Uso de Enzimas en Solventes Orgánicos en la Industria de

Bioprocesos
Claudia Maytorena-Verdugo y Fernando García-Carreño*

Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Mar Bermejo 195. La Paz,

BCS, México.
Tel. Fax: +52 612 123 84 01.
E-mail: [email protected]

.
RESUMEN
En este trabajo se hace un recuento de los tipos de sistemas industriales en donde
intervienen enzimas. Estos sistemas pueden ser medios acuosos los cuales se dividen en: a)
Agua + solvente miscible en agua, b) Agua + solvente inmiscible en agua, y c) medios
anhidros. Se presentan ventajas y desventajas de usar solventes en procesos que tienen como
catalizadores a enzimas. Se aborda el papel del agua en estos sistemas y el de los solventes y
su efecto en la actividad de las enzimas. También se hace un listado de las enzimas usadas
en estos sistemas y algunas características, enfocándose principalmente a lipasas.
Palabras clave: Bioprocesos, enzimas, medios no acuosos

ABSTRACT
This work emphasizes industrial process based on enzymes as catalyst in non-aqueous
media. These systems are classified as water-water miscible solvents, water-water immiscible
solvents and anhydrous medium. Advantages and disadvantages are discussed, also the role of
water and solvents in the enzyme activity. A list of enzymes used in the industry with their
characteristics is presented focusing on lipases and examples of companies that use enzymes
and organic solvents.
Keywords: Bioprocess, enzymes, non-aqueous media.

INTRODUCCIÓN al estar en contacto las células con los

La creciente necesidad de enzimas solventes orgánicos, es posible que se dé
resistentes a las condiciones de trabajo de un efecto negativo en la célula (toxicidad) o
algunos procesos industriales hace en la enzima (desnaturalización) (Yeom &
indispensable la búsqueda de enzimas Daugulis, 1999). El objetivo de este trabajo
resistentes a altas temperaturas por largos es mostrar un nuevo panorama sobre el
periodos de tiempo. Algunos solventes uso de enzimas en medios no acuosos,
orgánicos han sido usados en diferentes tipos de medios no acuosos, sus ventajas y
campos de la biotecnología como desventajas y explicar el efecto de algunos
complemento en procesos en donde solventes orgánicos en enzimas
intervienen células y enzimas, sin embargo hidrolíticas.

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USO DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA de detergentes en 1930, basándose en una
Los procesos biocatalíticos difieren de patente de Otto Röhm, la cual describía el
los procesos químicos convencionales uso de enzimas pancreáticas en
dadas las características del catalizador detergentes (Damhus et al., 2008). La
como parámetros cinéticos, estabilidad de mayoría de los bioprocesos utilizan
la proteína bajo las condiciones del enzimas hidrolíticas o se basan en
proceso, si la enzima está aislada o forma fermentación. Las condiciones de reacción
parte del metabolismo de una célula, para los bioprocesos generalmente están
crecimiento celular, inducción de la basadas en parámetros interdependientes,
actividad enzimática y/o el uso de rutas por lo tanto una descripción matemática del
metabólicas para reacciones múltiples proceso es esencial para su optimización.
(Schmid et al., 2001). El que un proceso El desarrollo de un bioproceso requiere de
sea sustentable implica una reducción en diferentes pasos: a) Identificar una reacción
los costos de energía y materia prima, específica para escalarla y que sea
disminución de desechos, estabilidad y costeable, b) Encontrar un biocatalizador
seguridad del proceso y calidad del que pueda catalizar la reacción deseada, c)
producto. Algunas compañías han optado Caracterizar el biocatalizador bajo las
por usar enzimas, obteniendo un mayor condiciones de trabajo del bioproceso
rendimiento, reducción de materia prima, (medio acuoso o mezcla agua-solvente), d)
disminución de desechos y aumento en la Aplicación, ya sea por inmovilización o
calidad del producto (Schmid et al., 2002). sistemas múltiples, e) Recuperación del
La primera aplicación de enzimas en producto, (Figura 1).
procesos industriales fue en la elaboración

Fig. 1. Desarrollo de un proceso de biocatálisis (Modificado de Schmid et al., 2000).

