-

ácido sulfhídrico, ya que con este m~todo se determina ex -

clusivamente el derivado reducido. Sin embargo e l análisis

fotom~trico que emplea 2 . 4 dinitrofenilhidrazina, es más

apropi ada para la determ inaci6n de l a vitamina "e" total.

Reactivos .

React ivo de 2-nitroanilina: 0.4 g. de 2-nitroanili

na para la determina ci6n fotom~trica del ácido asc6rbi co se

disuelven en 20 mI. de ácido ac~tico glacial aprox . 96 %

( d = 1 . 055 - 1.064) G. R . La soluci6n obtenida se diluye -
hasta 250 mI . con ácido clorhí dr ico al +0 %( 600 mI . de --
agua + 400 mI. de ácido cl orhídrico min o 25 %y d = 1.122

1-.124- G. R . ). Esta soluci6n se conserva durante largo -

tiempo.

Nitrito: se disuelven en 25 mI. de agua 0.02 g . de

nitrito s6dico G . R . en barritas .

Reactivo para Diazoaci6n .

Se mezclan 5 mI . del reactivo de 2-nitroanilina con

5 mI . de l a soluci6n de nitrito y con 10 mI . de una mezcla -

de volúmenes igual es de isobut anol (empl eado en el análisis

de l a vitamina B ) y de etanol absoluto G. R.

l
 39-

Hi dróxido Sódico 0 , 5 N.

Solución de hidróxi do sódico al 10 %. Un a parte , -

en peso , de hidróxi d o sódico puro G . R . (lentejas) se disuel

v e en nueve partes de agua (volúm en) . Soluci6n de ácido oxá

lico: 5 g . de ácido oxál ic o G. R. se disuelven en 1000 mI . -

de agua .

Soluc i6 n de ácido as e rbico . Exactame nte 100.0 g.

de éci do L (+) - as c6rbic o G. R . se disuelven en alrededo r de

1 00 mI . de la soluc i6 n de ácido oxál ico al 0 . 5 % en un matráz

aforado de 250 ml . Se d iluy e h as ta l a señal de aforo c on la

misma soluci6n .

Etanol absoluto G . R .

Is obutanol (para e l análisis de vitamina B ).

l
2 . 6 - d icl orofenol -i ndofenol sódico G. R .

Eter de pe tr61eo • Bencina de p e tró leo G. R . (inteE

valo ce •e = 40 -7 0ºC . ) .

Papel i nd ic ador universa l de pH 1 -1 0 con es c a l a co-

l orea~a .

1 0 . ) Pr ocü~ imiento simplificado para el análisis de

~cido ascórbico en s o lucio nes transparentes, inc oloras o d' -

bilmente amari l l entas .

Las mue stras sólidas se ext ra en con la cant i dad su-

ficiente de ácido o xálico al 0 . 5 % para proporc i onar una con

 40-

centración de ácido asc6rbico comprendida entre 0.2 y 2.0 -

mg . en 5 mI . Las muestras líquidas se diluyen hasta la mi~

ma concentración de ácido ascórbico , adicionando ácido oxá-

lico de tal moco que la concentración del mismo en la dilu-

yación final sea, aproximadamente, del 0 . 5 %.

Solución Problema .

Se p i petean , en un matráz aforado de 200 mI . de ca

pacidad 2 mI . del reactivo de 2-nitroanilina y 2 mI . del

reactivo de nitrito. Se me zcl an las soluciones y transcu -

rrido un minuto aproximadamente, se añade 75 mI . de etanol

y 5 mI . de la solución problema de ácido oxálico di luí do . -

Se mezclan inme diatamente . Despu~s de cinco minutos se aña

den 25 mI . de la soluc ión de hidróxido sódico al 10 %. La

mezcla se diluye hasta la señal de aforo con agua , se mez -

cla y se valora en una cubeta de fotómetro de 2 cm . a 540 -

mm . o empleando el filtro apropiado frente a un blanco que

contiene 5 mI . de áciGO oxálico al 0.5 %y todos los reacti

vos emp l eados en la determinación problema diluídos, igual-

mente hasta 200 mI . en un matráz aforado.

Solución de Referencia .

Al mismo tiempo , se prepara una solución de re fe -

rencia que tenga aproximadamente la concentración de ácido

ascórbico prevista en la soluci6n problema. Se trata de --

forma i d~ntica a la de scrita para la muestra . En lugar de

 41-

5 mI . de soluci6n problema, pueden emplearse , por ejemp l o: -

0 . 5 mI . ( = 200 mg . ) 1 mI . ( = 400 rng . ) , 2 mI . ( = 800 mg . )

6 ~ mI . ( 1 . 6 mg/ . ) d e la soluci6n de ácido asc6rbic o .

E . Muestra X mgs . de áci d o as c órb ic o en l a soluc i ón referen c ia

E . Referencia mgs . de áci do as c6rbico en so luci6n prob l ema .

Curva de Calibra ci 6n .

Si el m~to ¿ c se ap lic Q al análisis rutinar i o , es -

más c onvenio te c o nstruir una c urv a de c a1 i bra ci6 n mi d i endo

d ive rs a s soluc i ones de áci do asc6rbic o de c onc entra ci6 n pro -

gres i va (por e j e~p lo: cont eni endo 200 , 500 , 1 . 000 Y 2 . 000 mg .

de áci do asc6rbico) en lugar de e mplear una s i mple s olu ci6n

de r eferencia . L~ s medi ¿a s s e r ea lizan fr en te a l a soluci6 n

t est i go o blanc o . Los valor e s c e extinci6n forman una linea

recta , (1 5) .

Ba jas Conc ent r a ci oúe s .

Si l a sclu ci6n ( extracto) probl ema c ont iene menos

de 40 mc g . ( pe ro 1 0 ~ c g . mí n i mo) d e ácido as c 6rbic o por ml.

deben a -adi rse ~o 10 6 20 m1 . de l a misma eh l u ga r d e l os 5

m1 . emp l eados ante ri ormente a la mezcla de l r ea ct ivo de 2-ni

troani1ina n it rit o y etan o l. A continua ci6n se procede tal

c o~o se la ues crit 0 . La c o nc e ntrac i6n de l á ci do oxál ic o en

l a s oluci6n c~e referencia de b e hacerse i g u al a l a de l a so l!:!;

ció n problema me~ i ante l a ade cuada adici6n de soluci6n de

 42-

ácido oxálico al 0 . 5 %. Por ejemplo: si se emplea JO mI.

de una solución problema que se espera contengan 200 mc g . -

de ácido ascórbico , se añaden a la solución de referencia

0 . 5 mI . de solución de ácido al 0.04% y 19 .5 mI. de la solu

ción de ácido oxálico al 0.5 %.

Procedimi ento General según MOh~ .

Extracción.

Las muestras sólidas se extraen con un volÚIDen tal

de l a soluci6n de ácido oxálic o al 0 . 5 % que proporcionen -

una soluci6n cuyo c ontenido sea , como mí nimo de 0 . 05 mg •. de

ác i do asc6rbico en un volúmen que no excede los 90 mI . de -

so l u ci 6n . Las muestras líquidas (por ejemplo zumos de fru -

tas) se tratan c on l a cantidad sufic i ente d e ácido oxálico

(sóli do o en soluci6n concentrada) , para proporcionar una -

conc e ntración del 0 . 05 % en la soluci6n empleada para el

análisis . Algunas veces es conv eniente filtrar las solucio

nes que contienen ácido oxálico antes de realizar la deter -

minaci6n .

Valoraci6n Aproxi mada, Determi naci6n Principal, Testigos.

