PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS

PRÁCTICA 2

FROTIS

A. Objetivos

 Realizar preparaciones para ser observadas con el objetivo de inmersión

 Investigar lo relativo a los diferentes tipos de colorantes utilizados en muestras

celulares

 Conocer acerca de los beneficios de las diferentes coloraciones aplicables a

muestras celulares para ser observadas en el microscopio

 Realizar y conocer la técnica de frotis para la observación de muestras sanguíneas y

bucales

 Reconocer los componentes celulares de la sangre: glóbulos rojos, blancos y

plaquetas

 Reconocer las células epiteliales

B. Introducción

En microscopia es esencial disponer de buenas preparaciones microscópicas. La

preparación de especímenes y objetos sencillos no es difícil y requiere solo de algunas
herramientas simples, pero si es necesario tener mucha práctica. Casi todas las
preparaciones requieren de porta y cubreobjetos (también denominados portas y cubres). La
mayoría de los portaobjetos son láminas de vidrio de aproximadamente 1 mm de espesor y
8 cm de lado. El espesor es de gran importancia. Por otra parte, los cubres son de diversas
dimensiones, pero los más comunes son cuadrados y tienen 2 cm de lado. También en ellos
el espesor es muy importante y variable.

1. Preparaciones acuosas y al seco. Medios de preparación.

Las preparaciones más simples y fáciles de aprender son las acuosas o de objetos
líquidos, usada para examinar cualquier objeto fluido, como agua de estanque o sangre.
Este tipo de preparaciones de líquidos son de corta duración ya que se secan pronto. Para
evitar que se seque deben cerrarse herméticamente los bordes del cubre. Una preparación
microscópica líquida sellada de esta manera no dura indefinidamente, pero si un tiempo
considerable.

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Por el contrario, las preparaciones en seco, tales como alas de insectos, foramíferos
y otros, son de larga duración. En la preparación en seco, el procedimiento exige que el
objeto sea muy fino ya que el mismo es fijado a la superficie del portaobjeto mediante
goma arábiga. Para objetos más gruesos se requiere de una celdilla a fin de separar el porta
del cubre.

En las preparaciones microscópicas se utilizan diversos medios, pudiendo dividirlos

en dos grupos principales: productos solubles en agua y productos solubles en xilol. Los
primeros se usan en preparaciones directas de una solución acuosa, como agua de
estanques, siendo los dos medios más importantes solubles en agua son la gelatina
glicerinada y el preparado de Farrant. Por otra parte, los medios solubles en xilol más
comunes son el bálsamo de Canadá y el D.P.X., siendo necesario que el objeto se encuentre
completamente deshidratado o impregnado de xilol. Las preparaciones bien realizadas en
estos medios son permanentes.

2. Técnicas de coloración. Tipos de soluciones colorantes. Frotis.

Las preparaciones microscópicas simples revelarán solo una parte de la información

requerida. En algunos casos es preciso cortar secciones de algunos materiales para
examinarlos incluso someramente. Muchos de los elementos de una célula o preparación
son transparentes, por lo que es difícil percibir su estructura en preparaciones simples. Por
ejemplo, si se deposita una gota de sangre en un portaobjeto, se le cubre con un cubreobjeto
y se observa al microscopio se verán innumerables y pequeñísimas células amontonadas
unas sobre otras, pero se obtendrán pocos datos, aun usando lentes muy potentes. Se ha
alcanzado el límite de la preparación simple. Es necesario contar con otros tipos de
preparaciones como el frotis.

El frotis es una preparación para el microscopio hecha tomando parte de un tejido,

membrana o líquido que se necesita examinar. Se puede encontrar el frotis por aposición,
que se realiza mediante la toma de un corte de un órgano o cualquier estructura y con el
mismo se toca varias veces la superficie de un portaobjeto, tratando de realizar la extensión
de una capa de células por ejemplo el frotis bucal (Figura 1a); y el frotis sanguíneo, que
consiste en el extendido de una gota de sangre en la superficie de un portaobjetos o de un
cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente (Figura 1b). En particular, el frotis
bucal consiste en la toma de las células epiteliales ubicadas en la boca, específicamente, en
las paredes internas de la mejilla (Figura 2). Sin embargo, si las extensiones del frotis se
observan directamente al microscopio es casi imposible ver y distinguir células, sólo se
distingue su leve contorno, por lo que es necesario usar la técnica de colorantes, con lo cual

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se pueden teñir los diferentes elementos celulares con varios colores para obtener así una
visión detallada de su constitución.

Figura 1. Frotis bucal (A) y sanguíneo (B).

Figura 2. Célula epitelial tomada por medio de un frotis bucal.