BIOPROCESOS QUE UTILIZAN epoxidación enantioselectiva de estireno en

SOLVENTES ORGÁNICOS presencia de dioctil ftalato (50% v/v),
Panke y colaboradores (2002) diseñaron obteniendo 307 gramos de óxido de (S)-
un reactor en escala piloto para estireno por destilación. A nivel industrial, la

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 compañía DSM utiliza medios no acuosos cabo reacciones imposibles en agua por
para producir (2R,3S)-3-(p-metoxyfenil) restricciones cinéticas o termodinámicas,
glicidil metil ester a partir de una mezcla estabilidad de la enzima, recuperación
racémica de trans-3-(p-metoxyfenil) glicidil eficiente del producto y la insolubilidad de
metil ester utilizando lipasas, produciendo las enzimas en medios orgánicos, lo que
100 toneladas al año (Kierkels & Peeters, permite su recuperación y reúso, con lo
1994). A pesar de que algunos cual se excluye la inmovilización de
mecanismos no están claros sobre el enzimas (Zaks y Klibanov, 1985). Un
efecto de solventes en catálisis, a modelo de estudio ideal para reacciones
continuación se presentan algunas bases enzimáticas en solventes orgánicos debe
para explicar estos fenómenos. satisfacer los siguientes criterios (Zaks y
En general las enzimas funcionan en Klibanov, 1985): (a) La enzima debe estar
soluciones acuosas, por lo que los estudios disponible y debe ser costeable, (b) La
sobre sistemas enzimáticos son en este enzima debe trabajar en ausencia de un
tipo de soluciones, sin embargo, desde un cofactor, ya que la mayoría de los
punto de vista biotecnológico, el usar cofactores son insolubles en solventes
enzimas en solventes orgánicos en lugar orgánicos, (c) Los sustratos deben ser
de agua tiene ventajas, como la alta solubles en solventes orgánicos, (d) El
solubilidad de compuestos orgánicos en agua no debe participar en la catálisis
medios no acuosos, la habilidad de llevar a (Tabla 1).

Tabla 1. Ventajas y desventajas de usar solventes orgánicos en reacciones enzimáticas.

Ventajas Desventajas
Se incrementa la solubilidad de sustratos Algunas enzimas pueden perder actividad
hidrofóbicos biológica
Pueden producirse reacciones químicas que Se limita la transferencia de masas usando
no son posibles en soluciones acuosas solventes viscosos
El equilibrio termodinámico se ve favorecido a En procesos en donde se requieren
reacciones de síntesis reacciones de condensación, se necesita un
control de la actividad de agua
En medios no acuosos algunas enzimas
pueden presentar especificidad solo por
alguna región del sustrato o distinguir entre
enantiómeros
Las enzimas pueden recuperarse y reusarse
sin tener que inmovilizarlas
Se incrementan los rendimientos de
separación de los productos
Algunas enzimas son termoestables en
sistemas anhidros.
Se eliminan los riesgos de contaminación
microbiana

Las reacciones enzimáticas en las condiciones termodinámicas de

solventes orgánicos proveen ventajas a la equilibrio en reacciones de hidrólisis, se
industria, ya que incrementan la solubilidad elimina la posibilidad de producir
de sustratos no polares, se pueden revertir reacciones alternas al igual que reacciones