La concentraci6n aprox imada de áci do asc6rbico se

determina por v a lora ci6n con 2.6 diclorofenol -indofenol ,

por ejemplo: se miden con una p i peta 10 mI . de la soluci6n

prob l ema y se valoran con diclorofenol -indofeno l 0 . 001 N o

con una solución dü un compr imido de diclorofenol-indofenol

en 50 ml . de agua. De acuerdo con los datos proporcionados,

se coloca en un matráz aforado de 100 mI. un volumen de la

solución problema que equivalga a una concentración compren-

dida entre 50 mg . (como mínimo) y 500 mg . (como máximo) de -

ácido ascórbico . Si por ejemplo , la valoración aproximada -

de los 10 mI . de la solución ha ind i cado que contienen unos

80 mg . de vitamina C ., la cant i dad de solución que debe dis-

ponerse en el matráz aforado puede ser de 50 mI . ( = 400 mg .

de ácido ascórbico) . En otros dos matraces aforados de 100

mI . se coloca el mismo volumen de la solución problema ( 50

m1 . en el ejemplo dado) para la determinación aditiva (A: pa

tr6n interno) y para la prueba en blanco (B). La solución M

se diluye hasta la señal de aforo , c on agua. A la solución

A se l a añade el volúmen de la sol u ción de ác i do ascórbico -

que corresponda a la cantidad determinada en la va10raci6n -

de t a nteo inicial (en nue stro ejemp l o 400 rog . = l mI . de la

soluci6n ue ácido asc6rb i co) . La soluc i 6n B se trata con 5

m1 . de una soluci6n que c ontenga 0 . 2 g . de 2 . 6 diclorofenil -

i ndofenol só d ico en un litro de agua para oxidar e l ácido a s

c6rbico presente . A continuación, l~s soluciones A y B se -

diluyen as i mismo, hasta la señal e aforo con agua . A par-

tir de este momento las tres soluciones se tratan del mismo

modo . Se agitan y se vierten en los correspondientes embu

dos de separac i6n (directamente, sin adi cionar líquidos de

l avado) y se extraen primeramente con 50 mI . de isobutanol y

luego con 50 mI . de ~ter de petr6leo . Se e l iminan las capas

orgánicas , 50 mI . de cada una de las fases acuosas se tratan

con 2 mI . del reactivo de diazonio en otra serie de ampollas

de decantaci6n y se dejan reposar durante 5 minutos . Se ex-

traen ahora con JO mI . de isobutano1 y 25 mI . de cada una de

 ti,,,.. t "·.H'/\ L' 0[' EL ~J'~'¡~ uVto(
l ------- --

44-

l as fases orgánicas se agitan c on 5 mI. d e hidr6xi do s6dico

0 . 5 N" las ext inciones ce las c apas acuosas de c olora ci6n

rojizo-violeta pro ce ~entes ~e la d et e rminaci6n pr i nc i pal

(M) Y de la prueba a c1itiva (A) se mide a 540 run ., frente al

blanco (B) en un espectrofot6metro o en un fot metro con el

filtro apropiado , (15 , 16 , 19) .

cálculo .

(A X Em) C
= mg . por 1 00 de áci do as c6rbic o .
10 (EA EM)

donde A = ácido as c rbico él. ~adi ··lCJ en Plg .

E m= extinción del análi s i s principal (M)

EA = ext inci6n de l a p rueba aditiva

c = núme ro de gra mos ,·:'2 la muestra que co -

rresponden ~l volum ~ n de la oo lución -

roblema ( extra cto) lGl que se 22. ;::>ar-

tido .

Observaciones .

E m. debe hallarse c:)mpron(li (.~a, e n lo p ", sible, c1en-

tro de l int orv alo do 4/10 a 6/10 de In extinción prop ia de -

la determinación a~it iva . Si este requisito no se cumple t~

talmente , d ebe re et irss el ~n~l isi s empleando una cantidad

di f e r ente de s oluc i6n de ácido ascórbico o un volumen d istin

t o de la s o lución p r o blema .
 Al extraer el pro d ucto de reacci6n de la ~ase iso-

butanó1ica con hidróxido s6dico debe prestarse una especial

atención , aseguránd ose de que el extracto acuoso es cierta -

mente alcalino . Si ~uera ácido, no se lograría la completa

extracción de la coloración rojizo-violeta. En este caso, -

se añade una gota de hidróxido sódico al JO %, se agita la -

mezcla, se comprueba con papel indicador universal el pH re-

sultante y se repite el tratamiento hasta que la ~ase acuosa

sea alcalina.

Las soluciones ~inales acuosas y alcalinas (M, A Y

B) se enturbian con frecuencia después de su separación en -

las amp ollas d e decantación. Esta turbidez se debe a minús-

culas gotas d e isobutanol que se separan a partir de las so-

luciones saturad as en este disolvente como resultado de pe -

queños c ambios e n l a temperatura (enfriamiento), y pueden

evit a rse o eliminarse añadiendo 1 mI . de etanol a cada una -

de las tres soluciones M, A Y B.

Análisis Fotométrico de la Vitamina "C" con 2 . 4 Dinitrofenil

hidrazina .

Fundamento .

El ácido dehidroas có rbico reacciona con la 2 . 4 di-

nitro~enilhidraz ina para formar la 2 . 4-nitrofenilhidrazina -

que se disuelve en un alto porcentaje de ácido sulfúrico or!

g inando una colo r ación rojiza . El máximo de absorción se ha

11a a 520-525 nm . El ácido as c6rbico reacciona únicamente -

 46-

después de su o xi d ac i6 n cuantit a tiva a áci áo dehidroasc6rbi-

co c on un agente oxi dan te suave . Const ituye un pr ocedimien-

to co mparativ amente senc i llo p~ra dete rminar tanto 8 1 ácido

dehidroasc6rbico como la vitamina "C " total.

El ácido 2 . 3 dioxo - L-gu16nico, producto de o x i da -

ci6n despr ovi sto de actividad vitamínica C, de l a mi s ma rea c

ci6n . La p resenci a de este compu es to puede determi narse a is

l adamente previa r educ ci 6n c on ác i do sulfhí d rico de todo el

á c ido dehid roasc6rbico pr ese nte e n l a mue stra , sustrayéndose

la c a ntidad resul tante de l c ontenido to ta l en vi tami na "C" .

La dete rmina ci6n del ácido 2 - 3 d ioxo - L - gu16nico 8S de po c a -

importar-cia prác t ic a , y a Gue su c ontenido en lo s p roductos -

n~ tura l e s es normal me nt e muy p equeño en co mpara ci 6n con e l -

á cido ns c6rb ico . Por e llo , no pr estaremos má s atención a es

t e producto en ~l nresente cap ítul o , (15, 1 6 y 1 9) .

Ox ida ci6n a Acido Dehi d r oas córbico .

ROE Y KUETHER tratan la soluci6n problema c on c a r -

bón activo (Norita) para convert ir e l ácido as c6 rbico en ác!

do dehi droas c6rbico . Tamb ién el bromo se emp l e a frecuente -

ment e como agente oxidnnte . No so tro s h emos comprobad o que -

el mejor rea ctivo que pue d e empl e ars e es e l 2 . 6 di cl orofe n ol -

ind ofenol, un agente oxid:1nte muy su .... ve in troduci d o ir..icial -

mente para e l método de l~ d ini trofeni lh i dra zina por Bolin y

Book .
 47-

Tiourea .

Para evitar la descomposición del ácido dehidroas-

córbico durante su condensación con la 2 . 4 dinitrofenilhi -

drazina , que requiere tres horas, se añade un poco de tiou-

rea a la solución . De este modo se proporciona un medio dé

bilmente re ductor que , al mismo tiempo, impide la decolora -

ción de la solución de 2 . 4-dinitrofenilhidrazina por cual -

quier producto de oxidaci6n que pudiera formarse.

Condensaci6n .

La velocidad de condensación entre el ácido dehidro

asc6rbico y la 2.4 dinitrofenilhidrazina para dar la osaxo-

na co rrespondiente se incr ementa con la temperatura. Roe y

Kuether realizan la reacci6n a 37ºC. ( tiem~o: tres horas) •

Schaffert y Kingsley y Polk y colaboradores, la llevan a ca-

bo sobre baño de agua hirviendo (tiempo: cinco-diez minutos) .

Sin embargo Ros , ha precisado que la glucosa, fructosa y áci

do glucur6nico reaccionan en proporci6n considerable a temp~

raturas que exceden lOs 37º C . de tal modo que se obtienen -

resultados anormalmente altos . Este error se produce inclu-

so a 37º C ., si la concentración de azúcares solubles es va-

rias veces superior a la de vitamina C., tal como ocurre en

jarabes, zumos de frutas, etc . Si las dinitro fe nilhidrazo -

nas de los azúc a res solubles se separan de la del ácido dehi

droascórbico por cromatografIa en capa fina, deja de tener -

influencia la temperatura a la cual tiene lugar el proceso d e

condensaci6n .
 48-

Aplic a ciones .