Para poder teñir las células es necesario tratarlas con un preservativo, llamado
fijador, de lo contrario serían arrastradas fuera del portaobjeto o deterioradas por el agua de
la solución colorante. El fijador conserva las células y las protege en los procesos
subsiguientes. Los fijadores empleados para la realización de los frotis suelen ser bastante
activos y rápidos, diseñados para precipitar las proteínas de las células. El fijador común
para películas de sangre es el alcohol metílico absoluto. Ciertas células, como las
epiteliales, se fijan mejor con una mezcla a partes iguales del alcohol metílico y éter. Los

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fijadores utilizados para tejidos son de acción más suave que los empleados en los frotis, y
requieren mucho más tiempo.

La fijación aplicada, tanto a los frotis como a los órganos o cualquier otro corte, es
un método histológico de preservación destinado a obtener preparados duraderos que
conserven la estructura morfológica y química que presentan las células y tejidos en estado
vivo, y que permite realizar posteriormente los procedimientos de coloración o de
identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.

A la fijación de un frotis, de un órgano o de cualquier otra muestra le sigue el

proceso de coloración del mismo. Para ello se pueden escoger soluciones colorantes que
tiñan selectivamente ciertos componentes y otros no, lo que es preferible, al empleo
sucesivo de varios colorantes que se fijan cada uno de ellos a diferentes estructuras. Los
colorantes son sustancias que pueden comunicar su color a otros cuerpos. En ciertos casos,
en lugar de ser el color conferido igual al del colorante (ortocormasía), el que adquiere el
cuerpo es diferente al de la solución (metacromasía).

Se denomina coloración al proceso mediante el cual un cuerpo toma color por la

acción de una sustancia colorante y no destiñe con un lavado efectuado con el solvente
empleado para preparar la solución colorante. Según su origen los colorantes se clasifican
en:

a. Colorantes naturales:

1. Animales: carmín

2. Vegetales: hematoxilina-eosina, eosina, azafrán.

b. Colorantes artificiales o sintéticos (colorantes de anilina):

1. Ácidos: sales cuya base es incolora y el ácido coloreado (eosinato). Son

colorantes citoplamáticos.

2. Básicos: sales cuya base es coloreada y los ácidos incoloros (azul de metileno).
Son colorantes nucleares.

3. Neutros: sales en los que tanto el ácido como la base son coloreados (eosinato
de azul de metileno). Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.

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4. Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen poder

disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución
colorante (sudan III, rojo escarlata).

2.1. Utilidad de las técnicas de frotis sanguíneo y bucal

La técnica de frotis sanguíneo es de vital importancia para obtener información
diagnóstica acerca de:

1. La valoración de la estimulación eritropoyética.

2. Las anomalías en la maduración nuclear y citoplásmica de las células hemáticas.
3. Los trastornos en la arquitectura de las células al formarse en la médula ósea.
4. Las alteraciones singulares en la forma de las células, que son una identificación
especifica de algunas enfermedades.
5. Algún indicador de los efectos nocivos de la quimioterapia y de la radioterapia.
6. La diferenciación y recuento de los elementos celulares de la sangre.

La fidelidad de la información obtenida de ellos, depende en gran parte de la calidad

de las extensiones. Estas no deben ser demasiado gruesas porque las células se
amontonarían y no podrían ser reconocidas, ni diferenciarse, ni demasiado delgadas porque
las células se deformarían, distorsionarían y destruirían.

Por su parte, el frotis bucal se utiliza para obtener células con el fin de realizar
análisis cromosómicos y de ADN, con mayor frecuencia para pruebas genéticas. El Comité
Olímpico Internacional adoptó el examen hace muchos años para ayudar a detectar
impostores masculinos entre las atletas femeninas. Cuando el examen se hace de esta
manera, se denomina cromatina sexual. Este método también ayuda a establecer la
identidad sexual de recién nacidos.

3. La Sangre
Se sabe que la sangre es una suspensión de células en un líquido complejo. Es un
tejido fluido que circula por capilares, venas y arterias de todos los vertebrados, su color
rojo característico se debe a la presencia del pigmento hemoglobínico contenido en los
eritrocitos. Tiene una fase sólida (elementos formes, que incluye a los glóbulos blancos, los
glóbulos rojos y las plaquetas) y una fase líquida, representada por el plasma sanguíneo.