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que dependen de la cantidad de agua limitaciones de transferencia de masa,
disponible en el medio, se puede también teniendo como consecuencia mayor
alterar la especificidad por el sustrato y la eficiencia catalítica. Este sistema tiene la
enantioselectividad, y se elimina la ventaja de que modifica el equilibrio
contaminación microbiana. Sin embargo, la termodinámico a favor de reacciones de
aplicación de enzimas en solventes síntesis.
orgánicos es restringida ya que muchas de 2) Bifásico o sistema de dos fases. El
las enzimas son menos activas y estables sistema está compuesto por dos fases, una
en presencia de solventes. Por lo tanto, se fase acuosa que contiene a la enzima
han desarrollado varios métodos para disuelta y otra fase compuesta por un
mantener o aumentar la actividad y solvente inmiscible en agua. Entre la fase
estabilidad de las enzimas en presencia de acuosa y la fase orgánica se forma una
solventes orgánicos para uso industrial. interface. El sustrato (hidrofóbico) se
Estos métodos incluyen la inmovilización encuentra en la parte orgánica. El producto
de enzimas en soportes, la modificación presenta características hidrofóbicas por lo
química de las enzimas, modificaciones cual puede extraerse de la fase orgánica.
físicas con lípidos o surfactantes, la 3) Mezclas anhídridas. Las enzimas
inclusión de enzimas en micelas e en forma nativa son insolubles en solventes
ingeniería molecular. Algunas enzimas, de orgánicos, por lo tanto, en este tipo de
manera natural, son tolerantes a medios sistemas, la liofilización, la inmovilización y
orgánicos, las cuales son las mejores la modificación con compuestos anfipáticos
candidatas para aplicaciones son opciones para solubilizar enzimas. La
biotecnológicas ya que no se requiere liofilización puede causar daños en la
modificar la enzima. La investigación estructura de las proteínas por lo que la
dedicada a este tema durante los últimos coliofilización con aditivos como algunos
10 años ha sido a buscar enzimas de carbohidratos, polímeros y algunas sales
origen microbiano resistentes a solventes previenen estos daños. La enzima
orgánicos. proveniente de una solución acuosa con
condiciones óptimas, presentan las mismas
Clasificación de los sistemas que usan características catalíticas al liofilizarlas o
solventes orgánicos precipitarlas, este fenómeno es llamado
Dependiendo de la miscibilidad del “Memoria al pH”. En estos sistemas, las
solvente en el agua y la relación de éstos enzimas liofilizadas exhiben alta
en el medio, se pueden encontrar tres tipos termoestabilidad, pero menor actividad que
de sistemas: en sistemas acuosos. La actividad de agua
1) Co-solvente orgánico. En este tipo es importante para la actividad enzimática.
de mezclas, el solvente usado es miscible Como regla general, se sabe que en
en agua. Estos sistemas tienen la función solventes hidrofóbicos, las enzimas
de incrementar la solubilidad de los muestran mayor actividad, comparando con
compuestos hidrofóbicos y reduciendo las enzimas en solventes hidrofílicos. La

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movilidad conformacional de las enzimas añadiendo una cantidad mínima de agua,
es restringida en sistemas con poco agua. puede conservarse la actividad (Klibanov
Esto lleva a que las enzimas presenten 2001).
especificidades por sustrato únicas. En
este tipo de sistemas, las reacciones más Estabilización termodinámica de los
comunes son transesterificación de ésteres sistemas de transición en solventes
y síntesis de péptidos (Doukyo & Ogino, orgánicos
2010). Muchas enzimas tienen sitios activos
hidrofóbicos, teniendo un incentivo
Inactivación de enzimas en solventes energético para que los sustratos
orgánicos hidrofóbicos desplacen el agua cercana al
En general, el plegamiento de la sitio activo. Cuando el agua es
estructura terciaria de las proteínas en reemplazada con solventes orgánicos, se
medios acuosos da como resultado que los estabilizan los estados de transición de los
grupos polares en el exterior de la molécula sustratos. El alterar el equilibrio
interaccionen con el medio y los grupos no termodinámico puede resultar en un
polares a formar una coraza hidrofóbica al decremento de la actividad enzimática. En
interior de la proteína. La estructura de la 1998, Torres y colaboradores propusieron
proteína se mantiene gracias al balance de un modelo para evaluar el efecto de los
las interacciones hidrofóbicas, solventes en la actividad, ya que el
interacciones electroestáticas, fuerzas de coeficiente de partición no se puede aplicar
Van der Waals y puentes de hidrógeno. La a solventes miscibles en agua. La
desnaturalización de las proteínas se da hidrofobicidad (H) se considera como el
cuando el equilibrio de las interacciones se coeficiente de partición del sustrato en el
rompe. En medios orgánicos, la pérdida de sitio activo de la enzima y en el medio no
actividad enzimática se debe al acuoso. Al incrementar la hidrofobicidad del
rompimiento de la coraza hidrofóbica solvente, el sustrato se desplaza del sitio
dentro de la proteína. Los solventes polares activo al medio no acuosos, observando un
pueden penetrar dentro de la proteína e decremento en la actividad catalítica. Este
inducir algunos cambios estructurales a parámetro de hidrofobicidad correlaciona la
diferencia de los solventes no polares. actividad termodinámica del solvente
La flexibilidad conformacional de las orgánico en la mezcla de reacción y es
proteínas es crucial para mantener la inversamente proporcional a la polaridad
actividad biológica de las proteínas. Las del solvente. Ng y Tsai (2005) estudiaron
enzimas requieren de ciertas moléculas de las propiedades de una lipasa de papaya
agua unidas a la superficie de la estructura para sintetizar fármacos, especialmente el
para funcionar. Como ya se menciono naproxeno y al hacer un análisis
anteriormente, en medios anhidros, la termodinámico encontraron diferencias en
actividad decrece considerablemente, sin las energías de activación para la
embargo, se ha comprobado que discriminación de enantiómeros, también