El aná li s i s f otomét rico c on 2 , 4 dinitrofenilhi -

drazina , es de ap lic a ción ge n eral , siempre que l a so lución

problema c ontenga como mínimo 2 mg . de vit ami n a C ., por mI .

Si l a medi da se re nl iza en microcubetas pueden determinarse ,

inclus o , c onc ent r a ciones menores . Sin embargo , dado que -

los métodos v olu métricos , de más sencilla ap lic a ció n , pro -

p orc i onan r esulta do s sat isfactorios en e l cas o de prepara -

ci o n es farmnce ú t i cas , el emp l eo de l método de l a dinitrofe

nilh i draz ina se reduce , ac tualmen t e , el análisis de la vi-

t amina C ., en mu est r as b i ol g ic as . Puesto que e l áci do

as c órb ic o debe oxidarse siempre a dehi droasc 6 rb i co antes -

de l a reacción con d ini trofenilhi d r az ina este método es

p~rticulnrmente adecu~do para e l análi s i s de v i tamina C . ,

total en lí quidas bia ló g i cos (sangre , o rina ) producto s ve -

get~les y ~ lim ento p i ensos .

Reac tivos .

S olució n de ácido oxá lic o : 5 g r . de áci do oxáli -

co se disuelve~ en agua hasta un litro .

S o luci6n de ácido a scórbico: en un mat ráz afor~

do de 500 mI . se d i suelven 50 . 0 mg . de á ci do L (+)- ascór -

bico G . R . en 1 00 mI . aproxi madamente , de la soluc ión de _

ácido oxálico . La solución obteni da se diluye h~sta l a s~

ñal de aforo con el mismo d is olvente . Una a lícuota se d i-

l uye de nuevo hasta l a concentración requerida par a e l ex-

 49-

peri~ento de referencia empleando la solución de ácido oxá-

lico .

Solución de ácido tric10roac'tico: ~2 gr. de áci-

do tric10roac'tico se disuelven en 100 m1 . de agua.

Solución de tiourea: se disuelven 10 gr . de tio-

urea G . ~. en 100 m1. de una mezcl a de volúmenes iguales de

etanol a bsoluto G. R . yagua.

Solu ción de 2,6 diclorofenol-indofeno1: 0 . 25 gr.

de 2,6- diclorofenol-indofenol sódico G. R . se diseue1ven en

100 m1 . de agua .

Eter dietilico G. R.

Solución de DNPH: se disuelven 2 mg. de 2 , 4-dini-

trofeni1hidrazina G . R . en 100 m1 . de una mezcla de tres -

partes (v/v) de agua y una parte de ácido sulfúrico 95 - 97 %

(d= 1 , 84) G . R . La disolución se realiza cuando la mezcla

está todavia caliente .

Acido sulfúrico al 85 %: se añaden cuidadosamente

y con agitación, 85 gr . de ácido sulfúrico 95- 97 % (d= 1.84)

G. R. a 15 ml. de agua, dispuestos en un recipiente enfria-

do en baño de hielo .

M6todo de Extracción.

Las mue stras sólidas se extraen con soluci6n de -

 .50-

ácido oxálico mediante disgregac ión mecánica ( por ejemplo en

un disgregacor - b~tidor eléctrico de cuchill as) . En algunos

casos, esp2cialrnente CUfln~o se trata de mate ri ales vegetales,

es aconsej~b l e hervir la solución de ácido oxálico (elimina~

do , de este modo , e l a ire disuelt o) y emp l earla cuan~o toda -

vía es tá caliente . Las Proteín~s se e liminan do l0s extra c -

tos v egeta l es y de l a s~ngre ( o suero) por adición de ácido

tricloroacético . La soluci 11. ele ácido oxálico se añade tam-

bién a las muectr~s líquidas (por ejemplo: zumos de frutas)

para estab i l i zar 1 áci do ascórbico . Si se espera que el

cont e nido en v it amina C . , ser bajo , puede añacir se a l a mues

tra liqui da l a c~ntidad sufic i ente de ácido oxá lico crista1i

z a do p~ra obtener una concentrac ión final de áci do oxáli co -

del 0 . 5 % aproxim~Jamonte . Una vez pr epa rada para el anál i-

sis , la solución (o extracto) se di luy e con la soluci6n d e -

ácido oxál i co hasta q ue la conc entrac ión de vitamina C ., se

halle cornore~di~a ent:e 5 y 50 mg . en 4 ml .

Oxidación .

S o añade u n exceso ee l a so lución de 2 , 6 dic10ro -

f enol - i nclof"e:lO l a u __ volúmen ao sup 'orior a los 50 ml . del

prob l ema en un~ a~polla de sepa r aci ón . Transcurridos dos mi

nutos, el üxceso ~e d iclorofenol - indofenol se e linina por e x

tra cci6 n con 50 m1 . de ~ter. La c apa ac uo sa so recoge en un

matráz aforado de In c apac idRd adecuada ( por ejemplo: 50 mI . )

y la f2S0 et~rca se l ava repetidamente con pequeñas po rcion e s

de ln solución dr 6ci~0 oxálico . Los líquidos de l avado se

emp l ean pnra ir completando el vo lumen del matráz aforado .

 51-

Una vez se ha ll egado hasta la señal de a foro-siempre con la

soluci6n de ácido oxálico se procede a filtrar si fuera nece

sario .

Condensación con Dinitrofenilhidrazina .

En dos matraces aforados de 10 ml~ se pipetea un -

volumen comprendido entre 1 - 4 mI . de la soluci6n de ácido de

hidroasc6rbico , que contenga una cantidad prevista de 5 - 50 -

mg . de vitamina C . Si se emp l ea un volumen inferior a lo s -

4 mI ., las soluciones se llevan a es te volúmen con la solu -

ci6n de ácido oxálico . Acto seguido , se añaden dos gotas de

la solución de tiore a a c ada uno de los matraces. Una de

las dos soluciones (determinaci6n principal , marcada con una

S) se trata con 1 mI . de la soluci6n DNPH y se agita: se man

ti e n e en un termostato a 37 QC . , durante tres horas y final -

mente se enfr í a en hielo durante diez minutos . La otra solu

ción (determ inaci6n en blanco BI) se enfr í a también en hielo

y se trata con 1 mI . de la soluci6n de DNPH . Las dos solu -

ciones se diluyen hasta l a señal de aforo con ácido sulfúri-

co a l 85 %- adic iona do en p orciones pequeñas y con ag ita --

ci6n simul tánea y se dejan reposar hasta l a temperatura am -

biente , (15 y 19) .

Soluci6n de Re f e r e ncia .

La soluci6n de refer e ncia, conteniendo una c ant i -

dad de ácido asc6rbico aproximGdamente i gual a la que se sos

pe c ha contione l a solución probl e ma , se o x ida con d iclorofe -

nol - i nclofe.1.ol y se co ndensa con la solución do DNPH de forma

eX3ctu~ante i g ual a l a descr it ~ en e l pá r r a fo ant e rior . El

b l an c o de rOlerenc i a so prepara d e f orma i dé ntica a l bla nco

de l a solución proble~a , afiadie ndo I n so luci6n d e DNPH i nme -

d i atnillonte antes de I n adi ci6n de áci do s ulf6 r ico al 8 5 %.

Me d i da .

Las extincione s de l a s soluciones p roble ma y de r~

f2renc i ~ se mi den en cubetas de 2 CID . de un fo t6 metro ade cua

do en e l máx i :no do absor ción de 520 - 525 nm ~ (o se emp l ea e l

f i ltro aprop i ado fren~ o a l ~s soluci one s testigo corr e s p on-

d i en t e s .

Cál culos .

E s - EsBI x R ( Mc g) = Mcg . de vitamina C ., to -

E R - ErB I tal en e l v o lum e n d e

l a soluci6n p robl e ma

emp l eado pa r a l a con

densa ción con DNPH .

Acido Dehi d roascórbico .