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3.1. Plasma sanguíneo

El plasma sanguíneo es la porción líquida de la sangre en la que están inmersos los
elementos formes. Es salado y de color amarillento traslúcido y es más denso que el agua.
El volumen plasmático total se considera como de 40-50 mL/kg peso. El plasma sanguíneo
es esencialmente una solución acuosa de composición compleja conteniendo 91% agua, y
las proteínas el 8% y algunos rastros de otros materiales (hormonas, electrolitos, etc). Estas
proteínas son: fibrógeno, globulinas, albúminas y lipoproteínas. Otras proteínas plasmáticas
importantes actúan como transportadores hasta los tejidos de nutrientes esenciales como el
cobre, el hierro, otros metales y diversas hormonas. Los componentes del plasma se forman
en el hígado (albúmina y fibrógeno), las glándulas endocrinas (hormonas), y otros en el
intestino.

Además de vehiculizar las células de la sangre, también lleva los alimentos y las
sustancias de desecho recogidas de las células. El suero sanguíneo es la fracción fluida que
queda cuando se coagula la sangre y se consumen los factores de la coagulación.

Los componentes del plasma se forman en el hígado (albúmina y fibrógeno) y en las

glándulas endocrinas (hormonas). El plasma es una mezcla de proteínas, aminoácidos,
glúcidos, lípidos, sales, hormonas, enzimas, anticuerpos, urea, gases en disolución y
sustancias inorgánicas como sodio, potasio, cloruro de calcio, carbonato y bicarbonato.

3.2. Células sanguíneas: elementos formes.

Dentro de las células sanguíneas se tienen a los glóbulos blancos o leucocitos, que
"están de paso" por la sangre para cumplir su función en otros tejidos; y los eritrocitos
(hematíes) y las plaquetas (trombocitos), los cuales son los únicos componentes sanguíneos
que cumplen sus funciones estrictamente dentro del espacio vascular.

3.2.1. Glóbulos rojos: los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos constituyen

aproximadamente el 96% de los elementos sanguíneos. Su valor normal (conteo) en la
mujer promedio es de alrededor de 4.800.000, y en el varón, de aproximadamente
5.400.000 hematíes por mm³ (ó microlitro). Estos corpúsculos carecen de núcleo y
orgánulos, por lo cual no pueden ser considerados estrictamente células. Contienen algunas
vías enzimáticas y su citoplasma está ocupado casi en su totalidad por la hemoglobina, una
proteína encargada de transportar oxígeno. El dióxido de carbono, contrario a lo que piensa
la mayoría de la gente, es transportado en la sangre (libre disuelto 8%, como compuesto
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carbodinámicos 27%, y como bicarbonato, este último que regula el pH en la sangre). En la

membrana plasmática de los eritrocitos están las glucoproteínas (CDs) que definen a los
distintos grupos sanguíneos y otros identificadores celulares. Los eritrocitos tienen forma
de disco bicóncavo, deprimido en el centro; esta forma aumenta la superficie efectiva de la
membrana. Los glóbulos rojos maduros carecen de núcleo, porque lo expulsan en la médula
ósea antes de entrar en el torrente sanguíneo (esto no ocurre en aves, anfibios y ciertos
animales). Los eritrocitos en humanos adultos se forman en la médula ósea (Figura 3).

Figura 3. Glóbulos rojos. (A) Observación de glóbulos rojos en un frotis sanguíneo.

(B) Anatomía de los glóbulos rojos.

3.2.2. Plaquetas: las plaquetas (trombocitos) son fragmentos celulares pequeños (2-3 μm
de diámetro), ovales y sin núcleo (Figura 4). Se producen en la médula ósea a partir de la
fragmentación del citoplasma de los megacariocitos quedando libres en la circulación
sanguínea. Su valor cuantitativo normal se encuentra entre 150.000 y 450.000 plaquetas por
mm³. Las plaquetas sirven para taponar las lesiones que pudieran afectar a los vasos
sanguíneos. En el proceso de coagulación (hemostasia), las plaquetas contribuyen a la
formación de los coágulos (trombos), así son las responsables del cierre de las heridas
vasculares. Una gota de sangre contiene alrededor de 250.000 plaquetas.

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Figura 4. Observación de plaquetas en un frotis sanguíneo.

3.2.3. Glóbulos blancos: los glóbulos blancos o leucocitos forman parte de los efectores
celulares del sistema inmunológico, y son células con capacidad migratoria que utilizan la
sangre como vehículo para tener acceso a diferentes partes de la anatomía. Los leucocitos
son los encargados de destruir los agentes infecciosos y las células infectadas, y también
segregan sustancias protectoras como los anticuerpos, que combaten a las infecciones. El
conteo normal de leucocitos está dentro de un rango de 4.500 y 11.500 células por mm³ (o
microlitro) de sangre, variable según las condiciones fisiológicas (embarazo, estrés,
deporte, edad, etc.) y patológicas (infección, cáncer, inmunosupresión, aplasia, etc.). El
recuento porcentual de los diferentes tipos de leucocitos se conoce como "fórmula
leucocitaria".