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encontraron una compensación entre con el sitio activo y propusieron cambios
entalpía-entropía y lo atribuyen a la conformacionales en la proteína, formando
similitud de cadena de acilo de los “isómeros conformacionales” encontrando
sustratos. dos procesos paralelos: aceleración en las
tasas de formación del compuesto enzima-
Correlación entre la actividad enzimática y sustrato y disminución de la tasa de
la naturaleza de los solventes orgánicos deacilación (Figura 2). Para explicar este
Muchos investigadores han intentado tipo de fenómeno se ha recurrido al
correlacionar la actividad enzimática y el concepto de barrido de puentes de
efecto de los solventes en ésta. Laane y hidrógeno, en donde la formación de un
colaboradores (1987) han relacionado puente de hidrógeno entre Asp102 y His57
diferentes parámetros, como contante del sitio activo, tiene como consecuencia la
dieléctrica, momento dipolar y coeficiente alcalinidad del residuo His57 y su habilidad
de partición. El coeficiente de partición es para atraer más protones del residuo
el parámetro más usado para tratar de Ser195, facilitando el ataque nucleofílico al
relacionar los efectos de los solventes en la grupo carbonilo del sustrato y la formación
actividad enzimática, sin embargo, los del intermediario tetraédrico. La formación
solventes sólo se pueden relacionar si del puente de hidrógeno entre Asp102 y
pertenecen al mismo grupo funcional, por His57 decrece la energía de activación
ejemplo alcoholes y polioles. para el sustrato se convierta en el
intermediario tetraédrico. También se
Biocatálisis en solventes orgánicos propuso en este trabajo que los solventes
Existen pruebas de que las enzimas en orgánicos tienen un efecto de compresión
medios orgánicos pueden tener actividad estérica entre el sitio activo y el sustrato
catalítica. En algunos casos se ha para formar este puente de hidrógeno y así
reportado que la actividad catalítica aumentar la afinidad por el sustrato, y que
disminuye en diversos órdenes de el etanol actúa como agente nucleofílico en
magnitud cuando se exponen a medios la hidrólisis de la enzima acilada.
orgánicos por lo cual hay que tener cuidado
al momento de seleccionar los Efecto del agua en las reacciones de
componentes de la mezcla de reacción biocatálisis
(solventes, pH, concentración de iones y Cuando se habla de reacciones en
agua) para buscar una mayor actividad medios no acuosos, se debe entender que
enzimática. Se sabe que el mecanismo de la mayor parte del medio que rodea a la
catálisis en medios orgánicos para las enzima es no acuoso, ya que una enzima
quimotripsinas se ve afectado con dentro de su estructura contiene moléculas
solventes miscibles en agua, Belyaeva y de agua que permanecen unidas a esta a
colaboradores en el 2002 encontraron que pesar de tratamientos térmicos extremos.
el dimetil sulfóxido y el etanol interactúan Una manera de cuantificar el agua en una

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Fig. 2. Representación de la reacción de catálisis de α-quimotripsina en presencia de solventes
orgánicos. E (Enzima), S (Sustrato: N-acetil-L- tirosina p-nitroanilina), ES (Complejo enzima-
sustrato), EA (Enzima acilada), P1 (Producto de la incubación de la enzima con etanol: p-
nitroanilina), P2 (Producto de la enzima en medio acuoso: N-acetil-L-tirosina).