Si s ólo in toresq determ ina r el contenido en ácido -

 53-

dehi dronsc6rbico , se omite la oxidaci6n inici al con 2,6-di-

clorofenol-indofenol . La diferencia entre e l contenido to-

tal en vitamina "C" y el contenido en ~cido dehidroasc6rbi-

co da la cantidad de ácido asc6rbico presente en la muestra .

Curva de Calibraci6n .

Si este m~todo se aplica al anál i sis rutinario de

vitamina "C" es aconsejable construir una curva de calibra-

ci6n, si endo innecesario prep a rar una soluci6n de referen -

cia para cada ensayo , tal como se ha d e scrito anteriormente .

Se oxídan con 2 , 6 diclorofenol - indofenol 10 mI . de una sol~

ci6n que conti ene 250 Mc g . de ácido asc6rbico y se extrae

con ~ter . La capa acuosa se recoge y se diluye hasta la se

ña l de aloro con los líquidos de lavado, empleando un ma

tráz aforado de 25 mI . Se pipetean en matraces aforados de

10 mI . diversas porciones de l a soluci6n obtenida : 0,5 mI .

(= 5 Mcg) , 1 , 0 mI . (= 10 Mcg) , 2 , 0 mI . ( = 20 Mc g, 3 , 0 ml . -
(= 30 Mc g) y 4 , 0 ml . ( = 40 Mcg) de ácido asc6rbico . Las -

soluciones se disuelven hasta 4 mI. con l a soluci6n de áci -

do oxálico y se tratan a continua ci6n, tal como se ha des -

crito anteriormente (condensaci6n a 37ºC ., diluci6n con áci

do sulfúrico al 85 %) . Se miden l as extinciones de estas

soluciones e n una cubet a de 2 cm . en el máximo de absorci6n

de 520- 525 nro . (o se emp l ea el filtro aprop iado), frente a

un blanco de reactivos (mezcla de 4 mI . de la soluci6n de -

ácido oxálico , dos go tas de l a soluci6n de tiorea , 1 mI . de

la soluci6n de DNPH y 5 ml . de ácido sulfúrico al 85 %) .

Las extinciones se representan frente a los pesos correspon
 54-

d i en tes de ácido asc6rbico en 10 mI . de l a soluci6n final.

Cu¡,va.s é.~ e c a lib r a ci6n

pare el anál i ~ i s fo -

tom~trico de l a vita 05

mina C con 2. 4 d ini - 04

trofenilhidrazina . OJ

02

01

Mcg . do á~ido asc6rbico/lO mI.

~--------------------------~~
5 10 15 20 25 JO J5

Aná li s i s do ~itami na 11011

v en Alimentos de alto Contenido A zuca

rado .

Fundamento .

L os azúcares so lubl es i nterf ieren con el análisis .

En efecto , estos compue stos reaccionan co n la dinit rofenilhi-

razina form and o osazonas amarillentas : aunque el máximo d e -

absorci6n de estas osazonas se halla desplazado hac ia menores

longitudes d e onda , absorbe~ s in embargo, con la suf iciente -

i ntens i dad en l a región de 520 - 525 n m. para p ro porc iona r un -

va lor erroneame nte alto de la concentración en vitamina C. , -

las o sazonas interfer entes pueden c liminRrse por cro matogra -

fia en capa fina .

 55-

Reactivos .

Plac~s 0e s~ lica - gel . Las plac~s de sil ic a - ge l se

p re par an empleando Sil ic a - gel H o silica gel G para cromat~

grnfía e~'l capa fina , según STAHL . Las cromatopl acas no se

activan en est ufa , sino que se de j an secar simplemente a l -

a i re .

Solución e 2,6 - diclorofenol - indo feno l al 0 . 5 %:

0 . 5 g . de 2 , 6 - diclorofenol - indofenol G . R .: so d i s u e lven en

100 mI . de agua .

Aci~o ac tico ~lncial apro x . 96 %( d = 1 . 055 -1, 064 ) G . R .

ClDroformo G . -,
:"'_ e lqU8 con t i ene alrededor de l 1 % de etanol) .

1 c e tato ·::..ú otil o ")2.rn cro'ilFltograf í a .

Ac etona ro<
V . R.

M6todo .

En ur_ na traz aforado de 100 mI . s e pipetean de 50 a

90 mI . de l a soluc i6 n problema , que contengan de 2 a 20 mg .

de vitamina C ., e acidific an , s i fuera n Gce sario , con la s~

l uc ión de ~cido ox~li co . Se añade ahora , agi tando , un exce -

so de In soluci6n de 2 ,6- dic lorofenol - ind of enol a l 0,5 %a La

Dez c la se d iluye hosta l a s eña l do aforo con agua , se agita

vari~s veces y se d~ ja r eposar durante unos cinco minutos .

 56-

Si el exceso de 2 ,6-diclorofenol-indofenol (ácido libre) se

separa formando un precipitado cristalino, no requiere su

el i mina ci6 n por filtraci6n .

Cuando se mane j an soluciones y extractos fuertemeg

te coloreados resulta a menudo difícil saber si se ha añadi-

do o no un exceso de 2 , 6 diclorofenol indofenol . Dado que 1

mI . d e la soluci6n al 0,5 % pue de oxidar alrededor de J mg .

de ácido asc6rbico , el volúmen de 2 , 6 diclorofenol -indofenol

que se requi e re puede calculars e previamente de forma aproxi

mada , siempre que se conozc a el orden de magnitud de la con-

c entraci6n de vitamina C ., existente e n la muestra . Por eje~

p lo e l zumo de uva (tinto) contiene normalmente de 200 a 250

mg. de vitamina C ., por litro; deben emplearse alrededor de

75 mI . de zumo, acidificarse y oxi dar el ácido asc6rbico por

adición de 15 6 20 mI . de la soluc ión de diclorofenol -indo fe

nol ( c orresponde a un e xceso del 100 % aproxi madamente de

agente oXidante) &

Solución de Referencia .

Una alícuota de la solución de ácido asc6rbico , con

un contenido similar al de la cantidad de muestra empleada en

e l análisis , se diluye al mismo volum e n inicial y se trata a

continua ción de forma exactamente i g ual (oxi da ción, etc . ) .

Condens aci6n .

Se coloca en los re spe ctivos tubos de ensayo un vo-

 57-

1umen no inferior a los 2 m1 . ni superior a los 10 m1. de la

muestra pretratada y de las soluciones de referencia, que

contengan e ntr e 100 y 1000 rncg. de vitamina C . , para precipi

tar las osazonas se aña den O,S m1 . de la soluci6n de tiourea

y un volumen de la soluci6n de DNPH que equivalga aproximada

mente a l/S del empleado ( 1 - 2 m1 . ). Se mezcla el conteni -

do de cada uno de los tubos , se mantienen en un termostato a

unos 70ºC ., durante tr e s horas y finalmente se enfrían en

hielo dura nte diez minutos. Los precipitados rojos o pardo-

rojizos que s e forma n se recogen en embuditos de placa fil -

tra nte (1 GJ 6 1 G4) , s e l a van con agua hasta que los fi1tr~

dos son incoloros , y finalmente , se disuelven recuperándose-

del filtro con acetato de e tilo caliente o acetona . Las so -

luciones d e los pr e cipitados respectivos s e recogen en matra

c e s de fon d o r e dond o y se evaporan hasta sequedad a presi6n

r e duo i d a . Los r e siduos se redisuelven en S m1 . de acetona ,

exact ame nt e me d idos (empl~ese , pipeta aforada) .

Cromatografía en Capa Fina .

Alícuotas iguales de la soluci6n problema y de re-

f e renci a cada una en volúmene s de 0 . 1 a 1 , 0 m1 . y contenien-

do osazonas que correspondan a 20 - S0 mg . aproximadamente, de

ácido as c 6rbico se colocan "en banda" sobre la placa de sili

ca - gel , e mpl eando pipetas gradua das (con b a nda de Schel1bach)

de 0,1 . 0 . 2, 0 .5 &1 , 0 mI . de capacidad . Tal como se mue stra

en lámina 6 , las bandas de las solucione s de referencia y pr~

blema son de igua l longitud. La placa se coloca en una cáma -

ra cr oIDq tográfica que contenga el disolvente de d esarrollo

 58-

cloroformo/ acetato de tilo/ácido ac~tico, 60:35:5). El tiem

po de desarro llo es de alrededor de una hora. Una vez retira

da la cromatoplaca de la c~mara cromatogr~fica, se recogen i~

mediamente con una espátula las zonas , perfectamente defini -

das, de coloración rojo-ladrillo correspondiente a la muestra

y referencia . El polvo obtenido se coloca en los respectivos

tubos de centrífuga, tratándose a continuación con 5 6 10 mI .

