Coloracion de Tincion Simple, Gram

I.
INTRODUCCIÓN
Existen numerosos colorantes, en su mayoría compuestos orgánicos. Los colorantes que
se utilizan son moléculas cargadas positivamente y se combinan con los componentes
celulares llamados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos
(azul metileno, el cristal violeta). Otros colorantes son cargados negativamente. Los que
se combinan con elementos celulares cargados positivamente (eosina, la fucsina acida y
el rojo Congo). La tinción de Gram es una técnica de laboratorio que permite identificar
distintos tipos de bacterias según se tiña su superficie, aportando información muy útil
para orientar el tratamiento antibiótico, diseñada por Christian Gram, un científico danés,
en el año 1884. El fundamento de la técnica se hace con base a las paredes celulares de
las bacterias; Gram positivas y Gram Negativas. La pared celular de las bacterias Gram
positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano. Además de dos ácidos ticónico. La
capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una
segunda membrana plasmática exterior por medio de lipoproteínas. En cuanto al
procedimiento, la aplicación bacteriana se fija a la placa, se flamea en el fuego no por
mucho tiempo porque se puede quemar la muestra pasado de esto se tiñe con los diferentes
reactivos antes mencionados. Tales como el cristal violeta que se deja por 1 min, el lugol
que también se deja por 1 min segundo el alcohol que dejamos por mucho más tiempo 15
min y de ultimo la safranina que se deja por 1 min se lavan las muestras con agua corriente
sin fijar el agua a las placas para que no se corran la muestras después del secado se
observa en el microscopio la separación de los grupos de bacterias tales como cocos y
bacilos.
II. OBJETIVOS
 Realizar las técnicas de preparación de frotis y de tinciones para la observación de

algunas formas y agrupaciones de los microorganismos.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
 Medios de cultivos
 Mechero de Bunsen
 Violeta genciana
 Asa de anillo
 Portaobjetos
 Microscopio
 Agua destilada
 Cristal violeta (color azul), Lugol, Alcohol acetona, Sapranina
 Pinza de madera
IV. MARCO TEÓRICO
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar
grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo),
poblaciones celulares (por ejemplo, clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso
para resaltar orgánulos dentro de células individuales.
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el
laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un
siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad
de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes
infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos–. La tinción de Gram se
considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras
que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares
en el rubro de la parasitología. Hay técnicas tintoriales específicas de gran utilidad, como
la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas
como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e
identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el
laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y
tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa.
Existen diferentes tipos de tinciones, cada una de ellas es útil para la observación y
clasificación de diversos organismos. Entre algunas de estas técnicas encontramos:
 TINCIÓN SIMPLE: Se basa en a diferencia química entre los microorganismos del
medio que los rodea. Se realiza el mismo procedimiento que se describe en la técnica
anterior, solo que el agua es reemplazada por un colorante o el caldo se le agrega una
gota de alguno de los siguientes colorantes: cristal violeta 1/5000, fucsina
fenicada o azul de metileno.
 DIFERENCIAL: Se basa en las diferencias físicas y químicas de los

microorganismos que reaccionan de manera distinta frente a un procedimiento de
tinción.
 TINCIÓN DE GRAM: con esta tinción se pueden separar las bacterias en dos
grupos: Gram (+) y Gram (-) que defieren en su constitución física en la pared celular.
Se utiliza un colorante básico, cristal violeta; un mordiente, Lugol; agente
decolorante, alcohol-cetona y colorante de contraste que puede ser fucsina fenicada o
safranina. Las células que retienen el colorante básico se llaman Gram positivas y las
que se decoloran y toman el colorante de contraste Gram negativas.
 TINCIÓN ÁCIDO- ALCOHOL RESISTENTES: Es una tinción diferencial que