reacción es usar concentración de ésta en Control de la actividad de agua usando

molaridad o por porcentaje en peso o en soluciones salinas saturadas
volumen, sin embargo las propiedades Una manera de controlar la actividad de
catalíticas de una enzima son las más agua a nivel laboratorio es la de equilibrar
influenciadas por la cantidad de agua unida el medio con soluciones salinas saturadas.
a la enzima que por la cantidad de agua en Esto se basa en que la solubilidad de una
el medio; desafortunadamente la medición sal en agua tiene un valor determinado a
de la cantidad de agua enlazada a una una temperatura determinada, podrá
enzima puede ser un reto. Se acepta el equilibrar el contenido de agua en una
concepto de actividad de agua para poder solución de menor saturación. La tabla 2
cuantificar el agua presente en el sistema presenta el efecto de algunas sales en la
(Drauz & Waldmann, 2002). actividad de agua (Carrera & Riva, 2008).

Tabla 2. Soluciones saturadas para controlar la actividad de agua. Los valores presentados se
dan para trabajar a una temperatura de 25 °C.

Sal Actividad
de agua
LiCl 0.113
MgCl2 0.225
Acetato de potasio 0.328
K2CO3 0.432
Mg(NO3)2 0.529
SrCl2 0.708
KCl 0.843
KNO3 0.936
K2SO4 0.973

Lipasas como biocatalizadores biocatalizadores. Constituyen un grupo de

Las lipasas (EC 3.1.1.3; triacilglicerol enzimas que catalizan la hidrólisis y
acilhidrolasas) son un grupo versátil de síntesis de acilglicéridos de cadena larga

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cuando se da una interface entre los lípidos todas estas tienen una pequeña “lid”
y el agua, fenómeno llamado activación (Kourist et al. 2010).
interfacial (Kourist et al. 2010). La Un ejemplo sobre el efecto de los solventes
aplicación de lipasas en la industria ha sido en la actividad de lipasas es que pueden
destinada a la producción de detergentes, distinguir entre enantiómeros, en el 2000,
alimentos y saborizantes, fármacos, Overbeeke y Heijen estudiaron el efecto de
ésteres, agroquímicos, cosméticos y la acetona y una mezcla de octano-
perfumería (Hasan et al. 2006). Sin ciclohexano para reacciones de hidrólisis y
embargo, la creciente necesidad de esterificación añadiendo un exceso de
enzimas resistentes a las condiciones de enantiómeros sustrato y de productos la
trabajo de algunos procesos industriales ecuación de la figura 3 en donde
hace indispensable la búsqueda de determinaron los excesos de enantiómeros
enzimas termoresistentes. Se ha visto que representando como ees y eep. Encontraron
el proceso de desnaturalización de algunas que la composición de los solventes afecta
enzimas en presencia de solventes a la enatioselectividad, aumentando este
disminuye dependiendo del solvente usado valor hasta en 50%. En el 2003, Ghanem
y de la actividad de agua (Ahmed et al. estudio el efecto ciclodextrinas y solventes
2009, Mansfeld & Ulbrich-Hofmann 2007, orgánicos en la capacidad de
Royter et al. 2009, Sekhon et al. 2005). tranesterificación de lipasas y encontró que
Al contrario de las carboxil-esterasas la tasa de enantioselectividad también
(EC 3.1.1.1), la catálisis ocurre cuando se aumentaba. La estrategia que siguió fue
da una interface entre los lípidos y el agua, liofilizar una lipasa con ciclodextrinas y
y se ha demostrado que la mayoría de las encontró que la lipasa podía catalizar la
lipasas presentan un fenómeno llamado transesterificación de1-(2-furil)-etanol en
activación interfacial, lo que significa que tolueno. A nivel industrial, las lipasas se
una actividad catalítica alta solo se utilizan para la producción de alcoholes
observará en presencia de una fase enantiopuros a partir de mezclas
hidrofóbica (triacilglicéridos dispersos en racémicas, por la compañía BASF (Schöfer
agua o en solventes orgánicos). Este et al. 2001).
fenómeno está relacionado con la
presencia de un oligopéptido hidrofóbico Efecto de solventes orgánicos en enzimas
llamado “lid” o “flat” cubriendo la entrada al La aplicación de enzimas en solventes
sitio activo. En presencia de un ambiente orgánicos es restringida ya que muchas de
hidrofóbico, este oligopéptido o “lid” se las enzimas son menos estables en
desplaza y el sustrato puede entrar al sitio presencia de solventes por lo que se han
de enlace. Existen lipasas que no necesitan desarrollado métodos para mantener o
de activación interfacial como las de aumentar la actividad y estabilidad de las
Pseudomonas glumae, Pseudomonas enzimas para uso industrial. Estos métodos
aeruginosa y Candida antartica B, pero