(e xac t amente medidos con pipeta aforada) de ácido sulfúrico -

hasta que se obt i enen suspensiones hemog~ne as de coloración -

roja .

Las suspensiones se centrifugan y las soluciones -.

transparentes que se obtienen se miden frente a agua en un fo

tómetro , empleando una longitud de onda de 520-5 25 nm . o el -

filtro de c o lor aprop i ado , (15) .

Cálculo.

Es
x R = mg . de vitamina c. , total en el volÚInen de la
Er
solución problema empleado ,

donde Es = extinción de la solución problema.

Er = extinción de la soluci6n de refer encia.

R = cantidad (en mg .) de ácido asc6rbico presente

en el volumen de la solución de referencia

utilizado.

Obs ervac ie>nes.

Si la soluci6n problema ( o el extra ct o) contiene -

 59-

una c oncentraci6n muy a lt a de sustancias disueltas (por ejem

plo , azúcar es , aminoácidos , sales, etc .), ocurre c on frec ue~

cia que l as d initrofenilhidraz ina no se s e paran en forma su-

ficientemente cristali na , tal c omo 10 hace la dinitrofenilhi

drazina del á cido dehidro as c6rbico c onteni do e n la soluci6n

de r eferencia. El pre oip i tado f ormado puede ser tan fino

que pase a tr av~s del filtro o bloques s u s poros . En estos

casos , el producto de c ondensac i6 n debe dejarse reposar du -

r ante toda l a noche a la temp e ratura amb i ente , despu~s de ha

ber cal entado a 45-50 QC., durante dos horas . De este modo -

el prec ipit ado adq uiere e l tama ño de cristal a de cuado y su -

filtraci6n e s mucho más fácil . Tambi~n es aconsejable em---

plear un pa tr6 n interno , en e l cua l l as c ondiciones de prec i

pitaci6n son id~ nticas a l as de l a soluc i 6n problema . En es

t e exper i mento paralelo se añade a l a soluci6n prob l e ma un -

volUmen igua l de áci do asc6rbico a l estado de l a soluci6n de

ácido as c6rbi c o , que c ontenga l a c ant i dad prevista en e l vo -

lúmen de soluci6n problema empl eado . Esta adi ci6n se reali -

za antes de l a oxidaci6n con d i c 1orofeno1-indofeno1 . La mez

cla s e tra t a de formar exa ct ame nt e igua l a l a so luci6n pro -

blema a l a que no s e ha añadido ácido as c6rbico. El c onteni

do en vitamina C., se c al cul a como sigue:

Es
X c ant i dad añadida (mg . ) = mg . de vita8ina
Eist - Es
C., total en el

v o lumen de solu

donde Es = extinci6n de l a soluci6n ci6n problema -

prob lema empleado .

Eist = ext inci6 n del patr6n in-

terno .
 Las dificultades que se presentan en la filtraci6n

del precipitado pueden e liminarse extrayendo las dinitrofe--

nilhidrazina con JO mI . de acetato de eti10 . La extrac ci6n

se r epite con otros 20 mI . de acetato de tilo y los extrae -

tos combinndos se evaporan hasta alcanzar un pequeño volumen

de tal modo que pueda aplicarse a la placa de sílica - gel 1 -

mI . de la soluci6n final correspondiente a unos 20=50 mcg. -

de ácido asc6rbico .

La solución de referencia se trata de idéntica for

ma .

La separaci6n cromatográfica de las dinitrofenilhi

drazinas puede mejorarse a menudo, practicando un segundo d~

sarrollo . En este caso , después de una hora , aproximadamen-

te de desarrollo , cromatoplaca se retira de la cámara croma -

tográfica , se deja evaporar el disolvente y la placa se colo

ca de nuevo en la cámara cromatográfica. Después de este s~

gundo desarrollo , la banda rojiza de la vitamina C ., es sufi

cientomente nítida y pura , en general , para pro c eder a su va

loraci6n cuant it at i va .
 IjIEUf.TU.. '(. L~NI
ur~l\'Lk JI~/\[. ce t..
_ _ _ _ - -f\--SA.L..V
--- 61-

ANALISIS POLAROGRAFICO DEL ACIDO ASCO~BICO

Intervalo de pH .

El mejor int e rvalo de pH para el análisis polaro

gráfic o del ácido asc6rbico es el comprendido cntre J y 6 . -

A mayor es valores de pH el ácido asc6rbico se oxida muy rápi

damente . Por otra parte , en soluc iones de mayor acidez la -

onda an6dic a presenta una curva po co aguda y , por tanto no -

puede determinarse con exactitud . La adici6n de oxalato s6 -

dico protege l a oxidaci6n .

Esp0c i:fidad .

El ácido dehidroasc6rbi co no se determina por pola -

rogra:fí a . Interfieren otras "reductoras ", pero las ondas co -

rrespondientes pueden ser e liminadas norma l mente por adici6n

de forma l- dehido . Los haluros afectan notablemente l a medida,

especialme n te cuando se trabaja a va l ores bajos de pR . Sin -

duda , el análisis polaragráfico es menos exacto que la valora

ci6 n ox i d im~trica . Sin embargo, para el anális i s de ácido as

c6rbico en f6rmulas farma ceúticas complej as y en productos na

turales l a menor exactitud se contraresta por su mayor especi

ficidad . Además la polar ograf í a tiene l a v entaja de una ma -

yor sencillez de realiza oi6n que los m~todos fotom~tricos.

Conc ent raci6n .

La mayor exactitud se consigue a concentraciones -

 62-

comprendidas entre 25 y 250 mg . de ácido ascórbico por mI . -

Debe pres t arse una especial ~ten ci6n al estado del electrodo

de colomelanos ya que, si es deficiente , pueden producirse -

alteraciones t nto en e l orden de las ondas como en los po -

tenciales de semi onda .

Para la val oraci ón cuantitativa puede emplearse

bien sea una curva de calibración, c onstruída para i nt e rvalo

indicado (25 - 250) mcg . /ml . ) o bien puede realizarse una de -

terminaci6n ndit i va (patr6n interno) .

Reactivos.

Acido ac~tico 2 N: 125 g . de ácido ac~tico glacial

aprox . 96 % (d-l , 055 - 1,064) G. n. se diluyen hasta un litro -

con agua .

Acetato sódico 2 N: Se disuelven h a sta un litro -

con agua 272.2 g . de acetato sódico G. R . que no presente

reacción con permanganQto potásico , según Reinitzer .

Solución de formaldehido al 35 % peso G. R.

Oxalato disódico G. R .

Eter de petróleo: Bencina de petróleo G. R . con -

punto de ebul lición de 40º C., aproximadamente , (15) .

 ( Altura de onda)

A'.
cm , '

10

9
8

7
6

.5
4

3
2

1
Mc g . ácido as córbico/ml .

/ :r
50 100

Curva de calibración para l a det e rminación

polarográfica de l ácido as c6rbic o .

E1ectro1 i to de Soporte .

Potenc i al de Semionda .

Se mezclan 75 mI . de ácido a cétic o 2 N con 375 m1 . de

ace t ato sódico 2 N. en un matraz aforado de 500 m1 . Se aña-

den 5 m1 . de l a solución d e forma l dehido y la m zc1a resu1 -

tante se diluye h asta la señal de aforo con agua .

La solución obtenida s e satura con oxalato sódico y -

 64-

se filtra . El filtrado se emp l ea como electrolito de soporte

y tiene un pH . de alrededor de 5.5. En esta soluci6n de fon-

do 0 1 potencial de semionda del ~cido asc6rbico e s de + 0,07

voltios aproximadamente , (15).

M~todo .

A continuación se dan algunos ejemplos para ilus -

trar el pro c edimi ento experimental de l análisis polarográfico.