demuestra la resistencia de una célula teñida a ser decolorada por los ácidos. En
algunos micobacterias y actinomicetes, la propiedad de ácido-resistencia está
relacionada con su alto contenido en lípidos. Se emplea principalmente en el estudio
y diagnóstico de enfermedades producidas por especies ácidos - resistentes como la
tuberculosis y la lepra, también para especies saprofitas, no patógenas.
 TINCIÓN DE ESTRUCTURAS: En general, la célula individual se compone de una

pared rígida que rodea a una membrana o saco citoplásmico que contiene varios
componentes fluidos o semifluidos. Dentro del citoplasma existe una zona
que posee casi todas las características de un núcleo. Esta zona contiene ácido
desoxirribonucleico (DNA} ya veces se le asigna el nombre genoma bacteriano. El
citoplasma contiene también una variedad de gránulos compuestos de sustancias
tales como ácidos ribonucleicos y proteínas, azufre y carbohidratos. Hay algunas
especies bacterianas que contienen gránulos específicos como característica
particular.
 CÁPSULAS: Algunas paredes celulares bacterianas están rodeadas por una capa
compuesta de polisacáridos o bien, una combinación de polisacáridos y polipéptidos.
Sí la cubierta cuenta con una organización estructural se denomina cápsula; si carece
de ella, dicha capa se llama capa mucoide. El material capsular sirve también como
base para la diferenciación antigénica. Se utiliza tinción negativa o indirecta, con
nigrosina (colorante ácido), ya que su capacidad de coloración reside en el ion
negativo, no teñirá la célula, se deposita alrededor, las células son coloreadas con
safranina posteriormente y las cápsulas aparecerán como una zona transparente que
rodea a la pared célula.
 ESPORAS: Algunos géneros de bacterias pueden formar esporas: estructuras internas

que confieren a la célula un alto nivel de resistencia a estas condiciones adversas del
medio ambiente. Se puede utilizar a técnica de Schaeffer Fulton para diferenciar
esporas de células negativas. Se aplica un colorante primario en solución acuosa y se
lo hace vaporizar para incrementar la penetración de los recubrimientos relativamente
impermeables de las esporas. Las esporas sometidas correctamente resisten la
sustitución por el colorante de contraste.
 FLAGELOS: Muchas bacterias poseen estructuras adicionales que son periféricas a

la pared celular rígida; estos son los flagelos y las cápsulas; los flagelos, son los
orgánulos de locomoción, se originan dentro del citoplasma, pero son estructuras
primordialmente externas son los componentes que realizan el movimiento de la
célula. Los flagelos tienen también propiedades antigénicas específicas que
contribuyen a la identificación de las especies bacterianas. Generalmente
se encuentran en bacilos excepcionalmente en cocos.
V. PROCEDIMIENTO
1. Esterilizamos el asa de anillo con el mechero de Bunsen, unas cuantas pasadas

hasta que se vea un rojo vivo.
2. Luego sacamos con el asa, una gota de agua destilada y lo ponemos en un
portaobjeto; para ello usaremos 2 ya que se realizará coloración simple y de Gram.
3. Agarramos un cultivo, y donde se visualiza los cultivos con el asa de anillo le
damos una pasada y hacer un movimiento rotatorio para que quede la muestra en
los portaobjetos.
4. Con la pinza de madera agarramos la muestra para evitar accidentes y de paso con
la ayuda del mechero se hace el secado mediante algunas pasadas a una cierta
distancia. (este método se llama el extendido)
5. La fijación es pasarle con bastante calor, 3 veces el calor lo adhiere a las bacterias
se seca y se pega, si no se hace esto no se pega y se puede borrar.
PARA LA COLORACION: COLORACION SIMPLE