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Fig. 3. Ecuación para estudiar la capacidad de enantioselectividad en enzimas en donde se
relacionan constantes de especificidad para dos enantiomeros, ya sea del sustrato o del
producto y la velocidad de reacción para cada enantiomero.

incluyen la inmovilización de enzimas en transformar moléculas con exquisita

soportes, modificación química de las fidelidad y selectividad en soluciones
enzimas, modificaciones físicas con lípidos acuosas (Serdakowski & Dordick, 2007).
o surfactantes, encapsulamiento de En medios no acuosos, las enzimas
enzimas en micelas e ingeniería molecular. pueden presentar diferentes efectos como
Algunas enzimas, de manera natural, son la separación de las diferentes moléculas
tolerantes a medios orgánicos, las cuales de enzimas, esto se refiere a que en
son las mejores candidatas para conformación nativa el balance de la
aplicaciones biotecnológicas ya que no se estructura proteica esta dado por
requiere modificar la enzima (Okamoto & interacciones no covalentes, como puentes
Ueji 2000). de hidrógeno, interacciones iónicas,
En general, lipasas microbianas fuerzas de Van der Waals e interacciones
aumentan su actividad catalítica en hidrofóbicas. El agua es un requisito para
solventes con Log P igual o mayor a 2, y a que se den estas interacciones. En
valores menores a 2, la actividad presencia de solventes orgánicos, estas
enzimática disminuye considerablemente interacciones se rompen, teniendo como
(Laane et al. 1987). El amplio uso de consecuencia el desplegamiento de la
enzimas en procesos industriales ha estructura de la proteína. Como
creado la necesidad de identificar nuevas característica de los solventes orgánicos
fuentes de enzimas de bajo costo. El polares, éstos pueden penetrar dentro de la
potencial uso de enzimas de peces y otros estructura proteica, siendo capaces de
organismos marinos como fuentes de inducir cambios en las estructuras
lipasas sigue en investigación. Se tienen secundaria y terciaria. En enzimas con
reportes de lipasas que mantienen su estados de transición altamente polares, la
actividad catalítica en concentraciones interacción con solventes orgánicos reduce
mayores a 40% de solventes polares la polaridad del sitio activo desestabilizando
(Kurtovic et al. 2010, Maytorena 2011). los estados de transición polares en la
Una enzima en su forma nativa presenta catálisis (Serdakowski & Dordick, 2007). En
una estructura tridimensional con la figura 4 se presenta un modelo de
geometrías precisas para poder interacción del agua (esferas azules) y del

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octano (esferas rojas) en el sitio activo de máxima de la banda de absorción de mayor
subtilisina haciendo una modelación de longitud de onda de un disolvente
desplazamiento de moléculas de agua por determinado. El parámetro de solubilidad
parte de las moléculas de octano. En la de Hildebrand se define como la suma de
tabla 3 se presentan algunos solventes todas las fuerzas de atracción
usados en la industria y algunas intermoleculares de una sustancia (Costa
características. El término coeficiente de 2005).
partición es la razón entre las
concentraciones de esa sustancia en las Uso de solventes en síntesis
dos fases de la mezcla formada por dos Las proteasas de origen microbiano
disolventes inmiscibles en equilibrio. pueden funcionar como catalizadores en
Constante dieléctrica se refiere a la medida medios con solventes orgánicos con lo cual
de las propiedades de un solvente para se pueden ofrecen nuevas posibilidades a
mantener cargas opuestas separadas. El la industria, ya que puede darse un cambio
parámetro de Reichardt-Dimroth es una en el equilibrio termodinámico a favor de la
medida de la polaridad ionizante (pérdida síntesis, incrementando la solubilidad de
de la polaridad) de un disolvente basado en los sustratos hidrofóbicos, puede
la longitud de onda máxima de la banda de controlarse la especificidad con el uso de
absorción de mayor longitud de onda solventes y también puede aumentar la