Grageas .

a) Comprimidos polivitamínicos ( contenido en vita-

mina C . 100 mg . ). Se pu lv eriza en un mortero una gragea y el

polvo se disgrega con una gota d e ácido acético glacial y a1 -

gunos mI . de agua . La susp e nsión r esultante se diluye hosta

100 mI . en un matraz aforado y se f iltra 10 ml . del filtrado

s e colocan en otro matraz aforado de 100 mI . y se diluyen ha~

ta la señal de aforo con el ele ctrolit o de soporte. Se pasa

corri ente de nitr6geno a través de l a solución, que se deter-

mina polarográficamente; ( ánOdO) desde 0,3 voltios. La altu-

ra de l a onda se convierte en la c an tidad de ác ido asc6rbico

por mI . de l a soluci6n analizada mediante la oportuna curva -

de c a libración. Multiplicando por 1.000 se obtiene el peso -

de ácido asc6 rbico por gragea .

Cápsulas .

b) Cápsulas polivitamínicas que contienen una pre -

 65-

paraci6n oléosa (cont enido i ndicado e n vitamina C: 50 mg.).

Se abre una cápsula con una cuchilla de afe it a r y su c ontenido

se traslada cuan tit a tivame nte e n un embudo de separaci6n emp l~

ando 40 - 50 m1 . de éter . Los restos de l a cápsula se l avan con

20 m1 . de agua a los cuales se h a añadido una gota de ácido

acético glacial y los líquidos de l avado s e adiciona a l a amP2

11a de separación .

Se c i e rra el embudo c on un tap6n esmerilado y se

ag i ta vigorosamente durante un minuto . Cuando las fases se

han separado compl e tam e nte , l a c apa acuosa se r ecoge en un ma -

traz aforado de 50 mI. y la capa eté r ea se l ava con dos porc i~

n e s de 10 mI . de agua . Los extractos a cuosos combinados se di

luy en h asta la señal de afo ro (50 m1 . ) c on agua 10 m1. de la -

so lución r e sultante se diluyen h~sta 100 m1. c o n e l e 1 ectro 1i-

t o de soporte e n un matraz aforado de 100 m1. La soluci6n ob-

tenida se det e rmina polarográficamente tal como se h a descrito

en grageas .

Zumo de uva (Tint o) .

c ) 10 m1 . del mosto se diluyen con 10 m1 . del

e 1 e ctrol ito de soporte . Si e l pH de l a mezcla es inf e ri or a -

5.5, se a justa a este valor ( emp l ear e 1 b ctrodo de vidrio) me -

diant e la adición gota a gota , de una soluci6n de h i dr 6xido s6

dico . Se pasa una corri e nt e de nitr6geno a través de l a solu-

ci6n la cual se determina pol a rográficamente (an6di camente) a

partir de 0.3 voltios. La med i da eX8cta de l a onda se consi -

gue únic amente eu~ndo exi sten a lt as conc ent r a ci ones de ácido w

asc6rbico.
 66-

Si e l c o ntenido e n ácido as có rbico del zumo vegetal

es menor ce 25 mg/ml . es posible determinarlo cuantitativameg

tc ?or pa l nrogr a fí a s~&mpre que se afiada e l electro lito de so

por te una cantida¿ exact~mente ¿esada de áci do ascórbico . De

este ~o?o se incr ementa su c onc entra ción en la solución a va -

lor~r , ob ten~~n¿ose ondas polarog rtf~cas que pueden servir p~

ro dotGrmi~~ c~ ones cuantitativas . Para ce.lcul a r la cant idad

.+ . en la muestra basta co n
de vJ..v2.mJ..l1.a

Buot_uer ~e las result~~cs obtenidos el valor c orr es?ondiente

al i ci~0 ascórbicJ 8~~~ i de .

Los pr ~ meroG análisis de vit am inas se hi ci eron emp l~

ando m6todos b i o 16 g ic os . Los efectos espec ific as produci dos

p or las vita~inQs eri an i ~~lQs - oxperimentación sirvieron de

baso p~ra la (Valoraci6n) cu a~t it3tiva de las mi smas . Los m~

to dos q u í micos , F í sico - quí mi cos y Microbi o ló g ic os se han ido

dasarro 11::mCo gradu"llmonte . '. Todav í a huy, lo s m~todo s biológ.i

cos son a veces inGispensables p0ra l a dete rmina ci6n de vita-

mina . As í , un l a v.:::lc,ra ción do la Vitamina "DI! s o lo se obtie

ne la a~ocu~da es~e cif ic i dac emp l ea~do el e nsayo biológico,

puesto que lo s rn~tod os químicos no son suf ici entemente espec!

ficos n i sensibles pa~a las concentra ciones de vitaminas "D"

empleada s h bitua l me:ate en e s tos p ro ductos d e nutr ición ani -

mal . A pesar de la indiscutible vent a ja que l es proporciona

su mayor se l ectiv i ~ad , el c~plo o de lo s m~todos bio16gico s se

ha venido lire i tan~o sucesivamente , ya que requieren mayor tiem

po yar~ su 8jecuci6n , son normal mente caros y s us límites de -

 67-

error son con frecu enc i a muy amplios. La ex er imentaci6n

con anim ~ les ha quedado r estr ing i d a p or el lo , a los casos en

lo s que ~o pUGcen apl~c2rsú l os métodos químicos o físico - qu!

micos a c ausa de que l a conc ent r a ción vitamínica es de masia-

do baja o p orque 10 i ~p O D ibilitan algunos f a ctor e s interfe -

rente s . Ta~bi é n se recurro a lo s métodos bi o 16 g ic o s cuand o

s e q u i e re dete r minar l a fac ili dad de abso rci6n o l iberaci6n

de l e.s i tam i~a s presente s c n preparaciones farmaceúticas .

Lo s móto dos b io16 g i c o s est án basac o s e n el e xamen

d irect o ~o l alimento, 6rgano o pro ~ucto medicamentoso , como

fu ente do vitamina "C" p ara la co bay a en c are ncia . Las pru~

bas Bio 16 g ic as puo 1 ea ser emp l eadas en dos formas diferentes:

la . ) Como prueba prev0~ti & y 20 . ) c omo cura tiva . El p r e ve!!

tivo consi ste en adp1Ínistr2 r a l a s cobayas so~etida a una

dic t a sin vitamin~ ¡C" un ~ c ant i dad conoc i da de e lla y deteE

min~ r la canti dad mínima quien pe rmit e e l crecimiento y con-

si gui ente aunento de peso . La Prueba Curativa , por e l con -

tr~r i o consiste e n l~ cantidad nec esa ri a para que e l aume nto

de peso de cavias e il c arenci a de vitamina "C" vuelva a mani -

f cstarse . Otros aut o res en vez de est u d i ar la evoluci6n PO!!

deral e~ lo s ani maleS , utilizan cono testi go el estado de l os

di entes . Estns pruebas b iolÓ Gi cas deben r ea liza r se compara!!

do l a ~ ctivi dad ~nti~s corbú t ica de l p r oparado que se inv ~st !

ga con l a d e un producto ~Qtr 6n de compo s ici6n fija y activi

dad cone ci do. .

Estas compnr a ciones deben hacerse con e l producto

pa trón internacional GDt~bi cido en 1 94 3 que es tá formado p o r

1c ido cs c6rbi co l ev 6giro cristalizado; p~ra s u emp leo se di

 68-

suelve en agua destil? ~ a recientemente he rvida y f rí a . La -

Uni dad Int e r n ~ cional de est~ vita~ina es l a activi dad anties-

corbútic a ~e 0 . 0 5 mg . de este p ro duct o.

Va lo rac i6n de l a Vitam ina "C" por el M6todo d e l Cr e cimi ento -

Curativo.

S e utilizan coba yos de un peso aproxi mad o de 250 gr .

a los que se admi n i stra una d i e ta c arente d e v it ami n a C . , ha~

t a qua emp i e zan a perder p e so . Cuando han disminuí do entre -

10 Y 20 gr . Se l es administra l a vi tamina , para l a v a lo ra ci6 n ,

s e e st::tbl e cen grupos d e unos 6 cobayo s , uno de l os cua l e s qu~

da c omo co~trol , s in recib ir l a vitamina C . , lo s demás g rupo s

recibir1n do s is ~ ifer ~ nt a s e 1cido asc 6rbi co standard y de l

pr e p ,rQdo cuyn a c tivi dad quere m o~ d e termina r . La comparaci6 n

del ~umo _t e Ce pe s o de lo s Gtli w¡ l e s que han r e cib i do el stan-

dard y e l pro d ucto probl o ma p e rmite l a det e rmina ci6n cuant i ta

tiva d e 6sto .