Según las características microscópicas de su citoplasma (tintoriales) y su núcleo

(morfología), se dividen en:

A. los granulocitos o células polimorfonucleares: son los neutrófilos, basófilos y

eosinófilos; poseen un núcleo polimorfo y numerosos gránulos en su citoplasma,
con tinción diferencial según los tipos celulares (Figura 5).

i. Neutrófilos, presentes en sangre entre 2.500 y 7.500 células por mm³. Son
los más numerosos, ocupando entre un 55% y un 70% de los leucocitos. Se
tiñen pálidamente, de ahí su nombre. Se encargan de fagocitar sustancias
extrañas (bacterias, agentes externos, etc.) que entran en el organismo. En
situaciones de infección o inflamación su número aumenta en la sangre. Su
núcleo característico posee de 3 a 5 lóbulos separados por finas hebras de
cromatina, por lo cual antes se los denominaba "polimorfonucleares" o
simplemente "polinucleares".

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ii. Basófilos: se cuentan de 0,1 a 1,5 células por mm³ en sangre,

comprendiendo un 0,2-1,2% de los glóbulos blancos. Presentan una tinción
basófila, lo que los define. Segregan sustancias como la heparina, de
propiedades anticoagulantes, y la histamina que contribuyen con el proceso
de la inflamación. Poseen un núcleo a menudo cubierto por los gránulos de
secreción.
iii. Eosinófilos: presentes en la sangre de 50 a 500 células por mm³ (1-4% de los
leucocitos). Aumentan en enfermedades producidas por parásitos, en las
alergias y en el asma. Su núcleo, característico, posee dos lóbulos unidos por
una fina hebra de cromatina, y por ello también se las llama "células en
forma de antifaz".

B. los agranulocitos o células monomorfonucleares: son los linfocitos y los

monocitos; carecen de gránulos en el citoplasma y tienen un núcleo redondeado
(Figura 5).

i. Monocitos: Conteo normal entre 150 y 900 células por mm³ (2% a 8% del
total de glóbulos blancos). Esta cifra se eleva casi siempre por infecciones
originadas por virus o parásitos. Son células con núcleo definido y con
forma de riñón. En los tejidos se diferencian hacia macrófagos o histiocitos.

i. Linfocitos: valor normal entre 1.300 y 4000 por mm³ (24% a 32% del total
de glóbulos blancos). Su número aumenta sobre todo en infecciones virales,
aunque también en enfermedades neoplásicas (cáncer). Los linfocitos son los
efectores específicos del sistema inmunológico, ejerciendo la inmunidad
adquirida celular y humoral. Hay dos tipos de linfocitos, los linfocitos B,
encargados de segregar anticuerpos; y los linfocitos T, reconocen a las
células infectadas por los virus y las destruyen con ayuda de los macrófagos.

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Figura 5. Glóbulos blancos.

C. Materiales y equipos

 Lanceta

 Algodón, Alcohol

 Jabón y toallas secantes

 Portaobjetos

 Cubreobjetos

 Microscopio.

 Fijador (metanol)

 Colorante (giemsa)

 Hisopos

 Muestras de sangre y mucosa bucal

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D. Procedimiento experimental.

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Figura 6. Procedimiento para la realización del frotis sanguíneo.

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E. Resultados.

1. Observación del frotis sanguíneo.

Siguiendo las técnicas de enfoque, observe y dibuje la muestra de frotis sanguíneo con el
objetivo de 40X. Dibujar en el espacio señalado las diferentes células observadas, y señalar
cuál es cada una.

a. ¿Cómo se diferencia cada tipo de célula?

b. ¿Cuáles son las células que se encuentran en mayor proporción? ¿Es lógica esa
observación y por qué?.

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c. ¿Cuál es la utilidad del frotis sanguíneo para el bioanalista?

2. Observación del frotis bucal.

Siguiendo las técnicas de enfoque, observe y dibuje la muestra de frotis bucal con el
objetivo de 40X. Dibujar en el espacio señalado las células observadas, y señalar cuáles con
sus partes.

a. ¿Cuál es la función de las células epiteliales?

b. ¿Cuál es la utilidad del frotis bucal para el bioanalista?

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3. En la foto se presenta un frotis genital, tomado en una consulta ginecológica. (a)

¿Qué tipo de células observa? Señálelas en la figura. (b) ¿Qué función tienen las
células observadas? (c) ¿Es lógico encontrar este tipo de células? ¿Qué información
pueden brindar?

F. Bibliografía

 Guía de Histología, Primer año de Bioanálisis.

 Bernard J. (1974). Manual de Hematología. Ediciones Toray-Masson. Barcelona.

 Ville G. (1974). Biología.

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