Fig. 4. Representación de la interacción de un solvente orgánico en el sitio activo de una

enzima dependiendo de la polaridad del solvente (Serdakowski & Dordick, 2007). Las esferas
azules representan a moléculas de agua y las esferas rojas representan a moléculas de
solvente orgánico. Las esferas de mayor volumen simulan una mayor densidad de agua o
solvente según sea el caso. Los aminoácidos del sitio activo están representados en barras
(Asp32, His64 y Ser 121). La figura 4a muestra la interacción de subtilisina en agua. Cuando la
enzima esta en contacto con octano, el agua difícilmente puede interactuar con el sitio activo
(Fig. 4b). Sin embargo, cuando la enzima esta en contacto con un solvente relativamente polar
(tetrahidrofurano), el solvente si puede interactuar con esa área de la proteína (Fig. 4c).

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Tabla 3. Solventes usados en la industria y parámetros de solubilidad. Log P: Coeficiente de
partición entre octanol y agua. ε: Constante dieléctrica. ET: Parámetro de polaridad empírica de
Reichardt- Dimroth. HS: Parámetro de solubilidad de Hildebrand. Sw/o: Solubilidad del agua en
el solvente. So/w: Solubilidad del solvente en agua (Carrea & Riva, 2008).

Solvente Log P ε ET HS Sw/o So/w

DMF -1.01 36.71 0.404 20.3 100
Metanol -0.77 32.66 0.762 29.7 100 100
Etanol -0.31 24.55 0.654 26.1 100 100
1,4-Dioxano -0.27 2.21 0.164 20.7 100 100
Acetona -0.24 20.56 0.355 20.5 100 100
2-Butanona 0.29 18.51 0.327 19 10 24
Piridina 0.65 12.91 0.302 21.7 100 100
Acetato de etilo 0.73 6.02 0.228 18.6 2.94 8.08
1-Butanol 0.88 17.51 0.506 23.7 20.5 7.45
Éter dietílico 0.89 4.2 0.117 15.1 1.47 6.04
Diisopropil éter 1.52 3.88 0.102 14.4 0.57 1.2
Acetato de butilo 1.7 5.01 17.4 1.2 0.68
Benceno 2.13 2.27 0.111 18.7 0.0635 0.179
1,1,1-Tricloroetano 2.49 7.25 0.17 17.4 0.034 0.132
Tolueno 2.73 2.38 0.099 18.2 0.0334 0.0515
Hexano 3.98 1.88 0.009 14.9 0.0111 0.00123
Heptano 4.57 1.92 0.012 15.2 0.0091 0.000357

termoestabilidad de las enzimas (Rahman, p la constante de partición. Los autores

2007). En 1996, Cerovsky y Jakubke concluyeron que los solventes orgánicos
estudiaron la especificidad nucleofílica de bajo condiciones alcalinas, los amino de los
la subtilopeptidasa A, y encontraron que no nucleófilos se encuentran desprotonados,
es una opción viable para síntesis de siendo esto un requisito para que los
péptidos en medios acuosos, pero nucleófilos participen en la transferencia de
explicaron las bases moleculares porque si acilos. También se encontró que se
es una buena opción en medios orgánicos. necesitan residuos de glicina continuos u
Investigaron las constantes de partición de otros residuos hidrofílicos pequeños para
la subtilisina acilada en agua y en 10% de que puedan participar en la reacción y se
acetonitrilo, y una serie de derivados de dedujo que existen interacciones
aminoácidos teniendo glicina como electroestáticas entre los residuos
nucleófilos. Los autores calcularon las cargados negativamente de la enzima y los
constantes de partición siguiendo el residuos cargados positivamente del
siguiente esquema (Figura 5) y la ecuación sustrato, concluyendo que los péptidos
(d[P2]/dt)/(d[P3]/dt= p/[N], en donde [N] (sustratos) con residuos hidrofílicos
equivale a la concentración del nucleófilo y alrededor de glicina en suspensiones

BioTecnología, Año 2012, Vol. 16 No. 1 31

 orgánicas presentan características síntesis en medios orgánicos, en la
nucleofílicas al contrario de aminoácidos columna 1 se enlistan las enzimas que no
alifáticos y aromáticos alrededor de glicina. necesitan cofactores y en la columna 2 las
En la tabla 4 se presenta un listado de las enzimas que requieren cofactor y qué tipo
enzimas más usadas en reacciones de de cofactor (Carrea & Riva 2008).