Ant e s de a d ministrar I n di e ta libre de vitamina C . ,

es n ec e sario t e ne r a l os ani~ ~ l e s que van a ser empleados , en

l as jaul as donde s o re~ lizará l a exp e ri e nc i a , dur ante un tiem

po sufici ente p ~ ra que se hab itúen a l as c ondiciones d e ella,

pues es muy fr e c uent e qu nl co l o car a l os cobayos en las ja~

la s , empi ezan a perd e r pes o; por e llo es recome n c ab l e hacerlo

de l a sigui e n t e forma: grupos de 6 cob ayos S 8 colocan en jau-

l ~s , Gn el in terior de l Laborntorio y se emp ieza a administra r

la di J t n misma cnr e n te d e vitamina que va a ser utilizada para

la exper i e nci a , p e ro ~ ~ i~ion6ndolo 15 a 20 gr . d e verdura dia

ria por animal . Cuando e l au~ento da peso se manifi esta uni-

forme y regu l ar se suprime l a adi ci6n de verdura o de áoido

asc6rtico y se c omie nza el v erdad ro periodo de exper i menta -

y a los 15 6 20 d í ns de t r atam i ento , emp i eza a apare --

c er los primoros s í ntomas de e s corb ut o y e l peso comienza a -

des c ondc. Cuando e l peso ha dism i nuído 10 6 15 gr . se admi -

nistra a los d if erGntes l otes d 6 s i s d i st i ntos de l standard y

del p robl ema , ano tán¿osú cui dadosam ente , l aG r esulta_os de pe

sa ~a s en una g rá fica . A los 1 0 d í a s de administrao i6n d e lo s

prop8rn(L:~s , se i nt¿.rrumpe la experiencia r e int egrando los co -

bayos a l criadero y se dará d i e ta abundante de verdura . Los

pesos de c ada cob aya por lot e , reunen en una g rá f ic a común y

se comparan los resultados de los d if e rent es lot es , (2, 16).

Determina ci6n de l a Vitamina "C" por e l M ~t od o del Crecimien-

to Profilá ct ico .

Se se l e ccionan tr e s lo tes de 6 cobayos , d e un pes o

ap rox imad o de 250 gr . y se l e s some t e a d i eta co merc i a l dur a !!

te se i s semanas . Des d e e l pr i mer d í a de experiencia se adro!

ni tra a uno de los lot es , diariamente y por cabeza , 5 unida -

des int ernac io nales del Standard ; a o tro lot e 1 0 uni dades in-

t ernaciona l es del mismo producto y a l t e rcer lot e , una c ant i-

da d de l p r oducto problema que s osp e chamo s se encuentra co m --

prendido entre 5 y 10 uni dndes in ternac io nales . Al cabo de 6

semanas se c a l cula l a d i ferenc i a de peso de c ada lo te , en r e -

l a ci6n n su peso inicial y se construye l a co rrespondiente

gr~fica , en l a qu e se dispone e n l a ordenada , los a~~ent o s de

pe so , y en l a abs ci sa , los lo gc ritmos de d osi s .

 70-

Se traza ~~a líne a recta entr e los dos puntos corr e~

p ondi ente a l as d o s is de l standqrd y se c al cul a mediante

e lla , e l va lor a que corr es ponden e l aumento de peso pro d uci

do por e l prob l ema , (2 , 12) .

Det8!:'J.!1inac i6 n de l a Vitamina !te!l por e l Méto d o de lo s Dien -

Al gunoE: atores l::an propuesto para de t e r mi nar cuant!,

t a tivn.n.cnte e l grado de cura ci6n de los anima l es , e n vez de

emplcQr CODO crit rio el aum nt o de es o, el estudio de las

~ d ific ~ cion cs h i sto1 6 g icos de los d i ente s . Est a técnica ha

sido m dificada por d i fere tes qu tor es y s u exac titud es ma-

yor que I n de los m to dos anter i ormente des critos y el error

máxi mo no sue1 3 sobrepasar al 1 0 %.

Mé todo de Zey y Elphick .

E stos autores adop t a ro n una es c a l a ,con la que pueden

compa r a r la s v a riacio nes histo1 6 g ic as apre ciadas lo que fac!,

li t a l~ valo r~ ci6n . Para esta prueba se s e l ec cionan v ar ios

gruos de 4 a 6 co bay os ~ lo s que se someten a una de l as

d i etas escorbut í genas . A uno de los lot es se admini stra por

día y aniDal 20 uni dades int 8rn~ cional es de producto patr6n

y n ot r os grupos , dosis dif e r untes de l p ro d ucto prob lema en

un~ proporci 6 ~ apr oximada de 20 uni da d e s a lo s 1 4 6 21 días

se sacr i f i cn a lo s animq l Gs y se pr e p aran lo s d i on tes para -

su exnmen h i stol g ico . Es t a pr e pnraci 6 n de los d i e ntes r e -

 71-

quiere varias manipulaciones como: fijaci6n, descalcificaci6n,

i nclus i6n en parafina o gelatina, (2 , 19) .

Preparaci6n de lo s Dientes .

Una vez sacrificado el animal se procede a la ex -

tracci6n de los di e ntes , lo que hará con muc ho cuidado para -

que no se rompan . Por lo general se disecan y limpian bien -

s6lo los máxilares inferiores de l o s distintos animales aun -

que hay autores que recomi endan emplear tambi~n los inferiores.

El maxi l ar debe extraerse comp l eto s i n partir en las 2 mita -

des . El hueso limpio así extra í do se deja en líquido de Bouin

que se acabará de preparar . En este líquido se dejan los maxi

lares durante 2 6 J días , transcurrido este tiempo , se lavan

bien , pon i~ndolo s dentro de un cestillo de alambre que se in-

troduce en un cristalizador y se deja correr agua abundante -

durante 15 minutos. Una vez lavados , se introducen en: lo.}

alcohol de 95º , 24 h ., 20 . ) agua ; Jo . } ácido nítrico al 4 %-

(para de c al cific ar) 24 h . ; 40 . ) lavado abundante con agua du-

rante JO minutos ; 50 . ) sulfato de Na al 5 % 24 h .; 60 . ) lava-

do con H20 durante 2 h . poniéndose despu~s las piezas en al c~

hol J5 Q , durante JO minut os. Otros JO ' en a lcohol de 70 2 pa-

sándol o s durante igual tiempo en al cohol de 95º y dejándoles

al cohol absoluto durante 24 h ., más . Una vez descalcificados

y deshidratados , se pasan al xilol benzol o cloroformo , donde

permaneceran las piezas hasta que su tran sparencia confirma -

la completa penetraci6n del r eactivo; se es curren en 1 papel

filtro y se ponen en parafina fundida durante ci er to tiempo;

que puede oscilar entre l y 24 h . Luego se es curre la pieza

y se vue lve a i~tro du cir n p~ rafina de 1 punto de fus i6n

más l eve.do . ftl c abo de 1 h . s e for ma el bl oque orientando

b i en la p i eza s e dcj'l e __ fr i a r y a l e. 1/2 h . se quit a l a p ra-

finD sobrr-.nte pro curr:ndo c j~r l a p i eza en al c entro y for -

:lar 1 cubo de c ~r~D p l an~s q u e s e coloc ará e n el microtomo .

Los cort es S8 h~rán muy finos de unos 5 u . pr6ximos la

r a í z y e n d i ra c ci 6 n tra _ sv er sal al di e n te se coloca e n placas

d e p ··tri , pr '::;p arad o s con agu'1 c "'. li ,mte a 39 º - 40 Q e , par a -

que no s e f- ~da l~ par&f i ~q . Una voz extendi d os lo s cort e s

se coloc -.i'l ",n ",, 1 portaobj to s y se de j an er~ e stuf a temper~

tura de 4o º C , d lr~nt e 24- 48 h. Se quit a l a para fina con xi

1 1 ; 2 1 xi lol c~ _ al co ho l a~s ol ut o y s e empieza a hidr ata r

lent~;>l-;;;_~iJ". , I1l.~ i !!l::::'o coy¡ e l a lc ohol recti1' ic ado y añadi~ndo

despu és pOCJ a o co ~~ua .