1. Para la coloración simple se utilizó, violeta genciana 1 o 2 gotas durante 1 min.
2. Luego para que no manche, se lavó con agua destilada la muestra.
PARA LA COLORACION: COLORACION DE GRAM
1. Cristal violeta (color azul), Lugol, Alcohol acetona, Sapranina
2. Primero utilizamos cristal violeta por 1 min, unas 2 a 3 gotas pasado el tiempo lo
lavamos con agua destilada. Tiene una coloración azul
3. Ponemos ahora el lugol, 1 a 2 gotas y cambia a una coloración negra durante 1
min y lo lavamos.
4. Ponemos el Alcohol acetona, 3 a 4 gotas durante 30 seg. A 1 min. Y luego lo
lavamos.
5. Ponemos la Sapranina, 1 gota durante 30 seg. A 1 min. Y luego lo lavamos.
Luego de terminar con las 2 coloraciones, procedemos a secarlo con ayuda del Mechero
de Bunsen hacemos 3 pasadas en la llama para que quede totalmente seco. Después
ponemos aceite de inmersión para poder visualizar en el microscopio las muestras de
coloración simple y de Gram y observadas en el objetivo de 100 X.
Fig. 1 Fig. 2
Fig. 3 Fig. 4
VI. RESULTADOS
COCOBACILOS –
GRAM -
STREPTOCOCCUS – BACILOS – GRAM +
GRAM +
BACILOS ESPORULADOS – TIPO ESTAFILO

GRAM +
VII. CONCLUSION
 En conclusión, el objetivo principal de esta práctica se cumplió satisfactoriamente

pues se llevaron a cabo las técnicas de diversas tinciones. De igual forma, gracias
a estas tinciones se pudieron determinar ciertas características y reconocer a
ciertas bacterias.
 Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se
presentan morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo, al ejecutar
tinción de Gram en estas para identificar su grupo taxonómico, las Gram positivas
se tiñen de color violeta mientras que las Gram negativas se tiñen de color rosado.
 Las colonias de bacterias a las que se les realizó tinción de Gram se tomaron de
una muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido a que
en el suelo predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo, en el suelo
también se encuentran bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que
las Gram negativas, lo cual también explica la presencia de estas bacterias en el
suelo. De acuerdo a esto fue posible observar bacterias Gram negativas con
forma de bacilo (con forma de barra o vara) y Gram positivas como
Staphylococcus sp.
VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
 F. Martín, F. M. Prof.. (2014). Tinciones para microorganismos. Recuperado 10

marzo, 2020, de: https://www.studocu.com/es-mx/document/universidad-
nacional-de-cuyo/microbiologia/apuntes/tinciones-para-
microorganismos/3082525/view
 López-Jácome, L. E. Luis Esaú, Hernández-Durán, M. H. D. Melissa, & Colín-
Castro, C. A. C. C. Claudia Adriana. (2014, marzo). Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. Recuperado 10 marzo, 2020, de
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
 Gamazo C. Manual práctico de microbiología. Masson; 2010
 Esaú López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña
S,Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Las tinciones básicas en el laboratorio
de microbiología [Internet]. 2014. Disponible en:
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
 Santambrosio, E., Ortega, M., & Garibaldi, P. (2009). Tinción y observación
de microorganismos. Trabajo práctico. Universidad Tecnologica Nacional,
Departamento De Ingenieria Quimica

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 Realizar las técnicas de preparación de frotis y de tinciones para la observación de

III. MATERIALES Y EQUIPOS

 DIFERENCIAL: Se basa en las diferencias físicas y químicas de los

 TINCIÓN ÁCIDO- ALCOHOL RESISTENTES: Es una tinción diferencial que

 TINCIÓN DE ESTRUCTURAS: En general, la célula individual se compone de una

 ESPORAS: Algunos géneros de bacterias pueden formar esporas: estructuras internas

 FLAGELOS: Muchas bacterias poseen estructuras adicionales que son periféricas a

1. Esterilizamos el asa de anillo con el mechero de Bunsen, unas cuantas pasadas

PARA LA COLORACION: COLORACION SIMPLE

BACILOS ESPORULADOS – TIPO ESTAFILO

 En conclusión, el objetivo principal de esta práctica se cumplió satisfactoriamente

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

 F. Martín, F. M. Prof.. (2014). Tinciones para microorganismos. Recuperado 10

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