Fig. 5. Reacción de catálisis en la transferencia de acilo. E (Enzima), S (Ester donador de

acilo; componente carboxilo), N (nucleófilo; componente amino), P1 (Grupo saliente del
compuesto éster), P2 (Producto de hidrólisis), P3 (Péptido producto), EA (Enzima acilada), EAN
(Complejo nucleófilo-enzima, acilo). (Cerovsky y Jakubke 1996).

Tabla 4. Enzimas comúnmente usadas en síntesis en medios orgánicos (Carrea & Riva, 2008).

No requieren cofactores Requieren de cofactores

 Esterasas  Quinasas –ATP
 Lipasas  Oxidoreductasas –NAD(P)(H)
 Amilasas  Metiltransferasas – SAM
 Fosfolipasas  Enzimas que dependen de CoA
 Epoxido hidrasas  Sufuriliasas - PAPS
 Nucleótido fosfoliasa
 SAM sintetasa
 Glucosa isomerasa
 Aspartasa
 Fenilalanina amonia liasa
 Fumarasa
 Cianohidrina sintetasa

Enzimas inmovilizadas podemos mencionar la adsorción en

La inmovilización de biocatalizadores soportes poliméricos, como los de polivinilo
para sistemas continuos de producción se y de poliacrilamida; la microencapsulación
da cuando las enzimas, como las células en membranas semipermeables de
se inmovilizan en un soporte de manera celulosa o nylon; el entrecruzamiento para
que el sustrato se vaya transformando formar un producto insoluble, y la unión
continuamente sin que se pierda la enzima, covalente a soportes insolubles. Esta
como ocurre con los métodos de lote. Sin metodología ha permitido que se diseñen
embargo, a pesar de todos los esfuerzos y electrodos que, a semejanza de los de un
desarrollos tecnológicos en este campo, potenciómetro para medir pH, se utilizan en
estos métodos presentan todavía muchos la determinación de diversos compuestos,
problemas, por lo que no se han podido como son los azúcares. En un nivel
utilizar en forma generalizada. Entre los comercial pocas son las enzimas que se
métodos más comunes de inmovilización emplean de esta manera; entre ellas

BioTecnología, Año 2012, Vol. 16 No. 1 32

destacan la glucosa isomerasa y la organic solvents with the active site of α-
aminoacilasa (Badui, 1993). Tang y chymotrypsin. Biochem. (Moscow)
colaboradores en el 2007, inmovilizaron 67(9): 1032-1036.
lipasas alcalinas en nanopartículas de Carrea G, Riva S (2008) Organic synthesis
quitosano para que trabajaran en medios with enzymes in non-aqueous media.
ácidos y encontraron que estas enzimas al WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,
inmovilizarlas en la superficie de las Weinheim.
esferas, presentaban actividad catalítica lo Cerovsky V & Jakubke HD (1996)
cual podría ser una opción para estudiar Nucleophile specificity of subtilisin in an
enzimas lábiles en otro tipo de medios. organic solvent with low water content:
Investigation of via acyl transfer
CONCLUSIÓN reactions. Biotechnol. Bioeng. 49: 553-
Se han encontrado enzimas resistentes 558.
a solventes orgánicos en la mayoría de los Costa JM (2005) Diccionario de química
microorganismos y en los últimos 10 años física. Ediciones Díaz de Santos.
se han encontrado enzimas resistentes a Damhus T, Kaasgaard S, Lunquist H, Olsen
solventes en otros organismos como HS (2008) Enzymes at work. Tercera
peces, crustáceos, mamíferos y plantas, y edición. Novozymes Research &
la estabilidad en medios no acuosos varía Development. Reporte técnico No.
dependiendo de las características del 2008-08235-01.
solvente y la concentración en el medio, se Doukyu N & Ogino H (2010) Organic-
ha puesto especial atención a hidrolasas, solvent tolerant enzymes. Biochem.
pero también se ha encontrado resistencia Eng. J. 48: 270-282.
a solventes en otro tipo de enzimas, como Drauz K & Waldmann H (2002) Enzyme
las oxidoreductasas. catalysis in organic synthesis, A
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