Se t i ñc or ~l p roc e di mi ¿ nto q u e se desee ; general

me nt e h8matoxi1 i ~~ eos in2 .

La s mo d i f ic Qcionc s h i st o16 g ic as pr o duc i d as por la

d i eta s e Cl ~ 5i f ic a en 5 grados , ordenado s de l O al 4 .

El gru p o o ~ ~ prese nta el grad o má x i ~ o de l e scorbu-

t o y el # 4 de l ani ma l normal .

El cál culo d e lo s r e sultados puede v e rificarse h a -

llRn d o l n dosis qua produce el mi smo g r ado de p re v enci6n en

a~bos pro ~ uctos que se compa ran .

T~mb i n pu.:-dG con struir se u n a curva c ::1ra cterística

con . . . 1 st ?ci"ld8. rd y 'tcte!:'minc r en e ll '1 l a conc ent r a ci6n corres

 73-

pondiente al grado de prevenci6n hallado para ca d a animal del

lot e qu e r e cibi6 las 20 unidades del standard y se det ermina

el v a lor medio para lo s anima les de este grupo. Se repite lo

mismo para los animales del otro grupo que han recibido el

producto probl e ma . Los 2 valor e s así obtenidos se ll evan a -

la gráfic~ donde se puede apr e ci a r la dosis diari a relativa a

que corr e sponde n . Estos nue vos valores se relacionan entre -

si dividiendo e l correspondi e nte al producto problema por el

del standard y multiplicando el coci e nte así obtenido por 20 .

Este último producto representa e l número de unida des int erna

cion3 l es que pos ee e l producto problema por cada dosis diar ia

administrada .

Métodos Mi c robio16gicos .

Los méto dos mi crobio16 g icos han sido ampl i amente -

utilizados en l a determ ina ci6n de las vitaminas del grupo B .

De bido principalmente a su gran sensibilidad y alta especifi -

cidad, estos métodos son los pr e f e ridos en muchos l aborat orios,

esp e cialme nte para l a investigaci6n de vitaminas en materia -

l es de orige n natural. La espec ificidad y exactitud de lo s -

métodos MIC ~OBIOLOGICOS pue den incr e me ntarse, con frecuencia ,

medi a nte la ap lic ac i6n de métodos modernos de separaci6n (CRQ

MATOGRAFI A ~E INT~RCAMBIO - ONICO CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA , -

e ct . ) .

Los métodos microbio16 gicos para determinaci6n de

vitamina se basa en l a obs e rva ci6n de que a lgunos microorga -

nismos de c arac t e rístic8s bien de fini das , pueden multiplicar-

 74-

se y pro.::-~"ci:L' ci6 ::'t os l~roúuct oG metab6licos única ~18nte en pr~

2st os microorgQnis~os se cultivan -

en un m0~io nutritivo 6?ti~0 . Si en tonces so inocul~n en un

medio nut::,itivo que c~~ecen ue un compuest o v i tamínico deter-

r:1.in:;.do , 0 1 crccimiul1.to se inhibe totalmente . Cuando e l subs -

trato qU8 conti GDe la vit AoinA en estudio se afiade al medi o -

i nic i nl!:J0::'1.te trrEls1JarGnte:: por o.uscncü.'!. do crecimiento , la mul

t i p l ic ac i6n del rn icroorganis~o cnus~ un~ turbidez que puede -

Adem~s ~e la rnedid~ turbidim~

trica , los pr~ducto s metab6licos form~ ~os ?or e l microorge~i~

mo pued o~ detcr~;in~rse cuant it nt iv~ De nte ; por ejemp l o , puede

valorarse volumétricari'-'8 nte la i;¡ez clR e ácido producido por -

~lgunos microo rgani3mos él pqrtir de la glucosn suplementada

L~ v~10::,~ci6n fotométrica de la reacci6n de cr e ci -

ni0nto os más soncill::l y p ue cc ll evarsG a cabo con mayor rápi

doz . Si so a3~do c 8~t ida ~as creci~nt ~ s ~e la muestro. prob l e -

1"1 a , 12 tl~:.~ ~~ i ¿¡ ez ~el .:.-.:-.)6 io , que refleja .::::1 mé'.yor cr ec imi e nto ,

se inCI' ..;:3e::tc. ;;r.-¡~-~u::'.Ln . . . n tü , y C2.::.t.CO r·e un cierto int GI'va lo

de concei"ltra ciór: es (~ i~ o cta:n e nt e ?roporcionnl a l a c anti dad -

da vit~~in~ presente . Dentro d e este int e rvalo llamado d e

" requcrimi0nto p~ra un desa rrollo equiva l e nte a l~ mitad del

máxi mo n , pu::;c',on COmp2.T3rSe con .3'r ar:. preci sión lo s efectos cau

sados por In acici6n de l~ ~u cstrn prob l ena y ce une soluci6n

do ref G renc~n ue c ~tien2 1 3 vitamin~ pura , ( 20) .

 75 -

C o N C L U S ION E S

lo. M ~todos F í s i cos .

El m~s uS8do e s e l espectrofo to m ~t r ico.

20. M ~to d os Qu í micos .

Estos métodos S 8 basan e n e l g r an p ode r reduc -

tor de l á c i do as c6rbico . Entr e lo s más empl e a -

dos se e n cue ntran : Soluciones d e Yodo; de 2 , 6 -

diclorofenolindofeno l; siendo este último el

m~s e xt e n d ido ho y d í a .

Jo . M ~ todcs Bioq' í ~ icos .

El mñs usado es el de RANDOIN Y LEBLOND , basado

en e l hecho de qU6 cuando se administra a Coba -

yo s , rac iones apo r t ~ ndo c an ti dades d i fer entes -

de ~ci do asc6 rb ico , se e ncuent ra en lo s 6rga nos

de lo s an i D ~ les, d 6 s is de vit ~rn ina C., que es -

t án en re l a ci6n con l a inger i da e n l a alirnenta-

ci6n .

40 . M6todos Bi o 16 g icos .

Est os .étodos son usados e n l a s plant a s de fa -

 76-

br i c a ci6n de l a v i tamina C " y se e mp l e a n con i gual

i nt ens i dad , 10 5 p r e v e ntivos y c urat i vos .

 I l

77-

B I B L I O G R A F I A

1. DEL ? OZ O., Enciclo pedi a Fa rmacéutic a .

2. ~r . J O S~ 2UI Z GIJ ON , M t o d os Biológicos d e Valor a ción de

Med ic am e n t o s .

J. Fa r ~ a co p e~ d . E stn~ o s Un ido s , T o mo XI I

4. Fa r m ac o~ e G de Es tad os Uni d o s , Tomo XIII

5. F a r macop e a d e E s t ados Uni dos , T o mo XIV

6. F a rma c opea de Estado s ü n i d o s , T omo XV

7. F a_ma c opea d e Estados Unido s , T o mo XVI

8. ~arm a co pG a de ~st ad os Uni d os , Tomo XVII

9. Far macope a d e Es t ados Uni d o s , T omo XVIII

10 . Fo r mula r i o iac i o n a 1 , To mo IX

11 . Fo r mu1cr io da cionn 1 , T o mo X

12. Fo r mu1 ~ rio Na ciona l , T o mo XI

: 3. F G rmu 1 ~ r io Na ci ona l, Tomo XII

14~ Fo r mu1 n rio Nac i ona l, T o mo XIII

 78-

15 . ROL? ST~OH~CKER , Análisis de Vitaminas .

16. KIRK OTillfS2 , Enciclopodi a d e Tecnología Química, Tomo

XIII .

17. Motods of Analysis of t he Asso ci 3 tion of offici al Agr i-

cultural ChemistB , Torno IX .

18 . Motods of Analysis of the Associ a tion of official Agri -

cultural C~ e mists , Tomo X.

19 . F ont Over , Modic ame nta, Tomo l.

20 . MA2TI~T come , Fnrmac i a P rá ct ic a de'?_emington .